CN1200105C - 来自原生动物阴道毛滴虫的高半胱氨酸脱硫酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用一种催化高半胱氨酸，半胱氨酸，邻乙酰-L-丝氨酸和/或甲硫氨酸降解的酶，该酶更具体地说是高半氨酸脱硫酶，来测定生物学样品中高半胱氨酸，半胱氨酸，邻乙酰-L-丝氨酸和/或甲硫氨酸水平的测定法，还涉及编码原生动物高半胱氨酸脱硫酶的多核苷酸片断，包含该多核苷酸片断的重组载体，转化的细胞，原生动物高半胱氨酸脱硫酶多肽和用于医学或兽医学的含有重组高半胱氨酸脱硫酶的药用组合物。

Description

来自原生动物阴道毛滴虫的高半胱氨酸脱硫酶
本发明涉及使用一种催化高半胱氨酸，半胱氨酸，邻乙酰-L-丝氨酸和/或甲硫氨酸降解的酶，该酶具体地说是高半胱氨酸脱硫酶，来测定生物学样品中高半胱氨酸，半胱氨酸，邻乙酰-L-丝氨酸和/或甲硫氨酸水平的测定法，还涉及编码原生动物高半胱氨酸脱硫酶的多核苷酸片断，包含该多核苷酸片断的重组载体，含有所述多核苷酸片断或所述重组载体的转化细胞，原生动物高半胱氨酸脱硫酶多肽和用于医学或兽医学的含有重组高半胱氨酸脱硫酶的药用组合物。
血液中高半胱氨酸水平的升高似乎是许多人类疾病状态的重要指示物。高半胱氨酸是血管疾病和中风的征兆，Ueland，P.M.(1992)和Kluijtmans L.A.J.等(1996)；与糖尿病的形式和醇中毒相关，Cravo，M.L.等(1996)；用于监测肝脏和肾脏损伤，Bostom，A.G.等(1996)和神经管缺陷，Steegers-Theunissen，R.P.N.(1992)并与代谢的某些先天错误相联系，Mudd，S.H.，(1989)。
血液中高半胱氨酸的水平按常规使用高效液相色谱(HPLC)方法测定，参见例如Poele-Pothoff M.T.B.等(1995)。然而，HPLC方法采用了昂贵而费力的机器，一般很复杂且据认为对于许多常规分析是不实际的。
专利公开WO93/15220(Cockbain)描述了使用高半胱氨酸转化酶，S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH-水解酶)测定血液中的高半胱氨酸的方法。SAH-水解酶催化高半胱氨酸与共同底物，腺苷转变为S-腺苷-高半胱氨酸。然后经过测定消耗的腺苷量可与消耗的高半胱氨酸量相关联。然后从腺苷浓度差测定样品中高半胱氨酸的量。然而，这种测定需要使用两种起始底物(高半胱氨酸和腺苷)和两种酶，使其相当复杂。它还涉及测定腺苷浓度的下降，可能不尽人意。
US4940658(Allen等)描述了一种测定身体组织样品中巯基氨基酸，包括高半胱氨酸水平的方法，使用对总高半胱氨酸水平的测定来检测钴胺素和叶酸缺乏的方法，和使用对总高半胱氨酸水平的测定结合对甲基丙二酸的测定来区分钴胺素与叶酸缺乏的方法。该测定包括将样品与含有用合适标记物标记的待测已知量的巯基氨基酸的参照标准结合并用质谱仪测量各种类存在的标记和未标记的巯基氨基酸的相对量。由于标记种类的量是已知的，因此可计算标记与未标记种类的比率以测定在样品中存在的巯基氨基酸的量。
US5438017描述了一种用于分析体液样品中的巯基氨基酸的气相色谱/质谱分析法。该测定依赖于使用标记的参照巯基氨基酸，相似于在US4940658中所述，但在经气相色谱/质谱分析法分析样品前需要另外的处理和/或纯化步骤。
可以预期的是与HPLC方法相似，采用气相色谱/质谱分析法的上述测定一般较为复杂，需使用昂贵和费力的机器且据认为对于许多常规分析是不实际的。
本发明的一个目的是提供一种避免和/或减轻至少一些上述缺陷的测定方法。
本发明的另一目的是提供能催化包括用于所述测定的高半胱氨酸降解的重组酶。
本发明提供了编码原生动物高半胱氨酸脱硫酶的多核苷酸片断，如DNA片断。本发明进一步提供了一种重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶多肽。
本文所用的“高半胱氨酸脱硫酶”指能催化高半胱氨酸降解以释放α-丁酮酸，硫化氢，和氨的酶。
这种酶也可具有对诸如甲硫氨酸，半胱氨酸和邻乙酰基-L-丝氨酸的其它底物的亲和性。例如，如果甲硫氨酸用作底物，则该酶的代谢终产物是α-丁酮酸，氨和甲硫醇。
应预料到的是可以有一些形式(例如，来自不同生物)或同工型的“高半胱氨酸脱硫酶”且本文包括所有这些形式/同工型及其应用。
本文使用的“多核苷酸片断”指能产生高半胱氨酸脱硫酶或其生理学功能性衍生物的诸如脱氧核糖核酸(DNA)序列的核苷酸链和诸如RNA的其转录产物。生理学功能性衍生物是以酶功能性将该酶鉴定为上文所定义的高半胱氨酸脱硫酶的一种衍生物。因此，该术语包括双链和单链DNA和从其产生的RNA序列。该术语排除了包括例如，在原生动物Trichomonas vaginalis中发现的该多核苷酸片断的完整天然存在的基因组。
一般来说，该多核苷酸是基本上分离的形式。即，基本上没有正常情况下在体内与完整基因组相联系的生物学材料。
一般来说，术语“多肽”指表现出的生物学活性基本上相似于高半胱氨酸脱硫酶的生物学活性的氨基酸链或序列但不指具体长度的这种产物。如果需要，该多肽可在体内和/或体外进行修饰，例如，经过糖基化，酰胺化，羧基化，磷酸化和/或翻译后裂解修饰，因此其包含特别是肽，寡聚肽，蛋白质和融合蛋白质。自然，专业技术人员会预料到修饰的多肽应保留生理学功能，即，具有高半胱氨酸脱硫酶活性。
