ES2349592T3 - Métodos de prueba para determinar la concentración intracelular de nucleótidos cíclicos. - Google Patents
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Abstract
Método para determinar la concentración intracelular del nucleótido cíclico AMPc, caracterizado porque: i)se produce y se usa una célula, que expresa junto con una fotoproteína sensible a Ca2+ los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5 y ii)se determina la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos mediante la señal de luminiscencia de la fotoproteína.
Description
Métodos de prueba para determinar la
concentración intracelular de nucleótidos cíclicos.
La invención se refiere a métodos para el
análisis óptico cuantitativo de la concentración intracelular de
guanosín 3',5'-monofosfato cíclico (GMPc) o adenosín
3',5'-monofosfato cíclico (AMPc). Estos
procedimientos pueden ser útiles para identificar y evaluar las
propiedades farmacológicas de sustancias de prueba que influyen en
la actividad de receptores o enzimas implicados en la síntesis o
degradación de los nucleótidos cíclicos GMPc y AMPc. Como
resultado, el procedimiento es adecuado, por ejemplo, para encontrar
moduladores de receptores acoplados a proteínas G (GPCR), NO
sintasas, fosfodiesterasas (PDE) y guanilato ciclasas solubles y
unidas a membrana.
La invención describe un método en el que se
miden las concentraciones intracelulares de GMPc o AMPc con la
ayuda de líneas celulares recombinantes. Estas líneas expresan de
manera recombinante una combinación de canales iónicos particulares
activados por nucleótidos cíclicos (canales CNG), una fotoproteína
sensible a calcio y un receptor o una enzima para los que deben
encontrarse moduladores. El procedimiento es adecuado para la
automatización y para la selección de alto rendimiento (HTS) y la
selección de ultra-alto rendimiento (uHTS) de
moduladores.
Los métodos actuales para medir la concentración
intracelular de GMPc o AMPc tienen la desventaja de ser muy
costosos, debido al uso de radioactividad, de poder automatizarse
sólo parcialmente, como mucho, y de ser muy complicados.
Los sistemas comerciales convencionales para
determinar GMPc y AMPc son técnicas radioactivas tales como el
radioinmunoensayo (RIA; por ejemplo de IBL, Hamburgo, Alemania), el
ensayo de proximidad por centelleo (SPA; Amersham Bioscience, RU) y
el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas no radioactivo (ELISA;
por ejemplo de Amersham Bioscience, RU).
Los métodos descritos anteriormente no pueden
usarse para medir las concentraciones intracelulares de GMPc y AMPc
en células vivas "in situ". Para llevar a cabo las
mediciones, tienen que romperse las células y entonces extraerse
los nucleótidos cíclicos.
Otro método para medir el AMPc intracelular es
la medición con la ayuda de sistemas de promotores inducibles
("elemento de respuesta a AMPc", CRE) y la enzima luciferasa
(Goetz et al., J. Biomol. Screen. (2000) 5
377-384). Sin embargo, el método tiene la desventaja
de que tienen que producirse tanto la transcripción como la
traducción para que se forme la señal, lo que provoca que la
medición dure horas. Este método, por tanto, no es adecuado para la
medición rápida de las concentraciones de AMPc reales en las
células.
El objeto de la invención es encontrar un método
no radioactivo, mejorado para medir las concentraciones
intracelulares de GMPc y AMPc. La intención en este caso es poder
llevar a cabo las mediciones muy rápidamente y también con alta
sensibilidad. El método debe automatizarse y debe ser adecuado para
la selección de alto rendimiento de muestras o compuestos de prueba
(HTS y uHTS).
Los compuestos de prueba según la invención son
preferiblemente compuestos químicos de moléculas pequeñas que
tienen un peso molecular de desde 100 hasta 500 o desde 100 hasta
1000 o si no mayor que esto. Estos compuestos pueden usarse
individualmente o si no como una mezcla en el procedimiento según la
invención. Los compuestos de prueba según la invención también
incluyen anticuerpos, sustancias naturales, extractos de sustancias
naturales, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. Esta lista debe
considerarse sólo a modo de ejemplo y no como limitativa.
