CN1703520A - 检测和定量dna结合蛋白质的快速且敏感的以距离效应为基础的测定法 - Google Patents

检测和定量dna结合蛋白质的快速且敏感的以距离效应为基础的测定法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种以检测冷光或荧光信号变化为基础来确定任何一个乃至所有DNA结合因子、蛋白质或其片段的活性的方法。优选的是，将荧光供体附在一个含有DNA结合元件其中一部分的核酸上，并将荧光受体附在一个含有相同A结合元件其它部分的核酸上。或者，将一个微球体附在一个含有结合元件其中一部分的核酸上，并将一个冷光团或者荧光染料附在一个含有相同结合元件其它部分的核酸上。DNA结合因子和核酸组分结合时，会影响冷光的变化。这些方法也可以用来检测调结分析物，诊断疾病和/或筛选介导DNA结合因子活性的药物。

Description

检测和定量DNA结合蛋白质的快速且敏感的以距离效应为基础的测定法
政府支持
此项研究工作获得美国健康和人类服务工作部门/国家健康机构(U.S.Department of Health and Human Services/National Institutes of Health)的支持，补助金批准编号是GM50514。美国政府对本发明具有一定的权利。
序列表
一份书面拷贝的序列表，和一份相同的计算机可读形式的序列表，附在下以供参考。根据37C.F.R.1.821(f)，机读形式清单和笔写书面清单中所纪录的信息，是完全相同的。
发明背景
1.发明领域
大体而言，本发明涉及一种通过检测荧光素标记的强度变化，或者一个颜色计量底物的颜色变化来检测和定量特异性蛋白质的方法，尤其是检测和定量序列一特异性DNA结合蛋白质的方法。本发明可以应用在任何需要检测和定量一个DNA结合蛋白质的DNA活性的地方。
2.相关技术的描述
检测和定量特异性-蛋白质分子，在基础研究和临床应用中非常重要。在生物医学研究和分子诊断中，测定特异性蛋白质的量是最有用而且最重要的实验程序之一。许多疾病普遍使用特异性蛋白质在细胞内的量作为诊断标记。
蛋白质-核酸的相互作用乃是在细胞中所发现的一种极其重要且与生理相关连的生物大分子之间的接触。许多在调节细胞生理过程中扮演重要角色的蛋白质，具有天然的序列-特异性DNA结合活性。这些蛋白质包括转录因子，染色质重建因子以及脱氧核搪核酸(DNA)维持酶。DNA结合蛋白质的综合报告，请参阅Benjamin Lewin， Genes VII，牛津大学出版社，纽约，2000年，特此提出以供参考。
转录因子结合到特定同源核酸元件上，这些元件包括启动子，增强子和沉默元件。这些转录因子根据细胞内的其它物质，可以是活化因子，抑制因子，或者两者皆是。这些因子的量对基因表达的调控很重要。因此，许多这些蛋白质对疾病的发展和诊断十分重要。例如，有几种转录因子，当它们超量表达或不正确的表达时，就变成癌基因。这些癌荃因转录因子包括myc，myb，fos，jun，rel和erb。而很多种癌症的发展，都涉及到另外一个和癌症有关的转录因子，p53。(Ko，L.L.和Prives，C.Genes Dev.10，1054-1072，1996)。
染色质重建因子对基因表达的调控也很重要。一般而言，高度浓缩的染色质区域，即异染色质，其所含的墓因没有转录活性，而松散或不浓缩的染色质区域，即常染色质，其所含的基因则有转录活性。在细胞分化，癌转化和正常生理上的稳定状态下，染色质可能被重塑。也就是说，染色质上的一些区域变得不易于转录因子和RNA聚合酶的接近，而另一些区域则变的更易于转录因子和核搪核酸(RNA)聚合酶的接近。有数种DNA结合因子参与了这个动力十足的过程，其中包括核小体蛋白质(如组蛋白)，组蛋白氨酞转移酶，组蛋白脱氨酞酶，氨基酸甲基转移酶，核糖核酸甲基转移酶，核质素，HMG蛋白质，抑制复合蛋白质，多梳状(polycomb)-相关因子，以及三甲(trithorax)-相关因子。
DNA维持酶乃是在修复损伤DNA，忠实复制DNA，以及在重组过程中交换遗传信息不可或缺的DNA结合蛋白质。好几种类型的癌症和其他疾病的症状都是由DNA维持酶的缺乏所导致的。例如，着色性干皮病，这是一种十分可怕的遗传病，它的患者易于患皮肤癌，而该病就是由于缺乏核甘-切除修复酶所导致的。遗传性的非息肉病结肠直肠癌很大部分是由于欠缺错配修复酶所导致的。某些遗传性的乳腺癌则是由于欠缺同源重组酶所导致的。关于基因组的维持系统及它们在癌症上的作用，请参阅Hoeijmakers，J.H.J.，Nature 411，366-374，2001年，特此提出以供参考。因此，使用一种简便、准确的方法去检测、监视和/或定量DNA结合蛋白质的DNA结合活性，实乃具有非常重要的意义。
在检测蛋白质所展现的序列一特异性DNA结合能力的方法当中，最常用的方法是凝胶移位分析和各种DNA印记分析法(Fried，M.Ca和Crothers，D.M.NucleicAcid Res.9，6505，1981；Galas，D.J.和Schmitz，A.Nucleic Acid Res.5，3157-3170，1978)。这些方法不但很费力而且很费时，特别是它们还得使用既危险又昂贵的放射性元素。更重要的是，这些方法不能普遍的应用于高生产量的分析模式中。数种不同的以荧光素为基础，用来检测和研究DNA结合蛋白质的方法已经被研发出来，以克服凝胶移位分析和DNA印记分析法所具有的缺陷。
与其他的检测法相比，用荧光来检测分子具有几个重要优点。荧光具有无可匹敌的检测灵敏度，用荧光来检测单一分子的例子便可充分展示这一特点。(Weiss，S.Science 283，1676-1683，1999)。荧光的检测，荧光强度的变化，或者发光谱的变化，均可轻易的通过选择特定的激发和发射波长来完成。由于荧光提供的是实时的信号，因此可以用显微镜来进行实时的过程监测和实时的细胞成像(参阅Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy，KluwerAcademic/Plenum出版社，纽约，1999，特此提出以供参考)。另外，既有的非常完善的方法和仪器，可以完成高生产量荧光信号的检测。
目前用荧光来检测溶液中DNA结合蛋白质的方法，得依赖下列几个现象之一：
(i)某种荧光染料(也叫荧光团或荧光探针或荧光标记)的荧光强度的变化，这种荧光染料可以出现在蛋白质里也可以出现在DNA中，这种荧光强度的改变是由探针对蛋白质-DNA复合物形式的微环境的干扰所引起的；(ii)该种荧光染料之荧光极性的变化，是由于蛋白质-DNA复合物分子的尺寸，相对于未结合的DNA或蛋白质分子而言增大许多而造成的，这种荧光染料可以出现在蛋白质里也可以出现在DNA中；以及(iii)DNA上荧光染料和蛋白质上荧光染料之间的共振能量转移，这个现象是由在DNA-蛋白质复合物上的DNA和蛋白质彼此太接近所引起的。荧光信号检测法的综述，请参阅Hill，.J.J.和Royer，C.A.Methods in Enzymol.278，390-416(1997)，特此提出以供参考。
在第一种(i)方法中，荧光信号的变化是山荧光探针在一个蛋白质-DNA复合物形成时，其微环境的变化所引起的。由于荧光信号变化的产生，仰赖的是下述这个不可预料的特性，亦即一个蛋白质-DNA复合物的形成，会使得荧光探针环境改变到足以产生一个可以被检测到的荧光变化，因此这种方法并不适用于所有状况，它在某些状况下可行，在某些状况下不可行。这种分析方法的结果，端视DNA属性、DNA序列、DNA片段的长度、所使用的荧光探针、荧光探针与DNA的结合方式而定。因此，几乎不可能预测这种方法在何种状况下可行，在何种状况下不可行，这是因为由探针环境变化所引起的荧光强度变化的机械结构，尚不十分清楚的缘故。用这种方法将荧光染料结合在蛋白质或DNA上来检测蛋白DNA复合物的应用例子，请参阅下列技术文献：Sha.M，，Ferre-D′Amare，Burley，S.K，Goss，D.J.J.Biol.Chem.270，19325-19329，1995；Reedstrom R.J.，Brown，M.P.，Griillo，A.，Rosen，D和Royer，C.A.J.Mol.Biol.273，572-585，1997；Erickson，G.H.和Daksis，J，WO00/40753)。
下列这些文献可以说明这种分析模式的不可预测性。在某些已发表的文献中，荧光强度在蛋白质-DNA复合物形成时，产生了相当大的变化。例如，当被荧光标记的DNA和Trp抑制蛋白质结合时，可观测到50％被荧光标记的DNA猝灭了，另外糖皮质激素受体和数种不同的DNA标靶结合时，也被观则到类似的猝灭程度(Reedstrom，R.J.，Brown，M.P.，Grillo，A.，Roen，D和Royer，C.A.J.Mol.Biol.273，527-585，1997；Hill，J.J.和Royer，C.A.Methods in Enzymol.278，390-416，1997)。而在其它的文献中，则可观测到的荧光猝灭的程度很小或者荧光发射增加的程度很小(Bjomson，K.P.，Moore，K.J.M.和Lohman，T.M.Biochemistry 35，2268-2282，1996；Hey，T.，Lipps.G.和Krauss.G，Biochemistry 40，2901-2910，2001；Balley，M.，Hagmar，P.，Millar，D.P.，Davidson，B.E.，Tong G.，Haralambidis，J.，Sawyer，W.H.，Biochemistry 34，15802-15812，1995；Parkhurst.K.M.，Brenovritz，M.，和Parkhurst，L.J.Biochemistry 35，7459-7465，1996；Wang，K，Rodgers，M.E.，Toptygin，D.，Munsen，V.A.和Brand.L.，Biochemistry 37，41-50，1998。最后，在许多文献中，当蛋白质和被荧光标记的同原核酸结合时，所观测到的荧光强度根本没有变化(Batley，M.，Hagmar，P.，Millar，D.P.，Davidson，B.E.，Tong G.，Haralambidis，J.和Sawyer，W.H.Biochemistry 34，15802-15812，1995；Gourves，A.S.，LcGac，N.T.，Villani，G.，Boehmer，P.E.，和Johnson，N.P.J.Biol.Chem.275，10864-10869，2000；Hey，T.，Lipps，G.和Krauss，G.Biochemistry40，2901-2910，2001；Lima.L.M.T.R.，Froguel，D.和Silva，J.L Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，14289-14294，2000；Ozers，M.S.，Hill，JI，Wood，E.K.，Nardulli，A.M.，Royer，C.A.和Gorski，J.J.Biol.Chem.272，30405-30411，1997；Reedstrom，R.J.，Brown，M.P，Grillo，A.，Roen，D，和Royer，C.A.J.Mol.Biol.273，572-585，1997；Wang，k.，Rodgers，M.E.，Toptygin，D.，Munsen，V.A.和Brand，Biochemistry 37，41-50，1998)。
这种分析模式结果之缺乏可预测性，在Bailey等人(如前述)所述的工作中，可能展现的最为充分，他们检查了一个被荧光标记的DNA分子，和TyrR蛋白质结合时，其在八种不同位置的荧光变化。结果只观测到一个特定DNA构建物的荧光强度有所变化，其余七个的荧光强度都未观测到变化。
荧光-强度-改变模式的另一个弱点是荧光信号变化的范围非常有限。在最佳的例子中，可观测到的荧光猝灭的程度约为60-70％，而在大部分已发表跳例子中，可观测到的荧光猝灭(或增强)程度只有30％，甚至更低。60-70％的荧光猝灭程度足够进行实际分析，但是30％或更低的荧光猝灭程度，便不够进行实际分析了。再者，在荧光-猝灭分析法中，可用荧光探针的选择性亦很有限。在许多具体应用中，允许留言号增强或是在不同波长信号间的比率，得以使用各种荧光颜色是很有利的，
另一种建立在荧光基础上的测定法，叫做荧光极化，它也常被用来检测蛋白质-DNA复合物模式(请参阅Heyduk，T.和Lee，J.C.Proc.Natl.Acad.Sci USA 87，1774-1748，1990，特此提出以供参考)。这种方法的物理基础是，一个用荧光染料标记了的大分子，其荧光极化信号取决于该大分子的大小(Lakowicz，.R.Principles ofFluorecence Spectroscopy，Kluwer Academic/Plenum出版社，纽约，1999，特此提出以供参考)。因此，当蛋白质和DNA成分形成蛋白质-DNA复合物时，便形成了一个更大的分子整体，而其荧光信号也就随之改变了。使用荧光极化来检测蛋白质-DNA复合物的方法，在Royer中有所描述(1998，美国，Pat，No.5,756,292)，特此提出以供参考。荧光极化方式的限制包括：荧光极化变化的动力范围太小，只适用于相对而言较短的DNA分子，因光线散播所造成的加工效果的灵敏度。再者，荧光极化必需使用特殊仪器，如同上述方法所述的，荧光极化实验的结果有时也很难预测。例如，在Hill和Royer(Methods in Enrymol.278.390-416.1997，特此提出以供参考)所述的一个实验中，并没有检测到荧光极化信号的变化，虽然其它技术已经显示出蛋白质-DNA复合物的形成。