编码高半胱氨酸脱硫酶的DNA片断可经过利用部分高半胱氨酸脱硫酶的cDNA来获得。经过信使RNA的逆转录且随后一般使用本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)技术进行扩增可获得该cDNA，例如，该PCR使用针对相关酶的保守区域设计的引物，如胱硫醚γ-裂解酶编码序列，例如，人，大鼠和/或酵母胱硫醚γ-裂解酶。然后使用含有部分高半胱氨酸脱硫酶基因的扩增片断从含有该基因的cDNA文库克隆完整的高半胱氨酸脱硫酶基因。该cDNA文库可来自原生动物，例如，阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)cDNA文库。以这种方式获得的含有高半胱氨酸脱硫酶基因的多核苷酸片断在图1和2中描述。
图1的DNA片断编码含有下文称为CTLα(随后重新命名为MGL1)的396个氨基酸的开放阅读框(ORF)的基因ctlα(随后重新命名为mgl1)。图2的DNA片断编码含有下文称为CTLβ(随后重新命名为MGL2)的398个氨基酸的ORF的基因ctlβ(随后重新命名为mgl2)。图1和2所示的MGL1和MGL2与来自Pseudomonas putida的甲硫氨酸γ-裂解酶和来自酵母和人的胱硫醚γ-裂解酶(EMBL数据库登记号分别为D30039，P31373和S52784)相同性百分数(在氨基酸水平上)的比较在表1中显示。使用GCG Wisconsin程序包(Devereux，H.，Hacberli，P.Smithies，O.(1984)核酸研究，12，387-395)用缺口和加帽程序进行序列比较分析。
表1
MGL1 MGL2 P.putida的甲硫氨酸γ-裂解酶I 酵母胱硫醚γ-裂解酶 人胱硫醚γ-裂解酶
MGL1 - 69％ 44％ 44％ 42％
MGL2 - 45％ 43％ 43％
P.putida的甲硫氨酸γ-裂解酶 - 40％ 45％
酵母胱硫醚γ-裂解酶 - 52％
表1显示了图1和2所示的推断的高半胱氨酸脱硫酶与以前测序的甲硫氨酸γ-裂解酶和胱硫醚γ-裂解酶在氨基酸水平上仅有42-45％相同。因此，尽管使用针对胱硫醚γ-裂解酶保守区域设计的引物已克隆了MGL1和MGL2，但它们在多肽长度上基本上不相似。
本发明还包括与图1和2中举例的片断具有至少80％，特别是至少90％，和特别是至少95％相似性的多核苷酸片断。本发明还包括与图1和2中举例的多肽具有至少80％，特别是至少90％，和特别是至少95％相似性的多肽序列。“相似性”指核苷酸或氨基酸相同和保守取代，前提是高半胱氨酸脱硫酶的酶功能基本上未受损失。
技术人员会预料到可对基因或其衍生物进行遗传操作，例如，经过本领域普遍已知的重组DNA技术克隆基因并在体外或体内表达由此编码的多肽。具有图1和2所述核苷酸序列的多核苷酸片断或其衍生物优选用于高半胱氨酸脱硫酶的表达。
应明白对于本文包含的具体高半胱氨酸脱硫酶多肽，可存在变异(天然或其它)。这些变异可表现为在全序列上的氨基酸差异或在所述序列中一个或多个氨基酸的缺失，取代，插入，颠倒或添加。所有这些衍生物均包括在本发明的范围内，前提是该衍生物具有生理学功能(即，表现出本文限定的高半胱氨酸脱硫酶活性)。例如，为达到本发明目的，可在下列各组内的氨基酸之间进行保守取代：
(I)丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸；
(II)谷氨酸和天冬氨酸；
(III)精氨酸和赖氨酸；
(IV)天冬酰胺和谷氨酰胺；
(V)异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸；
(VI)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。
而且，可对鉴定在高半胱氨酸脱硫酶推断的功能结构域内的氨基酸进行特定取代。例如，鉴定在推断的底物结合结构域内的氨基酸可用保守或非保守氨基酸取代以观察该取代产生的酶动力学方面的任何改变。该改变可导致，例如，高半胱氨酸比活增加，或比活减小而高半胱氨酸的Km下降，或对诸如半胱氨酸和邻乙酰基-L-丝氨酸的其它底物的比活增加。
本发明人已表明MGL1中的半胱氨酸残基C113和MGL2中的C116在高半胱氨酸脱硫酶的催化活性中起部分作用。他们已表明用甘氨酸取代半胱氨酸113/116仍产生有催化活性的高半胱氨酸脱硫酶。尽管该突变一般产生对所有底物比活减少的酶，但MGL2中的半胱氨酸116突变为甘氨酸产生对半胱氨酸和邻乙酰基-L-丝氨酸比活增加的酶。而且，MGL2中半胱氨酸116突变为甘氨酸产生对高半胱氨酸的Km更低的酶。
另外已观察到MGL1和MGL2序列相对于胱硫醚γ-裂解酶向N-端插入了7个氨基酸(MGL1中的残基49-55)。该区域适合于突变研究。
突变研究使得可产生适合于许多不同用途的具有不同的催化活性的不同高半胱氨酸脱硫酶。
而且，可使用重组DNA技术制备编码这些如上所述的衍生物的核酸序列。
正如本领域所熟知的，遗传密码的简并性允许取代密码子中的碱基以产生能编码相同氨基酸的不同密码子，例如，氨基酸谷氨酸的密码子是GAT和GAA。因此，已清楚为了表达具有图1或2所示氨基酸序列的多肽，或其片断，可利用具有不同于图1或2所示核酸序列的这类可替换的密码子组合的衍生核酸序列。
另外，表现出高半胱氨酸脱硫酶活性的来自高半胱氨酸脱硫酶多肽或来自图1和2所示氨基酸序列的片断，或来自编码所述高半胱氨酸脱硫酶多肽的核苷酸序列的或来自编码所述高半胱氨酸脱硫酶多肽片断的图1和2所示的核苷酸序列的片断也包括在本发明中。
