CN1160470C - 研究体内蛋白质相互作用的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用来测定活细胞内第一种蛋白质和另一种蛋白质是否相互作用的方法。该方法包含在细胞内提供与供体荧光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。允许复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质在细胞内彼此相互靠近。然后检测由供体荧光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出的任何荧光，这里来自受体荧光团的荧光表明第一种蛋白质与第二种蛋白质已经发生了相互作用。

Description

研究体内蛋白质相互作用的方法
                       背景
对活细胞内蛋白质间相互作用的研究往往对于理解蛋白质功能及其作用机制非常必要。这些相互作用目前采用免疫沉淀、酵母双杂交方法和β-gal互补方法进行研究。
然而，这些方法具有一些缺陷。例如，这些方法带有假阳性。第二，这些方法不可以测定关于相互作用的定量化信息。此外，它们不可能体内实时监测相互作用。
因此，获得另一种没有这些缺点的研究体内蛋白质间相互作用的方法将非常有利。更优选地，本方法可以在多种多样的活细胞内用于广泛的蛋白质。同样优选地，本方法能够用来测定除蛋白质以外的其它分子间的相互作用。
                     概述
根据本发明的一个实施方案，提供一种测定活细胞内第一种蛋白质和第二种蛋白质是否发生相互作用的方法。本方法包括在细胞内提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。当第一种蛋白质靠近第二种蛋白质时供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团。然后复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质在细胞内允许相互靠近。接下去检测任何来自受体荧光团的荧光。由供体萤光素酶发光共振能量传递给受体荧光团导致受体荧光团产生荧光，表明第一种蛋白质与第二种蛋白质已经发生了相互作用。
在一个优选的实施方案中，提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA以及将基因工程化的DNA转移到活细胞内，这导致细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。在一个特别优选的实施方案中，含有与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞以及含有与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞均为哺乳动物细胞。
在另一个优选的实施方案中，所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。而在另一种优选的实施方案中，所提供的受体荧光团为一种水母(Aequorea)绿色荧光蛋白质。
在一个特别优选的实施方案中，使用分光荧光测定法检测受体荧光团所发出的荧光。
                        描述
本发明包括一种运用发光共振能量传递(LRET)测定活细胞内一种蛋白质和另一种蛋白质是否发生相互作用的方法。发光共振能量传递是由于供体萤光素酶能量的激发态向受体荧光团的传递。为了LRET的发生，在供体萤光素酶的发射光谱和受体荧光团的激发光谱之间必须有重叠。
发光共振能量传递的效率在诸多变量中尤其取决于分隔供体萤光素酶和受体荧光团的距离。一般来说，明显的能量传递仅当供体萤光素酶和受体荧光团彼此之间小于80_时才发生。这种短距离大大小于用常规显微镜观察两个实体所需的光学分辨距离。因此，检测到在供体萤光素酶和受体荧光团之间发生发光共振能量传递，表明供体萤光素酶和受体荧光团已经靠近并处于LRET发生所需的距离之内，即彼此之间大约小于80_。
本发明运用发光共振能量传递来测定活细胞内一种蛋白质和另一种蛋白质之间是否发生相互作用。它的完成是依靠将第一种蛋白质与供体萤光素酶复合和将第二种蛋白质与受体荧光团复合，并将复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质放入细胞内并处于适合第一种蛋白质与第二种蛋白质发生相互作用的条件下。如果第一种蛋白质与第二种蛋白质相互作用，供体萤光素酶将足够靠近受体荧光团从而发生发光共振能量传递，受体荧光团将发出荧光。由此，检测到来自受体荧光团的荧光将表明第一种蛋白质已经与第二种蛋白质发生了相互作用。有利地是，这种方法也可用于检测即使用例如常规显微镜的光学方法无法检测到的第一种蛋白质与第二种蛋白质之间的相互作用。
根据本发明运用发光共振能量传递检测两种蛋白质之间相互作用的方法具有几个优点。首先，活细胞内蛋白质的特异标记可通过基因工程的方法获得，而将荧光染料导入活细胞非常困难。此外，如果供有底物和氧，酶促反应导致如Renilla的萤光素酶发光相对稳定，而荧光染料则迅速光漂白。
如此处公开所用的方法，“将第一种蛋白质与供体萤光素酶复合”是指将供体萤光素酶和第一种蛋白质以如此方式结合在一起，使得当第一种蛋白质与第二种蛋白质相互作用时供体萤光素酶和第一种蛋白质基本上相互同样靠近。相似地，“将第二种蛋白质与受体荧光团复合”是指将受体荧光团与第二种蛋白质以如此方式结合在一起，使得当第一种蛋白质与第二种蛋白质相互作用时受体荧光团和第二种蛋白质基本上相互同样靠近。例如，可通过基因工程化使细胞生产包含供体萤光素酶和第一种蛋白质的融合蛋白以及包含受体荧光团和第二种蛋白质的融合蛋白来进行这种复合。
在一个优选的实施方案中，本发明使用Renilla萤光素酶作为供体萤光素酶，使用“人源化的”水母绿色荧光蛋白(人源化GFP)作为受体荧光团。Renilla萤光素酶是一种从Renilla reniformis中纯化出的34kDa的酶。有氧时该酶催化coelentenazine的氧化脱羧作用，产生发射波长最大值为471nm的蓝光。Renilla萤光素酶用作供体萤光素酶是因为它除外源光以外需要外源底物进行激活。这样可有利地除去来自外源光源和自发荧光产生的背景噪音，从而允许容易而准确地定量测定所产生的光。
“人源化”GFP是一种激发最大值在480nm荧光的27kDa的蛋白质荧光团。它与野生型水母绿色荧光蛋白相比有一个氨基酸差异。之所以选择“人源化”GFP作为受体荧光团是因为它的激发光谱与Renilla萤光素酶的发射光谱相重叠。此外，“人源化”GFP发出的光在活细胞内是可见的。并且，“人源化”GFP在用于证明这种方法的“人源化”GFP cDNA转染的哺乳动物细胞中可获得良好的表达。
根据本发明用于测定一种蛋白质与另一种蛋白质是否相互作用的方法显示如下。简而言之，胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP6)和胰岛素样生长因子II(IGF-II)选作第一种蛋白质和第二种蛋白质。已知IGFBP6是一种对IGF-II具有明显结合亲和力的蛋白质。
Renilla萤光素酶的cDNA与IGFBP6的cDNA相融合，“人源化”GFP cDNA与IGF-II cDNA相融合。融合的cDNA转染活细胞，且表达融合蛋白。产生并混合细胞提取物。加入融合的Renilla萤光素酶-IGFPB 6蛋白质中的Renilla萤光素酶部分的底物。最终，检测由融合的“人源化”GFP-IGF-II蛋白质中“人源化”GFP部分发出的荧光。现在更加详细地描述根据本发明显示的一种方法。
A)克隆融合的IGFBP-6 cDNA-Renilla萤光素酶cDNA、融合的IGF-IIcDNA-“人源化”GFP cDNA和融合的胰岛素cDNA-“人源化”GFPcDNA：
首先，生产三种融合的cDNA：1)融合的IGFBP-6 cDNA和Renilla萤光素酶cDNA；2)融合的IGF-II cDNA和“人源化”GFP cDNA；和3)融合的胰岛素cDNA和“人源化”GFP cDNA。IGFBP-6 cDNA，SEQ NO：1，Genbank收录号M69054，编码用作第一种蛋白质的SEQNO：2的IGFBP-6。Renilla萤光素酶cDNA，SEQ NO：3，Genbank收录号M63501，编码用作供体萤光素酶的SEQ NO：4的Renilla萤光素酶。IGF-II cDNA，SEQ NO：5，编码用作第二种蛋白质的SEQNO：6的IGF-II。“人源化”GFP cDNA，SEQ NO：7，Genbank收录号为U50963，编码用作受体荧光团的SEQ NO：8的“人源化”GFP。胰岛素cDNA，SEQ NO：9，Genbank收录号为AH002844，编码SEQNO：10的胰岛素。与“人源化”GFP融合的胰岛素用作蛋白质对照，因为胰岛素与IGF-II同源，但不与IGFBP-6结合。SEQ NO：1的IGFBP-6 cDNA、SEQ NO：5的IGF-II cDNA和SEQ NO：9的胰岛素cDNA用PCR如下进行修饰。