第三种建立在荧光基础上，用来检测蛋白质一DNA复合物形成的分析方法是共振能量转移(FRET)(Strye，L..Ann.Rev.Biochem.47，819-849，1978，特此提出以供参考)。FRET所根据的基础是，荧光染料(荧光供体)所发射的光能量可以转移到另一个接受分子(荧光受体)上，而接受分子也可以是另荧光染料。FRET分析法所根据的基础是，被荧光染料标记的DNA和被荧光染料标记的蛋白质，两者之间的距离因反应情况而不相同。在蛋白质-DNA复合物中两个荧光染料之间的实质距离小于自由蛋白质和自由DNA之间的实质距离。有好几篇已发表的论文，描述了使用这种分析法来检测和研究蛋白质-DNA之间的相互作用(参阅Kane，S.A.，Fleener，C.A.，Zhang，Y.S.，Davis，L.J.Musselman，A.L.，Hunag，P.S.Anal.Biochem.278，29-39，2000，特此提出以供参考)。FRET分析方法最主要的限制是，DNA和蛋白质都需要被荧光探针修饰。
综上所述，以冷光或荧光为基础的分析系统，乃是一种用来检测DNA结合蛋白质的非常吸引人的工具。然而一项具有普遍性、很便宜、很简单、可使用多色或单色的荧光或冷光来检测序列特异性DNA结合蛋白质的方法，这个方法并且可适用于大量检测的模式，目前尚不存在。
发明概述
以下陈述的是建立在因缩短距离而产生冷光转移效应的基础上，来检测和定量DNA结合蛋白质的方法。本发明的其中一项具体应用是，两个双链低聚核苷酸的合成或分离，亦即，通过结合两个双链低聚核苷酸，在低聚核苷酸的连接处形成一个完整的DNA元件(见图1A)。DNA结合元件包含DNA结合蛋白质的一个同源序列所组成。第一个低聚核苷酸用荧光物标记，在下文我们称之为荧光供体，第二个低聚核苷酸用荧光猝灭分子标记，在下文我们称之为荧光受体，此处所谓的猝灭分子可以是激发波长比第荧光物低的另荧光物。将被荧光标记的低聚核苷酸与含有DNA结合因子的样品混合。混合时，DNA结合因子与其同源DNA元件的两个部分相结合，从而稳定了两个低聚核苷酸之间的结合。当这两个低聚核苷酸紧密接近时，第一个低聚核苷酸核酸的荧光供体，将其所发射的光能量，转移给第二个低聚核苷酸的荧光受体，其结果是，荧光供体所发射的光被猝灭了。荧光乃是通过标准的分光光度计或荧光测定仪测定的。荧光信号的猝灭和DNA结合因子与同源DNA元件的结合相关联。
如果能够准确、精确的针对荧光和荧光猝灭进行例行性测量的话，则该发明可用来测量样品中某一DNA结合因子的特定活性或为其定量，测量某一DNA结合因子的解离常数或亲和力，或者通过测量荧光波长或强度的变化来检测样品中某一DNA结合因子的存在与否。
在这个发明的其中一项具体应用中，包含一个DNA结合元件被标记的低聚核昔酸(亦称之为核酸组分)被置于溶液中，并且可以自由向各个方向扩散。在另一项具体应用中，所述低聚核苷酸被固定在固态底物上，例如微量滴定板，微芯片，膜，微球体。在另一项具体应用中，每一对或每一种配对的低聚核苷酸，都通过接头分子被连接起来，其中位于每个低聚核苷酸末端的接头分子将第一个低聚核苷酸和第二个低聚核苷酸连接起来，而该末端是每个低聚核苷酸的DNA结合元件或荧光标记末端的末梢部位。被连接的低聚核苷酸配对可以被固定在固态底物上，比如微量滴定板，膜，微芯片装置，或微球体等等；它们也可以在溶液中自由扩散。
这个发明的另一项具体应用是，在一个单一的多聚核昔酸上的两处位点做标记，第一个位点作为荧光供体，第二个位点作为荧光受体，而且两个标记之间的距离，要远到在没有DNA结合因子的情况下，荧光标记之间不会发生光谱相互干扰的情况。这个具体应用的其中一个层面是，DNA元件的一部分位于第一个位点附近，而该DNA元件的另一部分则位于第二个位点附近。当DNA结合因子与上述元件的两个部分相结合时，第一个位点被带到第二个位点的附近，从而协助或稳定了荧光供体和荧光受体之间光谱的相互作用。这个具体应用的另一个层面是，第一个DNA元件位于第一个位点上或其附近，第二个DNA元件位于第二个位点上或其附近。当DNA结合因子或DNA结合因子的复合物(例如在一个增强复合体中)结合到第一个和第二个元件上时，第一个位点被带到第二个位点的附近，从而协助或稳定了荧光供体和荧光受体之间光谱的相互作用，进而导致一种由荧光能量的转移或猝灭所引起的可测量的荧光变化。
任何建立在距离效应基础上或是建立在偶遇效应基础上的冷光检测法，都可以应用到目前本发明中。其具体应用包括但不仅限于荧光能量转移、冷光共振能量转移、荧光交叉相关分光术、流式细胞仪、定向猝灭、基态复合物形成、化学发光能量转移、生物发光能量转移以及激发态二聚体的形成。可以理解的是，熟练的技术人员会发现这，其它建立在距离效应基础上的冷光检测法也可以应用在本发明中，而那些检测法也包括在本发明的范围内。
在本发明中，任何荧光物都可以被用来当作荧光供体或荧光受体，不过，最好是受体的激发波长和供体的发射波长彼此相配。在另一项具体应用中，猝灭分子可以被用来当作荧光受体，它即使受到激发它也不会发光。下列是一组荧光物和猝灭分子的例子：Alexa Fluro_350、Alexa Fluro_430、Alexa Fluro_488、Alexa Fluro_532、Alexa Fluro_546、Alexa Fluro_568、Alexa Fluro_594、Alexa Fluro_633、Alexa Fluro_647、Alexa Fluro_660、Alexa Fluro_680、7-二乙酰胺香豆素-3-羧基酸、荧光素、Oregon Green 488、Oregon Green 514、四甲基玫瑰精、玫瑰精X、德克萨斯红染料、QSY 7、QSY 33、丹磺酞、BODIPY FL、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPYTMR-X、BODIPY TR-X、二烃荃氨基香豆素、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPA(Eu3+)-AMCA和TTHA(Eu3+)-AMCA。可以理解的是，熟练的技术人员会发现，任何可相容的荧光供体/受体配对都可适用于本发明中，所述荧光物和猝灭分子只是一些范例，而非本发明的范围限制。
另一项具体应用的考量是，除了以距离效应为基础的分析法之外，以流式细胞仪或比色酶为基础的分析方法，也可以被用来检测DNA结合因子和其同源DNA元件的结合。在荧光辅助的细胞分类中，一个核酸组分配给一粒珠子或微球体，另一个核酸组分则配给冷光分子或荧光染料。
另一项具体应用是，本发明可以通过对病人诊断样品中各种DNA结合蛋白质活性的测定，去诊断和域记述疾病状态的特征。我们预见，有一些疾病涉及到DNA结合因子的错误表达。比方说，某些癌症和诸如c-myc，c-fos，c-jun，rel或erbA(请参阅Genes IV by Lewin，第890页)等转录因子的超量表达有关，而另外一些癌症，例如某些乳腺癌和结肠直肠癌，则和DNA修复酶的低量表达有关。在这项具体应用中，将生检样品与被标记的低聚核苷酸或核酸组分结合在一起，如上文所述，以便分析特定DNA结合因子的出现，缺席，或特定活性。
另一项具体应用是，本发明涉及检测和/或定最样品中细胞调节因子的方法，其中，细胞调节因子扮演辅因子或辅酶的角色，它协助或阻止DNA结合因子与同源DNA元件的结合。将一个可能含有调节因子的样品，与混合物或测试样品(kit)相混合，混合物或测试样品是由本发明中被标记的低聚核苷酸或多聚核苷酸(如前述)以及同源DNA结合因子所组成的，其中DNA结合因子的DNA结合活性，完全或部分仰赖于前述调节因子的存在与否。我们预见，如果DNA结合因子需要上述调节因子才能结合到同源DNA元件上的话，则当样品中含有调节因子时，将会产生荧光能量转移或猝灭的现象。基于同样的考量，如果上述调节因子干扰了DNA结合因子和其同源DNA元件之间的结合时，则不会产生荧光能量转移或猝灭的现象。
另一项具体应用是，本发明涉及一种用来识别调节DNA结合因子与DNA元件相结合之试剂与药物的方法。这个状况和检测和/或定量样品中细胞调节因子的方法类似(如前述)，所有可能的试剂或药物，与各套DNA结合因子以及被标记的低聚核苷酸或者由同源DNA元件所组成的核酸组分相混合。如果试剂或药物抑制或干扰了DNA结合因子与DNA元件之间的结合，将不会测量到荧光的变化。如果试剂或药物促进了DNA结合因子与DNA元件之间的结合，则会测量到增大的荧光能量转移或荧光变化。
另一项具体应用是，本发明牵引出一种阵列仪器(array device)，它包含许多对以线性或多维式的模式，被附着在一个固体矩阵内或者悬浮在溶液中的被标记的低聚核苷酸。被标记的低聚核苷酸的同源配对，被附着在固体底物的特定位点或悬浮在多孔盘的特定孔中，其中每个低聚核苷酸成分都含有DNA元件的一部分，此乃是一个DNA结合因子的结合位点，而且第一个标记是荧光供体分子或者一个化学发光或比色底物，第二个标记则是荧光受体或者化学发光的催化剂或比色底物的催化剂。固体底物可以是膜，例如硝化纤维，尼龙，聚偏二氟乙烯(PVDF).也可以是多孔盘或者它种适合此类用途的便利底物。这项具体应用的另一个层面是，通过将一个接头分子附着到每个低聚核苷酸末端标记和DNA元件或其一部分的方式，将每一对同源低聚核苷酸彼此连结起来。连结起来的低聚核苷酸配对，被附着到一个特定阵列模式中的固体矩阵上，或者被置入一个多孔盘的特定孔中。这项具体应用的另一个层面是，含有数个核酸组分的阵列仪器以行列模式排列，其中每个多聚核昔酸含有一个或多个被标记的DNA元件，其中第一个标记是荧光供体分子或者一个化学发光或比色底物，而第二个标记则是荧光受体或者一个化学发光的催化剂或比色底物的催化剂。同所述低聚核昔酸配对一样，每个特定的多聚核昔酸也被附着到一个固体底物的特定位点或者悬浮在一个多孔盘的特定孔中(如前述)。
上述总结只是简要地描述了该发明首选的一些具体应用，并不是把该项发明限制在这些范围内。熟练的技术人员会发觉，该发明还有其他可能的具体应用，而这些应用均是利用距离效应化学反应的概括性原则，去识别涉及到DNA结合的试剂。
附图简述
图1.建立在距离效应基础上的DNA-结合-蛋白质的总体设计描述。
图2.展示的是在图1所显示的设计中，在含有DNA结合蛋白质的情况下，荧光信号在理论上的模拟变化。
图3.描述的是使用被荧光染料标记的低聚核昔酸，其序列号为1-4(SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：4)以检测CAP蛋白质。
图4.展示了图3中所显示的DNA分子的荧光光谱。含有CAP和cAMP(B组，曲线2)，不含有CAP(A组)，含有CAP但不含有cAMP(C组)，含有Trp抑制蛋白质(D组)。
图5描述的是对照试验，在该试验中，一个含有CAP结合位点的未标记的DNA片断，阻止了在含有CAP时可观察到的荧光信号的变化，而一个非特异性的DNA片断，不会影响荧光信号的变化。
图6描述的是荧光信号改变的程度对CAP蛋白质浓度的依赖性。
图7描述的是当含有CAP时，荧光信号的变化与时间的关系。
图8显示的是使用7-二乙基香豆素-3-梭基酸来检测CAP蛋白质。曲线1代表不含有CAP蛋白质的情况，曲线2代表CAP蛋白质浓度为100nM的情况。
图9描述的是在检测CAP蛋白质时，针对不同波长所使用的荧光比率。曲线1-9代表CAP的增加量，分别从0到150nM。
图10描述的是cAMP对CAP与CAP1/CAP4以及CAP2/CAP3 DNA双链结合所产生的影响。在不含有cAMP的情况下，没有发生可检测的结合。
图11显示的是一个分析的设计。在这个试验中，两个DNA分子通过灵活的长连接物被共价键连接起来，以排除实验分析对DNA浓度的依赖性，并减短试验所需的时间。B组描述的是间隔-18-氨墓磷酸酯原子团的一个单位。
图12描述的是使用图11中所显示的共价连接设计，在含有CAP的情况下所观察到的荧光信号的变化。B组描述的是使用灵活一连接物的构建物后。荧光猝灭的反应时间。
图13描述的是使用被荧光染料标记的低聚核昔酸，其序列编号为12-15(SEQID NO：12-15)来检测LacR蛋白质。
图14描述的是因LacR蛋白质与同源DNA序列相结合而引起的荧光猝灭。曲线1-7分别代表LacR蛋白质逐渐增加的量，从0到200nM。
图15描述的是含有部分TrpR蛋白质结合位点的核酸二聚物，其序列编号从16到19(SEQ ID NO：16-19)。
图16描述的是因TrpR蛋白质与同源DNA序列相结合而引起的荧光猝灭。曲线1-5分别代表TrpR蛋白质逐渐增加的量，从0到800nM。
图17描述的是同时使用两种颜色来检测两种蛋白质：CAP和TrpR。A组描述的是在433nm的激发波长处所得到的荧光光谱，B组描述的是在490nm的激发波长处所得到的荧光光谱。曲线1是两种蛋白都不含有的情况；曲线2是只含有CAP的情况：曲线3是只含有TrpR的情况：曲线4是两种蛋白都含有的情况。C组总结了A组和B组的结果。
图18描述的是含有部分p53蛋白质DNA结合元件的核酸二聚物，其序列编号为20-23(SEQ ID NO：20-23)。
