CN102798717B - 一种o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，即首次采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性：将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0~40℃孵育30~60min，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0~40℃孵育30~60min，然后再加入荧光素底物，4~30℃下静置5~30min，检测670nm处的发光强度，进而计算获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；本发明方法操作简便，应用范围广，避免了外源激发光所引起的散射和样品基质荧光等本底的干扰，具有更高的灵敏度和准确度。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，特别涉及采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的方法。
(二)背景技术
烷化剂是最大一类抗肿瘤药物，临床上常用的例子有环磷酰胺、尼莫司汀、卡巴嗪、硝卡芥、氮芥和替莫唑胺等，广泛用于治疗脑、头颈、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等恶性肿瘤。烷化剂药物对肿瘤细胞的杀伤主要是通过对DNA分子的鸟嘌呤O6位上的烷基化而实现的，而O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-Methylguanine DNA-Methyltransferase,MGMT)的存在能够去除这种烷基加合物，使肿瘤细胞和正常细胞得以生存而产生所谓的耐药性，是哺乳动物细胞修复烷化剂所造成DNA损伤的一个重要环节。其作用机理是：将烷基加合物从O6-鸟嘌呤的O6位转移到自身半胱氨酸残基上，使DNA链上的鸟嘌呤复原，同时自身不可逆的失活，以此方式来实现修复。如果肿瘤细胞中的MGMT水平过高可能会导致耐药，而对于正细胞却可能减少其化疗的毒副作用。如何控制MGMT水平以达到最佳的化疗效果是如今MGMT研究的热点。而且，MGMT在预测肿瘤化疗的效果以及制订个体化治疗方案的潜在价值已被大量实例研究所证实并被医学界广泛认可。因此，如何灵敏、准确地检测MGMT在细胞中的含量，对提高化疗效果以及减少药物毒副作用有着重要的意义。
目前还没有一种简易可靠、可应用于常规临床检验的方法来测定MGMT的活性。大量文献描述MGMT基因启动子甲基化以及MGMT蛋 白表达的免疫测定，并试图建立这些分子生物学和血清学指标与肿瘤耐药性、生存率以及个体化治疗方案的相关性，但这些烦琐而且不稳定的检测方法不适合在临床上常规使用，而且它们不直接测定MGMT的酶学活性可能会引入各种与肿瘤耐药机制无关的干扰因素。而基于同位素标记底物的MGMT活性测定法只适用于实验室研究，而难以被用于常规临床检验中。此外，这种方法所用的蛋白沉淀步骤容易引入诸如黑色素(Melanin)等蛋白的非特异结合所引起的假阳性。也有人用非同位素标记的底物和酶联免疫分析方法来测定MGMT活性，但这个方法所需的多步而费时的固相分离和反应从临床应用和检测效率(灵敏度)的角度来看是个明显的缺点。
上世纪末Xu Y.等人发现，荧光素酶(Luciferase)和荧光素反应所产生的生物发光可以转移并激发与之靠近的荧光色团，这就是所谓的生物发光共振能量转移(Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET)现象。如果将荧光素酶和荧光色团分别标记在有亲和力的两个生物分子上，那么这对分子的结合就可以通过因这种结合所带来的BRET所表示出来。这种BRET技术具有匀相检测(即不需要分离)以及无激发本底两个优点，且具备操作简便和高灵敏度两大方法学优势，很快就在研究蛋白质相互作用以及亲合结合分析方面得到了广泛的应用。尽管这样，到目前为止还没有应用BRET来测定MGMT活性的报道。
本发明结合化学发光技术，首次提出采用BRET的方法测定O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性，该方法利用BRET技术和化学发光技术的优势来解决临床常规MGMT活性测定难题，将为个体化的肿瘤治疗的现代临床实践提供技术支撑。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测 方法，该方法为操作简便、特异性好和灵敏度高的匀相MGMT活性测定方法。
本发明采用的技术方案是：
一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，所述方法为：(1)将待测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤反应，获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，所述生物素为维生素H；
(2)将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0～40℃孵育30～60min，使链亲和素-荧光素酶融合蛋白中的链亲和素与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶中的生物素结合，形成O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0～40℃孵育30～60min，使荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物一端的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶结合，形成荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体-O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，然后再加入荧光素底物，4～30℃下静置5～30min，使荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物中的荧光素酶融合蛋白与荧光素底物反应产生发光物质，并检测670nm处的发光强度，根据生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，进而根据公式(1)计算O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的定义为：在37℃条件下，1min内能转化生物素标记的 O6-苄基鸟嘌呤生成1微摩尔的生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶所需的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)酶量为一个酶活单位(U)。
