ES2317671T3

ES2317671T3 - Ensayo bioologico para determinar anticuerpos estimulantes de la tiroides.

Info

Publication number: ES2317671T3
Application number: ES98946557T
Authority: ES
Inventors: Marian Elizabeth Ludgate
Original assignee: University College Cardiff Consultants Ltd; Cardiff University
Current assignee: University College Cardiff Consultants Ltd; Cardiff University
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2018-09-29
Also published as: EP1019537B1; US6984520B1; ATE415487T1; AU9356398A; WO1999016902A1; DE69840268D1; JP2001518309A; EP1019537A1; GB9720693D0

Abstract

Método de ensayo para determinar autoanticuerpos frente a TSH-R o TSH, incluyendo el método la etapa (a), que es: poner en contacto una muestra de prueba, en presencia o ausencia de TSH, con células de un clon que expresa el TSH-R humano en el orden de 10 5 TSH-R por célula, y en el que dicho clon está transfectado de manera estable con un constructo indicador que comprende ADNc de ambos (i) un reactivo, tal como una enzima, que puede producir una respuesta medible cuando se pone en contacto con un sustrato correspondiente, tal como una proteína, (ii) un promotor que contiene elementos de respuesta al AMP cíclico (AMPc) (CRE) que comprenden la secuencia consenso de CRE TGACGTCA, mediante lo cual los niveles del reactivo varían con los niveles de AMPc endógeno inducido y en el que el promotor es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene una repetición en tándem de la secuencia consenso de CRE TGACGTCA; y (iii) medir la cantidad de reactivo producido como resultado de niveles de AMPc aumentados provocados por la interacción, si existe, entre dicha muestra de prueba y dicho TSH-R humano.

Description

Ensayo biológico para determinar anticuerpos estimulantes de la tiroides.

La presente invención se refiere a un ensayo para medir anticuerpos frente al receptor de tirotropina; a un kit de ensayo para el mismo; y específicamente al uso en el mismo de una línea celular transfectada con ADNc de a-luciferasa.

Se sabe que el receptor de tirotropina (en lo sucesivo en el presente documento "TSH-R") regula tanto la función como la proliferación de la célula tiroidea, y se estimula mediante la hormona tirotropina (TSH). El TSH-R es también una diana para autoanticuerpos, que inhiben la unión de TSH al receptor. Estos autoanticuerpos o bien bloquean la acción de TSH (TBAb) (es decir, antagonistas de TSH, que actúan como hipoestimulantes o inhibidores) o bien estimulan (hiperestimulan) la tiroides (TSAb) actuando como agonistas para TSH.

Se cree que la estimulación mediante TSAb es un mecanismo que funciona en la enfermedad de Graves (EG), mientras que se cree que la inhibición mediante TBAb es el caso en el mixedema idiopático. Los pacientes con enfermedad de Graves hipertiroidea producen anticuerpos que imitan la acción de TSH, conduciendo a una estimulación crónica de la adenilato ciclasa; y mientras que los autoanticuerpos en algunos pacientes con mixedema idiopático también pueden unirse al TSH-R, no obstante esto no da como resultado un aumento en el adenosín 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc) intracelular.

Se han desarrollado muchos ensayos para medir autoanticuerpos frente a TSH-R. El más ampliamente usado es un ensayo de radiorreceptor en el que la unión de ^{125}I-TSH bovina a TSH-R porcino solubilizado con detergente se inhibe mediante inmunoglobulinas o sueros de pacientes de los que se sospecha que tienen autoanticuerpos frente a TSH-R. Los problemas principales de este ensayo son que usa un antígeno no humano; y que mide la unión y no la actividad biológica, por tanto no puede distinguir entre TSAb y TBAb.

Es claramente deseable poder distinguir entre estimulación e inhibición, y por tanto se han realizado intentos para desarrollar un ensayo biológico en el que se mide un efecto de TSH (o su inhibición por TBAb) o TSAb, tal como el aumento en AMPc. Esto puede realizarse en cortes de la tiroides o células tiroideas en cultivo y la mayor sensibilidad, definida como el mayor porcentaje de pacientes con la enfermedad de Graves que son positivos, se consigue cuando el ensayo se realiza en un medio hipotónico (libre de cloruro de sodio). Tanto el radiorreceptor como los ensayos biológicos se ven obstaculizados por la disponibilidad limitada de material biológico. Para superar esto, se ha desarrollado una línea celular tiroidea de rata (FRTL-5), pero en este caso las diferencias entre especies pueden ser aún problemáticas. La reciente clonación y secuenciación del TSH-R proporcionan un acceso ilimitado a TSH-R humano recombinante.