自然，本领域的技术人员可预料到本发明包含产生所述高半胱氨酸脱硫酶多肽或基因的酶活性衍生物的上文所述的这类修饰。本发明的所述高半胱氨酸脱硫酶多核苷酸片断优选与调控序列相连接。该控制序列可包括启动子，操纵子，诱导物，核糖体结合位点，终止子等。本领域的普通技术人员可选择给定宿主的合适的控制序列。另外，诸如添加氨基酸的所谓的“标记序列”可加到多肽的N或C端以便在表达多肽时产生所谓的融合蛋白质。
根据本发明的多核苷酸片断可以连接到任何一个或多个各种表达控制DNA序列上，产生所谓的重组DNA分子。因此，本发明也包括含有可表达核酸分子的表达载体。然后，该重组核酸分子可用于转化合适的宿主。表达载体优选是来自例如，质粒，或来自噬菌体或病毒产生的核酸序列的杂合DNA分子且称为“载体分子”。
可用于克隆根据本发明的核酸序列的具体载体在本领域是已知的(例如，Rodriguez，R.L.和D.T.Denhardt，编辑，载体：分子克隆载体和其用途综述，Butterworths，1988)。
两个特定的细菌表达载体pQE60和pQE30(Qiagen Hilden，德国)已用于高半胱氨酸脱硫酶表达。pQE系列表达载体(例如，pEQ60和pQE30)编码一个6组氨酸标记(6xhis-tag)，它能使用金属-螯合亲和色谱和快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化融合蛋白质。
用于构建根据本发明的重组核酸分子的方法是技术人员已知的且特别是在Sambrook，等，(分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，1989)中阐述。
本发明也涉及含有可表达形式的核酸分子的转化细胞。本文使用的“转化”指将异源核酸序列导入宿主细胞，而不论所使用的方法，例如，直接吸收，转染或转导。异源多核苷酸片断可通过自主复制来维持或可选择整合进宿主基因组。优选提供具有与指定宿主相配伍的合适的控制序列的重组核酸分子且该控制序列可调节插入的多核苷酸片断表达，例如，T7启动子，taq启动子，lac启动子和trp启动子。
用于表达重组核酸分子的合适的宿主可以是原核或真核来源。最广泛用于表达重组核酸分子的宿主可选自细菌，酵母，昆虫和哺乳动物细胞。重组高半胱氨酸脱硫酶的克隆和表达也有利于产生试剂，该试剂用于例如，原位表达研究的探针生产，抗高半胱氨酸脱硫酶抗体(特别是单克隆抗体)的生产和重组高半胱氨酸脱硫酶体外和体内生物学活性的评价。
本发明进一步提供了重组高半胱氨酸脱硫酶，它用于生产用作预防和/或治疗剂的试剂。具体地说，本发明提供了含有重组高半胱氨酸脱硫酶及其药用上可接受的载体的药用组合物。诸如癌症的疾病状态可按与Hori，H.等(1996)对甲硫氨酸γ-裂解酶所述相似的方式受益于高半胱氨酸脱硫酶疗法和/或预防处理。典型的高半胱氨酸脱硫酶可用于开发新的抗毛滴虫药，抗含高半胱氨酸脱硫酶和/或甲硫氨酸γ-裂解酶的其它病原体有活性的化合物。它们既包括使用重组高半胱氨酸在，例如，组合文库中筛选抑制剂且也包括分析酶结构以便提供特异性抑制剂或前体药物。
本发明提供了测定高半胱氨酸水平的工具。
因此，在本发明的另一方面提供了测定样品中的高半胱氨酸的方法，包括下列步骤：
a)将样品与能降解高半胱氨酸的酶接触，和
b)测定由所述酶对高半胱氨酸进行酶促降解所形成的任意反应产物。
可优选对高半胱氨酸和/或所述反应产物不进行色谱分离。
该酶优选高半胱氨酸脱硫酶，更优选的是重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶。
优选的是高半胱氨酸脱硫酶是根据图1，2，6或7的高半胱氨酸脱硫酶。
重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶也可用于测定样品中的其它底物，包括甲硫氨酸，半胱氨酸和邻乙酰基-L-丝氨酸。
一般来说，生物学样品可以是血液，血浆，粪便，唾液，阴道液或尿的样品。高半胱氨酸可经二硫键结合到诸如白蛋白的循环蛋白质上，高半胱氨酸也可以其它二硫化物衍生物(一般是高半胱氨酸-半胱氨酸连接物)的形式存在。为了获得存在于样品中的总高半胱氨酸推定值，因此需要用还原剂处理样品以裂解任何二硫键且释放游离高半胱氨酸。二硫化物还原参见Jocelyn，酶学方法， 143：243-256(1987)，其中列出了广泛的合适还原剂。在本发明的说明中引入这些合适的还原剂。
为了方便，可测定上文所述反应的终产物，α-丁酮酸，硫化氢和氨，且各种合适的方法是技术人员已知的，例如，比色法，分光光度法，电化学法，荧光测定法或发光法。优选的是该方法的灵敏度足以检测样品中＜5μmol/l的高半胱氨酸浓度。
高半胱氨酸降解产生的α-丁酮酸可按Soda(Soda，K.(1968)生化年鉴，25：228-235)法使用3-甲基-2-苯并噻唑腙盐酸(MBTH)检测。
测定α-丁酮酸的另一方法按Li，R.+Kenyon，G.L.(1995)，α-二羧酸化合物的分光光度法测定及其应用于α-丁酮酸的酶促形成， 分 析生物化学， 230，37-40中所述。
检测α-丁酮酸的一个特别优选的方法是经过加入NADH和乳酸脱氢酶以便将α-丁酮酸转变为α-羟基丁酸且产生NAD+。然后可经过许多涉及转变成NADH的方法测量NAD+水平，该方法包括经过在340nm处测吸光度的分光光度法，经过在365nm处激发和在460nm处发射的荧光法(Palmer T.(1991)，了解酶，第3版，Ellis Horwood，伦敦)；使用四氮唑盐的比色法(Altma，P.F.(1974)组织化学 38，p155-171)；电化学法(Morroux J.Elring PJ(1979)化学年鉴，51，346；Blaedel WJ，Jenkins RA(1975)化学年鉴 47，1335；Juegfeldt H等(1981)化学年鉴 53，1979；Wang J，Lin MS(1987)电化学年鉴 221，257)；和发光法(Whitehead TP等(1979)临床化学 25，1531)。