Con el fin de establecer un sistema de selección
para enzimas y receptores que influyen en el nivel intracelular de
AMPc o GMPc, se transfectan diversos canales iónicos activados por
nucleótidos cíclicos (canales CNG), solos o en diversas
combinaciones, en células que expresan adicionalmente una
fotoproteína sensible a calcio de una manera recombinante.
Posteriormente se transfectan estas células con diversas enzimas o
receptores con el fin de someter a prueba la idoneidad de las
células para la selección de alto rendimiento. Esto implica usar,
por ejemplo, guanilato ciclasa soluble, dado que puede producir GMPc
intracelular tras la estimulación. Un ejemplo de un receptor que
puede usarse es el receptor \beta-adrenérgico que,
tras una activación, induce un aumento en la concentración
intracelular de AMPc.
Los canales CNG son proteínas integrales de
membrana que se abren con los nucleótidos cíclicos GMPc y AMPc.
Esta familia de canales iónicos son canales catiónicos no selectivos
que son permeables a iones sodio, potasio y calcio. Los canales
funcionales están compuestos de cuatro subunidades idénticas o si no
diferentes (homo o heterotetrámeros). Puede influirse en las
sensibilidades a GMPc y AMPc combinando diversas subunidades (Biel
et al. TCM (1996) 6, 274-280; Kaupp y
Seifert, Physiol. Rev. (2002) 82, 769-824). Se han
clonado y publicado las subunidades de canal
CNG1-CNG6 que, según una nomenclatura más reciente,
también se denominan CNGA1-CNB3 (Bradley et
al., Science (2001) 294, 2095-2096). También
existen variantes de corte y empalme tales como CNG4.3, por ejemplo
(Sauter et al., PNAS (1998) 95, 4696-4701).
El documento DE 101 388 76 A da a conocer el uso de líneas
celulares que contienen canales CNG para determinar la concentración
intracelular de Ca^{2+}.
El aumento de la concentración intracelular de
GMPc o AMPc da como resultado la apertura de los canales CNG y de
ese modo un flujo de entrada de iones calcio. Entonces puede
detectarse el calcio entrante con la ayuda de indicadores
fluorescentes sensibles a calcio, tales como, por ejemplo, FURA,
Fluo-3 etc., o con la ayuda de las fotoproteínas
sensibles a calcio tales como aequorina u obelina.
La fotoproteína aequorina que se deriva de la
medusa Aequorea victoria es un indicador de calcio altamente
sensible en células. El complejo de aequorina consiste en la
proteína apoaequorina, oxígeno molecular y la coelentarazina
luminófora. Este complejo emite luz azul en presencia de calcio
(iones Ca^{2+}), con el máximo de emisión a 466 nm (Jones et
al., Trends Biotechnol. (1999) 17, 477-481).
Otra fotoproteína es la obelina que se ha
clonado de diversos hidrozoos tales como Obelia longissima,
por ejemplo. Ésta consiste en apoobelina, O_{2} y el luminóforo
coelenterazina. Asimismo, se emite luz azul en presencia de calcio
(Illarionov et al., Métodos Enzymol. (2000) 305,
223-49).
Las guanilato ciclasas son responsables de
producir GMPc a partir de GTP. Se hace una distinción entre las
guanilato ciclasas solubles y las unidas a membrana. La guanilato
ciclasa soluble es un heterodímero compuesto de una subunidad alfa
1 y una subunidad beta 1. Es un receptor natural del monóxido de
nitrógeno (NO) producido por la NO sintasa endotelial y por tanto
también puede activarse farmacológicamente por sustancias
liberadoras de NO tales como, por ejemplo, Sie-1.