Tal como se describe por Libert et al en Biochem. & Phys. Res. Comm. 165 (3) 1250-1255 (1989), la clonación previa del receptor de tirotropina de perro abrió el camino a la caracterización molecular del TSH-R humano a través del aislamiento de clones de ADNc de TSH-R humano; el análisis de la estructura primaria del polipéptido codificado; y evidencia de que la molécula recombinante se une a autoanticuerpos encontrados en pacientes con la enfermedad de Graves y mixedema idiopático. Se usó el ADNc de TSH-R de perro (un fragmento de 2,8 kb) para hibridar una biblioteca de ADN de tiroides humana. La secuenciación de los clones resultantes dio lugar a un marco de lectura abierto de 2292 residuos de nucleótido que codificaba para un polipéptido de 744 aminoácidos que tenía una similitud del 90,3% con el TSH-R de perro. La transfección de la secuencia codificante en el vector pSVL de células COS-7 permitió la confirmación de la capacidad de la proteína para unirse específicamente a TSH.

La cotransfección de células de ovario de hámster chino (CHO) con un vector pSVL que contiene la región codificante de TSH-R humano condujo a la selección de líneas celulares que responden particularmente a TSH o TSAb en cuanto a su acumulación de AMPc (notificado por Perret et al en Biochem. & Biophys. Res. Comm. 171 (3) 1044-1050 (1990)). Se notificaron las curvas de dosis-respuesta de la acumulación de AMPc mediado por TSH para los clones JP14, JP26 y JP28, y se encontró que el número de receptores por célula era el más alto en los clones JP14 y JP09.

Este trabajo dio lugar a la posibilidad de un ensayo biológico en el que se mide la producción de AMPc en células CHO transfectadas de manera estable con el TSH-R humano en presencia de un autoanticuerpo o bien solo (TSAb) o bien en presencia de TSH (TBAb), (Ludgate et al en Molec. & Cell. Endocrin. 73 R13-R18). Sin embargo, un ensayo de este tipo no es suficientemente robusto para su uso rutinario puesto que se tarda varios días en realizarlo, especialmente en vista de la detección final del AMPc generado mediante RIA, y requiere instalaciones para el cultivo tisular.

Himmler et al en Journal of Receptor Research, 1993, V13, páginas 79-94 dan a conocer el uso de líneas celulares indicadoras de luciferasa que responden a AMPc para pruebas funcionales de receptores de dopamina D1 y D5 humanos.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de ensayo para determinar autoanticuerpos frente a TSH-R o TSH que comprende la etapa de:

\quad: poner en contacto una muestra de prueba, en presencia o ausencia de TSH, con células de un clon que expresa TSH-R humano en el orden de 10^{5} TSH-R por célula, y en el que dicho clon está transfectado de manera estable con un constructo indicador que comprende ADNc de ambos

(i): un reactivo, tal como una enzima, que puede producir una respuesta medible cuando se pone en contacto con un sustrato correspondiente, tal como una proteína,

(ii): un promotor que contiene elementos de respuesta al AMP cíclico (AMPc) (CRE) que comprenden la secuencia consenso de CRE TGACGTCA, mediante lo cual los niveles del reactivo varían con los niveles de AMPc endógeno inducido y en el que el promotor es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene una repetición en tándem de la secuencia consenso de CRE TGACGTCA; y

(iii): medir la cantidad de reactivo producido como resultado de los niveles de AMPc aumentados provocados por la interacción, si existe, entre dicha muestra de prueba y dicho TSH-R humano.

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente, el método de ensayo comprende además la etapa de:

(b): añadir el sustrato correspondiente a células puestas en contacto de ese modo.

Más preferiblemente, el método de ensayo comprende aún además las etapas de:

(c): medir la respuesta en las células expuestas al sustrato; y

(d): comparar la respuesta de la etapa de prueba (c) con la respuesta de una muestra convencional o normal que se ha sometido a las etapas (a) a (c).

\vskip1.000000\baselineskip

Por tanto, la presente invención proporciona especialmente un ensayo para determinar autoanticuerpos frente a TSH-R o TSH, que comprende:

(a): poner un contacto una muestra de prueba con células de un clon que expresa TSH-R humano transfectadas de manera estable con un constructo indicador que comprende ADNc tanto de un reactivo que puede producir una respuesta medible cuando se pone en contacto con un sustrato correspondiente como de un promotor que contiene elementos de respuesta al AMPc mediante lo cual los niveles de AMPc varían con la expresión del reactivo;

(b): añadir el sustrato correspondiente a células puestas en contacto de ese modo;

(c): medir la respuesta en las células expuestas al sustrato; y

En el método de ensayo de la presente invención, todos los reactivos usados en el mismo peden juntarse en una o más etapas, tales como las etapas (a) a (d) definidas en el presente documento. No debe interpretarse que la notación de las etapas (a) a (d) significa solamente que cada etapa se lleva a cabo secuencialmente o que cada componente del ensayo debe ponerse en contacto individualmente entre sí. Por ejemplo, dos o más de las etapas (a) a (d) pueden llevarse a cabo sustancialmente de manera simultánea; y/o todos los reactivos usados en el mismo pueden juntarse en una etapa. El método de ensayo o cualquier combinación de las etapas en el mismo puede llevarse a cabo mediante medios manuales, parcialmente automatizados o completamente automatizados.

Constructos indicadores adecuados (a los que se hace referencia en la etapa (a)) son aquéllos en los que la actividad enzimática da como resultado un cambio de color, un cambio de fluorescencia o una emisión de luz. Los ejemplos de tales enzimas incluyen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa de luciérnaga, luciferasa de Renilla, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano o proteína fluorescente verde.