首先，将由EcoRI片段携带的前原-IGF-II cDNA克隆进pBluescript KS(+)II载体。插入片段由T7和T3引物进行测序，确定包含已知的前原-IGF-II cDNA序列。IGF-II前体的5′端与pBluescriptKS(+)II载体中的T7启动子相连。设计IGF-II 3′引物以产生一个允许可察觉的(Notice of Allowance)限制性位点，从而去除前原-IGF-II的D和E结构域，保持“人源化”GFP的允许可察觉的片段处于IGF-II开放阅读框架中。
其次，IGF-II片段使用T7启动子引物和IGF-II 3′引物进行PCR扩增。PCR扩增的IGF-II片段由EcoR I和Not I消化，克隆入pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)，产生pCDNA-IGF-II。然后，“人源化”GFP的允许可察觉的片段插入pCDNA-IGF-II的Not I位点，产生pC-IGF-II-GFP。
包含B、C和A结构域信号肽的前体胰岛素的cDNA按照以上相应于IGF-II片段的方式进行修饰。然后将“人源化”GFP的cDNA连接到修饰的胰岛素cDNA之3′端相连，产生pC-INS-GFP。
最后，利用PCR从一个名为大鼠标记的人IGFBP6质粒中扩增IGFBP6 cDNA。IGFBP6的终止密码子被去除，其开放阅读框架符合来自pCEP4-RVC的Renilla萤光素酶cDNA的框架(Mayerhofer R，Langridge WHR，Cormier MG和Szalay AA。重组Renilla萤光素酶在转基因植物中的表达导致高水平光发射。植物杂志，1995；7；1031～8)。将Renilia萤光素酶cDNA连接到修饰的IGFBP-6 cDNA的3′末端，产生pC-IGFBP6-RUC。
所有构建体中插入DNA片段的序列通过DNA测试分析所证实。Qiagen Maxi质粒试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)用于纯化质粒DNA。
B)用磷酸钙沉淀方法将pC-IGF-II-GFP、pC-INS-GFP和pC-IGFBP6-RUC瞬时转染哺乳动物细胞：
紧接着，用克隆的融合DNA转染哺乳动物细胞。首先，COS-7细胞(非洲绿猴肾细胞，美国典型培养物保藏中心CRL 1651)在含有L-谷氨酰胺、10％胎牛血清和包含终浓度为青霉素100u/ml、链霉素100mg/ml和两性霉素B 250ng/ml(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO，美国)的抗霉菌抗生素溶液的Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM)中37℃于5％CO2条件下生长。转染前一天将每组1×106细胞铺板，转染时约有50％～60％的汇集。
每一质粒融合DNA 40mg沉淀后用Dulbecco′s磷酸缓冲盐溶液重悬，然后用标准的磷酸钙沉淀法将质粒融合DNA导入哺乳动物细胞。24小时后用荧光显微镜估计转染效率。在pC-IGF-II-GFP DNA转染细胞的平板、pC-INS-GFP DNA转染细胞的平板以及用作阳性对照的只包含GFP的质粒DNA转染的平板中每个平板的绿色荧光细胞数目相类似。
C)融合蛋白表达的证实
用DNA磷酸钙沉淀方法转染DNA 24小时以后，用荧光显微镜通过检测GFP荧光可观察到质粒DNA转染的单个COS-7细胞。pC-IGF-II-GFP和pC-INS-GFP转染的细胞显示出相类似的荧光模式，即典型的分泌蛋白质从ER向高尔基体转移。pC-IGFBP6-RUC转染的细胞不发荧光。然而，加入Coelenterazine后用低光成像系统显示pC-IGFBP 6-RUC转染的细胞发光。
进一步，预期分子量分别约为36kDa和56kDa的融合蛋白IGF-II-GFP和IGFBP6-RUC可用免疫印迹分析法检测。这样可以确证瞬时转染细胞中两种融合蛋白的存在。
D)通过分光荧光测定法检测蛋白质相互作用：
已经确证了预期融合蛋白IGF-II-GFP和IGFBP 6-RUC的存在，以及供体萤光素酶和受体荧光团的功能后，这些瞬时转染细胞的细胞提取物可用于进行基于融合蛋白Renilla萤光素酶部分和“人源化”GFP部分之间能量传递的蛋白质结合实验。钙转染48小时之后，COS细胞用PBS洗2次，然后用细胞刮刀将细胞收获于包含0.5M NaCl、1mM EDTA和0.1M磷酸钾(pH7.5)的萤光素酶分析缓冲液中。收获的细胞用Fisher 550型超声破碎仪(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，美国)以10秒间隔进行3次10秒超声，以产生细胞提取物。
接着，混合包含IGF-II-GFP和IGFBP 6-RUC的细胞提取物，立即加入0.1μg coeIenterazine。使用SPEX Fluoro Max_(仪器S.A.，Inc.，Edison，NJ)进行分光荧光测定。光谱表明在471nm处有单一发射峰，其相应于已知的Renilla萤光素酶发射谱。
在第一次分光荧光测定之后，混合物室温保存30分钟，并加入新鲜的Coelenterazine重复示踪光谱。30分钟后示踪显示在471nm和503nm处有2个最大发射峰值。细胞提取物的分光荧光测定进行更长的时间，但光谱模式不随时间发生改变。
作为对照的pC-INS-GFP和pC-IGFBP 6-RUC转染细胞的提取物混合物按类似方法制备并进行光谱示踪。示踪显示仅在471nm处有一个峰，其相应于Renilla萤光素酶的发射峰。光谱模式不随时间改变。
因此，这些数据表明IGFBP-6和IGF-II相互作用而胰岛素与IGFBP 6不发生相互作用。
除了以上公开的实施例，蛋白质一蛋白质相互作用也可以使用相应的方法在共转化的大肠杆菌和哺乳动物细胞中通过检测LRET进行检测。
尽管本发明已经相当详尽地讨论了有关的优选实施方案，其它实施方案同样可行。例如，除蛋白质以外的分子间相互作用可用相应的方法进行研究。其它分子可以靠扩散、输入和掺入或其它方式提供给活细胞。此外，基因工程化活细胞生产的融合蛋白可在研究相互作用之前进行翻译后修饰，如添加糖部分。同样，使用这些方法通过分光荧光测定法低光成像分析在细胞、集落和组织中观察活细胞。此外，可使用本发明方法结合微滴孔或多阵列检测的细胞分选术和低光成像分析，可完成高通量的集落筛选。因此，附加的权利要求的精髓和范围不应局限于这里包含的优选实施方案的描述。
                          序列表
<110>Szalay，Aladar A.
     Wang，Yubao
     Wang-Pruski，Gefu
     Loma Linda University
<120>用于研究蛋白质体内相互作用的方法
<130>11785-3PCT
<140>在此提交
<141>1999-09-02
<150>60/135,835
<151>1999-05-24
<150>60/099,068
<151>1998-09-03
<160>10
<170>PatentIn Ver.  2.0
<210>1
<211>918
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(3)..(719)
<400>1
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   Cys Pro His Arg Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu
     1               5                  10                  15
ctg ctc gct gcc agc cca gga ggc gcc ttg gcg cgg tgc cca ggc tgc    95
Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Ala Leu Ala Arg Cys Pro Gly Cys
                 20                  25                  30