公式(1)：z＝[(y-b)/aMt]×106
其中y＝ax+b(y中的a和b分别与公式(1)中a和b相同)：a和b均为常数项(根据标准曲线确定)，x为生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，y为吸光值，z为O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性，M为生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶分子量，t为反应时间。
进一步，步骤(1)所述生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的生物素标记方法为：将O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤混合，充分混匀后0～40℃水浴0.5～4h(优选37℃下水浴4h)，反应结束后，将反应液加入14KD的透析袋，用pH为6.4的TBS缓冲溶液为透析液在4℃下透析，每隔3～5h更换一次透析液，总共更换三次，然后将截留液用凝胶琼脂分子筛过滤，取滤液，即获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；所述凝胶琼脂分子筛为下列之一：交联琼脂糖凝胶CL-6B、交联琼脂糖凝胶CL-4B、琼脂糖凝胶-6B或琼脂糖凝胶-4B，更优选交联琼脂糖凝胶CL-6B(美国Invitrogen公司)。
进一步，步骤(2)具体为：用链亲和素-荧光素酶融合蛋白包被微孔板，再将生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶加入包被后的微孔板中，封闭反应孔，0～40℃下孵育30～60min，用pH为6～7的TBS缓冲溶液洗板，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体与pH为6～7的TBS缓冲溶液的混合液，0～40℃下孵育30～60min，用pH为6～7的TBS缓冲溶液洗板，最后向微孔板中加入0.1～0.5mol/L的荧光素底物缓冲溶液，4～30℃下静置5～30min，检测670nm处(荧 光染料Cy6的吸收波长)的发光强度，根据生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，进而获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的活性；所述荧光素底物缓冲溶液为荧光素底物溶于pH为6～7的TBS缓冲溶液制成的0.1～0.5mol/L的荧光素底物缓冲溶液；所述荧光染料为常用荧光染料Cy5、荧光染料Cy6或荧光染料Cy7，所述荧光素底物为与荧光素酶融合蛋白相对应的化学发光底物，优选萤火虫荧光素、腔肠荧光素或碱性磷酸酶发光底物(AMPPD)。
更进一步，所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法推荐按如下步骤进行：
(1)标记：将1～5mg/ml O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的TBS缓冲溶液与2～10mg/ml生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤的TBS缓冲溶液以体积比4:1充分混匀后，在0～40℃下水浴0.5～4h，反应结束后，将反应液加入14KD的透析袋中，用pH为6.4的TBS缓冲溶液为透析液在4℃下透析，每隔3～5h更换一次透析液，总共更换三次，然后取截留液用凝胶琼脂分子筛过滤，取滤液在4℃冷冻干燥10h，即获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；所述凝胶琼脂分子筛为下列之一：交联琼脂糖凝胶CL-6B、交联琼脂糖凝胶CL-4B、琼脂糖凝胶-6B或琼脂糖凝胶-4B；
(2)包被：将链亲和素-荧光素酶融合蛋白用pH为6.0～7.0的TBS缓冲溶液配置成1mg/mL的包被液，并加入96孔白底透的聚苯乙烯微孔板中，每孔200μl，0～40℃放置30～60min，弃包被液，每孔加入质量浓度5～20％牛血清蛋白的TBS缓冲溶液作封闭液，每孔200μl，0～40℃封闭1h，用pH为6.0～7.0的TBS缓冲液洗涤微孔板，4～30℃下真空干燥后，放入封闭袋中真空保存，获得包被链亲和素-荧光素酶融合蛋 白的微孔板；
(3)加样：将步骤(1)制备的生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶加入步骤(2)中获得的包被链亲和素-荧光素酶融合蛋白的微孔板中，每孔加入50～200μl，用96孔板封板膜封住反应孔，0～40℃孵育30～60min后，用pH为6.0～7.0TBS缓冲溶液洗板；所述封板膜为常规96孔板封板膜(可从上海生工生物购得)；
(4)加标记抗体：用pH为6.0～7.0的TBS缓冲溶液配置1～5mg/mL荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体缓冲溶液，分别加入步骤(3)加样后的微孔板中，每孔加入50～200μl，0～40℃孵育30～60min后，用pH为6.0～7.0的TBS缓冲溶液洗板，获得加标记抗体后的微孔板；