El elemento de respuesta al AMP cíclico (CRE) del gen indicador es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene elementos de respuesta al AMPc en tándem, descrito por Kay et al en Endocrinology 134 (2) 568-573 (1994). Otro ejemplo es un constructo que dirige la expresión de la enzima CAT que se ha descrito por Chatterjee et al en Molecular Endocrinology 5 (1) 100-109 (1991).

Sin embargo, el ensayo según la presente invención comprende preferiblemente, en la etapa (a), el uso de un ADNc de luciferasa dirigido por un promotor que contiene elementos de respuesta al AMPc; y, en la etapa (b), el uso de luciferina; lo que significa que la respuesta medida en las etapas (c) y (d) es la producción de luz de las células con luciferina. Preferiblemente, la luciferasa es luciferasa de luciérnaga, aunque también sería adecuada luciferasa de Renilla o similares.

Lo más preferiblemente, el constructo indicador es \alpha-luciferasa, que es un ADNc de luciferasa dirigido por el promotor para la subunidad \alpha de hormonas de glicoproteína, mencionado anteriormente. Por ejemplo, puede emplearse el plásmido pA3luc, que tiene el promotor de la subunidad \alpha de hormonas de glicoproteína introducido tal como se describe por Maxwell et al en Biotechniques 7 276-80 (1989). Por tanto, la \alpha-luciferasa tiene 846 pares de bases de la secuencia flanqueante en 5' y 44 pares de bases del exón 1 del promotor de la subunidad \alpha de hormonas de glicoproteína en el plásmido pA3luc. Alternativamente, la secuencia que contiene CRE podría subclonarse en un sistema indicador de luciferasa comercialmente disponible tal como el vector pGEM-luc de Promega. Una alternativa adicional es usar una pluralidad de plásmidos, tal como en el sistema disponible de Stratagene (sistema de notificación de CREB, nº 219010), que incluye plásmidos que permiten medir una respuesta de luciferasa tras un aumento en AMPc. Alternativamente, podrían incluirse plásmidos inducibles distintos de CRE.

Las células pueden obtenerse tal como se describe en la referencia mencionada anteriormente por Perret et al. Alternativamente, el TSH-R humano podría subclonarse en cualquier vector de expresión eucariota (del que pSVL es un ejemplo) disponible de Stratagene, InVitrogen o similares para la transfección en cualquier línea celular o célula eucariota. Para la selectividad, pueden usarse vectores duales más recientemente desarrollados que incorporan el gen de resistencia a antibióticos dentro del mismo plásmido, tales como pcDNAIII (disponible de InVitrogen). De otro modo, puede emplearse un plásmido separado para la selección.

Preferiblemente, las células usadas en el ensayo (etapa (a)) son aquéllas identificadas tal como del clon JP09 en la referencia mencionada anteriormente que se han transfectado de manera estable con (es decir, que expresan) en el orden de 10^{5} TSH-R humano por célula. Más preferiblemente, se cotransfectan tanto con ADNc de \beta\alpha-luciferasa como de un plásmido que codifica para resistencia a puromicina tal como pSV_{2}Neo (disponible de Clontech) para permitir la selección de células de ensayo con puromicina. Las células que sobreviven se someten entonces a prueba para determinar la actividad luciferasa en respuesta a TSH. Alternativamente, pueden emplearse células que se han transfectado de manera transitoria con cualquiera de estos plásmidos.

Por tanto, la presente invención proporciona un ensayo biológico que comprende TSH-R humano expresado en, por ejemplo, células CHO, en el que la mejora comprende (en lugar de un RIA para AMPc) medir la producción de luz de un gen de luciferasa dirigido por un promotor que contiene CRE. Esto hace más rápido el ensayo, permitiendo la evaluación completa de TSAb, desde el punto en que el suero está en contacto con las células hasta la obtención de datos para los cálculos, en el plazo de un único día de trabajo. Además, este ensayo puede realizarse en suero no fraccionado, eliminando la necesidad de preparación de las muestras.

Preferiblemente, las células estarían liofilizadas (deshidratadas por congelación), congeladas o comprendidas en un gel y se proporcionarían en recipientes individuales usándose un recipiente por ensayo. Alternativamente, las células podrían congelarse o incorporarse en un gel (tal como Matrigel^{TM}), para su almacenamiento.

Puede llevarse a cabo otra cotransfección para dotar al ensayo de un método de corrección para el número de células sembradas en un pocillo durante su uso, en el caso de que vayan a usarse células no liofilizadas. Puesto que el constructo de luciferasa de Renilla es constitutivo y tiene diferentes requisitos de sustrato que la luciferasa de luciérnaga, proporciona un método de este tipo. Se esperaría el mismo valor de cada pocillo mientras que las diferencias reflejarían un número de células variable. Un plásmido apropiado para esta transfección es el plásmido de luciferasa de Renilla disponible de Promega, nº E2241. Contiene el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple en el sentido de 5' de la luciferasa de Renilla, que se expresa por tanto de manera constitutiva.