ggg caa ggg gtg cag gcg ggt tgt cca ggg ggc tgc gtg gag gag gag    143
Gly Gln Gly Val Gln Ala Gly Cys Pro Gly Gly Cys Val Glu Glu Glu
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gat ggg ggg tcg cca gcc gag ggc tgc gcg gaa gct gag ggc tgt ctc    191
Asp Gly Gly Ser Pro Ala Glu Gly Cys Ala Glu Ala Glu Gly Cys Leu
         50                  55                  60
agg agg gag ggg cag gag tgc ggg gtc tac acc cct aac tgc gcc cca   239
Arg Arg Glu Gly Gln Glu Cys Gly Val Tyr Thr Pro Asn Cys Ala Pro
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gga ctg cag tgc cat ccg ccc aag gac gac gag gcg cct ttg cgg gcg   287
Gly Leu Gln Cys His Pro Pro Lys Aap Asp Glu Ala Pro Leu Arg Ala
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gca gag gag aat oct aag gag agt aaa ccc caa gca ggc act gcc cgc   383
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            115                 120                 125
cca cag gat gtg aac cgc aga gac caa cag agg aat cca ggc acc tct   431
Pro Gln Asp Val Asn Arg Arg Asp Gln Gln Arg Asn Pro Gly Thr Ser
        130                 135                 140
acc acg ccc tcc cag ccc aat tct gcg ggt gtc caa gac act gag atg    479
Thr Thr Pro Ser Gln Pro Asn Ser Ala Gly Val Gln Asp Thr Glu Met
    145                 150                 155
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Gly Pro Cys Arg Arg His Leu Asp Ser Val Leu Gln Gln Leu Gln Thr
160                 165                 170                 175
gag gtc tac cga ggg gct caa aca ctc tac gtg ccc aat tgt gac cat    575
Glu Val Tyr Arg Gly Ala Gln Thr Leu Tyr Val Pro Asn Cys Asp His
                180                 185                 190
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<210>2
<211>239
<212>PRT
<213>人
<400>2
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  1               5                  10                  15
Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Ala Leu Ala Arg Cys Pro Gly Cys Gly
             20                  25                  30
Gln Gly Val Gln Ala Gly Cys Pro Gly Gly Cys Val Glu Glu Glu Asp
         35                  40                  45
Gly Gly Ser Pro Ala Glu Gly Cys Ala Glu Ala Glu Gly Cys Leu Arg
     50                  55                  60
Arg Glu Gly Gln Glu Cys Gly Val Tyr Thr Pro Asn Cys Ala Pro Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Cys His Pro Pro Lys Asp Asp Glu Ala Pro Leu Arg Ala Leu
                 85                  90                  95
Leu Leu Gly Arg Gly Arg Cys Leu Pro Ala Arg Ala Pro Ala Val Ala
            100                 105                 110
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Gln Asp Val Asn Arg Arg Asp Gln Gln Arg Asn Pro Gly Thr Ser Thr
    130                 135                 140
Thr Pro Ser Gln Pro Asn Ser Ala Gly Val Gln Asp Thr Glu Met Gly
145                 150                 155                 160
Pro Cys Arg Arg His Leu Asp Ser Val Leu Gln Gln Leu Gln Thr Glu
                165                 170                 175
Val Tyr Arg Gly Ala Gln Thr Leu Tyr Val Pro Asn Cys Asp His Arg
            180                 185                 190
Gly Phe Tyr Arg Lys Arg Gln Cys Arg Ser Ser Gln Gly Gln Arg Arg
        195                 200                 205
Gly Pro Cys Trp Cys Val Asp Arg Met Gly Lys Ser Leu Pro Gly Ser
    210                 215                 220
Pro Asp Gly Asn Gly Ser Ser SerCys Pro Thr Gly Ser Ser Gly
225                 230                235
<210>3
<211>1196
<212>DNA
<213>Renilla reniformis
<220>
<221>CDS
<222>(10)..(945)
<400>3
agcttaaag atg act tcg aaa gtt tat gat cca gaa caa agg aaa cgg atg  51
          Met Thr Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met
            1               5                  10
ata act ggt ccg cag tgg tgg gcc aga tgt aaa caa atg aat gtt ctt    99