(5)检测：在步骤(4)的加标记抗体后的微孔板中加入0.1～0.5mol/L荧光素底物的TBS缓冲溶液，每孔加入50～200μl，4～30℃下静置5～20min，在微孔板检测仪上检测670nm处的发光强度，根据生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与发光强度的标准曲线获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度，进而根据公式(1)获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的活性；所述荧光素底物为萤火虫荧光素、腔肠荧光素或碱性磷酸酶发光底物(即3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD)。
本发明所述的待测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶来源于临床肿瘤组织。本发明所述的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品购自上海志研生物科技有限公司(100u/mg)。
所述荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体购自美国Invitrogen公司。
所述生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤购自美国Invitrogen公司。
本发明所述链亲和素—荧光素酶融合蛋白的制备参照文献(Nakamura M.等，2004)，采用基因合成的方法获得链亲和素—荧光素酶融合蛋白基因，然后将该基因引入大肠杆菌(E.coli BL21)表达菌株中表达，培养，破碎，分离纯化出链亲和素—荧光素酶融合蛋白，最后分装冻存于-80℃，待用。
本发明采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性，其原理为：链亲和素-荧光素酶融合蛋白(Streptavidin-Luciferase,SA-Luc)以及荧光染料(Cy6)标记的MGMT抗体分别与生物素标记的MGMT结合，以MGMT为桥梁把荧光素酶和荧光染料拉近到以内；然后加入荧光素底物启动荧光素酶生物发光以及发生到荧光染料的共振能量转移。检测荧光染料所发的光，将光的强度与样品中MGMT的浓度直接相关，进而计算出MGMT的活性。因此，可根据光的强弱进行定量分析，该方法的基本原理如图1所示。
由于游离的荧光素酶和荧光染料之间的距离在以上，只有结合在MGMT上的这对分子(荧光素酶和荧光染料)才可能发生能量转移，也就是说，在不需要分离游离试剂的情况下，通过测量述荧光素酶和荧光染料的能量转移下荧光染料的发光强度就可以得到与MGMT浓度相关的定量指标，因此可以根据纯品MGMT浓度和能量转移关系的标准曲线来检测各种场合下MGMT浓度，进而获得MGMT的酶活。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明方法操作简便，应用范围广，不需要单独分离出O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，且适于检测各种场合下O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度；(2)本发明避免了外源激发光所引起的散射和样品基质荧光等本底的干扰，具有更高的灵敏度和准确度；(3)本发明为匀相分析方法，不需要分离和同位素标记，因此十分有利于高通量的自动化检测；(4)本发明方法不仅具 有免疫反应的特异性，而且具备化学发光反应的高灵敏性；(5)本发明恰到好处地利用BRET的技术优势来解决临床常规MGMT活性测定难题，将为个体化的肿瘤治疗的现代临床实践提供技术支撑。
(四)附图说明
图1检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的原理图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述链亲和素—萤火虫荧光素酶融合蛋白的制备参照文献(Nakamura M.等，2004)，利用NCBI查找相关的基因序列，获得链亲和素—萤火虫荧光素酶融合蛋白基因，通过上海捷瑞生物公司合成整个融合基因，然后将该融合基因构建到pET-24a(+)载体中，导入实验室现有的E.coli BL21表达菌株中进行表达，培养，破碎，分离纯化出链亲和素—萤火虫荧光素酶融合蛋白，最后分装冻存于-80℃，待用。
实施例1 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的生物素标记
在4ml含4mg待测MGMT(取自肿瘤细胞)的TBS缓冲溶液(pH为6.4)中加入1ml含2mg生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤的TBS缓冲溶液(pH为6.4)，充分混匀后37℃下水浴4h，反应结束后，将反应液加入14KD的透析袋中，用pH为6.4的TBS缓冲溶液为透析液在4℃下透析，每隔3h更换一次透析液，总共更换三次，然后将截留液用交联琼脂糖凝胶CL-6B过滤，取滤液，4℃冷冻干燥10h，获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶。
实施例2 检测MGMT活性
(1)包被：将链亲和素-萤火虫荧光素酶融合蛋白用pH为6.4的0.1mol/L TBS缓冲溶液配置成1mg/mL的包被液50ml。将包被液加入96 孔白底透的聚苯乙烯微孔板的加样孔中，每孔200μl，37℃放置60min，弃包被液，每孔加入200μl质量浓度10％牛血清蛋白(BSA)的上述TBS缓冲溶液作封闭液，37℃封闭1h，用上述TBS缓冲溶液洗板，每次浸泡3min，洗板3次，30℃下真空干燥后，放入封闭袋中真空保存，制得包被链亲和素-萤火虫荧光素酶融合蛋白的微孔板；
(2)加样：将步骤(1)中制备的包被链亲和素-萤火虫荧光素酶融合蛋白的微孔板的加样孔中分别加入实施例1制备的浓度为1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.4、0ng/mL和未知浓度(待测样品，取自肿瘤组织样品)的生物素标记的MGMT的TBS缓冲溶液(pH为6.4)200μl，用常规的96孔板封板膜(上海生工)封住反应孔，37℃孵育30min，用pH为6.4的0.1mol/L TBS缓冲溶液洗板，每次浸泡3min，洗板3次；