图19描述的是因p53蛋白质结合到同源DNA结合元件序列上所引起的荧光猝灭。曲线1-5分别代表p53蛋白质逐渐增加的量，从0到130nM。
发明详述
定义
除非另行定义，否则此处所使得的所有技术和科学名词，均是此项发明所属领域中普通技术人员普遍了解的名词。任何类似于或相当于下述的方法及材料，都可以用其中项发明的测试或实际应用中，以下所述的，只是我们首选的方法及材料。特为本发明，定义下列名词。
此处所谓的″标记″是指任何被附着到一个核苷酸或核营酸聚合物上的复合物，其附着的方式可以是共价结合或非共价结合。最好是可以被检测到的标记，允许所说的核苷酸或核苷酸聚合物可以被本发明的实际操作者检测到。标记若是一个冷光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光猝灭试剂、有色分子、放射性同位素或闪烁材料则更好。标记若是荧光染料或荧光猝灭试剂则最好。″探针″这个名词其中项发明中，全然等同于″标记″这个名词。
此处所谓的″冷光″或″发冷光的″意思是指，任何的发光过程，包括荧光、磷光、闪光、化学发光、生物发光。
此处所谓的″荧光染料″是指被激发时，其所发光的波长比激发光的波长更长的荧光复合物。所谓的″荧光供体″是指在木发明所述的分析法中，其所发之光将被测量的荧光染料。更确切的说法是，荧光供体发出的光被荧光受体吸收。所谓的″荧光受体″是指可以吸收荧光供体所发光的第二个荧光染料或猝灭分子。第二个荧光染料吸收荧光供体发射的光，并且发射比荧光供体所发之光波长更长的光。猝灭分子仅仅吸收荧光供体发射的光。
我们预见，任何冷光分子，最好是荧光染料和域荧光猝灭剂，均可用在本发明的实际操作中，这其中的例子包括：Alexa Fluro_350、Alexa Fluro_430、AlexaFluro_488、Alexa Fluro_532、Alexa Fluro_546、Alexa Fluro_568、Alexa Fluro_594、Alexa Fluro_633、Alexa Fluro_647、Alexa Fluro_660、Alexa Fluro_680、7-二乙酰胺香豆素-3-羧基酸、荧光素、Oregon Green 488、Oregon Green 514、四甲基玫瑰精、玫瑰精X、德克萨斯红染料、QSY 7、QSY 33、丹磺酞、BODIPY FL、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、二烃荃氨基香豆素、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPA(Eu3+)-AMCA和TTHA(Eu3+)-AMCA等等。
此处所谓的″化学发光″，″化学发光的″或″化学发光底物″是指一个化学物质由于发生化学反应而导致发光。常用的化学发光底物包括：发光氨(5-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮)，洛粉碱(2，4，5-三苯基咪哇)，光泽精(二-N-甲基-吖啶)，其它吖啶酯和荧光素-荧光素酶。例如，在Amersham公司的识别ECLTM检测系统中，吖啶底物被山葵过氧化酶氧化后，生成吖啶酯，在pH值为碱性时，与过剩的过氧化物反应，在430nm处产生可见的化学发光。
此处所谓的″比色的″或″比色底物″是指一个化学物质因化学反应而生成有色产物，其所产生的光吸收性质的变化。在一个已被认知的例子中，p-硝基苯基硫磷酸盐，在含有碱性磷酸化酶的情况下，水解生成p-硝基酚，在波长405nm处吸收光(黄色)。在另一个例子中，p-苯基二胺加上苯磷二酚，在含有过氧化酶和过氧化物的情况下，会生成一种褐黑色物质。
此处所谓的″核酸″是指低聚核昔酸或多聚核昔酸，它们可能被修饰过或者带有修饰碱基。低聚核苷酸是一条单链核苷酸聚合体，由2到60个核苷酸组成。多聚核苷酸是由两个或两个以上的核苷酸组成。它可以是双链DNA，包括退火的低聚核苷酸，其中第二条链是一个核苷酸，它具有和第一个核苷酸反向互补的序列，可以是由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的单链核酸聚合物，可以是单链RNAs，也可以是双链RNAs或RNA/DNA杂交双链。
此处所谓的″核酸构建物″或″核酸组分″是指一对退火的可互补的单链低聚核苷酸，它们包含DNA结合元件的一部分，当两种核酸组分相结合时，就形成了一个完整的DNA结合元件。此处所谓的一″套核酸组分″是指一种相配的两种核酸组分，当两种核酸组分相结合时，就形成了一个完整的DNA结合元件。我们并且认为，在本发明的某些具体应用中，一个核酸组分可能包含一个单一的DNA结合元件，一种核酸组分则包含两个或两个以上，彼此在功能上互相合作的DNA结合元件。在这类具体应用中，在含有转录因子或其他DNA结合蛋白质的情况下，DNA结合因子与一个或多个DNA元件的结合事件，就可以被检测到。我们并且认为，数组核酸组分可以被集合成一个矩阵，用以监测多种不同的DNA结合因子或分析物。
此处所谓的″阵列″是指一些以线性，二维或三维格局排列的独特核酸组分组。我们预见，一个矩阵可能含有数组以分散格局排列，被附在固体底物上的核酸组分组，这里所谓的″固体底物″是指固体的、半固体的或超低温液体表面的物质或矩阵。固体底物的例子包括膜，塑料多孔盘，玻璃滑片，芯片或微球体。我们并且认为，一个阵列亦可含有数组，溶解在溶液中分散在一个微量滴定盘孔内的核酸组分。
此处所谓的″DNA结合元件″或″DNA元件″是指一个和蛋白质或/和其它部分相结合的核苷酸序列。DNA元件最好是一个可以与同源DNA结合蛋白质或因子相结合的特定核酸序列。这里所谓的″同源″是指两个化学实体之间的特定认知，例如，一个配体和其同源受体或是一个酶和其同源底物。DNA结合元件的例子包括：启动子、操作子、增强子和沉默子，及其中的一部分。
此处所谓的″DNA结合因子″是指一个和核酸非共价连结的化学实体。其中较佳的一项具体应用是，DNA结合因子是一个和同源DNA元件相结合的蛋白质，多肤或多肤的片断，因此其中处皆被称之为″DNA结合蛋白质″。其中最佳的一项具体应用是，DNA结合因子是一个序列-特定的DNA结合蛋白质，它们能直接和特定同源DNA序列相结合。在另一项较佳的具体应用中，DNA结合蛋白质或因子是一个蛋白质、多肤、多肤的片断或其它的化学结构，它们能间接和DNA元件相结合，或与其它DNA结合蛋白质联合起来，以协助或抑制其它DNA结合蛋白质的功能。我们预见，转录激活因子，转录抑制因子，或者增强子的其它成分，虽未直接与DNA结合，但是由于它们可以与其它的DNA结合因子相结合以影响基因的活性，因此它们也包括其中项定义的范围内。
在另一项具体应用中，从某一受试者取得样品，样品中含有DNA结合因子和分析物。该受试者最好是罹患某种癌症或者其它基因组不稳定性疾病的病人。受试者也可以是动物、植物、微生物或一个细胞。样品最好是含有DNA结合因子的″细胞物质的提取物″，并且最好是完全不要对DNA结元件有所干扰或竞争。
我们进一步认为，DNA结合因子或DNA结合蛋白质可以包括转录因子，染色质重塑因子和基因组维持酶等等。在Benjamin Lewin， Genes VII，牛津大学出版社，纽约，2000一文中。列有一份包括数种类型的DNA结合因子在内的短目录和描述，特此提出以供参考。
转录因子与启动子、增强子和沉默元件等特定同源DNA元件相结合，并且负责基因表达的调控。转录因子可以是转录激活因子，转录抑制因子，或者两者兼是，依细胞属性而定。转录因子的例子包括：p53，c-myc，c-jun，c-myb，c-fos，，c-rel，c-crbA，E2F，β-连环蛋白，cAMP受体蛋白质(″CAP″)，Lac抑制子(″LacR″)，类固醇受体，类似结构域蛋白质，POU结构域蛋白质，螺旋-转角-螺旋转录因子，碱性螺旋一环一螺旋转录因子(″bHLH″)，碱性亮氨酸拉链转录因子(″bZip″)，锌指转录因子和核子激素受体等等。
增强子复合物的成分是由一种转录因子的子集所组成。此处所谓的″增强子复合物″是指一个由数个转录因子所组成的大型核蛋白质复合物，彼此团结合作地结合到增强子的数个结合位点上。增强子复合物的一个重要成分是HMG-1，这是一个和DNA双螺旋小沟结合的DNA结合蛋白质，它促进DNA的弯曲。增强子复合物蛋白质包括DNA一弯曲蛋白质，含HMG框的蛋白质，SR又LEF-1，HMG-1，HGM-2，转录因子和基本转录因子。
此处所谓的″基本转录因子″是指RNA聚合酶II以及它的相关因子，这是此学术领域中普遍知悉的事。墓本转录因子包括RNA聚合酶II，TFIID，TFIIA，TATA一结合蛋白质，TFIIB，TFIIF，TFIIE，TATA-结合蛋白质-相关因子，NTF-1和Spl。
染色质-重塑因子参与了异染色质(或其它无转录活性的区域)和常染色质(或其它有转录活性的区域)的维持。它们并且参与了染色体伸展的全面休止以及诸如基因组印迹等的现象。染色质-重塑蛋白质包括核小体蛋白质，(如组蛋白)，组蛋白氨酞转移酶(″HATs″)，组蛋白脱氨酞酶(″HDAs″)，DNA甲基转移酶，核胞浆素，高迁移率蛋白质组(HMG)，抑制复合蛋白质，多梳状物(polycomb)-相关因子，三甲(trithorax)-相关因子。SWI/SNF复合物的成分，Sin3抑制复合物的成分，RSC复合物的成分，NURF复合物的成分，PcG复合物的成分，trxG复合物的成分，CpG甲基化酶，MeCPI和MeCP2等等。
基因组-维持酶是对损伤DNA的修复、DNA的忠实复制、或在重组过程中对遗传信息的交换非常有用的DNA结合蛋白质和其它蛋白质。它们包括：DNA聚合酶，RNA聚合酶，碱基切除修复酶，核昔酸切除修复酶，同源重组酶，末端连接酶，错配修复酶，外切酶，内切酶，双链解对修复酶，单链解开修复酶，转录配对修复酶，连接酶，贯穿损害(translesion)合成酶，端粒代谢酶等等。在本发明中，山于p53的角色是一个细胞周期检验点荃因产物，因此它既被视为是基因组维持酶，又被视为是转录因子。
此处所谓的″一个DNA结合因子的活性″是指一个样品中，DNA结合因子的特定活性或量，以及同源DNA结合元件的DNA结合因子的亲和力。
此处所谓的″接头″或″接头分子″是指任何连接在一种包含两个核酸上的聚合物，这一种两种核酸组分，包含一个完整的DNA结合元件，而连接方式可以是共价结合或非共价结合。我们预见，接头可以是氨基酸多聚物或核苷酸的多聚物。接头分子最好是具有通融性，而且不会干扰DNA结合因子和核酸组分组之间的结合。接头分子最好是由12个间-18-内氨基磷酸酷部分组成(Glen Rasearch，Sterling，VA)。它的结构列在图11B中。
此处所谓的″分析物″一般是指一个调节DNA结合因子和核酸元件之间结合的化学原子团，它们可以是离子或分子复合物。分析物并可包括二级信使分子，例如：钙离子，cAMP和IP3。分析物一般亦指细胞事件，例如：磷化，脂质化，或其它翻择后修饰，与转接分子的结合或分解，或者影响DNA结合因子和核酸元件之间结合的蛋白质水解事件。分析物并可指，DNA结合因子和核酸元件之间结合的调节物，其中包括任何药物，测试剂，试剂，未来新进的药物，未来新进的试剂，或者未来新进的测试剂。此处所谓的″结合的调节物″意指抑制部分或全部的结合，或者帮助部分或全部的结合。
本发明实施方案的描述
以下叙述的是确定DNA结合蛋白质和测量其DNA结合活性的方法。此项发明的中心思想是，制备两个核酸分子，以使和一个同源蛋白质-结合位点相符合的序列分开在两个核酸分子上。这两个核酸分子(亦指核酸组分)可以悬上一个补充性的短臂，以使核酸组分具有一些结合倾向，但是这种倾向必需设计的很低，这样在没有蛋白质的情况下，核酸组分之间的结合几乎不会发生。两种核酸组分之间的结合，重新产生了蛋白质的同源结合位点，所以在蛋白质存在的情况下，蛋白质对其同源核酸结合位点的亲和力，驱使两种核酸组分完成彼此间的结合。对蛋白质-DNA复合物形成的检测，是通过将两种核酸组分，标记上冷光探针、荧光染料、化学发光底物或比色底物来完成的。在一个蛋白质-DNA复合物中，两个核酸片段之间物理距离的亲近程度，为荧光信号的变化，或与蛋白质-DNA复合物的形成相关联的比色/化学发光产物的形成，提供了机制。
在本发明的另一项具体应用中，可以将其中一个核酸组分附在珠子上(微球体)，将另一个核酸组分标上冷光探针或荧光探针。当同源DNA结合因子存在时，就会形成蛋白质-DNA复合物，这样珠子或微球体就会被标上冷光探针了。被标记的珠子或微球体，可以使用荧光催化细胞分类仪或流式细胞仪这些已知的技术加以检测。这项具体应用代表了以偶遇为基础的冷光信号检测法。在本发明中″以距离的亲近程度为墓础″这个名词，其意义也包括以偶遇为基础。