Ile Thr Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu
 15                  20                  25                  30
gat tca ttt att aat tat tat gat tca gaa aaa cat gca gaa aat gct    147
Asp Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala
                 35                  40                  45
gtt att ttt tta cat ggt aac gcg gcc tct tct tat tta tgg cga cat    195
Val Ile Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His
             50                  55                  60
gtt gtg cca cat att gag cca gta gcg cgg tgt att ata cca gat ctt   243
Val Val Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu
         65                  70                  75
att ggt atg ggc aaa tca ggc aaa tct ggt aat ggt tct tat agg tta   291
Ile Gly Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu
     80                  85                  90
ctt gat cat tac aaa tat ctt act gca tgg ttt gaa ctt ctt aat tta   339
Leu Asp His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu
 95                 100                 105                 110
cca aag aag atc att ttt gtc ggc cat gat tgg ggt gct tgt ttg gca    387
Pro Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala
                115                 120                 125
ttt cat tat agc tat gag cat caa gat aag atc aaa gca ata gtt cac    435
Phe His Tyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His
            130                 135                 140
gct gaa agt gta gta gat gtg att gaa tca tgg gat gaa tgg cct gat    483
Ala Glu Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp
        145                 150                 155
att gaa gaa gat att gcg ttg atc aaa tct gaa gaa gga gaa aaa atg    531
Ile Glu Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met
    160                 165                 170
gtt ttg gag aat aac ttc ttc gtg gaa acc atg ttg cca tca aaa atc    579
Val Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile
175                 180                 185                 190
atg aga aag tta gaa cca gaa gaa ttt gca gca tat ctt gaa cca ttc    627
Met Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe
                195                 200                 205
aaa gag aaa ggt gaa gtt cgt cgt cca aca tta tca tgg cct cgt gaa    675
Lys Glu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu
            210                 215                 220
atc ccg tta gta aaa ggt ggt aaa cct gac gtt gta caa att gtt agg    723
Ile Pro Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg
        225                 230                 235
aat tat aat gct tat cta cgt gca agt gat gat tta cca aaa atg ttt    771
Asn Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe
    240                 245                 250
att gaa tcg gat cca gga ttc ttt tcc aat gct att gtt gaa ggc gcc    819
Ile Glu Ser ASp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala
255                 260                 265                 270
aag aag ttt cct aat act gaa ttt gtc aaa gta aaa ggt ctt cat ttt    867
Lys Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe
                275                 280                 285
tcg caa gaa gat gca cct gat gaa atg gga aaa tat atc aaa tcg ttc    915
Ser Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe
            290                 295                 300
gtt gag cga gtt ctc aaa aat gaa caa taa ttactttggt tttttattta      965
Val Glu Arg Val Leu Lya Asn Glu Gln
        305                 310
catttttccc gggtttaata atataaatgt cattttcaac aattttattt taactgaata  1025
tttcacaggg aacattcata tatgttgatt aatttagctc gaactttact ctgtcatatc  1085
attttggaat attacctctt tcaatgaaac tttataaaca gtggttcaat taattaatat  1145
atattataat tacatttgtt atgtaataaa ctcggtttta ttataaaaaa a           1196