(3)加标记抗体：用pH为6.4的0.1mol/L TBS缓冲溶液配置1mg/mL荧光染料Cy6标记的MGMT抗体缓冲溶液(购自美国Invitrogen公司)，分别吸取200μl上述抗体溶液加入步骤(2)微孔板的相应加样孔中，37℃孵育30min，用pH为6.4的0.1mol/L TBS缓冲溶液洗涤，每次浸泡3min，洗板3次，获得加样后的微孔板；
(4)检测：在步骤(3)微孔板的相应加样孔中加入新配置的0.1mol/L萤火虫荧光素的TBS缓冲溶液，20℃下静置10min，在微孔板检测仪(DTX880、BECKMAN COULTER)上检测670nm处的发光强度，以0ng/mL的生物素标记的MGMT的TBS缓冲溶液为对照，以发光强度为纵坐标，MGMT浓度(1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.4ng/mL的生物素标记的MGMT的TBS缓冲溶液)为横坐标，绘制标准曲线，从而确定待测样品中生物素标记的MGMT浓度，进而根据公式(1)计算出待测样品中MGMT的酶活。
公式(1)为z＝[(y-b)/aMt]×106
其中y＝ax+b(a和b与公式(1)中a和b分别相同)：a和b均为常数项，x为生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，y为吸光值，z为O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性，M为生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶分子量，t为反应时间。
实施例3 检测MGMT活性
(1)包被：将链亲和素-碱性磷酸酶融合蛋白用pH为6.4的0.5mol/L TBS缓冲液配置3mg/mL的包被液50ml。将包被液加入96孔白底透的聚苯乙烯微孔板的加样孔中，每孔200μl，25℃放置1h，弃包被液，每孔再加入200μl质量浓度5％牛血清蛋白(BSA)的上述TBS缓冲液作封闭液，37℃封闭1h，用上述TBS缓冲液洗涤，每次浸泡3min，洗板3次，25℃下真空干燥后，放入封闭袋中真空保存，制得链亲和素-碱性磷酸酶融合蛋白；
(2)加样：在步骤(1)中制备的包被链亲和素-碱性磷酸酶融合蛋白的微孔板的加样孔中分别加入浓度为1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.4、0ng/mL和未知浓度(待测样品，取自肿瘤组织样品)的实施例1方法制备的生物素标记的MGMT的TBS缓冲溶液(pH为6.4)50μl，用常规96孔封板膜封住反应孔，37℃孵育1h，用pH为6.4的0.5mol/L TBS缓冲溶液洗板，每次浸泡3min，洗板3次，制成加样后的微孔板；
(3)加标记抗体：用pH＝6.4的0.5mol/L TBS缓冲液配置3mg/mL荧光染料Cy6标记的MGMT抗体缓冲溶液，分别吸取200μl该标记抗体缓冲溶液加入步骤(2)加样后微孔板的相应加样孔中，37℃孵育1h，用pH为6.4、0.5mol/L TBS缓冲液洗板，每次浸泡3min，洗板3次，获得标记抗体后的微孔板；
(4)检测：在步骤(3)标记抗体后微孔板的相应加样孔中加入新配置的 0.5mol/L3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷(AMPPD)，20℃下静置30min，在微孔板检测仪上检测670nm处的发光强度，以0ng/mL生物素标记的MGMT的TBS缓冲溶液为对照，以发光强度为纵坐标，MGMT浓度(1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.4ng/mL生物素标记的MGMT的TBS缓冲溶液)为横坐标，绘制标准曲线，从而确定待测样品中MGMT浓度，进而根据公式(1)(同实施例2)计算出待测样品中MGMT的酶活。
Claims (6)
1.一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于所述方法为：(1)将O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤反应，获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；(2)将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0～40℃孵育30～60min，使链亲和素-荧光素酶融合蛋白中的链亲和素与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶中的生物素结合，形成O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0～40℃孵育30～60min，使荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物一端的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶结合，形成荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体-O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，然后再加入荧光素底物，4～30℃下静置5～30min，使荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体-O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物中的荧光素酶融合蛋白与荧光素底物反应产生发光物质，检测670nm处的发光强度，根据生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，进而根据酶活定义获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的定义为：在37℃条件下，1min内能转化生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤生成1微摩尔的生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶所需的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶酶量为一个酶活单位。