任何以距离的亲近程度为基础(包括以偶遇为基础)的冷光信号检测法，如FRET(Stryer，L.Ann.Rev.Biovhem.47，819-846，1978)，荧光交叉相关分光术(″FCCS″)(Maiti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，11753-11757，1997)，流式细胞仪(Nolan Sklar，NatureBiotechnology 16：633-638，1998)，闪烁亲近测定法(″SPA″)(Hart and Greenwald，Molecular Immunology 16：265-267，1979；美国专利号4,658,649)，冷光共振能量转移(LRET)(Mathis，Ct Clin.Chem.41，1391-1397，1995)，定向猝灭(Tyagi等，NatureBiotechnology 16，49-53，1998)，基态复合物形成(Packard，B.Z.，Toptygin，D.D.，Komoriya，A.和Brand，L.：.Biophys.Chem.67，167-176，1997)，化学发光能量转移(CRET)(Campbell，A.K.和Patel.A.Biochem.J.216，185-194，1983)，生物发光共振能量转移(BRET)(Xu Y.，Piston D.W.，Johnson，Proc.Natl；.Acad.Sci.96，151-156，1999)，或受激准分子形成(Lakowicz，J.R.，Principles of Fluorescence Spectroscopy，kluwerAcademic/Plenum出版社，纽约，1999)都与这个分析的设计相兼容。再者，我们预见，任何化学发光分析法或比色分析法，例如，识别碱性磷酸酶-NB/BCIP系统的技术。都可以应用在本发明中。我们更进一步认为，因为本发明是建立在所有DNA结合蛋白质的共性基础上，而非某一特定蛋白质的特性之上，所以它对任何DNA结合蛋白质都适用。本发明的信号检测模式和其所使用的荧光探针的性质，都具有很大的灵活性。本发明并可从事多色检测。
根据对此项发明的上述介绍，用FCCS检测样品，涉及到荧光强度信号波动的测量，该检测样品含有两种核酸组分，其中每个核酸组分都被具有不同发射波长的荧光染料标记。在同源DNA结合因子蛋白质存在的情况下，通过检测两个荧光染料每个信号间的交叉相关性，可以测量两个被荧光染料标记的核酸组分之间的结合。使用FCCS来检测两个被不同荧光染料标记的大分子之间的结合的方法，在″用双色荧光交叉相关分光术法去研究两个DNA赞螺旋键同时与NtrC-增强子复合物结合″一文中有具体描述(Rippe，K.，″Simultaneous Binding of two DNA duplexes tothe NtrC-Enhancer complex Studied by Two-color Fluorescence Cross-correlationSpectroscopy″，Biochemistry 39，2131-2139，2000)，特此提出以供参考。
根据对本发明的上述介绍，流式细胞仪也可用来检测被冷光或荧光标记的核酸组分与″目标″核酸组分之间的结合，其中目标核酸组分被固定在微球体的表面。在类似情况下的流式细胞仪的使用，可参考″流式细胞仪的出现可以对分子间相互作用进行高灵敏度的实时测量″一文(Nolan，J.P.和Sklar，L.A.″The emergency of flowcytometry for sensitive，real-time measurements of molecular interactions″NatureBiotechnology 16，633-638，1998)，特此提出以供参考。在其中一项具体应用中，一个核酸组分被固定在微球体上，此处的核酸组分可以被荧光染料标记或不标记，此处的微球体其直径最好是几个微米。第二个核酸组分可以被荧光染料标记，如果被附在微球体上的核酸组分也被荧光染料标记，则这两个荧光染料的颜色要不同。在同源DNA结合因子存在的情况下，流式细胞仪可通过测量微量荧光的变化，或者两个不同颜色的荧光比例的变化(如果两种核酸组分都被荧光染料标记的话)，去测量两种核酸组分之间的结合。
根据对本发明的上述介绍，我们预见，闪烁亲近测定法(″SPA″)亦可用来检测DNA结合因子的活性。在其中一项具体应用中，一个核酸组分被附在含有固体闪烁体的微球体上，另一个核酸组分被放射性同位素标记，最好是用氖。在同源DNA结合因子存在的情况下，放射性同位素标记就被带到与含有固体闪光的微球体非常近的位置，从而诱导发光物发光。SPA的使用方法请参考Hart和Greenwald，分子免疫学(Molecular Immunology)16：265-267，1979和美国专利号4,658,649，特此提出以供参考。
在本发明的另一个具体应用中，本发明提供了一种方法，可以快速的测定蛋白质-DNA复合物形成的物理参数，例如解离常数。本发明还提供了一种，测定一个DNA结合因子与相异DNA结合元件之间亲和力的方法。在这个具体应用中，包含相异DNA结合元件的核酸和DNA结合因子及其被标记的同源核酸组分混合在一起。我们预见，与对照组相比，这些相异的核酸结合元件通过对DNA结合因子的竞争，对发光信号会产生影响。
更进一步，假设许多蛋白质的DNA结合活性是通过其它分子或分析物来调节的，例如cAMP或IP3，那么本发明提供了一种可以用来检测这些其它分子或分析物的方法。同样的道理，我们预见，本发明可以作为平台技术，去识别新的试剂、其它分析物和分子，或者可调节蛋白质-DNA交互作用的药物。我们并且认为，本发明可用来识别包含一个增强子复合物或超数染色体结构的蛋白质，其中蛋白质不是直接结合在DNA上，而是直接或间接地结合在其它DNA结合蛋白质上。
图1A说明的是上述发明所述的检测序列-特定的DNA结合蛋白质的基本概念。在本发明的一个具体应用中，制备两个核酸片段(成分)，其中每个片段都含有一个和蛋白质的同源结合位点相对应的部分核酸序列。图1B显示的是这类分子数种可能的设计选项。这项具体应用的一个方向是，两个核酸片段可以悬上一个补充性的短臂，以使两个片段具有一些结合倾向。这项具体应用的另一个方向是，我们预见，本发明对检测那些可以有效地与一段短的DNA序列结合的蛋白质非常有用，比方说，10或10以下的碱荃对(bP)，其两个核酸片段相当于一个核酸双链的两条单链成分(图1B，设计选项″c″。设计选项″a″和设计选项″b″中短臂的长度，或设计选项″c″(图1B)中单链少聚核苷酸的长度，检测两个核酸分子在没有同源蛋白质存在时的结合倾向，因此所选择的短臂长度，需使在分析时所使用的两个核酸片段的浓度下，两个核酸片段之间自动连接效率非常低。因此，在同源蛋白质不存在的情况下，两个DNA分子几乎不发生连接，而在同源蛋白质存在的情况下，蛋白质对核酸的亲和力，促使两个核酸片段连接，进而形成一个特定蛋白质-DNA复合物。两个核酸片段的再连接，使得两个标记或荧光染料紧密接触，这种由蛋白质-诱导的紧密接触，会造成冷光信号的变化或生成一种有色产物，这些可以表示蛋白质-DNA复合物的形成。
本发明首选的具体应用的物理学墓础是建立在一个形成蛋白质-DNA复合物所需的自由能(ΔG0)和结合平衡常数(K)之间的基本关系，结合平衡常数可以表达在任何一个既定的核酸和蛋白质浓度下，所形成的蛋白质-DNA复合物的量：
(等式1)ΔG0＝-RTInK
假如将蛋白质结合到其同源核酸位点的自由能是ΔG0，那么将同源结合位点分成两个″半位点″使其变成两个分开的DNA片段的话，如图1A所述的那样，就会使结合到每个半位点的自由能变成大约为1/2ΔG0。由于自由能(ΔG0)和结合平衡常数(K)之间是一种对数关系(等式1)，将结合自由能减低一半，会使得结合平衡常数减少几十倍。因此，当一个蛋白质可以有效地结合到其同源全位点的情况下，将不会发生可以被检测的蛋白质只与其半位点的结合。蛋白质与全位点之间以及蛋白质与半位点之间亲和力的大差别，是在蛋白质存在的情况下，两个核酸半位点再连接的推动力。
鉴于本发明并不受理论的束缚，以下的反应流程描述的是图1所述的检测系统的作用
                  K1             KD
(等式2)DNA-A+D-DNA·D-DNA-DNA-A+P·P-(D-DNA-DNA-A)
此处的DNA-A是被受体标记的DNA半位点，DNA-D是被供体标记的DNA半位点，P是DNA结合蛋白质，K1是连接DNA-A和D-DNA片段的结合平衡常数，Ko是蛋白质P和其同源DNA结合位点的结合平衡常数，两个不同长度的补充性短臂的计算结果，显示在图2中，短臂的长度确定K1的值。这些模拟展示出此处以及图1中表现了有关本发明基本设计的可行性，以及此设计可轻易测量其变化的可见信号，不论信号变化是基于荧光能量转移或是化学发光或有色物质的生成均可被检测到，而这适用于一个宽阔范围的DNA蛋白质结合平衡常数。因此，本发明之所以对任何DNA结合蛋白质皆具有一般的实用性，乃源自于它是建立在所有DNA结合蛋白质的一般性特质的基础上，这个一般性的特质便是结合到一个完整的同源结合位点的高亲合性，以及交互作用的自由能和结合平衡常数之间的一般性热力学的对数关系。
本发明在各种冷光或比色探针的选用上、这类探针在核酸分子中结合位点的选择上、一种信号产生或进行检测的特殊方法的选择上，均提供了广泛的自由度和灵活性。许多商业界提供的试剂，使我们可以在低聚核营酸自动合成时，得以将各种各样的探针，结合到5’端、3’端或低聚核苷酸的内部位点上。因此，在合成时将探针结合到低聚核苷酸上，或者在合成后修饰低聚核苷酸带有氨基或硫醇基反应的衍生物时，将探针结合到低聚核苷酸上，是可能的事情。目前本发明对探针的本质和位点并没有限制，只要探针不影响蛋白质一核酸复合物的形成即可。如图1B所述的，被标记的核酸片段还有几个可能的具体应用模式。例如，有些蛋白质不能使用设计选项″a″(图1B)，其中设计中，探针乃是位于蛋白质结合位点内，是以探针可能会对蛋白质的结合，具有潜在的干扰性。在这种情况下，可选用设计选项″b″(图1B)，其中设计中，探针乃是位于蛋白质结合位点的外面。
另一项具体应用中，低聚核苷酸可以被标记上任何可以与带氨基或硫醇基反应的可发出任何光谱的冷光探针，这样，可以根据应用时的特定需要，在分析中选择冷光或荧光信号的颜色。这种可能性，使得在一次分析试验中，可以同时检测两种或两种以上的蛋白质，其中使用可识别不同蛋白质的DNA构建的混合物，每个DNA构建被标记上可显示不同发光谱的冷光探针。
用这种方法检测DNA结合蛋白质的检测灵敏度至少受到两个因素的影响：冷光信号的检测灵敏度和蛋白质和其DNA结合位点的亲和力。由于商业化的设备，能常规性的在皮摩(picomolar)荧光染料的浓度下检测到荧光，所以本发明的检测灵敏度，不至于受到信号检测灵敏度的限制，尤其是在荧光检测的情况下。另外，最近在信号检测方面的先进发展，使得灵敏度已足够检测单个荧光染料分子。因此，更可能的是，蛋白质对其DNA结合位点的亲和力，将会确定检测的灵敏度。DNA结合蛋白质的检测范围将会在DNA结合蛋白质与其同源DNA结合位点的亲合力范围内，后者的蛋白质浓度通常是从低皮摩到高纳摩(nanomolar)。
目前本发明也为测定法中所使用的DNA分子的设计，提供了很大的灵活性。例如，DNA分子的长度不受限制，额外的元件也可被并入DNA分子中。在其中一项具体应用中，一个供第二个蛋白质结合的预各结合位点，可被并入其中一个核酸片段中，而第二个蛋白质与被分析的蛋白质互相合作结合到核酸上。然后在具有第二个蛋白质的情况下进行分析，或者再在具有和不具有第二个蛋白质的情况下进行分析，以确定被研究的蛋白质，其在具有第二个蛋白质的情况下所产生的不同活性。
在另一项具体应用中，分析中使用的DNA成分，被附在固体支持物的表面上。将核酸附在固体支持物上的技术，在本发明的学术领域中已经非常成熟，并且在下列文献中有所描述(请参阅Rogers，YH.等，Anal.Biochem.266，23-30，1999；Joos，B.等，Anal.Biochem.247，96-101，1997；Running J.A和Urdea MS，Bio Techniques，8：276-277，1990；特此提出以供参考)。通过监视固体支持物表面所发射的信号来检测蛋白质。用来检测不同蛋白质的数个DNA构建物，可以被附在固体表面，排列成矩阵，以便能够同时检测许多DNA结合因子。固体支持物可以是膜，例如硝酸纤维，PVDF或尼龙，塑料组织培养皿，或塑料多孔盘。
在另一项具体应用中，分析中使用的核酸组分，可由单个核酸分子组成，每个核酸组分被一定长度的核酸分开，以便使整个核酸得以弯曲，进而使核酸组分之间可紧密接触。我们预见，这样的模式可以用来检测或识别，例如，涉及较高阶染色质结构或增强子复合物结构的DNA结合蛋白质。
在另一项具体应用中，分析中所使用的核酸组分，可以通过一个灵活的接头分子连接在一起。我们预见，核酸组分的连接，将会协助蛋白质与其同源核酸结合位点之间的相互作用，并使相互作用在动力学上变得更快。这个灵活的接头分子最好是间-18-氨基磷酸酯，兹叙述如下。
目前本发明的最大特点是，它易于操作而且是真正的均匀系统。只需要将分析溶液和测试溶液混合在一起即可。分析溶液含有核酸组分：测试溶液含有DNA结合蛋白质、分析物或其它涉及到染色质或增强子复合物结构的蛋白质成分，然后进行短时间的温育和信号检测。此分析法不需要洗涤步骤，也不需要连续加入其它成分。
在另一个具体应用中，本发明可直接用于对患者或受试者的疾病诊断，此处的疾病是指由DNA结合蛋白质，或同源DNA结合元件中的一个突变体所引起的。患者或受试者可以是人类也可以是其他动物。这种疾病可能是由DNA结合蛋白质的改变所引起的，例如，乳腺癌就是由DNA修复酶BRCAI或BRCA2活性的改变所引起的。其它疾病和它们的分子基础列在表1中(请参阅Hoeijmakers，J.H.J.，Nature 411：366-374，2001，特此提出以供参考)。必需了解的是，表1中所列出的疾病和症状，只代表可以用本发明进行诊断的疾病中的一小部分。表1中的信息仅是一些例证，而不要理解成限制。