<210>4
<211>311
<212>PRT
<213>Renilla reniformis
<400>4
Met Thr Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr
  1               5                  10                  15
Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser
             20                  25                  30
Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile
         35                  40                  45
Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val
     50                  55                  60
Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly
 65                  70                  75                  80
Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp
                 85                  90                  95
His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys
            100                 105                 110
Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe His
        115                 120                 125
Tyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His Ala Glu
    130                 135                 140
Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu
145                 150                 155                 160
Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu
                165                 170                 175
Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg
            180                 185                 190
Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu
        195                 200                 205
Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro
    210                 215                 220
Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr
225                 230                 235                 240
Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu
                245                 250                 255
Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys
            260                 265                 270
Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Ser Gln
        275                 280                 285
Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu
    290                 295                 300
Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
305                 310
<210>5
<211>543
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(543)
<400>5
atg gga atc cca atg ggg aag tcg atg ctg gtg ctt ctc acc ttc ttg    48
Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu
  1               5                  10                      15
gcc ttc gcc tcg tgc tgc att gct gct tac cgc ccc agt gag acc ctg    96
Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu
             20                  25                  30
tgc ggc ggg gag ctg gtg gac acc ctc cag ttc gtc tgt ggg gac cgc    144
Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg
         35                  40                  45
ggc ttc tac ttc agc agg ccc gca agc cgt gtg agc cgt cgc agc cgt   192
Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg
     50                  55                  60
ggc atc gtt gag gag tgc tgt ttc cgc agc tgt gac ctg gcc ctc ctg   240
Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu
 65                  70                  75                  80
gag acg tac tgt gct acc ccc gcc aag tcc gag agg gac gtg tcg acc   288
Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu Arg Asp Val Ser Thr
                 85                  90                  95
cct ccg acc gtg ctt ccg gac aac ttc ccc aga tac ccc gtg ggc aag  336
Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys
            100                 105                 110
ttc ttc caa tat gac acc tgg aag cag tcc acc cag cgc ctg cgc agg   384
Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leu Arg Arg
        115                 120                 125
ggc ctg cct gcc ctc ctg cgt gcc cgc cgg ggt cac gtg ctc gcc aag   432
Gly Leu Pro Ala Leu Leu Arg Ala Arg Arg Gly His Val Leu Ala Lys
    130                 135                 140
gag ctc gag gcg ttc agg gag gcc aaa cgt cac cgt ccc ctg att gct   480
Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Ala Lys Arg His Arg Pro Leu Ile Ala
145                 150                 155                 160cta ccc acc caa gac ccc gcc cac ggg ggc gcc ccc cca gag atg gcc   528
Leu Pro Thr Gln Asp Pro Ala His Gly Gly Ala Pro Pro Glu Met Ala
                165                 170                 175
agc aat cgg aag tga                                               543
Ser Asn Arg Lys
            180
<210>6
<211>180
<212>PRT
<213>人
<400>6
Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu
  1              5                  10                  15
Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu
             20                  25                  30
Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg
         35                  40                  45
Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg
     50                  55                  60
Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu
 65                  70                  75                  80
Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu Arg Asp Val Ser Thr
                 85                  90                  95
Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys
            100                 105                 110
Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leu Arg Arg
        115                 120                 125
Gly Leu Pro Ala Leu Leu Arg Ala Arg Arg Gly His Val Leu Ala Lys
    130                 135                 140
Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Ala Lys Arg His Arg Pro Leu Ile Ala
145                 150                 155                 160
Leu Pro Thr Gln Asp Pro Ala His Gly Gly Ala Pro Pro Glu Met Ala
                165                 170                 175
Ser Asn Arg Lys
            180
<210>7
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(717)
<223>人工序列描述：人源化绿色荧光蛋白质cDNA
<400>7
atg agc aag ggc gag gaa ctg ttc act ggc gtg gtc cca att ctc gtg   48
Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
  1               5                  10                  15
gaa ctg gat ggc gat gtg aat ggg cac aaa ttt tct gtc agc gga gag   96
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
             20                  25                  30
ggt gaa ggt gat gcc aca tac gga aag ctc acc ctg aaa ttc atc tgc    144
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
         35                  40                  45
acc act gga aag ctc cct gtg cca tgg cca aca ctg gtc act acc ttc   192
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe
     50                  55                  60
tct tat ggc gtg cag tgc ttt tcc aga tac cca gac cat atg aag cag   240
Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
 65                  70                  75                  80
cat gac ttt ttc aag agc gcc atg ccc gag ggc tat gtg cag gag aga    288
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
                 85                  90                  95
acc atc ttt ttc aaa gat gac ggg aac tac aag acc cgc gct gaa gtc    336
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
            100                 105                 110
aag ttc gaa ggt gac acc ctg gtg aat aga atc gag ctg aag ggc att    384
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
        115                 120                 125
gac ttt aag gag gat gga aac att ctc ggc cac aag ctg gaa tac aac   432
