ES2349592T3 - Métodos de prueba para determinar la concentración intracelular de nucleótidos cíclicos. - Google Patents

Métodos de prueba para determinar la concentración intracelular de nucleótidos cíclicos. Download PDF

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Abstract

Método para determinar la concentración intracelular del nucleótido cíclico AMPc, caracterizado porque: i)se produce y se usa una célula, que expresa junto con una fotoproteína sensible a Ca2+ los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5 y ii)se determina la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos mediante la señal de luminiscencia de la fotoproteína.

Description

Métodos de prueba para determinar la concentración intracelular de nucleótidos cíclicos.
La invención se refiere a métodos para el análisis óptico cuantitativo de la concentración intracelular de guanosín 3',5'-monofosfato cíclico (GMPc) o adenosín 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc). Estos procedimientos pueden ser útiles para identificar y evaluar las propiedades farmacológicas de sustancias de prueba que influyen en la actividad de receptores o enzimas implicados en la síntesis o degradación de los nucleótidos cíclicos GMPc y AMPc. Como resultado, el procedimiento es adecuado, por ejemplo, para encontrar moduladores de receptores acoplados a proteínas G (GPCR), NO sintasas, fosfodiesterasas (PDE) y guanilato ciclasas solubles y unidas a membrana.
La invención describe un método en el que se miden las concentraciones intracelulares de GMPc o AMPc con la ayuda de líneas celulares recombinantes. Estas líneas expresan de manera recombinante una combinación de canales iónicos particulares activados por nucleótidos cíclicos (canales CNG), una fotoproteína sensible a calcio y un receptor o una enzima para los que deben encontrarse moduladores. El procedimiento es adecuado para la automatización y para la selección de alto rendimiento (HTS) y la selección de ultra-alto rendimiento (uHTS) de moduladores.
Los métodos actuales para medir la concentración intracelular de GMPc o AMPc tienen la desventaja de ser muy costosos, debido al uso de radioactividad, de poder automatizarse sólo parcialmente, como mucho, y de ser muy complicados.
Los sistemas comerciales convencionales para determinar GMPc y AMPc son técnicas radioactivas tales como el radioinmunoensayo (RIA; por ejemplo de IBL, Hamburgo, Alemania), el ensayo de proximidad por centelleo (SPA; Amersham Bioscience, RU) y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas no radioactivo (ELISA; por ejemplo de Amersham Bioscience, RU).
Los métodos descritos anteriormente no pueden usarse para medir las concentraciones intracelulares de GMPc y AMPc en células vivas "in situ". Para llevar a cabo las mediciones, tienen que romperse las células y entonces extraerse los nucleótidos cíclicos.
Otro método para medir el AMPc intracelular es la medición con la ayuda de sistemas de promotores inducibles ("elemento de respuesta a AMPc", CRE) y la enzima luciferasa (Goetz et al., J. Biomol. Screen. (2000) 5 377-384). Sin embargo, el método tiene la desventaja de que tienen que producirse tanto la transcripción como la traducción para que se forme la señal, lo que provoca que la medición dure horas. Este método, por tanto, no es adecuado para la medición rápida de las concentraciones de AMPc reales en las células.
El objeto de la invención es encontrar un método no radioactivo, mejorado para medir las concentraciones intracelulares de GMPc y AMPc. La intención en este caso es poder llevar a cabo las mediciones muy rápidamente y también con alta sensibilidad. El método debe automatizarse y debe ser adecuado para la selección de alto rendimiento de muestras o compuestos de prueba (HTS y uHTS).
Los compuestos de prueba según la invención son preferiblemente compuestos químicos de moléculas pequeñas que tienen un peso molecular de desde 100 hasta 500 o desde 100 hasta 1000 o si no mayor que esto. Estos compuestos pueden usarse individualmente o si no como una mezcla en el procedimiento según la invención. Los compuestos de prueba según la invención también incluyen anticuerpos, sustancias naturales, extractos de sustancias naturales, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. Esta lista debe considerarse sólo a modo de ejemplo y no como limitativa.
Con el fin de establecer un sistema de selección para enzimas y receptores que influyen en el nivel intracelular de AMPc o GMPc, se transfectan diversos canales iónicos activados por nucleótidos cíclicos (canales CNG), solos o en diversas combinaciones, en células que expresan adicionalmente una fotoproteína sensible a calcio de una manera recombinante. Posteriormente se transfectan estas células con diversas enzimas o receptores con el fin de someter a prueba la idoneidad de las células para la selección de alto rendimiento. Esto implica usar, por ejemplo, guanilato ciclasa soluble, dado que puede producir GMPc intracelular tras la estimulación. Un ejemplo de un receptor que puede usarse es el receptor \beta-adrenérgico que, tras una activación, induce un aumento en la concentración intracelular de AMPc.
Los canales CNG son proteínas integrales de membrana que se abren con los nucleótidos cíclicos GMPc y AMPc. Esta familia de canales iónicos son canales catiónicos no selectivos que son permeables a iones sodio, potasio y calcio. Los canales funcionales están compuestos de cuatro subunidades idénticas o si no diferentes (homo o heterotetrámeros). Puede influirse en las sensibilidades a GMPc y AMPc combinando diversas subunidades (Biel et al. TCM (1996) 6, 274-280; Kaupp y Seifert, Physiol. Rev. (2002) 82, 769-824). Se han clonado y publicado las subunidades de canal CNG1-CNG6 que, según una nomenclatura más reciente, también se denominan CNGA1-CNB3 (Bradley et al., Science (2001) 294, 2095-2096). También existen variantes de corte y empalme tales como CNG4.3, por ejemplo (Sauter et al., PNAS (1998) 95, 4696-4701). El documento DE 101 388 76 A da a conocer el uso de líneas celulares que contienen canales CNG para determinar la concentración intracelular de Ca^{2+}.
El aumento de la concentración intracelular de GMPc o AMPc da como resultado la apertura de los canales CNG y de ese modo un flujo de entrada de iones calcio. Entonces puede detectarse el calcio entrante con la ayuda de indicadores fluorescentes sensibles a calcio, tales como, por ejemplo, FURA, Fluo-3 etc., o con la ayuda de las fotoproteínas sensibles a calcio tales como aequorina u obelina.