表1：与异常DNA结合蛋白质相关的疾病
  疾病或症状   影响的分子机制
  毛血管扩张性运动失调(AT)   双链断裂修复
  AT类似的变异   双链断裂修复
  布卢姆综合症   同源修复
  乳腺癌   同源重组
  抗放射治疗癌   P53(转录因子)
  科凯恩综合症   与转录相连的修复(TCR)
  遗传性非肉息性结肠直肠癌   错配修复
    合成酶IV缺乏症     末端融合
    Nijmegen破损异常     双链断裂修复
    罗-汤综合症     同源修复
    毛发缺疏性营养不良     NER和TCR
    维尔纳综合症     同源重组/贯穿修复
    着色性干皮病     核酸外切修复(NER)
    变异性着色性干皮病     贯穿合成
可使用标准的提取方法，将蛋白质或其它分析物从患者的样品中提取出来，这些提取方法在这个学术领域里广为人知。样品可以是活检组织、血细胞、表皮细胞、毛发囊细胞、组织栓、取自口腔或其它组织来源的上皮细胞等。样品也可以是植物组织、微生物或原核细胞的培养物。将提取的样品与核酸组分混合在一起，并且分析DNA结合的活性，是协助DNA结合的活性还是抑制DNA结合的活性。
我们预见，本发明也可用来识别，可以促进异常DNA结合蛋白质与同源DNA元件相结合，或相反，促进正常DNA结合蛋白质与异常DNA元件相结合的试剂或药物。在另一个具体应用中，本发明可用来识别，可以干扰异常DNA结合蛋白质与同源DNA元件相结合，或相反，干扰正常DNA结合蛋白质与异常DNA元件相结合的试剂或药物。此处所谓的″异常″是指，在患者体内所发现的异常或突变的核酸或蛋白质形式，它们不能再以正常的生理方式，与它们各自的配偶相结合。
以上描述的仅是此项发明的几个较佳的具体应用，不因将此视之为本发明的范围限制。我们预见，熟练的技术人员在应用的过程中，会发现其它上文没有提及的此项发明的具体应用。此项发明进一步强调，任何以及所有会影响DNA-蛋白质交互作用的DNA结合蛋白质、转录因子、新药、新试剂和/或新分析物，都可以用本发明去进行检测或加以识别。
以下再通过一些实施例，进一步说明此项发明。这些实施例只是为了说明本发明，并非限制本发明的应用范围。
实施例1：检测E.coli中所具有的序列-特异性DNA结合蛋白质-AMP受体蛋白质(CAP)
CAP是一种细菌转录激活因子，通过识别特定序列与DNA结合，结合常数是Kd＝约0.1nM(Busby，S.和Ebright，R.H.J.Mol.Biol.293，199-213，1999)。以相当于一个共通CAP结合位点(Ebright，R.H.，Ebright，Y.W.& Gunasakera，A.Nucleic Acids Res.17，10295-10305，1989)的一段长为38bp的DNA序列，作为该低聚核苷酸的设计基础，而根据图1A所展示的方法去制备CAP分析试剂所需要的低聚核苷酸。图3说明了该设计的细节。接下来的四个低聚核苷酸是使用标准氨基磷酷自动化低聚核苷酸合成仪合成的。(F＝dT-荧光素；D＝dT-丹磺酞)：
5’-AACGCAATAAATGTGA                (CAP1；SEQ ID NO：1)
5’-AGFAGATCACATTTTAGGCACC3’                 (CAP2；SEQ ID NO：2)
5’-GGTGCCTAAAATGTGA                (CAP3；SEQ ID NO：3)
5’-TCDACTTCACATTTATTGCGTT          (CAP4；SEQ ID NO：4)
使用商业界提供的dT-荧光素和dT-丹磺酞(Glen Reseach，Sterling，VA)将荧光供体(荧光素)和荧光受体(丹磺酸)放入DNA片断，其中dT代表脱氧胸腺嘧啶。低聚核苷酸通过所述RPC柱子(Pharmacia公司出产)逆相层析纯化(Heyduk，E.和Heyduk.，T Anal.Biochem.248，216-227，1997)0含有低聚核苷酸的片断经过真空离心机干燥，然后用50μl的水溶解。将小部分储存液稀释到400μl，然后测其紫外线一可见光(UV-VIS)的吸收光谱以检测低聚核苷酸储存液的浓度。低聚核苷酸CAPI(SEQ IDNO：1)与低聚核昔酸CAN(SEQ ID NO：4)杂交形成CAP1/CAN双链。低聚核苷酸CAP2(SEQ ID NO：2)与低聚核苷酸CAPS(SEQ ID NO：3)杂交形成CAP2/CAP′)双链。杂交时，将合适的低聚核昔酸配成浓度为10mm的100。1溶液，溶液中含有50mM的Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃加热1分钟后，在1小时之内冷却到25℃。随后所有的荧光测量都是在25℃下进行的，将含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM氯化钠(或50nM的氯化钠，根据指示而定)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及200μM cAMP的测量溶液，放在200μl的石英试管中，使用Aminco-Bowman系列2的分光荧光计去进行测量。激发光波长为490nm，发光波长为500到650nm。
图4A显示的是50nM CAP2/CAP3双链的光谱(曲线1)，以及在50nM CAPI/CAN双链存在的情况下，50nM CAP2/CAP3双链的光谱(曲线2)。CAP1/CAN双链存在时，并没有引起CAP2/CAP3双链光谱发生很大变化，这说明当CAP蛋白质不存在时，CAP1/CAN双链和CAP2/CAPS双链几乎不发生结合。图4B显示的是加了CAP蛋白质后，所观察到的荧光变化。曲线1记录的是50nM CAP1/CAP4双链和50nM CAP2/CAP3双链的荧光光谱。曲线2是加入75nM CAP蛋白质，温育15分钟，然后记录的荧光光谱读数。与对照组信号强度相比，所观察到的荧光猝灭程度大约为50％。这个现象与下列预测一致：CAP蛋白质的存在，会促进CAP1/CAP4双链和CAP2/CAP3双链的结合，从而使CAP2/CAP3双链上的荧光素(荧光供体)与CAPI/CAP4双链上的丹磺酰(荧光受体)紧密接近，这使得荧光素和丹磺酰之间因共振能量转移而导致荧光猝灭。
为了检验所观察到的荧光猝灭的特异性，在cAMP不存在的情况下我们重复了图4B中的实验。由于CAP的序列-特定结合需要cAMP的存在，因此当cAMP不存在时，只观察到低亲合力的非-特异性DNA结合。当cAMP不存在时，加入CAP蛋白质亦没有观察到荧光的变化(图4C)，这更进一步证明了这个分析法的特异性。而且，在加入高浓度(400nM)的Trp抑制因子(″TrpR″)这种不相关的DNA结合蛋白质时，也没有观察到荧光的变化(图4D)。
图5中的实验是测试加入未标记的DNA双链对此分析法的影响。使用下列低聚核苷酸制备两个未标记的30bp的DNA双链：
5’-CCTAAAATGTGATCTAGATCACATTTATTG-3’  (SP1；SEQ ID NO：5)
5’-GCATCGGTCACTGCAGTCTCGACAGCTACG-3′  (NSP1；SEQ ID NO：6)
为了制备30bp的双链，将SP1和NSP1低聚核苷酸分别与其互补的单链低聚核苷酸杂交，杂交方式和上述CAP低聚核苷酸一样。SP1 DNA(SEQ ID NO：5)含有CAP蛋白质的共通结合位点，其中NSPI DNA(SEQ ID NO：6)代表一段随机DNA序列。首先，我们在含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，50nM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及200μM cAMP的测量溶液中，测量了在50mM CAP存在的情况下，50nM CAP2/CAP3双链荧光的光谱(曲线1；图5A和图5B)。逐渐增加SP1双链(图5A)和NSP1双链(图5B)的浓度，然后重复所述测量。所使用的双链浓度分别如下：19.6nM(曲线2)，39.1nM(曲线3)，58.7nM(曲线4)，97.6nM(曲线5)和194.2nM(曲线6)。每种条件下所观察到的荧光猝灭显示在图5C中。含有CAP结合位点的DNA双链能有效的阻止CAP蛋白质的检测，而含有随机序列的双链对CAP蛋白质的检测没有影响。因此，图5中的结果，不仅为CAP蛋白质的检测特异性提供了另一个证明，同时也说明了这种竞争性分析法可以用来评估蛋白质与多种DNA分子间，有关的结合亲合力的大小。
图6显示的是在分析中逐渐增加CAP蛋白质的量时所观察到的荧光变化。这个试验的条件与图4所述的试验条件是一样的。荧光猝灭作用随着CAP蛋白质浓度的增加成比例的增加，直到CAP蛋白质浓度在～150nM时达到信号饱和。这个结果暗示：这个分析方法可用来检测样品中DNA结合蛋白质的浓度。
我们也研究了CAP诱导荧光猝灭的动力学原理，以确定完成分析所需的时间(图7)。在这个试验中，将激发波长设定在490nm处，而在520nm处监测50nMCAP2/CAP3双链荧光强度随时间的变化。在图7中用箭头所标记的时间点，加入100nM的CAP蛋白质，然后继续监测荧光信号。根据数据，反应大约在15分钟内完成，这说明了这个分析方法只需要15-30分钟的温育时间便可完成。实施例2：使用不同发光谱的荧光染料和不同的荧光信号检测摸式的论证使用标准氨墓磷醋自动化低聚核苷酸合成法合成下列低聚核苷酸。这两条低聚核苷酸含有与CAP2和CAN相同的序列。其中x代表氨基-脱氧胸腺嘧啶。
5’-AGXAGATCACATTTTAGGCACC-3’  (CAPS；SEQ ID NO：N0：7)
5’-TCXACTTCACATTTATTGCGTT-3’  (CAP6：SEQ ID NO：NO：8)
在前述CAP2和CAP4低聚核苷酸中分别导入荧光素-dT和丹磺酰-dT的位点，导入氨荃修饰分子C2 dT(Glen Research，Sterling，VA)。氨基修饰分子C2 dT含有一个活性的脂肪氨基团，它能与任何有氨基反应活性的荧光探针共价结合。用7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸，玻拍酸酯去修饰CAP5(SEQ ID NO：NO：7)和CAP6(SEQID NO：NO：8)低聚核苷酸。这个荧光物在433nm处被激发，其最大的发光出现在475nm处，这使得可以用不同发光颜色去进行测试分析。为了修饰荧光染料，将约20nM的低聚核苷酸溶解在50μl的50mM NaHCO3(pH值为8.3)中，加入50nM干燥的7-二乙基氨荃香豆素-3-羧基酸-玻拍酸酯(Molecular Probes，Eugene，OR)。反应混合物在室温下温育过夜。未结合的多余染料通过G-25旋转柱去除(AmershamPharmacia Biotech，皮斯卡塔韦，NJ)，被标记的低聚核苷酸则通过逆相层析进一步被纯化。含有荧光染料标记的低聚核昔酸片段用真空离心机干燥收集，并且溶解在50μl的水中。通过将小部分储存液稀释到400μl，然后测其紫外线-可见光(UV-VIS)的吸收光谱以确定低聚核苷酸储存液的浓度。被7-二乙墓氨基香豆素-3-羧基酸-玻泊酸酯标记的CAP5低聚核苷酸与CAP3低聚核苷酸杂交形成CAP5/CAP3双链。被7-二乙基氨基香豆素-3-按基酸-玻拍酸酷标记的CAP6低聚核苷酸与CAP1低聚核苷酸杂交形成CAP6/CAP1双链。杂交时，将合适的低聚核苷酸配成浓度为10mM的100μl溶液，溶液中含有50mM的Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃加热1分钟后，在1小时之内冷却到25℃。
在第一个实验中(图8)，用CAP分析法去检测CAP5/CAP3和CAP4/CAP1核酸双链对。在这种模式中，出现在CAP5/CAP3双链中的7-二乙荃氨鳌香豆素-3-按基酸-唬珀酸酯标记，其功能是荧光供体，而结合在CAP4/CAP1双链上的丹磺酸标记，其功能则是荧光受体。实验在25℃下进行，所用的测量溶液包含：50mMTris/HCl(pH值为8.0)，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)以及200μM cAMP。图8中曲线1显示的是没有CAP蛋白质时，50nM CAP5/CAP3加上CAP4/CAP1溶液的荧光光谱。加入100nM CAP蛋白质后，如预料的，产生了急剧的(～70％)荧光猝灭反应(图8，曲线2)。