作为选择，丙酮酸脱氢酶可用于代替乳酸脱氢酶以产生NAD+并按上述检测NAD+。
高半胱氨酸降解产生的硫化氢可经过，例如，按照下列(化学计算)方程式与醋酸铅反应产生硫化铅来测定。
然后可在合适的波长，如A360nm处经分光光度法测量所产生的硫化铅。(Thong K.W.+Coombs，G.H.(1985)毛滴虫中的高半胱氨酸脱硫酶活性。IRCS医药科学 13，493-494)。
作为选择，使用Clime，J.D.Limnol，Oceanogr.(1969)14：454-458所述的亚甲蓝方法可测量硫化氢。简单地说，硫化氢与在酸中的0.17mM N，N-二甲基-对-苯二胺磺酸和在酸中的氯化铁反应产生可在650-670nm经分光光度法检测的亚甲兰。
高半胱氨酸降解产生的氨可在次氯酸盐存在下与酚反应以产生靛酚，如Horn，D.B.+Squire，C.R.(1967)，检测血浆中氨的改进方法，临床化学学报， 17，99-105中所述。然后可在合适的波长，例如，570nm下经分光光度法检测所产生的靛酚。
检测氨的其它方法包括：酶学法，按Guilbault等(1985)化学年鉴， 57，2110所述使用α-酮戊二酸和NAD(P)+与谷氨酸脱氢酶；使用2-酮戊二酸和NADH以产生谷氨酸，水和NAD+且然后按上述测量NAD+；向氨中加入硝酸银以产生黑色沉淀。
根据本发明的重组高半胱氨酸脱硫酶对许多底物表现出活性，除了高半胱氨酸外，还包括甲硫氨酸，半胱氨酸和邻乙酰基-L-丝氨酸。因此可预料到高半胱氨酸脱硫酶可用于以上述相同的方式测定甲硫氨酸，半胱氨酸和/或邻乙酰基-L-丝氨酸。
而且，由于本发明的重组高半胱氨酸脱硫酶对广泛的底物表现出活性，该酶可用于合成非常见氨基酸和相关分子。
另外高半胱氨酸脱硫酶可用于从溶液中，例如从生物学培养基中去掉高半胱氨酸，甲硫氨酸和/或半胱氨酸。
高半胱氨酸脱硫酶也可用于试验能催化涉及高半胱氨酸作为底物或产物的反应的酶(例如，S-腺苷高半胱氨酸水解酶)。以这种方式可测定的高半胱氨酸可应用于在生物学样品中对其的检测上。同样，高半胱氨酸脱硫酶可用于测定能催化涉及甲硫氨酸或半胱氨酸或有关化合物作为底物或产物的反应的酶。这些代谢物可经过其被高半胱氨酸脱硫酶转变为α-酮酸并按前面所述测量α-酮酸来测定。
该测定法也可用于估测分析物，该分析物首先断裂成高半胱氨酸，然后经过测量高半胱氨酸的浓度来测定分析物的浓度。该分析物的例子包括高胱氨酸(其中使用DTT将高胱氨酸转变成高半胱氨酸)或甲硫氨酸(可酶促转变为高半胱氨酸)。因此在两种情况下经过测量高半胱氨酸可测定分析物的浓度。
在另一方面，提供了一种用于体外测定样品中高半胱氨酸水平的诊断试剂盒，其中该试剂盒包括：
a)能降解高半胱氨酸的酶，和
b)能测定高半胱氨酸被该酶降解产生的反应产物的工具。
优选的是，该酶是高半胱氨酸脱硫酶，更优选的是重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶。
典型的是，该试剂盒的形式可以是用于手工和自动使用的以杯为基础的试验试剂盒，微量滴定平板试验试剂盒或以试验条为基础的试验试剂盒。
一种特别优选的用于体外测定样品中高半胱氨酸水平的诊断试剂盒包括：
a)重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶，和
b)乳酸脱氢酶和NADH，用于将所述高半胱氨酸脱硫酶降解高半胱氨酸产生的α-丁酮酸转变成α-羟基丁酸并伴随着NAD+释放，以合适的方式测定所述的NAD+释放。
现在将以下面非限制性实施例的方式进一步描述本发明。
实施例1设计用于克隆Trichomonas vaginalis高半胱氨酸脱硫酶的引物
图3显示了来自人，大鼠和酵母的胱硫醚γ-裂解酶(分别参见Lu等，1992，Erickson等，1990和Ono等，1992)的多蛋白质序列对比。加黑的是选择用于设计简并寡核苷酸以用作聚合酶链式反应(PCR)的同源区域。选择用于设计5’寡核苷酸引物的第一个同源区域是在不同的胱硫醚γ-裂解酶分子间序列高度同源的区域(V163-N170)。选择用于设计3’引物的第二个区域是吡哆醛5’-磷酸(PLP)结合结构域(A222-G228)。根据这些同源区域设计的简并寡核苷酸序列在图4中表示。为了便于克隆，将酶Hindlll和Xhol的选择性位点分别标记到两个简并寡核苷酸的末端。这两个寡核苷酸命名为Cyst 5’和Cyst 3’。Cyst5’有31个核苷酸长且含有3个肌苷(I)，Cyst3’有28个核苷酸长且含有两个肌苷残基。在多个可能含有四重简并性的位置导入肌苷以减少所得的合成寡核苷酸库。按照标准方案使用应用生物系统DNA合成仪合成该寡核苷酸。
实施例2使用简并寡核苷酸的PCR
RNA分离
阴道毛滴虫的克隆细胞系(G3)按Lockwood等(1984)的以前所述在改良的Diamond’s培养基中生长。在生长晚期(1-2×106/ml)收获(4℃下以2300g离心15分钟)细胞并在0.25M蔗糖中洗涤两次。使用Nucleon II试剂盒(Scotlab，Coatbridge，Scotland)分离DNA。
使用可从商业途径获得的TRIZOL(RTM)试剂(可从Gibco，Paisley，Scotland获得)以单一步骤从阴道毛滴虫分离总RNA，根据厂家说明书该试剂是酚和异硫氰酸胍的单相溶液。