La fotoproteína aequorina que se deriva de la medusa Aequorea victoria es un indicador de calcio altamente sensible en células. El complejo de aequorina consiste en la proteína apoaequorina, oxígeno molecular y la coelentarazina luminófora. Este complejo emite luz azul en presencia de calcio (iones Ca^{2+}), con el máximo de emisión a 466 nm (Jones et al., Trends Biotechnol. (1999) 17, 477-481).
Otra fotoproteína es la obelina que se ha clonado de diversos hidrozoos tales como Obelia longissima, por ejemplo. Ésta consiste en apoobelina, O_{2} y el luminóforo coelenterazina. Asimismo, se emite luz azul en presencia de calcio (Illarionov et al., Métodos Enzymol. (2000) 305, 223-49).
Las guanilato ciclasas son responsables de producir GMPc a partir de GTP. Se hace una distinción entre las guanilato ciclasas solubles y las unidas a membrana. La guanilato ciclasa soluble es un heterodímero compuesto de una subunidad alfa 1 y una subunidad beta 1. Es un receptor natural del monóxido de nitrógeno (NO) producido por la NO sintasa endotelial y por tanto también puede activarse farmacológicamente por sustancias liberadoras de NO tales como, por ejemplo, Sie-1. Dado que el GMPc producido por la guanilato ciclasa induce la relajación de los vasos sanguíneos, la enzima es una diana farmacológica altamente interesante (Hobbs AJ., TIPS (1997) 18, 484-491). Las guanilato ciclasas unidas a membrana tienen un segmento transmembrana y se activan con diversos agonistas tales como ANP, BNP, CNP o guanilina (Wedel y Garbers, Annual Rev. Physiol. (2001) 63, 215-233).
Otra familia de proteínas farmacológicamente interesante son los "receptores acoplados a proteínas G" (GPCR). Estos son proteínas integrales de membrana que pueden transducir la acción de una hormona extracelular hacia el interior de la célula. Se influye en los niveles intracelulares de AMPc o de calcio mediante el acoplamiento de estos receptores a diversas proteínas G. La activación de los "receptores acoplados a Gq" da como resultado una liberación de calcio de reservas internas y por tanto un aumento en la concentración citoplasmática de calcio. La activación de los "receptores acoplados a Gs" da como resultado un aumento en la concentración de AMPc, mientras que la activación de los "receptores acoplados a Gi" reduce el contenido intracelular de AMPc (Gurrath M., Curr. Med. Chem. (2001) 8, 1605-1548). Un ejemplo de receptores acoplados a Gs son los "receptores \beta-adrenérgicos" que pueden estimularse con la ayuda de agonistas tales como isoprenalina (Dzimiri N., Pharmakol. Rev. (1999) 51, 465-
501).
Los nucleótidos cíclicos GMPc y AMPc producidos por guanilato ciclasas y los GPCR, respectivamente, se hidrolizan mediante "fosfodiesterasas" (PDE) para dar GMP y AMP, respectivamente. Las fosfodiesterasas son una familia de enzimas cuyos miembros son claramente diferentes con respecto a los patrones de especificidad del sustrato, regulación y expresión en el organismo (Francis et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. (2001) 65, 1-52). Las PDE desempeñan una parte decisiva en el control de los niveles intracelulares de AMPc y GMPc y por tanto son asimismo dianas importantes para la intervención farmacológica.
Sorprendentemente, la combinación del canal CNG3 (SEQ ID NO: 5, n.º de registro X89600) o, en particular, el canal CNG2 (SEQ ID NO: 1, n.º de registro X55010) con una fotoproteína resultó ser particularmente adecuada para detectar cambios en las concentraciones intracelulares de GMPc (figura 1).
Una sorpresa similar fue una combinación de CNG2/CNG4.3/CNG5 (SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 2, n.º de registro AJ000515/SEQ ID NO: 3, n.º de registro U12623) y una fotoproteína, que resultó ser muy adecuada para detectar los cambios en la concentración intracelular de AMPc (figura 3). La combinación de CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5 (SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 2/ SEQ ID NO: 3) con una fotoproteína resultó ser particularmente adecuada para la medición del AMPc. En el mutante de CNG2, CNG2(T537A) (SEQ ID NO: 4), se ha sustituido el aminoácido treonina-537 por alanina. (Altenhofen et al., PNAS (1991) 88, 9868-9872).
Las líneas celulares recombinantes pueden prepararse usando vectores comunes tales como pcDNA1.1 Amp o pcDNA3 (Invitrogen Life Technologies). Pueden usarse reactivos de transfección comunes tales como, por ejemplo, lipofectamina (Invitrogen Life Technologies) para transfectar los constructos de plásmido correspondientes.
Las células se siembran para las mediciones en placas de microtitulación (MTP) de 384 pocillos a 1500 células por pocillo y en MTP de 1536 pocillos a 250 células por pocillo. Tras 1-2 días de crecimiento a 37ºC/CO_{2} al 5%, se extrae el medio de cultivo celular (DMEM/F12 que contiene suero bovino fetal al 10%) y se cargan las células con coelenterazina (0,8 \mug/ml) en solución Tyrode libre de calcio a 37ºC/CO_{2} al 5% durante 3 h. Posteriormente, se añaden las sustancias de prueba y las sustancias control apropiadas (por ejemplo SIN-1 o isoprenalina) en la solución Tyrode libre de calcio y se incuban en las células durante 5-10 min. Entonces se lleva a cabo la medición extra en una caja hermética a la luz añadiendo la solución Tyrode que contiene calcio mediante un peine (concentración final de calcio: 3 mM), con la ayuda de una cámara con dispositivo acoplado de carga.
Para medir los efectos de las sustancias directamente, se cargan las células con coelenterazina en solución Tyrode que contiene calcio. Entonces se añaden las sustancias dentro de la caja hermética a la luz y se inicia la medición inmediatamente con la adición de las sustancias (figura 5).
Las ventajas de este procedimiento son la alta sensibilidad de la medición, los bajos costes por punto de medición y la idoneidad para HTS y uHTS. El procedimiento tiene una excelente razón señal con respecto a ruido, y es posible lograr factores de estimulación de 50-150. Además es posible aplicar sustancias de prueba durante periodos de tiempo muy cortos, dado que una señal puede ya observarse tras algunos segundos (figura 5). Esto tiene la ventaja de que se minimizan los efectos inespecíficos de las sustancias de prueba (por ejemplo debido a citotoxicidad) en las células usadas. El procedimiento además es adecuado para caracterizar "receptores huérfanos" (receptores cuyo ligando natural no se conoce), dado que es posible observar tanto los cambios en el nivel del AMPc (acoplamiento a Gs y acoplamiento a Gi) como los cambios en la concentración intracelular de calcio (acoplamiento a Gq) mediante la medición de la luminiscencia o la fluorescencia.