在第二个实验中(图9)，用CAP分析法去检测CAP6/CAP1和CAP2/CAP3核酸双链对。在这种分析模式中，出现在CAP6/CAP1双链上的7-二乙墓氨基香豆素-3-羧基酸-玻珀酸酯标记，其功能是荧光供体，而结合在CAP2/CAP3双链上的荧光素标记，其功能则是荧光受体。在这里，供体和受体都可产生荧光。实验在25℃下进行，所用的测量溶液包含：50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及200μM cAMP：图9中曲线1显示的是50nM CAP6/CAP1加上CAP2/CAP3溶液的荧光光谱。激发光波长是433nm，在475nm处可观察到主要发射峰，这是7-二乙基氨基香豆素-3-梭基酸的发射最大值。在520nm处所观察到的肩角，是由荧光的剩余发射所导致的，它并且在433nm处出现小程度的激发。当加入不同量的CAP蛋白质，从0到150nM(曲线2-9)，在475nm处会出现一个显著的猝灭峰，在520nm处会出现一个显著的增强峰。荧光素的发射最大值是在520nm处。这些数据说明了，CAP蛋白质或其它任何同源DNA结合蛋白质的检测，既可以通过475nm处的荧光猝灭反应，又可以通过520nm处的荧光增强反应来完成。而且，正如图9中插图所示，520nm和475nm处的荧光强度比率，可用来检测DNA结合蛋白质的浓度。这种测比率的信号检测模式非常有用，因为它受微小误差(例如移液误差，分析样品中的不相关化合物所引起的猝灭)的影响比较小。总体来说，这个试验中的数据说明了，本发明所述的分析方法，为所使用的荧光探针本质、探针的发光谱以及荧光信号的检测模式等方面，提供了很大的灵活性。
实施例3：cAMP等分析物的检测法
许多DNA结合蛋白质的活性是通过小分子、其它蛋白质或细胞事件(如磷酸化)来调节的。因此，我们预见，本发明可以用来识别或检测这些具有调节作用的小分子或细胞事件。
CAP蛋白质与cAMP和cGMP都具有微摩尔(micromolar)的亲和力(Takahashi，M.，Blazy，B.和Baudms，A.Biochemistry，9，5124-30)。因此，CAP蛋白质本身乃是一个很弱的检测cAMP的试剂。然而CAP与其同源DNA结合序列的高度亲和力，却是选择性的依赖于cAMP，而非cGMP。由于只有cAMP与序列一特定的DNA以热力学的关系相结合，是以当含有CAP结合位点的DNA存在时，CAP与cAMP之间的亲和力增加了1000倍，但与cGMP之间的亲和力则不变。因此当含有CAP结合位点的DNA存在时，CAP就成了对cAMP具有灵敏度和选择性的传感器。
正如图4C中所展示的，当cAMP不存在时，CAP蛋白质不会引起荧光信号强度的变化。为了证明可以使用CAP分析法来检测cAMP我们在含有50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及75nM CAP的测量溶液中，测量了50nM CAPI/CAP4加上CAP2/CAP3溶液在不同CRP浓度下的荧光强度，其中cAMP的浓度范围是0-100μM。图10显示的是，一如预期，所观察到的荧光猝灭的程度与cAMP的浓度成正比，大约到5μM的cAMP时达到信号饱和。因此，本发明可以成为cAMP或任何可加强DNA结合之试剂或事件的敏感检测器。
这个分析设计的灵活性，正是本发明的最大优势，它显著地优化了分析的灵敏度，荧光发光的颜色，和/或荧光信号的检测模式。虽然这个实施例示范了如何应用本发明来检测cAMP，但是我们预见，本发明并不仅限于检测cAMP。任何分子，只要它的存在能与DNA和DNA结合蛋白质之间亲合力变化相联连，都可以应用本发明去加以检测。更广泛地讲，任何能影响DNA结合蛋白质与DNA之间亲合力的过程，都能应用本发明去进行分析。
实施例4：使用被灵活的长接头分子连接的DNA的变通分析法
图1中所显示的分析法的性质，端赖核酸片段的总浓度而定。而使用一个很长的灵活接头共价连接两个DNA双链(亦即分析溶液中所用的成分)，在荧光信号检测的范围内，以及在能够满足蛋白质结合的DNA浓度范围内，分析法变成对DNA浓度不具依赖性。图11显示的是检测CAP分析法的一种变通设计。分析中的核酸组分在合成低聚核苷酸时，通过导入12个单位的间-18-氨基磷酸酯部分彼此共价连接(Glen Research，Sterling，VA)，其结构显示在图11B中。加入12个单位的间-18，使得被连接的低聚核苷酸之间的距离变成～270A.备制下列低聚核苷酸(F＝dT-荧光素，D＝dT丹磺酰，X＝间-18)：
CFA GAT CAC ATT TTA GGC ACC XXX XXX XXX XXX AAC GCA ATA AAT
GTG AT                           (CAP7：SEQ ID NO：9)
CDA GAT CAC ATT TAT TGC GTT      (CAP8：SEQ ID NO：10)
GGT GCC TAA AAT GTG AT           (CAP9：SEQ ID NO：11)
用前述的方法(Heyduk，E.和Heyduk.，T.Anal.Biochem.248，216-227，1997)，在一个RPC柱上(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，使用逆相层析版纯化低聚核苷酸。含有低聚核苷酸的片断经过真空离心机干燥收集，然后用50μl的水溶解。将小部分储存液稀释到400μl，然后测其紫外线一可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核昔酸储存液的浓度。为了形成CAP7/CAP8/CAP9双链(图11A)，将CAP7，CAP8和CAP9(序列编号分别为9，10，11)低聚核苷酸，混合为浓度为10μM的100μl测量溶液，溶液中含有50mM的Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃加热1分钟后，在1小时之内冷却到25℃。
这项具体应用的另一个优点是，产生信号所需要的温育时间被缩短了，因为如图11A所示，当核酸组分被连接起来后，由于每个成分之间的距离相对而言变得比较近，因而核酸组分之间的结合反应速率增加了。如果核酸组分需要被固定在固体支持物上，那么以上所提及的本发明的变通方法将是较好的选择。我们预见，一个具反应性的氨基团可以被包含在接头中，而接头将整个核酸构建固定在固体支持物上。
图12显示的是图11中所述的，有关本发明的一种改进的变通设计。图12A中曲线1表示50nM CAP7/CAP8/CAP9构建，在包含50mM Tris/HCl(pH值为8.0)，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及200μM cAMP测量溶液中的光谱。加入75nM CAP蛋白质会引起大约70％的荧光信号猝灭，这说明使用这种分析模式，很容易检测到DNA结合蛋白质。我们也研究了CAP蛋白质诱导荧光猝灭的动力学，以确定完成分析所需要的温育时间(图12B)。在这个实验中，将发光波长设定在490nm处，监测50nM CAP7/CAP8/CAP9构建在发光波长520nm处的荧光强度变化与时间的关系。在图12B中箭头标示的时间点，加入75nM的CAP蛋白质，然后继续监测荧光信号。在加入CAP蛋白质所需的时间内(约20秒内)，反应已经基本上完成了。因此核酸组分的连接，使得荧光信号发生变化所需要的时间急剧减短。
实施例5：Lac抑制蛋白质(LacR)的检测法。
为了证明本发明具有检测、识别或定量任何DNA结合蛋白质的普遍性能力，合成下列含有Lac抑制结合元件的低聚核苷酸(F＝dT-荧光素，D＝dT-丹磺酸)：
GGTGTGTGGAATTGTGA          (Lac1；SEQ ID NO：12)
GCGFATAACAATTTCACACAGG     (Lac2；SEQ ID NO：13)
CTTGTGTGAAATTGTT           (Lac3；SEQ ID NO：14)
ADACGCTCACAATTCCACACACC    (Lac4；SEQ ID NO：15)
用前述的方法(Heyduk，E.和Heyduk.，T.Anal.Biochem.248，216-227，1997)，在RPC柱上使用逆相层析版纯化低聚核苷酸(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有低聚核苷酸的片段用真空离心机干燥收集，并且溶解在50μl的水中。将小部分储存液稀释到400μl，然后测其紫外线-可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核昔酸储存液的浓度。低聚核苷酸Lac1(SEQ ID NO：12)与低聚核苷酸Lac4(SEQ ID NO：15)杂交形成Lac1/Lac4构建，低聚核苷酸Lac2(SEQ ID NO：13)与低聚核苷酸Lac3(SEQ ID NO：14)杂交形成Lac2/Lac3构建。为了进行杂交，将合适的低聚核普酸配成浓度为10μM的100μl测量溶液，溶液中含有50mM的Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃加热1分钟后，在1小时内冷却到25℃。随后所有的荧光测量都是在25℃下，在含有50mm的Tris/HCl(PH值为8.0)，100mbf的氯化钠(NaCl)，1mm的乙二胺四乙酸以及0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的测量溶液中进行。通过杂交所获得的双链核酸构建显示在图13中。双链含有LacR结合位点(下面划线的序列)，而这些LacR结合位点源自于分裂到两个双链构建中每个双链构建上的Lac操纵子序列。
图14曲线1记录的是，当LacR不存在时，50nM Lac1/Lac4加上Lac2/Lac3的荧光光谱，图14曲线2-7记录的是，加入0-200nM范围内不同量的LacR的荧光光谱。荧光信号猝灭的程度与加入反应混合物中LacR的量成正比，大约到150nM的LacR时达到信号饱和(图14中插图)。通过在分析混合物中加入5mM的IPTG可以验证了LacR检测法的特选性，其中IPTG选择性地与LacR结合并且降低了LacR的DNA结合活性。
实施例6：Trp抑制蛋白质(TrpR)的检测法。
为了更进一步证明本发明具有检测、识别或定量任何DNA结合蛋白质的普遍性能力，合成了下列含有Trp抑制子结合元件的低聚核昔酸(F＝dT-荧光素，D＝dT-丹磺酰)：
GAGATCTATCGAACTA          (Trp1；SEQ ID NO：16)
GFAAACTAGTACGAAACTAGAG    (Trp2；SEQ ID NO：17)
CTCTAGTTTCGTACTA          (Trp3；SEQ ID NO：18)
GDTTACTAGTTCGATAGATCTC    (Trp4；SEQ ID NO：19)
用前述的方法(Heyduk，E.和Heyduk.，T.Anal.Biochem.248，216-227，1997)，在RPC柱上使用逆相层析版纯化低聚核苷酸(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ).含有低聚核苷酸的片段用真空离心机干燥收集，并且溶解在50μl的水中。将小部分储存液稀释到400μl，然后测其紫外线一可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以确定低聚核苷酸储存液的浓度。低聚核苷酸Trp1(SEQ ID NO：16)与低聚核苷酸Trp4(SEQ ID NO：19)杂交形成Trp1/Trp4构建，低聚核苷酸Trp2(SEQ ID NO：17)与低聚核苷酸Trp3(SEQ ID NO：18)杂交形成Trp2/Trp3构建。为了进行杂交，将合适的低聚核苷酸配成浓度为10μM的100μl测量溶液，溶液中含有50mM的Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃加热1分钟后，在1小时之内冷却到25℃。随后所有的荧光测量都是在15℃下，在含10mM的钾磷酸盐(pH值为7.6)，50mM的氯化钠(NaCl)，0.1mM的乙二胺四乙酸，4mM的色氨酸，10％的丙三醇，0.01％叠氮钠，以及1.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的测量溶液中进行。通过杂交所获得的双链核酸构建显示在图15中。双链含有一个TrpR结合位点(下面划线的序列)。，这个结合位点分裂到两个双链构建中图16A曲线I记录的是，当TrpR不存在时，溶液中含有250nM Trp1/Trp4和300nMTrp2/Trp3的荧光光谱，图16曲线2-5记录的是，加入0-800nM范围内不同量的TrpR的荧光光谱。荧光信号猝灭的程度与加入反应混合物中TrpR的量成正比，TrpR大约在150nM时信号达到饱和(图16B)。通过在含有用来检测LacR蛋白质核酸组分的分析混合物中加入TrpR，验证了TrpR检测法的特异性(图16A，插图，曲线1和2)。
实施例7：使用双色检测法同时检测两个蛋白质。
由于本发明中所述的分析方法，能够兼容可以发射不同波长的各种探针，因此通过不同的实验设计，可以同时检测。将每个待检测的蛋白质所对应的特定的核酸构建，标上具有不同发光波长的探针。在这个实施例中，反应混合物中含有被7-二乙基氨基香豆素-3-狡基酸标记用来检测CAP蛋白质的核酸构建(参见实施例2)，以及被荧光素标记用来检测饰抑制蛋白质的核酸构建(参见实施例6)。更确切的描述是，混合物中还含有100nM的CAP5/CAP3，120nM的CAP1/CAP4，100nMTrp2/Trp3和120nM Trp1/Trp4双链。