Además, cuando se usan células intactas en lugar de liofilizadas, con el fin de evitar la distorsión del ensayo por la presencia de cualquier TSH presente en el suero usado en el medio de cultivo celular, debe tratarse el suero con carbón aproximadamente 24 horas antes del ensayo.

Además, tal como en el RIA, la capacidad de respuesta a TSH se ve reducida en condiciones libres de sal (es decir, libre de NaCl). Para potenciar adicionalmente la sensibilidad del ensayo, pueden añadirse reactivos tales como inhibidores de fosfodiesterasa.

Por tanto, la presente invención proporciona además un constructo indicador que comprende ADNc tanto de un reactivo, tal como una enzima, que puede producir una respuesta medible cuando se pone en contacto con un sustrato correspondiente como de un promotor que contiene elementos de respuesta al AMPc, mediante lo cual los niveles de AMPc varían con la expresión del sustrato, en particular en el que el reactivo es una luciferasa.

Por consiguiente, la presente invención proporciona además células de un clon que expresa TSH-R humano en el orden de 10^{5} TSH-R por célula, y estando dicho clon transfectado de manera estable con un constructo indicador que comprende ADNc tanto de

(i): un reactivo, tal como una enzima, que puede producir una respuesta medible cuando se pone en contacto con un sustrato correspondiente, tal como una proteína, como de

(ii): un promotor que contiene elementos de respuesta al AMPc (CRE) que comprenden una secuencia promotora u oligonucleótido sintético que contiene la secuencia consenso de CRE TGACGTCA,

mediante lo cual los niveles del reactivo varían con los niveles de AMPc endógeno inducido; y en el que la secuencia promotora u oligonucleótido sintético es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene una repetición en tándem de la secuencia consenso de CRE TGACGTCA. Preferiblemente, el ensayo según esta invención se lleva a cabo por medio de un kit para permitir resultados rápidos y convenientes en un laboratorio de bioquímica médica habitual o laboratorio de diagnóstico o patología hospitalario. Por tanto, la presente invención proporciona además un kit para llevar a cabo un ensayo, particularmente un ensayo bioluminiscente, de la presente invención, comprendiendo el kit:

(a): células de un clon que expresa TSH-R humano, en el orden de 10^{5} TSH-R por célula y estando dicho clon transfectado de manera estable con un constructo indicador que comprende ADNc tanto de un reactivo, tal como una enzima, que puede producir una respuesta medible cuando se pone en contacto con un sustrato correspondiente, tal como una proteína, como de un promotor que contiene elementos de respuesta al AMP cíclico (AMPc) (CRE) que comprenden la secuencia consenso de CRE TGACGTCA, mediante lo cual los niveles del reactivo varían con los niveles de AMPc endógeno inducido y en el que el promotor es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene una repetición en tándem de la secuencia consenso de CRE TGACGTCA;

(b): una muestra convencional para el ensayo;

(c): medio para cultivar y/o reconstituir las células; y

(d): instrucciones para llevar a cabo el ensayo según la presente invención.

También pueden proporcionarse como parte del kit la proteína correspondiente y los reactivos referentes para la misma, y medios para llevar a cabo las mediciones de la respuesta. Por ejemplo, el kit puede comprender además:

(e): tampón para lisar las células; y/o

(f): tampón para el constructo indicador, preferiblemente tampón de luciferasa; y/o

(g): sustrato correspondiente, preferiblemente proteína, más preferiblemente luciferina, en tampón;

y, opcionalmente, un luminómetro.

Alternativamente, por ejemplo, en el caso en el que se emplean luciferasa/luciferina en el ensayo, puede emplearse un kit separado, comercialmente disponible tal como uno de los disponibles de Promega Corporation. Estos kits comercialmente disponibles incluyen el nº E1483 en el que la luciferasa es luciferasa de luciérnaga, y un sistema dual-luciferasa nº E1910, que emplea también luciferasa de Renilla.

El método de ensayo según la presente invención y el kit para el mismo pueden usarse en asociación con un estado o una enfermedad seleccionado de: enfermedad tiroidea autoinmunitaria, enfermedad tiroidea no autoinmunitaria, autoinmunidad de origen no tiroideo y enfermedad poliendocrina. Por ejemplo, pueden usarse en el examen de pacientes seleccionados de: mujeres embarazadas, aquéllos con enfermedad ocular eutiroidea y aquéllos que reciben amiodarona y/o litio. El kit o método de ensayo según la invención es adecuado para medir TSAb o TBAb, o para medir autoanticuerpos frente al TSH-R que tiene parte de su secuencia modificada, tal como sustituyéndose uno o más de sus aminoácidos o modificándose de otra manera, para incluir etiquetas.