La invención se refiere a métodos para determinar la concentración intracelular del nucleótido cíclico AMPc, caracterizados porque
i)
se produce y se usa una célula, que expresa junto con una fotoproteína sensible a Ca^{2+} los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5
y
ii)
se determina la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos mediante la señal de luminiscencia de la fotoproteína.
La invención se refiere a los métodos tal como se describieron anteriormente, en los que la fotoproteína es aequorina.
La invención también se refiere a métodos tal como se describieron anteriormente, en los que la fotoproteína es obelina.
La invención se refiere a un método de selección de compuestos de prueba para identificar ligandos de receptor, en el que se usa cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente en los que la célula usada expresa el receptor y tiene un sistema mensajero intracelular que permite que un enlace receptor-ligando provoque una modulación medible del flujo de iones a través del canal iónico, se incuba dicha célula con sustancias de prueba de las que se seleccionan las que modulan la luminiscencia.
La invención también se refiere a un método de este tipo, en el que el receptor es un receptor acoplado a proteínas G.
La invención también se refiere a un método correspondiente, en el que el receptor acoplado a proteínas G es un receptor huérfano.
La invención se refiere además a un método de selección de compuestos de prueba para identificar moduladores de fosfodiesterasas, en el que se usa cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente en el que la célula usada expresa la fosfodiesterasa, se incuba dicha célula con las sustancias de prueba de las que se seleccionan las que modulan la luminiscencia.
La invención también se refiere a una célula preparada mediante cualquiera de los métodos ilustrados anteriormente.
Descripción de las figuras
Figura 1: Representación esquemática del método para determinar la concentración intracelular de GMPc.
Figura 2: Medición de la luminiscencia tras la activación de guanilato ciclasa soluble con SIN-1. Se midieron las "unidades relativas de luz" (URL) durante 1 min. Se muestra la cantidad de luz medida a la concentración de SIN-1 indicada durante este periodo.
Figura 3: Representación esquemática del procedimiento para determinar la concentración intracelular de AMPc.
Figura 4: Medición de la luminiscencia tras la activación del receptor \beta-adrenérgico con isoprenalina. El tiempo de incubación con isoprenalina es de 10 min. en solución Tyrode libre de calcio. Se inicia la medición añadiendo calcio. Se miden las unidades relativas de luz (URL) en intervalos de segundos. Se muestra la evolución en el tiempo de la señal de luminiscencia tras la adición de calcio y la incubación previa con 0 M (estrellas), 10^{-7} M (cuadrados) y 10^{-6} M (triángulos) de isoprenalina.
Figura 5: Cinética de la señal de luminiscencia tras la activación del receptor \beta-adrenérgico con isoprenalina en solución Tyrode que contiene calcio. Se inicia la medición con la adición del agonista isoprenalina (10^{-6} M) dentro de la caja hermética a la luz.
Ejemplos
Si, por ejemplo, se expresa adicionalmente la guanilato ciclasa soluble en una línea celular que expresa, tal como un sistema de medición de GMPc, el canal CNG2 (SEQ ID NO: 1) junto con una fotoproteína sensible a calcio, es posible aumentar la concentración intercelular de GMPc con la ayuda del estimulador de guanilato ciclasa SIN-1 de una manera dependiente de la dosis y para detectar una señal de luminiscencia intensificada (figura 2).
Si, por ejemplo, se expresa adicionalmente el receptor \beta-adrenérgico en células que, como un sistema de medición de AMPc, expresan una fotoproteína sensible a calcio junto con las subunidades del canal CNG, CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5 (SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 2/ SEQ ID NO: 3), la activación de este receptor por medio de la isoprenalina da como resultado de una manera dependiente de la dosis un aumento de la concentración de AMPc y una señal de luminiscencia intensificada (figura 4). Si las células se cargan con coelenterazina en la solución Tyrode que contiene calcio, también puede añadirse el agonista isoprenalina directamente a las células dentro de la caja hermética a la luz. Entonces, se observará una señal de luminiscencia en el plazo de algunos segundos (figura 5).
<110> Bayer AG, BHC
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<120> Métodos de prueba para determinar la concentración intracelular de nucleótidos cíclicos
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<130> Le A 36 621
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<160> 5
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 3166
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<212> ADN
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<213> Bos taurus 
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 3266
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<212> ADN
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 2
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\hskip0,8cm
2 
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<210> 3
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<211> 2351
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<212> ADN
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 3
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3 
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4 
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<210> 4
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<211> 1992
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<212> ADN
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<213> CNG2 mutado
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<400> 4
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5 
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50 
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<210> 5
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<211> 2641
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<212> ADN
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<213> Bos taurus 
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<400> 5
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6