从总RNA分离Poly[A]+RNA用作cDNA合成的模板。Poly[A]+RNA使用Poly[A]+快速柱(可从Stragene，LaJolla，California，美国获得)按照厂商说明书分离。
来自阴道毛滴虫的1微克Poly[A]+RNA与逆转录酶一起按照Sambrook等(1989)所述的方法用于合成第一链阴道毛滴虫cDNA。然后将cDNA用作带有简并寡核苷酸的PCR的模板。
PCR的条件如下：起始在94℃变性4分钟，接着进行30轮由94℃1分钟，42℃1分钟和72℃1分钟组成的扩增循环，随后在72℃5分钟进行最后的延伸循环。部分反应物与合适的对照反应物一起在琼脂糖凝胶(1.5％)上电泳。染色琼脂糖凝胶后观察到两个PCR产物，一个大小为大约200碱基对(bp)(下面的带片断)，第二个大小为大约250bp(上面的带片断)。
为了获得足够的材料用于克隆，进一步进行了相同的PCR。
实施例3克隆扩增的PCR产物
将来自几个PCR反应的材料(大约1μg DNA)合并在一起并对PCR扩增的DNA进行酚/氯仿提取，乙醇沉淀且重悬于水中以去掉污染的核苷酸和Taq聚合酶。然后用Hindlll和Xhol限制性酶(其限制性酶切位点分别经过将其包含在Cyst 5’和Cyst 3’简并寡核苷酸的末端已改造到扩增的DNA末端)完成对扩增的DNA的限制以产生有利于定向克隆的“粘性末端”。经过在2％TAE琼脂糖凝胶上电泳，随后用溴化乙锭染色并在长波紫外光下观察来进一步纯化DNA。使用干净的解剖刀片从凝胶上切下感兴趣的扩增带(上面和下面的带产物)，使用可从商业途径获得的Spin X柱(可从Costar，Cambridge，MA，USA获得)按照厂商说明书从琼脂糖凝胶片洗脱DNA。然后从用简并引物经PCR产生的限制性酶切且纯化的DNA(单独的上面带和下面带产物和两者的混合)与预先也用Hindlll和Xhol限制性消化的pBluescript(可从Stragene，La Jolla，California，美国获得)混合，并通过2％TAE琼脂糖凝胶纯化并使用spin X柱洗脱，如上所述。pBluescript和大约200和250bp的扩增的PCR片断以200ng插入片断加200ng载体的量使用Amersham连接试剂盒(可从Amersham，Little Chalfort，Bucks，UK获得)按照厂商说明书进行连接。
然后将连接反应物用于转化超感受态XL1 Blue大肠杆菌细胞(可从Stragene，La Jolla，California，美国获得)。大约30至40ng连接的DNA用于转化感受态细菌细胞。转化混合物涂布在含有LB amp，X-gal，IPTC的平板上37℃培养过夜。使用Promega(Promega，Madison，Wisconsin，USA)的Wizard质粒少量制备程序从白色细菌转化子分离质粒DNA并进行选择限制性分析以证实是否成功地将扩增的DNA克隆进了pBluescript质粒。
对含有克隆的PCR产物的转化子进行测序并随后分析以确定是否已从阴道毛滴虫cDNA扩增了真正的胱硫醚γ-裂解酶同源物片断。
实施例4分离全长的阴道毛滴虫  高半胱氨酸脱硫酶基因
使用两个PCR克隆(命名为cysta2和cysta 16)从阴道毛滴虫λZAP II cDNA文库(Mallinson，D.J，Lockwood，B.C.，Coombs，G.H.，North，M.J.(1994)，来自病原体原生动物 Trichomonas vaginalis四个半胱氨酸蛋白酶基因的鉴定和分子克隆。普通微生物学杂志 140 2725-2735)分离相应的全长基因。按下列程序筛选出总共100,000个cDNA克隆。将100,000个噬菌体与宿主细胞大肠杆菌XL1Blue一起涂布在L-顶级琼脂糖上，使噬菌体在37℃下繁殖直到它们在菌苔中刚好互相接触。然后经过印迹到Hybond N尼龙滤纸(可从Amersham，Little Chalfont，Bucks，UK获得)上转移噬斑。
原位变性噬菌体DNA且随后与用随机引物放射性标记的cysta2或cysta16的200碱基对的高半胱氨酸脱硫酶片断杂交。
使用高度严格条件在0.1×SSC/0.1％SDS中65℃下1小时对cDNA文库的初次筛选揭示了有25个噬斑与cysta 2探针杂交，而18个与cysta16探针杂交。将显示杂交阳性噬斑的放射自显影胶片与含有噬菌体的平板并排以取出含有阳性噬菌体的琼脂糖块。将琼脂糖块放入4℃的SM缓冲液和痕量氯仿中且使噬菌体失活过夜。
为了鉴定在高度严格条件下与cysta 2或cysta16中任何一个的200碱基对放射性探针杂交的单个噬斑，进行了第二轮噬菌体纯化。
实施例5分析Cysta 2和C ysta 16杂交克隆
与Cysta 2探针杂交的两个λ克隆和与Cysta 16探针杂交的5个λ克隆可使用F1辅助噬菌体机制(按照Stragene，La Jolla，California，美国厂商说明书的方案)直接拯救进pBluescript。随后经过限制性酶切分析来分析拯救的质粒以测定克隆的插入DNA的大小。
作为对用Cysta 2或Cysta 16探针分离的质粒进行限制性分析的结果，选择了两个克隆用于全部测序，一个是Cysta 2杂交克隆(ctlα，后来重新命名为mgl1)，另一个是Cysta 16杂交克隆(ctlβ，随后重新命名为mgl2)。选择这两个克隆是因为它们具有最大的插入片断(大小大约为1.2到1.3千碱基)且据认为其大小足以编码阴道毛滴虫  高半胱氨酸脱硫酶基因的全长拷贝。
实施例6两个阴道毛滴虫  高半胱氨酸脱硫酶基因的测序
对两个阴道毛滴虫高半胱氨酸脱硫酶基因中的每一个进行限制性作图以便亚克隆更小的片断帮助获得各基因的全部核苷酸序列。