Dado que el GMPc producido por la guanilato ciclasa induce la
relajación de los vasos sanguíneos, la enzima es una diana
farmacológica altamente interesante (Hobbs AJ., TIPS (1997) 18,
484-491). Las guanilato ciclasas unidas a membrana
tienen un segmento transmembrana y se activan con diversos
agonistas tales como ANP, BNP, CNP o guanilina (Wedel y Garbers,
Annual Rev. Physiol. (2001) 63, 215-233).
Otra familia de proteínas farmacológicamente
interesante son los "receptores acoplados a proteínas G"
(GPCR). Estos son proteínas integrales de membrana que pueden
transducir la acción de una hormona extracelular hacia el interior
de la célula. Se influye en los niveles intracelulares de AMPc o de
calcio mediante el acoplamiento de estos receptores a diversas
proteínas G. La activación de los "receptores acoplados a Gq"
da como resultado una liberación de calcio de reservas internas y
por tanto un aumento en la concentración citoplasmática de calcio.
La activación de los "receptores acoplados a Gs" da como
resultado un aumento en la concentración de AMPc, mientras que la
activación de los "receptores acoplados a Gi" reduce el
contenido intracelular de AMPc (Gurrath M., Curr. Med. Chem. (2001)
8, 1605-1548). Un ejemplo de receptores acoplados a
Gs son los "receptores \beta-adrenérgicos"
que pueden estimularse con la ayuda de agonistas tales como
isoprenalina (Dzimiri N., Pharmakol. Rev. (1999) 51, 465-
501).
501).
Los nucleótidos cíclicos GMPc y AMPc producidos
por guanilato ciclasas y los GPCR, respectivamente, se hidrolizan
mediante "fosfodiesterasas" (PDE) para dar GMP y AMP,
respectivamente. Las fosfodiesterasas son una familia de enzimas
cuyos miembros son claramente diferentes con respecto a los patrones
de especificidad del sustrato, regulación y expresión en el
organismo (Francis et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.
(2001) 65, 1-52). Las PDE desempeñan una parte
decisiva en el control de los niveles intracelulares de AMPc y GMPc
y por tanto son asimismo dianas importantes para la intervención
farmacológica.
Sorprendentemente, la combinación del canal CNG3
(SEQ ID NO: 5, n.º de registro X89600) o, en particular, el canal
CNG2 (SEQ ID NO: 1, n.º de registro X55010) con una fotoproteína
resultó ser particularmente adecuada para detectar cambios en las
concentraciones intracelulares de GMPc (figura 1).
Una sorpresa similar fue una combinación de
CNG2/CNG4.3/CNG5 (SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 2, n.º de registro
AJ000515/SEQ ID NO: 3, n.º de registro U12623) y una fotoproteína,
que resultó ser muy adecuada para detectar los cambios en la
concentración intracelular de AMPc (figura 3). La combinación de
CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5 (SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 2/ SEQ ID
NO: 3) con una fotoproteína resultó ser particularmente adecuada
para la medición del AMPc. En el mutante de CNG2,
CNG2(T537A) (SEQ ID NO: 4), se ha sustituido el aminoácido
treonina-537 por alanina. (Altenhofen et
al., PNAS (1991) 88, 9868-9872).
Las líneas celulares recombinantes pueden
prepararse usando vectores comunes tales como pcDNA1.1 Amp o pcDNA3
(Invitrogen Life Technologies). Pueden usarse reactivos de
transfección comunes tales como, por ejemplo, lipofectamina
(Invitrogen Life Technologies) para transfectar los constructos de
plásmido correspondientes.