Claims (8)

1. Método para determinar la concentración intracelular del nucleótido cíclico AMPc, caracterizado porque:
i)
se produce y se usa una célula, que expresa junto con una fotoproteína sensible a Ca^{2+} los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5
\quad
y
ii)
se determina la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos mediante la señal de luminiscencia de la fotoproteína.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la fotoproteína es aequorina.
3. Método según la reivindicación 1, en el la fotoproteína es obelina.
4. Método de selección de compuestos de prueba para la identificación de ligandos de receptor, usando un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula usada expresa el receptor y tiene un sistema mensajero intracelular, que permite que un enlace receptor-ligando induzca una modulación medible del flujo de iones a través del canal iónico, se incuba esta célula con las sustancias de prueba y se seleccionan tales sustancias de prueba que modulan la luminiscencia.
5. Método según la reivindicación 4, en el que el receptor es un receptor acoplado a proteínas G.
6. Método según la reivindicación 5, en el que el receptor acoplado a proteínas G es un receptor huérfano.
7. Método para seleccionar compuestos de prueba para identificar moduladores de fosfodiesterasas, usando un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula usada expresa la fosfodiesterasa, se incuba esta célula con las sustancias de prueba y se seleccionan tales sustancias de prueba que modulan la luminiscencia.
8. Célula, que expresa los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CGN4.3/CNG5 y una fotoproteína sensible a Ca^{2+}.
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