使用Sequenase(RTM)快速变性质粒测序试剂盒(可从Amersham，Little Chalfont，Bucks，UK获得)与T7和T3引物(可从Stragene，La Jolla，California，美国获得)按照厂商说明书完成对两个克隆和其各自的亚克隆的测序。测定了第一个克隆(mgl1)的全部核苷酸序列和其推定的氨基酸序列以及第二个克隆(mgl2)的全部核苷酸序列和推定的氨基酸序列。
为了获得mgl1和mgl2的5’非翻译区(UT Rs)并证实起始密码子，使用可从商业途径获得的5’RACE试剂盒(可从Gibco，Paisley，Scotland获得)按照厂商说明书进行cDNA末端的5’逆转录酶快速扩增(RT-RACE)。获得的mgl1和mgl2 RACE产物大小均为大约250个碱基对。按照厂商说明书将mgl1和mgl2 RACE产物直接克隆进ligATor试剂盒(可从R&D Systems，Minneapolis，USA获得)的pTAg载体中。该系统采用的特征是在Taq聚合酶存在下进行的PCR具有标记到任意扩增片断末端上的5’腺苷悬垂。该系统有助于将PCR产物克隆进具有互补胸苷残基悬垂的载体中。
对转化子的限制性分析揭示5’RACE产物已克隆进了pTAg载体。使用可从商业途径获得的-20引物和M13逆向引物在两条链上进行RACE克隆的测序。
对mgl1的5’RACE产物测序揭示了5’UTR极短(13个核苷酸长)，但证实了从cDNA序列鉴定的起始ATG密码子。
对于mgl2获得了两个独立的5’RACE产物，两个克隆都具有从cDNA文库分离的基因拷贝所缺少的ATG起始密码子。更长的mgl2RACE克隆鉴定了一个大约14个核苷酸长的短5’UTR区域。
图1和2显示了mgl1和mgl2的5’UTRs以及mgl1和mgl2各自完整的cDNA序列和推定的氨基酸序列。序列对比分析(见表1)  显示推定的MGL1和MGL2与以前测序的胱硫醚γ-裂解酶具有相当低水平的序列相同性且不可能克隆出阴道毛滴虫胱硫醚γ-裂解酶。该发现证实了克隆的基因产物不具有胱硫醚γ-裂解酶活性(见表2)。
实施例7组氨酸标记的高半胱氨酸脱硫酶融合蛋白质的克隆和表达
QIAexpress系统(Qiagen，La Jolla，California，USA)用于MGL1和MGL2多肽的表达和纯化。将mgl1和mgl2基因克隆进pQE载体，它在表达的蛋白质N或C末端编码6-组氨酸标记。然后使用Ni2+-NTA树脂亲和纯化6-组氨酸标记的蛋白质(详情参见QIAexpress手册)。
mgl1的克隆
mgl1 cDNA克隆在质粒pBluescript中维持。初步的序列分析表明阴道毛滴虫mgl1 cDNA以与预期相反的方向克隆进了pBluescript，因此从pBluescript直接亚克隆mgl1到pQE载体是不可能的。为了克服pBluescript中mgl1 cDNA的方向问题，采用PCR克隆方案能将cDNA克隆进合适的pQE载体。
寡核苷酸引物设计成mgl1 cDNA的5’和3’端，它们分别包括限制性核酸内切酶位点Ncol和Bglll。通过PCR扩增方法，将这两个限制性位点改造到mgl1 DNA的末端，其存在有利于将DNA克隆进Ncol和Bglll限制的pQE载体。两个引物的核苷酸序列在图5中显示。
选择pQE60，一种ATG构建体用作载体，将mgl1 DNA克隆进该载体。ATG构建体使得表达的蛋白质用真正的ATG密码子开始。mgl1cDNA编码起始甲硫氨酸，且因此认为适合于克隆进该具体的pQE载体(详情参见QIAexpress手册)。
含有mgl1 cDNA的pBluescript使用BamHl线性化，将线性化的DNA用作模板与图5中列出的两个寡核苷酸一起用于PCR。PCR混合物的成分在下面列出。
1μl(10ng/μl)pBluescript/mgl1 BamHl线性化的模板
5μl(100ng/μl)5’Ncol引物
5μl(100ng/μl)3’Bglll引物
5μl 10×pfu缓冲液(Stragene，La Jolla，California，美国)
2.5μl各5mM的dATP，dGTP，dCTP，dTTP
1μl pfu聚合酶(可从Stragene，La Jolla，California，美国获得的Taq的校正型)
30.5μl水
使用下列条件进行mgl1 DNA的扩增
94℃下5分钟，随后是如下的30次循环
94℃下1分钟
42℃下1分钟
72℃下1分钟，最后是如下的一次延伸反应
72℃下5分钟
经PCR扩增后，使用Magic PCR Wizard preps(Promega，Madison，Wisconsin，USA)按照厂商说明书从mgl1 DNA中去掉污染的核苷酸和聚合酶。纯化的mgl1 DNA在其5’端现在具有一个Ncol位点在其3’端具有一个Bglll位点，与pQE60载体一样用这两种酶限制性酶切该DNA。将限制性酶切的pQE载体和mgl1 DNA连接起来并将含有该插入片断的完整载体转化进M15[pREP4]细胞，详情参见QIAexpress手册。然后按照QIAexpress手册将含有mgl1 DNA的pQE60质粒用于试验重组蛋白质的表达。
mgl2的克隆
将包含在pBluescript中的mgl2 cDNA直接亚克隆进pQE30。含有mgl2 DNA的pBluescript用BamHl和Xhol限制性酶切。将该限制性插入片断与已用BamHl和Sall限制性酶切的pQE30载体连接。将完整的pQE30载体和插入片断转化进M15 pREP4细胞。然后将含有mgl2 DNA的pQE30载体按照QIAexpress手册用于试验重组蛋白质的表达。