图17显示的是证明这种兼容性的实验结果。所有的测量都是在15℃下，在含有10mM的钾磷酸盐(pH值为7.6)，50mM的氯化钠(NaCl)，0.1mM的乙二胺四乙酸，4mM的色氨酸，200μM cAMP，10％的丙三醇，0.01％的叠氮钠。以及1.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的测量溶液中进行。以下分别记录的是，当蛋白质不存在时，在433nm激发光处(7-二乙荃氨基香豆素-3-数基酸激发光，图17A)和490nm激发光处(荧光素激发光，图17B)的荧光光谱(曲线1)，当只有CAP存在时(曲线2)，当只有TrpR存在时(曲线3)，当CAP和TrpR都存在时(曲线4)的荧光光谱。当只有CAP存在时，荧光信号不发生变化(图17B，曲线2)，此处会观察到大约60％的7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸信号发生猝灭(图17A，曲线2)。当只有TrpR存在时，7-二乙基氨基香豆素-3-羧基酸信号不发生变化(图17A，曲线3)，此处会观察到大约60％的荧光信号发生猝灭(图17B，曲线3)。最后，当CAP和TrpR都存在时，两个发光谱的猝灭反应都会被观察到(图17A&B，曲线4)。图17C用条状格式总结了这些结果，其中黑色条状代表检测CAP时所观察到的荧光颜色的猝灭，灰色条状代表检测TrpR时所观察到的荧光颜色的猝灭。这个实施例的数据证明了，应用本发明所述的分析方法，可以同时使用多色检测法来检测两个或两个以上的分析物。
实施例8：p53蛋白质的检测法。
p53蛋白质的突变对许多种类型的肿瘤发展很具关键性，绝大多数的肿瘤中含有p53蛋白质的突变形式(Ko，L.L.，和Prives，C.，Gene Dev.10，1054-1072，1996)。另外，缺少p53蛋白质功能的肿瘤对放射治疗很顽抗。p53蛋白质通过序列特定的方式结合到双链DNA上，它的DNA结合活性对它的功能是很重要的。从人类肿瘤中分离出来的绝大多数的突变p53蛋白质，都缺乏DNA结合活性。因此，能够针对p53蛋白质的存在与否和其特定活性进行检测的功能性分析方法，将会为癌症的识别和治疗，提供一个非常重要的诊断工具。
为了证明这个分析方法具有检测p53蛋白质的能力，合成下列含有同源p53结合元件的低聚核苷酸(F＝dT荧光素，D＝dT-丹磺酰)：
GCATCGGTCACAGACA              (P1；SEQ ID NO：20)
TGCCFAGACATGCCTTGCAGTCTCGA    (P2；SEQ ID NO：21)
TCGAGACTGCAAGGCA              (P3；SEQ ID NO：22)
TGTCDAGGCATGTCTGTGACCGATGC    (P4；SEQ ID NO：23)
用前述的方法(Heyduk，E.和Heyduk.，T Anal.Biochem.248，216-227，1997)，在RPC柱上使用逆相层析版纯化低聚核普酸(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)。含有低聚核苷酸的片段用真空离心机干燥收集，井且溶解在50μl的水中。将小部分储存液稀释到400μl然后测其紫外线一可见光(UV-VIS)的吸收光谱，以检测低聚核苷酸储存液的浓度。低聚核苷酸P1(SEQ ID NO：20)与低聚核苷酸P4(SEQID NO：23)杂交形成P1/P4构建。低聚核苷酸P2(SEQ ID NO：21)与低聚核苷酸P3(SEQ ID NO：22)杂交形成P2/P3构建。为了进行杂交，将合适的低聚核苷酸配成浓度为10μM的100μl测量溶液，溶液中含有50mM的Tris/HCl(pH值为8.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸，在95℃加热1分钟后，在1小时之内冷却到25℃。随后所有的荧光测量都是在25℃下，在含有50-mM的钾磷酸盐(pH值为7.5)，50mM的氯化钠(NaCl)，0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以及100成的非特异性30-by DNA双链的测量溶液中进行。通过杂交所获得的DNA双链显示在图18中。DNA双链含有10-bp的重复序列：PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy(SEQID NO：24)，这段序列分裂在两个DNA双链上。而这段序列(SEQ ID NO：24)已经被确认为是一个p53识别序列的共通序列(E1-DeiryW.S.，Kem.，S.E，Pietenpol，J.A.，Kinzler，K.W和Vogelstein，B.Nature Genetics，1，45-49，1992)。在这个分析方法中所使用的p53蛋白质，是一个在细菌中表达的人体重组全长蛋白质(Dr.KathleenS.Matthews；Nichols，N.M和Matthews，K.S.Biochemistry 40，3847-3858，2001，特此提出以供参考)。
图19A曲线1记录的是，当p53蛋白质不存在时，25nM的P1/P4加上30nM的P2/P3的荧光光谱，图19A曲线2-6记录的是，当p53的量在0-130nM之间时，不同量的p53的荧光光谱。所观察到的荧光信号猝灭程度与加入分析混合物中的p53蛋白质的量成正比(图19B)。以下的实验结果验证了p53测定法的特异性：将p53蛋白质加入含有CAP1/CAP4和CAP2/CAP3核酸构建的反应混合物中，并没有发生荧光猝灭(图19A，插图，曲线1代表p53不存在时所观察到的信号，曲线4-5代表加入1-90nM的p53所观察到的信号)。总结起来，这个实施例证明了目前本发明可以普遍的应用在任何以及所有的DNA结合蛋白质上，包括重要的哺乳类的肿瘤抑制蛋白质，例如p53蛋白质。
通过前述的启示，这个领域中熟练的技术人员，在具体应用本发明中的方法时，很可能会发现许多其它修改，变动，以及替代的方法，而这些方法并不脱离此项发明的精神或范畴。
                           序列表
<110>T.海普克(Heyduk，Tomasz)
<120>检测和定量DNA结合蛋白质的快速且敏感的以距离效应为基础的测定法
<130>16153-7963
<160>24
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>1
aacgcaataa atgtga                                                16
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>3
<223>n＝被荧光素标记的t
<400>2
agnagatcac attttaggca cc                                         22
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>3
ggtgcctaaa atgtga                                                  16
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>3
<223>n＝被丹磺酰标记的t
<400>4
tcnacttcac atttattgcg tt                                           22
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>5
cctaaaatgt gatctagatc acatttattg                                   30
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>6
gcatcggtca ctgcagtctc gacagctacg                                   30
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>3
<223>n＝氨基修饰的胸腺嘧啶
<400>7
anangatcac attttaggca cc                                           22
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>3
<223>n＝氨基修饰的胸腺嘧啶
<400>8
tcnacttcac atttattgcg tt                                           22
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>2
<223>n＝被荧光素标记的胸腺嘧啶
<220>
<221>misc-feature
<222>21...22
<223>一个非核苷酸间隔元件，18-0-二甲氧基三苯甲基六乙烯基乙二醇，1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-氨基磷酸酯，被共价插入核苷酸21和22之间
<400>9
cnagatcaca ttttaggcac caacgcaata aatgtgat                                38
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>2
<223>n＝被丹磺酰标记的胸腺嘧啶
<400>10
cnagatcaca tttattgcgt t                                                  21
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>11
ggtgcctaaa atgtgat                                                       17
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>12
ggtgtgtgga attgtga                                                       17
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>4
<223>n＝被荧光素标记的胸腺嘧啶
<400>13
gcgnataaca atttacaca gg                                                  22
<210>14
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>14
cttgtgtgaa attgtt                                                      16
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>2
<223>n＝被丹磺酰标记的胸腺嘧啶
<400>15
anacgctcac aattccacac acc                                              23
<210>16
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>16
gagatctatc gaacta                                                      16
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>2
<223>n＝被荧光素标记的胸腺嘧啶
<400>17
gnaaactagt acgaaactag ag                                               22
<210>18
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>18
cactagtttc gtacta                                                      16
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>2
<223>n＝被丹磺酰标记的胸腺嘧啶
<400>19
gnttactagt tcgatagatc tc                                                 22
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>20
gcatcggtca cagaca                                                        20
<210>21
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>5