La presente invención se ilustrará ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos:

Ejemplo 1 Preparación de células para su uso en ensayo luminiscente para determinar anticuerpos frente a TSH y TSH-R - Uso de luciferasa de luciérnaga

Se sometieron células de ovario de hámster chino (CHO-K1), disponibles de la ATCC número CCL61, a cotransfección con fosfato de calcio, usando protocolos convencionales (Current Protocols in Molecular Biology, 1996, John Wiley & Sons Inc. sección 9.1.4), con pSV_{2}Neo (disponible de Clontech) y un vector de expresión eucariota que portaba el gen de TSH-R humano, pSVL-hTSHR (disponible de G. Vassart, IRIBIIN, Bruselas, Bélgica), tal como se describe por Perret et al (1990, citado anteriormente). Se seleccionaron las células con geneticina (G418) 400 \mug/ml y se clonaron mediante dilución limitante. Se aisló el clon JP09 mediante este método (y también está disponible del Prof. G. Vassart), que expresa aproximadamente 10^{5} receptores por célula, tal como se evalúa en experimentos de unión a TSH (descritos por Costagliola S, Swillens S, Niccoli P, Dumont J, Vassart G, Ludgate M en J Clin Endocrinol Metab 75 1540 y siguientes (1992)).

Se mantuvieron las células de JP09 a 37ºC en dióxido de carbono al 5% en aire en medio de Ham F12 con suero de ternero fetal al 10%.

Se cotransfectó el clon JP09, de nuevo usando el método de fosfato de calcio convencional indicado anteriormente, con un vector de expresión eucariota que portaba el gen de resistencia a puromicina (disponible de, entre otros, InVitrogen, Stratagene etc.) y pA3Luc (disponible de V. Chatterjee, Univ. Cambridge, RU). Se seleccionaron las células en puromicina, 2,5 \mug/ml y se clonaron mediante dilución limitante. Se sometieron a prueba los clones para determinar la producción de luz (véase el ejemplo 3) en respuesta a TSH bovina (de Sigma, T8931). Se sometieron a prueba los clones que daban una buena respuesta frente a TSH con un panel de sueros humanos normales, siendo en este caso el criterio de selección una baja producción de luz de \leq 1,5 unidades relativas de luz.

Ejemplo 2 Preparación de células para su uso en ensayo luminiscente para determinar anticuerpos frente a TSH y TSH-R - Uso de luciferasa de luciérnaga y de Renilla

Se siguió el método del ejemplo 1, pero tras la segunda cotransfección que implicaba el gen de resistencia a puromicina, se llevó a cabo otra cotransfección repitiendo el método de fosfato de calcio convencional, pero en cambio con un vector de expresión eucariota que portaba el gen de resistencia a higromicina (disponible de Stratagene) y el plásmido de luciferasa de Renilla E2241 (disponible de Promega).

Ejemplo 3 Ensayo para la medición de (i) actividad biológica de TSH y (ii) anticuerpos estimulantes (TSAB) o (iii) anticuerpos bloqueantes (TBAB) de la tiroides

El medio de cultivo para las células era RPMI; suero de ternero fetal al 10% (FCS); glutamina al 1%; piruvato al 1%; estreptomicina/penicilina al 2% (y puromicina 2,5 \mug/ml, cuando se amplifican las células para el ensayo). Se sembraron placas de 96 pocillos con 5 x 10^{4} células preparadas según el ejemplo 1 y se cultivaron durante la noche (aproximadamente 16 horas) a 37ºC en un incubador saturado con agua. Entonces se cultivaron durante una segunda noche en medio que contenía suero de ternero tratado con carbón al 10% en lugar de de FCS (disponible de Gibco). Se midió la producción basal de luz, en pocillos por triplicado, en presencia de 100 \mul del medio que contenía suero tratado con carbón al 10%. Los patrones (véase más adelante) y las muestras de prueba estaban en forma del suero de paciente al 10% hasta un volumen final de 100 \mul del medio que contenía suero de ternero tratado con carbón al 10%. Las incubaciones basales, patrón y de prueba fueron durante 2-3 horas tal como anteriormente. Se expresó el resultado final como unidades relativas de luz (URL) obtenidas mediante la razón de patrón: basal o prueba: basal.

Actividad biológica de TSH: esta prueba es para pacientes que tienen altos niveles de TSH en circulación cuando se miden mediante radioinmunoanálisis pero baja T4 libre en circulación, indicativo de hipotiroidismo debido a TSH defectuosa. Los patrones son muestras de suero hipotiroideo y eutiroideo bien caracterizadas de actividad biológica creciente.

Las mediciones de TSAb se realizan en pacientes con hipertiroidismo. Los patrones son suero humano normal reunido (que tiene una producción de luz \leq1,5 URL), sueros que contienen TSAb bien caracterizados y bTSH de actividad creciente.

Las mediciones de TBAb se realizan en los mismos pacientes que en (i), pero los pocillos de ensayo contienen también 1 mU/ml de bTSH. Los patrones son sueros normales reunidos + bTSH 1 mU/ml y sueros que contienen TBAb bien caracterizados de actividad creciente.

Medición de la producción de luz

Tras el periodo de incubación, se retiraron los sobrenadantes de los pocillos y se lavan las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato. Se midió la producción de luz usando un kit comercialmente disponible de Promega Corporation, nº E1483, según las instrucciones del fabricante. Esto implicaba tratar las células en tampón de lisis (Promega nº E1513), añadir el reactivo de luciferasa de luciérnaga y medir la producción de luz en un luminómetro.