Las células se siembran para las mediciones en
placas de microtitulación (MTP) de 384 pocillos a 1500 células por
pocillo y en MTP de 1536 pocillos a 250 células por pocillo. Tras
1-2 días de crecimiento a 37ºC/CO_{2} al 5%, se
extrae el medio de cultivo celular (DMEM/F12 que contiene suero
bovino fetal al 10%) y se cargan las células con coelenterazina
(0,8 \mug/ml) en solución Tyrode libre de calcio a 37ºC/CO_{2}
al 5% durante 3 h. Posteriormente, se añaden las sustancias de
prueba y las sustancias control apropiadas (por ejemplo
SIN-1 o isoprenalina) en la solución Tyrode libre
de calcio y se incuban en las células durante 5-10
min. Entonces se lleva a cabo la medición extra en una caja
hermética a la luz añadiendo la solución Tyrode que contiene calcio
mediante un peine (concentración final de calcio: 3 mM), con la
ayuda de una cámara con dispositivo acoplado de carga.
Para medir los efectos de las sustancias
directamente, se cargan las células con coelenterazina en solución
Tyrode que contiene calcio. Entonces se añaden las sustancias dentro
de la caja hermética a la luz y se inicia la medición
inmediatamente con la adición de las sustancias (figura 5).
Las ventajas de este procedimiento son la alta
sensibilidad de la medición, los bajos costes por punto de medición
y la idoneidad para HTS y uHTS. El procedimiento tiene una excelente
razón señal con respecto a ruido, y es posible lograr factores de
estimulación de 50-150. Además es posible aplicar
sustancias de prueba durante periodos de tiempo muy cortos, dado
que una señal puede ya observarse tras algunos segundos (figura 5).
Esto tiene la ventaja de que se minimizan los efectos inespecíficos
de las sustancias de prueba (por ejemplo debido a citotoxicidad) en
las células usadas. El procedimiento además es adecuado para
caracterizar "receptores huérfanos" (receptores cuyo ligando
natural no se conoce), dado que es posible observar tanto los
cambios en el nivel del AMPc (acoplamiento a Gs y acoplamiento a
Gi) como los cambios en la concentración intracelular de calcio
(acoplamiento a Gq) mediante la medición de la luminiscencia o la
fluorescencia.
La invención se refiere a métodos para
determinar la concentración intracelular del nucleótido cíclico
AMPc, caracterizados porque
- i)
- se produce y se usa una célula, que expresa junto con una fotoproteína sensible a Ca^{2+} los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5
y
- ii)
- se determina la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos mediante la señal de luminiscencia de la fotoproteína.
La invención se refiere a los métodos tal como
se describieron anteriormente, en los que la fotoproteína es
aequorina.
La invención también se refiere a métodos tal
como se describieron anteriormente, en los que la fotoproteína es
obelina.
La invención se refiere a un método de selección
de compuestos de prueba para identificar ligandos de receptor, en
el que se usa cualquiera de los procedimientos descritos
anteriormente en los que la célula usada expresa el receptor y
tiene un sistema mensajero intracelular que permite que un enlace
receptor-ligando provoque una modulación medible
del flujo de iones a través del canal iónico, se incuba dicha célula
con sustancias de prueba de las que se seleccionan las que modulan
la luminiscencia.
La invención también se refiere a un método de
este tipo, en el que el receptor es un receptor acoplado a
proteínas G.
La invención también se refiere a un método
correspondiente, en el que el receptor acoplado a proteínas G es un
receptor huérfano.
La invención se refiere además a un método de
selección de compuestos de prueba para identificar moduladores de
fosfodiesterasas, en el que se usa cualquiera de los procedimientos
descritos anteriormente en el que la célula usada expresa la
fosfodiesterasa, se incuba dicha célula con las sustancias de prueba
de las que se seleccionan las que modulan la luminiscencia.
La invención también se refiere a una célula
preparada mediante cualquiera de los métodos ilustrados
anteriormente.
Figura 1: Representación esquemática del método
para determinar la concentración intracelular de GMPc.
Figura 2: Medición de la luminiscencia tras la
activación de guanilato ciclasa soluble con SIN-1.