<223>n＝被荧光素标记的胸腺嘧啶
<400>21
tgccnagaca tgccttgcag tctcga                                             26
<210>22
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>22
tcgagactgc aaggca                                                        16
<210>23
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<220>
<221>修饰过的碱基
<222>5
<223>n＝被丹磺酰标记的胸腺嘧啶
<400>23
tgtcnaggca tgtc tgtgac cgatgc                                            26
<210>24
<211>10
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>
<222>
<223>这些序列是化学合成的，但也可以通过重组方法产生
<400>24
rrrcwwgyyy                                                               10

Claims (36)

1.一种确定样品中DNA结合因子活性的方法，其特征在于，所述方法包括使两种核酸组分与样品结合，其中，
(a)每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的DNA结合元件，
(b)其中一个核酸组分被荧光供体标记，另一个核酸组分被荧光受体标记，以及
(c)通过以距离效应为墓础的冷光检测法来检测包含在样品中的一个或多个DNA结合因子与DNA结合元件之间的结合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
(a)DNA结合因子选自转录因子、染色质重建因子以及基因组维持酶，和
(b)以距离效应为基础的冷光检测法选自荧光共振能量转移(″FRET″)、冷光共振能量转移(″LRET″)、荧光交叉相关分光术(″FCCS″)、流式细胞仪、闪烁亲近测定法(″SPA″)、定向猝灭、基态复合物形成、化学发光能量转移(″CRET″)、生物发光能量转移(″BRET″)和受激准分子形成。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA结合因子是转录因子。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以距离效应为基础的冷光检测法是FRET。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述两种核酸组分被一个接头连结在一起。
6.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述接头由间-18-氨基磷酸酯部分构成。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸组分被固定在一个固体底物上。
8.一种检测样品中增强子复合物蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括使DNA分子与所述样品结合，其中
(a)所述DNA分子至少包含两个DNA结合元件。
(b)所述DNA分子的一个位点被荧光供体标记，另一个位点被荧光受体标记，
(c)通过以距离效应为墓础的冷光检测法来检测一个或多个增强子复合物蛋白质与DNA分子的结合。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述DNA分子被固定在固体底物上。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，以距离效应为基础的冷光检测法选自荧光共振能量转移(″FRET″)、冷光共振能量转移(″LRET″)、荧光交叉相关分光术(″FCCS″)、流式细胞仪、闪烁亲近测定法(″SPA″)、定向猝灭、基态复合物形成、化学发光能量转移(″CRET″)、生物发光能量转移(″BRET″)和受激准分子形成。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，以距离效应为墓础的冷光检测法是FRET。
12.一种检测或量化样品中一种分析物的量方法，其特征在于，所述方法包括使两种核酸组分和至少一个DNA结合因子与样品结合，其中
(a)每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的DNA结合元件，
(b)其中一个核酸组分被荧光供体标记，另一个核酸组分被荧光受体标记，
(c)通过以距离效应为墓础的冷光检测法来检测DNA结合因子与DNA结合元件之间的结合，以及
(d)DNA结合因子与DNA结合元件之间的结合是由分析物介导的。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，
(a)DNA结合因子选自转录因子、染色质重建因子以及基因组维持酶，和
(b)以距离效应为墓础的冷光检测法选自荧光共振能量转移(″FRET″)、冷光共振能量转移(″LRET″)、荧光交叉相关分光术(″FCCS″)、流式细胞仪、闪烁亲近测定法(″SPA″)、定向猝灭、基态复合物形成、化学发光能量转移(″CRET″)、生物发光能量转移(″BRET″)和受激准分子形成。(c)分析物选自二级信使分子、细胞事件、药物、试剂、检测剂、新药物、新试剂和新检测剂。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，DNA结合因子是基因组维持酶。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，以距离效应为基础的冷光检测法是FRET。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，转录因子是CAP，分析物是cAMP。
17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其特征在于，两种核酸组分被一个接头连结在一起。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述接头由间-18-氨基磷酸酯部分构成。
19.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其特征在于，核酸组分被固定在一个固体底物上。
20.一种检测或量化样品中多个不同DNA结合因子的量的方法，其特征在于，所述方法包括使至少至少两组核酸组分与样品结合，其中
(a)一组核酸组分中的每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当所述核酸组分组中的两种核酸组分结合在一起时，就组成一个完整的DNA结合元件，
(b)一组核酸组分中的一个核酸组分被荧光供体标记，一组核酸组分中的另一个核酸组分被荧光受体标记，
(c)每组核酸组分都被一个独特的荧光供体和受体的组合标记，使其在独特的波长处发光，以及
(d)通过以距离效应为墓础的冷光检测法来检测样品中所包含的一个或多个DNA结合因子与DNA结合元件之间的结合。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，
(a)所述DNA结合因子选自转录因子、染色质重建因子以及基因组维持酶，和
(b)以距离效应为签础的冷光检测法选自荧光共振能量转移(″FRET″)、冷光共振能量转移(″LRET″)、荧光交叉相关分光术(″FCCS″)、流式细胞仪、闪烁亲近测定法(″SPA″)、定向猝灭、基态复合物形成、化学发光能量转移(″CRET″)、生物发光能量转移(″BRET″)和受激准分子形成。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，以距离效应为基础的冷光检测法是FRET。
23.一种诊断由DNA结合因子介导的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括使获自受试者的样品与至少两种核酸组分结合，其中
(a)每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的DNA结合元件，
(b)其中一个核酸组分被荧光供体标记，另一个核酸组分被荧光受体标记，
(c)样品含有细胞提取物，以及
(d)通过以距离效应为墓础的冷光检测法来检测样品中所包含的一个或多个DNA结合因子与DNA结合元件之间的结合。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，
(a)DNA结合因子选自转录因子、染色质重建因子以及基因组维持酶，和
(b)以距离效应为墓础的冷光检测法选自荧光共振能量转移(″FRET″)、冷光共振能量转移(″LRET″)、荧光交叉相关分光术(″FCCS″)、流式细胞仪、闪烁亲近测定法(″SPA″)、定向猝灭、基态复合物形成、化学发光能量转移(″CRET″)、生物发光能量转移(″BRE T″)和受激准分子形成。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述DNA结合因子基因组维持酶。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述基因组维持酶是p53。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述以距离效应为基础的冷光检测法是FRET。
28.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述受试者是人类患者。
29.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述人类患者患有某种类型的癌症或由基因组不稳定所导致的疾病。
30.一种检测样品中DNA结合因子活性的方法，其特征在于，所述方法包括使两种核酸组分与样品结合，其中
(a)每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的DNA结合元件，
(b)其中一个核酸组分被酶、辅因子或催化剂标记，另一个核酸组分被化学发光底物或比色底物标记，以及
(c)通过检测冷光或颜色的变化来确定包含在样品中的一个或多个DNA结合因子与DNA结合元件的结合。
31.一个包含数组核酸构建物的阵列，其特征在于，
(a)一组核酸组分中的每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当所述核酸组分组的两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的DNA结合元件，以及
(b)一组核酸组分的一个核酸组分被荧光供体标记，这组核酸组分的另一个核酸组分被荧光受体标记。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述数组核酸构建物被固定在一个固体底物上。
33.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于，一组核酸组分的两种核酸组分被一个接头连结在一起。
34.一种检测样品中DNA结合因子活性的方法，其特征在于，所述方法包括使两种核酸组分与样品结合，其中
(a)每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的DNA结合元件，
(b)其中一个核酸组分连接到一个微球体，另一个核酸组分被荧光染料标记，以及
(c)通过流式细胞仪检测包含在样品中的一个或多个DNA结合因子与DNA结合元件之间的结合。
35.一种确定DNA结合因子与变体核酸序列之间亲合力的方法，其特征在于，所述方法包括使变体核酸序列与DNA结合因子和两种核酸组分结合，其中
(a)每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的DNA结合元件，
(b)其中一个核酸组分被荧光供体标记，另一个核酸组分被荧光受体标记，以及
(c)通过以距离效应为基础的冷光检测法来检测样品中所包含的一个或多个DNA结合因子与DNA结合元件之间的结合。
36.一种检测样品中DM结合因子活性的方法，其特征在于，所述方法包括使两种核酸组分与样品的结合，其中
(a)每个核酸组分都含有DNA结合元件的一部分，当两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的DNA结合元件，
(b)其中一个核酸组分连接到被闪烁体浸透的微球体，另一个核酸组分被放射性同位素标记，以及
(c)通过闪烁亲近测定法检测包含在样品中的一个或多个DNA结合因子与DNA结合元件之间的结合。
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