将含有mgl1或mgl2的pQE质粒转化进大肠杆菌菌株M15[pREP4]且获得单个的菌落。将单个菌落接种进含有100ug/ml氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的20ml LB培养基在37℃生长过夜。
然后用全部过夜培养物接种1升LB培养基，培养物在37℃下生长直到A750达到0.8(大约2-3小时)。然后加入IPTG至终浓度为1mM并在37℃使其继续生长21/2小时。
离心收获细胞并在-70℃冷藏。
按照Qiagen QIAexpress方案的方案5，使用诸如Ni-NTAsuperflow的金属螯合树脂以FPLC纯化表达的蛋白质。
经SDS-PAGE分析以FPLC获得的含有蛋白质的馏份，混合那些具有重组高半胱氨酸脱硫酶的馏份并在-20℃贮存前用含有10％甘油的超声处理缓冲液(50mM磷酸钠pH8.0，300mM NaCl)透析过夜。
实施例8用于纯化重组阴道毛滴虫高半胱氨酸脱硫酶的改良方法
下面详细描述的方法包含细菌的生长，重组酶的表达和FPLC/Ni-NTA纯化。所有缓冲液，培养基等的详情在附录中给出。载体，细菌宿主菌株和方法的进一步详情可参考QIAGEN蛋白质表达手册找到。
第1天
将5μl M15[pREP4]细胞(含有pQE30/阴道毛滴虫cDNA)的贮备甘油种子划线到含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上。37℃生长过夜。[在LB平板上的菌落可在4℃贮存达到2周]。
第2天
在500ml烧瓶中用单个菌落接种50ml含有氨苄青霉素和卡那霉素(终浓度如上)的LB培养基。37℃下在有轨摇床中以-200rpm摇动生长过夜。
第3天
在两升烧瓶中，用50ml过夜培养物接种400ml加有氨苄青霉素和卡那霉素的新鲜LB培养基。
-37℃下摇动(200rpm)生长培养物1.75小时。经过加入无菌IPTG(以得到0.2mM的终浓度)并在37℃下再摇动生长2.25小时诱导细胞表达高半胱氨酸脱硫酶。
-经过在4℃下以8000g离心10-15分钟沉淀细胞。
-将沉淀重悬于5ml超声缓冲液中并转移进15ml Falcon试管中，加入吡哆醛5’磷酸(PLP)至终浓度为20μM。在-70℃冷冻重悬的细胞直到纯化需要。为了检测进行的表达，取出200μl细菌培养物样品，取出时间为：a)刚好在加入IPTG前和b)在加入IPTG后在2.25小时诱导期间结束时。沉淀(1300rpm/5分钟)细胞，重悬于80μl Laemmli’s样品缓冲液中，煮沸5分钟，取10μl等分试样在12.5％SDS-PAGE凝胶上电泳以证实IPTG诱导后高半胱氨酸脱硫酶的表达。[作为选择可取样更大体积的未诱导和诱导的细胞(1ml)，经过超声处理裂解并进行高半胱氨酸脱硫酶活性测定]。
用 超声处理缓冲液平衡Ni-NTA树脂柱过夜。一般来说可使用8ml填充体积的树脂/柱。
第4天在Ni-NTA树脂上以FPLC亲和纯化His-标记的酶。
1.从-70℃冷库中取出冷冻细胞，经过将试管放入装有冷水的烧杯中复苏。
2.经超声处理裂解细胞。
3.将超声处理的材料转移进50ml离心试管中并在4℃以10,000g离心30分钟。特别是当首先使用超声仪时，经过以SDS-PAGE比较沉淀和上清馏份对于检查细菌是否充分裂解是有用的。高半胱氨酸脱硫酶是高度可溶的且95％应在可溶馏份中。
4.离心后，上清[含有可溶性酶](～5-6ml总体积)通过0.22μmMillipore滤器直接过滤进附着在FPLC导入口(注射孔)的Luer-lock注射器中并开始纯化。
注意：在包括Waters 600S控制器和Waters 600S泵的WatersFPLC系统中进行所列的纯化程序。基本步骤是：
样品应用(当导入口转向‘注射’档时从注射器自动吸取样品到柱上)。实际上可见该酶作为极亮的黄色带结合到NT-NTA树脂上。
1.用 超声缓冲液短暂洗涤
2.用 洗涤缓冲液洗涤更长时间
3.使用线性梯度0-500mM咪唑[100％ 洗涤缓冲液至100％ 洗脱缓 冲液(inc.500mM咪唑)]进行酶洗脱
注意：FPLC运行条件的全部细节(流速，洗涤时间，梯度等)参见附录。
5.在280nm下以紫外检测器持续监测柱流出物的蛋白质浓度，收集全过程中的馏份。
6.合并含有重组酶的馏份(容易以其亮黄绿色鉴定)并在4℃下用1升透析缓冲液透析过夜(如果需要可更换几次缓冲液)(以去掉咪唑)。
7.取少量(～50μl)透析酶制品的样品使用BCA方法(Pierce化学公司BCA[Bicinchoninic acid]试剂盒)测定蛋白质含量。剩余制品与 稳定缓冲液按1∶1混合，以1ml的等分试样贮存于-20℃。
附录
所需的试剂和缓冲液
Luria-Bertani培养基(LB培养基)
在1升中：
在950ml水中溶解下列成分：
细菌用胰蛋白胨          10g
细菌用酵母抽提物        5g
NaCl                   10g
将pH调节到7.0(如果需要)。加蒸馏水至1升。以151b/平方英寸高压灭菌20分钟(对于LB琼脂，每升含有15g细菌用琼脂)。
抗生素
氨苄青霉素(Sigma A-9518)
(在蒸馏水中的100mg/ml贮液)-通过0.2μm，Millipore滤器过滤灭菌，以1ml的等分试样贮存于-20℃。
卡那霉素(Sigma K-4000)
(在蒸馏水中的25mg/ml贮液)-按上述灭菌和贮存。