Se midieron las "unidades relativas de luz" (URL) durante 1
min. Se muestra la cantidad de luz medida a la concentración de
SIN-1 indicada durante este periodo.
Figura 3: Representación esquemática del
procedimiento para determinar la concentración intracelular de
AMPc.
Figura 4: Medición de la luminiscencia tras la
activación del receptor \beta-adrenérgico con
isoprenalina. El tiempo de incubación con isoprenalina es de 10
min. en solución Tyrode libre de calcio. Se inicia la medición
añadiendo calcio. Se miden las unidades relativas de luz (URL) en
intervalos de segundos. Se muestra la evolución en el tiempo de la
señal de luminiscencia tras la adición de calcio y la incubación
previa con 0 M (estrellas), 10^{-7} M (cuadrados) y 10^{-6} M
(triángulos) de isoprenalina.
Figura 5: Cinética de la señal de luminiscencia
tras la activación del receptor \beta-adrenérgico
con isoprenalina en solución Tyrode que contiene calcio. Se inicia
la medición con la adición del agonista isoprenalina (10^{-6} M)
dentro de la caja hermética a la luz.
Si, por ejemplo, se expresa adicionalmente la
guanilato ciclasa soluble en una línea celular que expresa, tal
como un sistema de medición de GMPc, el canal CNG2 (SEQ ID NO: 1)
junto con una fotoproteína sensible a calcio, es posible aumentar
la concentración intercelular de GMPc con la ayuda del estimulador
de guanilato ciclasa SIN-1 de una manera
dependiente de la dosis y para detectar una señal de luminiscencia
intensificada (figura 2).
Si, por ejemplo, se expresa adicionalmente el
receptor \beta-adrenérgico en células que, como un
sistema de medición de AMPc, expresan una fotoproteína sensible a
calcio junto con las subunidades del canal CNG,
CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5 (SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 2/ SEQ ID
NO: 3), la activación de este receptor por medio de la isoprenalina
da como resultado de una manera dependiente de la dosis un aumento
de la concentración de AMPc y una señal de luminiscencia
intensificada (figura 4). Si las células se cargan con
coelenterazina en la solución Tyrode que contiene calcio, también
puede añadirse el agonista isoprenalina directamente a las células
dentro de la caja hermética a la luz. Entonces, se observará una
señal de luminiscencia en el plazo de algunos segundos (figura
5).
<110> Bayer AG, BHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos de prueba para determinar la
concentración intracelular de nucleótidos cíclicos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Le A 36 621
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3266
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1992
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> CNG2 mutado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2641
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (8)
1. Método para determinar la concentración
intracelular del nucleótido cíclico AMPc, caracterizado
porque:
- i)
- se produce y se usa una célula, que expresa junto con una fotoproteína sensible a Ca^{2+} los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5
- \quad
- y
- ii)
- se determina la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos mediante la señal de luminiscencia de la fotoproteína.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la fotoproteína es aequorina.
3. Método según la reivindicación 1, en el la
fotoproteína es obelina.
4. Método de selección de compuestos de prueba
para la identificación de ligandos de receptor, usando un método
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la
célula usada expresa el receptor y tiene un sistema mensajero
intracelular, que permite que un enlace
receptor-ligando induzca una modulación medible del
flujo de iones a través del canal iónico, se incuba esta célula con
las sustancias de prueba y se seleccionan tales sustancias de
prueba que modulan la luminiscencia.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
el receptor es un receptor acoplado a proteínas G.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
el receptor acoplado a proteínas G es un receptor huérfano.
7. Método para seleccionar compuestos de prueba
para identificar moduladores de fosfodiesterasas, usando un método
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la
célula usada expresa la fosfodiesterasa, se incuba esta célula con
las sustancias de prueba y se seleccionan tales sustancias de prueba
que modulan la luminiscencia.
8. Célula, que expresa los canales iónicos
activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CGN4.3/CNG5 y
una fotoproteína sensible a Ca^{2+}.
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