Si las células usadas para el ensayo expresan también luciferasa de Renilla de manera constitutiva (tal como se preparó en el ejemplo 2) para proporcionar un método de normalización del número de células/pocillo, se usa el sistema dual-luciferasa de Promega, no. E1910. En este caso, tras la medición de la luciferasa de luciérnaga tal como anteriormente, se añade un reactivo para extinguir la señal luminiscente seguido del reactivo de luciferasa de Renilla y se toma una segunda lectura.

Ejemplo 4 Selección y uso de células lulu1 para ensayo

Se sometieron células de JP09, tal como se describió en el ejemplo 1, a transfección con fosfato de calcio convencional, o bien con 5 \mug de AMPc-luciferasa y 2 \mug de pBABE puro o bien con el plásmido de resistencia a puromicina solo. La AMPc-luciferasa tiene 846 pb de la región flanqueante en 5' y 44 pb del exón 1 del promotor de la subunidad \alpha de hormonas de glicoproteína, que contiene dos elementos de respuesta al AMPc (CRE) en tándem, unidos al gen de la luciferasa de luciérnaga (tal como se describe por Chatterjee et al en Mol Endocrin 5 100-110 (1991)). Se obtuvieron conjuntos de células resistentes a puromicina tras la selección y se sometieron a prueba, en placas de 6 pocillos, para determinar la producción de luz en respuesta a la TSH bovina (tal como se describió en el ejemplo 3). Se aislaron colonias usando anillos de clonación.

(a) Selección de lulu1

Se cultivaron los clones seleccionados durante la noche en medio con suero de ternero tratado con carbón al 10% (Sigma) en lugar de FCS, seguido de incubación de 4 horas con concentraciones variables de TSH bovina. Se midió la producción de luz mediante ensayo de indicador de luciferasa (Promega) en un luminómetro de Berthold. Se calcularon los resultados como la razón de producción de luz en presencia de TSH: producción de luz en ausencia de TSH y se expresaron como unidades relativas de luz (URL). Entonces se clonaron los clones que mostraban una buena respuesta frente a TSH mediante dilución limitante y se volvieron a someter a prueba con TSH bovina y humana y patrón de TSAb internacional 90/672.

(b) Determinación de un intervalo de referencia

Se sembraron aproximadamente 2 x 10^{4} células lulu1 en placas de 96 pocillos y se cambiaron a 100 \mul/pocillo de Ham F12 que contenía suero de ternero tratado con carbón al 10% el día antes del ensayo. Se sometieron a prueba 34 sueros eutiroideos de individuos negativos para anticuerpos frente a tiroglobulina y tiroperoxidasa, y que no tenían antecedentes conocidos de enfermedad tiroidea, por duplicado, añadiendo 10 \mul directamente a los pocillos e incubando a 37ºC durante 4 horas. Se sometieron a ensayo las células tal como se describió en (a) anteriormente, pero usando un luminómetro de placas de 96 pocillos de Berthold. Los resultados se expresan en URL, como la razón entre la producción de luz en presencia del suero individual: producción de luz en ausencia de suero. Posteriormente, se reunieron los 34 sueros para proporcionar un control negativo.

Se sometieron a ensayo por duplicado sueros de 100 pacientes tratados con EG, 50 negativos en un ensayo de TBII comercial (TSH-R) (TRAK, BRAHMS Diagnostica, Berlín; el límite de corte era de 9 unidades, y la sensibilidad de ensayo funcional y el límite superior eran de 8 y 405 unidades TRAK, respectivamente) y 50 positivos, añadiendo 10 \mul de suero directamente a los pocillos. El ensayo se realizó también en 20 sueros de Hashimoto, 27 de bocio multinodular (8 tóxicos), 20 de lupus eritematoso sistémico y 12 de artritis de factor reumatoide positivo. Todos los resultados se calcularon en URL tal como en (a) anteriormente.

(c) Comparación de AMPc medido mediante luminiscencia / RIA

También se sometieron a ensayo 44 de los sueros de EG descritos anteriormente, (35 TBII (TSH-R) positivos) y el patrón de TSAb, en un ensayo biológico tradicional en el que se midió mediante RIA el AMPc liberado al medio de cultivo. Se sembraron lulu1 en placas de 96 pocillos y se realizó el ensayo en 100 \mul/pocillo de medio de Hank libre de NaCl, que contenía IBMX 2 mM y 10 \mul de suero de EG individual o eutiroideo reunido. Se midió el AMPc mediante el sistema de ensayo de AMPc [^{3}H] (Amersham) tal como se describe por Ludgate et al en Exp Clin Endo 100 73-4. Estos resultados se muestran en la siguiente tabla (tabla 1), en la que: ^ = lecturas (n = 3) medias del luminómetro con la emisión de luz de fondo restada, (EEM); y * = pmoles de AMPc medios (n=2), (EEM).