2.如权利要求1所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于步骤(1)所述生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的生物素标记方法为：将O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤混合，充分混匀后0～40℃下水浴0.5～4h，反应结束后，将反应液加入14KD的透析袋中，用pH为6.4的TBS缓冲溶液为透析液在4℃下透析，然后将截留液用凝胶琼脂分子筛过滤，取滤液，即获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶。
3.如权利要求2所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于所述的透析每隔3～5h更换一次透析液，总共更换三次。
4.如权利要求1所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于步骤(2)所述荧光素底物为与荧光素酶相对应的化学发光底物。
5.如权利要求1所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于步骤(2)具体为：用链亲和素-荧光素酶融合蛋白包被微孔板，再将生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶加入包被后的微孔板中，封闭反应孔，0～40℃下孵育30～60min，用pH为6～7的TBS缓冲溶液洗板，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体与pH为6～7的TBS缓冲溶液的混合液，0～40℃下孵育30～60min，用pH为6～7的TBS缓冲溶液洗板，最后向微孔板中加入0.1～0.5mol/L的荧光素底物缓冲溶液，4～30℃下静置5～30min，检测670nm处的发光强度，根据生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，进而获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的活性；所述荧光素底物缓冲溶液为荧光素底物溶于pH为6～7的TBS缓冲溶液制成的0.1～0.5mol/L的荧光素底物缓冲溶液；所述荧光染料为荧光染料Cy5、荧光染料Cy6或荧光染料Cy7，所述荧光素底物为萤火虫荧光素或腔肠荧光素。
6.如权利要求1所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：
(1)标记：将1～5mg/ml O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的TBS缓冲溶液与2～10mg/ml生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤的TBS缓冲溶液以体积比4:1充分混匀后，在0～40℃下水浴0.5～4h，反应结束后，将反应液加入14KD的透析袋中，用pH为6.4的TBS缓冲溶液在4℃下透析，每隔3～5h更换一次透析液，总共更换三次，然后取截留液用凝胶琼脂分子筛过滤，取滤液在4℃冷冻干燥10h，即获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；所述凝胶琼脂分子筛为下列之一：交联琼脂糖凝胶CL-6B、交联琼脂糖凝胶CL-4B、琼脂糖凝胶-6B或琼脂糖凝胶-4B；
(2)包被：将链亲和素-荧光素酶融合蛋白用pH为6.0～7.0的TBS缓冲溶液配置成1mg/mL的包被液，并加入96孔白底透的聚苯乙烯微孔板中，每孔200μl，0～40℃放置30～60min，弃包被液，每孔加入质量浓度5～20％牛血清蛋白的TBS缓冲溶液作封闭液，每孔200μl，0～40℃封闭1h，用pH为6.0～7.0的TBS缓冲液洗涤微孔板，4～30℃下真空干燥后，获得包被链亲和素-荧光素酶融合蛋白的微孔板；
(3)加样：将步骤(1)制备的生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶加入步骤(2)中获得的包被链亲和素-荧光素酶融合蛋白的微孔板中，每孔加入50～200μl，用96孔板封板膜封住反应孔，0～40℃孵育30～60min后，用pH为6.0～7.0TBS缓冲溶液洗板，获得加样后的微孔板；
(4)加标记抗体：用pH为6.0～7.0的TBS缓冲溶液配置1～5mg/mL荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体缓冲溶液，分别加入步骤(3)加样后的微孔板中，每孔加入50～200μl，0～40℃孵育30～60min后，用pH为6.0～7.0的TBS缓冲溶液洗板，获得加标记抗体后的微孔板；
(5)检测：在步骤(4)加标记抗体后的微孔板中加入0.1～0.5mol/L荧光素底物的TBS缓冲溶液，每孔加入50～200μl，4～30℃下静置5～20min，在微孔板检测仪上检测670nm处的发光强度，根据生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与发光强度的标准曲线获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度，进而根据公式(1)获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的活性；所述荧光素底物为萤火虫荧光素或腔肠荧光素。
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