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
    130                 135                 140
tat aac tcc cac aat gtg tac atc atg gcc gac aag caa aag aat ggc   480
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145                 150                 155                 160
atc aag gtc aac ttc aag atc aga cac aac att gag gat gga tcc gtg   528
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
                165                 170                 175
cag ctg gcc gac cat tat caa cag aac act cca atc ggc gac ggc cct   576
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Tle Gly Asp Gly Pro
            180                 185                 190
gtg ctc ctc cca gac aac cat tac ctg tcc acc cag tct gcc ctg tct   624
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
        195                 200                 205
aaa gat ccc aac gaa aag aga gac cac atg gtc ctg ctg gag ttt gtg   672
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp Eis Met Val Leu Leu Glu Phe Val
    210                 215                 220
acc gct gct ggg atc aca cat ggc atg gac gag ctg tac aag tga       717
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225                 230                 235
<210>8
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
  1               5                  10                  15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
             20                  25                  30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
         35                  40                  45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe
     50                  55                   60
Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
 65                  70                  75                  80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
                 85                  90                  95
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
            100                 105                 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
        115                 120                 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
    130                 135                 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145                 150                 155                 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
                165                 170                 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
            180                 185                 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
        195                 200                 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
    210                 215                 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225                 230                 235
<210>9
<211>333
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(333)
<400>9
atg gcc ctg tgg atg cgc ctc ctg ccc ctg ctg gcg ctg ctg gcc ctc   48
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
  1               5                  10                  15
tgg gga cct gac cca gcc gca gcc ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc   96
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
             20                  25                  30
tca cac ctg gtg gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc ttc   144
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
         35                  40                  45
ttc tac aca ccc aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg ggg   192
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
     50                  55                  60
cag gtg gag ctg ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc ttg   240
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