TABLA 1

1

Detección de TSAb en EG tratada

Un límite superior de <1,45 URL se derivaba del percentil 97,5 del análisis de 34 muestras eutiroideas (intervalo de 0,96 - 1,48 URL). Cuando se sometieron a ensayo los sueros de EG en condiciones fisiológicas, el 66% de los sueros TBII negativos y el 80% de los sueros TBII positivos produjeron >1,5 U.R.L en el ensayo luminiscente, lo que se obtuvo solamente con el 4% de los sueros control de diversos grupos de enfermedad.

La variación intraensayo era del 11,9%, calculada usando los 100 sueros de EG y la variación interensayo era del 14,6% calculada a partir de las 100 muestras de EG medidas en dos ensayos separados mediante análisis emparejado.

33 de los sueros eran positivos en el ensayo luminiscente, 27 mediante RIA, 7 eran negativos en ambos ensayos y 6 eran positivos mediante RIA pero negativos en el ensayo luminiscente. Los resultados que usan los tres ensayos para determinar los anticuerpos frente a TSH-R en los 100 sueros de EG se muestran en la siguiente tabla (tabla 2):

2

En las condiciones empleadas, el ensayo biológico luminiscente de esta invención funcionó mejor que la medición mediante RIA tradicional para AMPc, quizás puesto que la medición indirecta, mediante la producción de luz, amplifica la respuesta. El comportamiento del patrón muestra a modo de ejemplo esto: en el ensayo luminiscente, la producción de luz era aproximadamente 10 veces la del conjunto normal; mientras que, en el RIA, proporcionó solamente un aumento de 7 veces.

También se ha observado que la capacidad de respuesta a TSH se disminuye en condiciones libres de sal (libres de NaCl), y estudios preliminares muestran que el ensayo luminiscente es más sensible para medir TSAb pero menos para TSH cuando se compara con medio isotónico.

Claims

1. Método de ensayo para determinar autoanticuerpos frente a TSH-R o TSH, incluyendo el método la etapa (a), que es:

\quad: poner en contacto una muestra de prueba, en presencia o ausencia de TSH, con células de un clon que expresa el TSH-R humano en el orden de 10^{5} TSH-R por célula, y en el que dicho clon está transfectado de manera estable con un constructo indicador que comprende ADNc de ambos

(iii): medir la cantidad de reactivo producido como resultado de niveles de AMPc aumentados provocados por la interacción, si existe, entre dicha muestra de prueba y dicho TSH-R humano.

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2. Método de ensayo según la reivindicación 1, que incluye además la etapa (b), que es:

\quad: añadir el sustrato correspondiente a células puestas en contacto de ese modo.

3. Método de ensayo según la reivindicación 2, que incluye además las etapas:

(c): medir la respuesta en las células expuestas al sustrato; y

4. Método de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el promotor comprende un constructo que dirige la expresión de la enzima CAT.

5. Método de ensayo según cualquier reivindicación anterior, en el que la respuesta medible es un cambio de color, un cambio de fluorescencia o una emisión de luz.

6. Método de ensayo según la reivindicación 5, en el que el reactivo se selecciona de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa de luciérnaga, luciferasa de Renilla, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano y proteína fluorescente verde.

7. Método de ensayo según la reivindicación 3, que comprende, en la etapa (a), el uso de un ADNc de luciferasa dirigido por un promotor que contiene elementos de respuesta al AMPc; en la etapa (b), el uso de luciferina; y, en la etapa (c), medir la producción de luz del lisado celular en presencia de luciferina.

8. Método de ensayo según cualquier reivindicación anterior, en el que el constructo indicador comprende \alpha-luciferasa.

9. Método de ensayo según cualquier reivindicación anterior, en el que el clon para su uso en la etapa (a) puede obtenerse mediante cotransfección estable de células CHO o cualquier línea celular eucariota con un ADNc que contiene la región codificante de hTSH-R en un vector de expresión eucariota y un ADNc que contiene el constructo indicador que comprende tanto el promotor como el reactivo.

10. Método de ensayo según cualquier reivindicación anterior, en el que todos los reactivos usados en el mismo se juntan en una o más etapas; y/o en el que dos o más de las etapas (a) a (d) se llevan a cabo sustancialmente de manera simultánea.

11. Método de ensayo según cualquier reivindicación anterior, que se lleva a cabo mediante medios manuales, parcialmente automatizados o completamente automatizados.

12. Kit, comprendiendo el kit:

(a): células de un clon que expresa TSH-R humano, en el orden de 10^{5} TSH-R por célula y en el que dicho clon está transfectado de manera estable con un constructo indicador que comprende ADNc tanto de un reactivo, tal como una enzima, que puede producir una respuesta medible cuando se pone en contacto con un sustrato correspondiente, tal como una proteína, como de un promotor que contiene elementos de respuesta al AMP cíclico (AMPc) (CRE) que comprenden la secuencia consenso de CRE TGACGTCA,

\quad: mediante lo cual los niveles del reactivo varían con los niveles de AMPc endógeno inducido y en el que el promotor es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene una repetición en tándem de la secuencia consenso de CRE TGACGTCA;

(b): una muestra convencional o normal para el ensayo;

(c): medio para cultivar y/o reconstituir las células; y

(d): instrucciones para llevar a cabo el ensayo.

13. Kit según la reivindicación 12, que comprende además:

(e): tampón para lisar las células; y/o

(f): tampón para el constructo indicador, preferiblemente tampón de luciferasa;

\quad: y/o

(g): sustrato correspondiente, preferiblemente luciferina, en tampón; y, opcionalmente, un luminómetro.

14. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, en el que el constructo indicador comprende el plásmido pA3luc que tiene el promotor de la subunidad \alpha de hormonas de glicoproteína introducido en el mismo.

15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la secuencia que contiene CRE está subclonada en un sistema indicador de luciferasa comercialmente disponible, tal como pGEM-luc.

16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que el constructo indicador comprende una pluralidad de plásmidos.

17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en el que el TSH-R humano está subclonado en un vector de expresión eucariota.

18. Kit según la reivindicación 17, en el que dicho vector de expresión eucariota es pSVL.

19. Kit según la reivindicación 17, en el que el TSH-R está subclonado en un vector dual que incorpora el gen de resistencia a antibióticos dentro del mismo plásmido.

20. Kit según la reivindicación 19, en el que el vector dual comprende pcDNAIII.

21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, en el que las células para el componente (a) proceden del clon JP09 tal como se identifica en el presente documento, que se han transfectado de manera estable con, en el orden de, 10^{5} TSH-R por célula.

22. Kit según la reivindicación 21, en el que dichas células están cotransfectadas tanto con ADNc de \alpha-luciferasa como con un plásmido que codifica para resistencia a puromicina.

23. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, en el que las células están liofilizadas (deshidratadas por congelación), congeladas o comprendidas en un gel, y se proporcionan en recipientes individuales.

24. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, en el que dichas células están cotransfectadas adicionalmente para dotar al ensayo de un método de corrección para el número de células sembradas en un pocillo durante su uso.

25. Kit según la reivindicación 24, en el que dichas células están cotransfectadas adicionalmente usando un plásmido de luciferasa de Renilla.

26. Método de ensayo según las reivindicaciones 1-11, para su uso en la detección de un estado o una enfermedad asociado con uno cualquiera de lo siguiente:

\quad: enfermedad tiroidea autoinmunitaria, enfermedad tiroidea no autoinmunitaria, autoinmunidad de origen no tiroideo, enfermedad poliendocrina, mujeres embarazadas, aquéllos con enfermedad ocular eutiroidea y aquéllos que reciben amiodarona y/o litio.

27. Kit según las reivindicaciones 12-25, para su uso en la detección de una enfermedad o un estado asociado con uno cualquiera de lo siguiente: mujeres embarazadas, aquéllos con enfermedad ocular eutiroidea, aquéllos que reciben amiodarona y/o litio, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, enfermedad tiroidea no autoinmunitaria, autoinmunidad de origen no tiroideo y enfermedad poliendocrina.

28. Uso de un constructo indicador que comprende ADNc tanto de

\quad: como de

(ii): un promotor que contiene elementos de respuesta al AMPc (CRE) que comprenden la secuencia consenso de CRE TGACGTCA y en el que el promotor es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene una repetición en tándem de la secuencia consenso de CRE TGACGTCA, mediante lo cual los niveles del reactivo varían con los niveles de AMPc endógeno inducido, teniendo lugar el uso en un método de ensayo o en la preparación de un kit, caracterizado porque dicho ensayo o kit es tal como se define en cualquier reivindicación anterior.

29. Uso según la reivindicación 28, en el que el reactivo enzima es una luciferasa y/o el sustrato es luciferina.

30. Clon que expresa TSH-R humano en el orden de 10^{5} TSH-R por célula, y estando dicho clon transfectado de manera estable con un constructo indicador que comprende ADNc tanto de

(i): un reactivo, tal como una enzima, que puede producir una respuesta medible cuando se pone en contacto con un sustrato correspondiente, tal como una proteína

\quad: como de

(ii): un promotor que contiene elementos de respuesta al AMPc (CRE) que comprenden una secuencia promotora o un oligonucleótido sintético que contiene la secuencia consenso de CRE TGACGTCA,

mediante lo cual los niveles del reactivo varían con los niveles de AMPc endógeno inducido; y en el que la secuencia promotora o el oligonucleótido sintético es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene una repetición en tándem de la secuencia consenso de CRE TGACGTCA.

31. Clon según la reivindicación 30, en el que el reactivo enzima es una luciferasa y/o el sustrato es luciferina.

32. Células producidas por un clon según cualquiera de las reivindicaciones 30 ó 31.

33. ADNc o ARNm que codifica para TSH-R humano y un constructo indicador que comprende ADNc tanto de

\quad: como de

(ii): un promotor que contiene elementos de respuesta al AMPc (CRE) que comprenden la secuencia consenso de CRE TGACGTCA,

mediante lo cual los niveles del reactivo varían con los niveles de AMPc endógeno inducido; y en el que el promotor es aquél para la subunidad alfa de hormonas de glicoproteína que contiene una repetición en tándem de la secuencia consenso de CRE TGACGTCA.

34. ADNc o ARNm según la reivindicación 33, en el que el reactivo enzima es una luciferasa y/o el sustrato es luciferina.