 65                  70                  75                  80
gcc ctg gag ggg tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc tgt    288
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
                 85                  90                  95
acc agc atc tgc tcc ctc tac cag ctg gag aac tac tgc aac tag        333
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Aan Tyr Cys Asn
            100                 105                 110
<210>10
<211>110
<212>PRT
<213>人
<400>10
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
  1               5                  10                  15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
             20                  25                  30
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
         35                  40                  45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
     50                  55                  60
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
 65                  70                  75                  80
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
                 85                  90                  95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
            100                 105                 110

Claims (24)

1.一种测定活细胞内第一种蛋白质和第二种蛋白质是否相互作用的方法，方法包括：
a)在细胞内提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质；
b)在细胞内放置复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质使之相互靠近；和
c)检测来自受体荧光团的任何荧光；
当第一种蛋白质靠近第二种蛋白质时，供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团；以及
供体萤光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出荧光，则表明第一种蛋白质与第二种蛋白质已经发生了相互作用。
2.权利要求1的方法，其中提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA以及将基因工程化的DNA转入活细胞，这引起细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。
3.权利要求1的方法，其中提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
4.权利要求1的方法，其中提供了与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
5.权利要求1的方法，其中所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。
6.权利要求1的方法，其中所提供的受体荧光团为绿色荧光蛋白质。
7.权利要求1的方法，其中所提供的受体荧光团为水母绿色荧光蛋白质。
8.权利要求1的方法，其中采用分光荧光测定法检测来自供体萤光素酶的任何荧光。
9.一种测定第一种蛋白质和第二种蛋白质是否相互作用的方法，方法包括：
a)提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质；
b)将复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质相互靠近；和
c)检测来自受体荧光团的任何荧光；
当第一种蛋白质靠近第二种蛋白质时，供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团；以及
供体萤光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出荧光，则表明第一种蛋白质与第二种蛋白质已经发生了相互作用。
10.权利要求9的方法，其中提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA以及将基因工程化的DNA导入活细胞，这引起细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质以及与受体荧光团复合的第二种蛋白质。
11.权利要求10的方法，其中提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
12.权利要求10的方法，其中提供了与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
13.权利要求9的方法，其中所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。
14.权利要求9的方法，其中所提供的受体荧光团为绿色荧光蛋白质。
15.权利要求9的方法，其中所提供的受体荧光团为水母绿色荧光蛋白质。
16.权利要求9的方法，其中使用分光荧光测定法检测来自供体萤光素酶的任何荧光。
17.一种胞外测定第一种分子和第二种分子是否相互作用的方法，方法包括：
a)提供与供体萤光素酶复合的第一种分子和与受体荧光团复合的第二种分子；
b)将复合的第一种分子和第二种分子相互靠近；和
c)检测来自受体荧光团的任何荧光；
当第一种分子与第二种分子靠近时，供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团；和
供体萤光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出荧光，则表明第一种分子和第二种分子已经发生了相互作用。
18.权利要求17的方法，其中第一种分子为第一种蛋白质而第二种分子为第二种蛋白质；以及
其中提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA和将基因工程化的DNA转入活细胞，这引起细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。
19.权利要求18的方法，其中提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
20.权利要求18的方法，其中提供了与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
21.权利要求17的方法，其中所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。
22.权利要求17的方法，其中所提供的受体荧光团为绿色荧光蛋白质。
23.权利要求17的方法，其中所提供的受体荧光团为水母绿色荧光蛋白质。
24.权利要求17的方法，其中采用分光荧光测定法检测来自供体萤光素酶的荧光。
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