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；Gibco BRL 15529-019)
1M贮液(在蒸馏水中)-滤器灭菌(0.2μm滤器)，以1ml的等分试样贮存于-20℃。
吡哆醛5’-磷酸(PLP；Sigma P-9255)
在蒸馏水中的1M贮液。每次新鲜配制(用于加入悬浮的细胞中)。
Ni-NTA Superflow树脂(QIAGEN 30430)
超声处理缓冲液：50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，300mM NaCl
1M Na2HPO4：46.6ml
1M NaH2PO4：3.4ml
17.53g NaCl
加蒸馏水至1升
洗涤缓冲液：50mM磷酸钠缓冲液，pH6.0，300mM NaCl，10％
甘油
1M Na2HPO4：6ml
1M NaH2PO4：44ml
17.53g NaCl
100ml甘油
加蒸馏水至1升
洗脱缓冲液：含有500mM咪唑的洗涤缓冲液
将17.02g咪唑溶于500ml洗涤缓冲液中。
(咪唑-Sigma I-0125)
透析缓冲液：100mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，300mM，20％甘油，
20μM PLP，15μM二硫苏糖醇
1M Na2HPO4：30.35ml
1M NaH2PO4：69.65ml
17.53g NaCl
200ml甘油
2ml 10mM PLP贮液
15μl 1M二硫苏糖醇贮液(二硫苏糖醇-Sigma D-9779)
稳定缓冲液：100mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，80％甘油，40μM PLP， 30μM DTT
在10ml中：1.96ml 100mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，8ml甘油，40μl 10mM PLP，3μl 100mM DTT
叠氮钠(Sigma S-2002)：0.05％溶液
-用后泵到Ni-NTA柱上以防止细菌生长(纯化期间将柱贮存在4℃的叠氮化物中)。
在蒸馏水中制备10％(w/v)的贮液(4℃贮存)。稀释得到0.05％的工作浓度。
在FPLC上使用的所有缓冲液用前应抽气。使用Millipore真空滤器单元通过0.2μm滤膜过滤缓冲液实现抽气。
用于监测纯化的高半胱氨酸脱硫酶活性测定
该试验测量H2S的产生；H2S被醋酸铅‘捕获’形成胶体硫化铅(一种深棕色化合物)，它在360nm处具有最大吸光度。
试剂
测定缓冲液：100mM咪唑缓冲液，pH6.5
D，L-高半胱氨酸(Sigma H-4628)；贮液100mM(在测定缓冲液中制备)。测定中终浓度＝40mM(400μl贮液)
醋酸铅(BDH 10142)；贮液3.3mM(在蒸馏水中制备)。测定中的终浓度＝0.33mM(100μl贮液)
重组酶：作为起点，使用10μl 100×稀释度的纯酶制品。(在100mM磷酸钠缓冲液，pH6.5中稀释酶制品)
用测定缓冲液将测定混合物的终体积调节为1.0ml。
进行对照测定的混合物：1)没有酶，2)没有底物。
计算酶活性
使用硫化铅的摩尔消光系数为5205M-1cm-1。
Figure C9719832400261
Figure C9719832400262
纯化重组阴道毛滴虫  MGL2的详细FPLC程序
                                                     梯度
          时间          流速         ％A        ％B       ％C
1.   (使用0-30分钟的    0.2          100        0          0
          样品)
2.        30            0.5          100        0          0
3.        90            0.5          0          100        0
4.        150           0.5          0          100        0
5.        250           0.5          0          0          100
缓冲液：A＝超声处理缓冲液
        B＝洗涤缓冲液
        C＝洗脱缓冲液
实施例9  高半胱氨酸测定
测定I
使用根据前面实施例在66mM磷酸钠缓冲液pH7.5，0.33mM醋酸铅中制备的重组高半胱氨酸脱硫酶测量高半胱氨酸水平。
高半胱氨酸脱硫酶催化高半胱氨酸转变为α-丁酮酸，氨和硫化氢。硫化氢与醋酸铅反应产生硫化铅，硫化铅可在360nm下以分光光度法检测(摩尔消光系数＝5205M-1cm-1)。
测定试剂
0.1M磷酸钠                 0.5ml
1mM醋酸铅                  0.5ml
100μM至10mM高半胱氨酸     0.49ml
(33μM-3.3mM终浓度)
高半胱氨酸脱硫酶(6μg/ml)  10μl
-最后加入
测定试剂在20℃保温0至120分钟使其显色。然后经过在360nm下测量吸光度来测定高半胱氨酸水平。
结果
高半胱氨酸浓度     吸光度改变
                    (40分钟)
3.3mM                1.066
333μm               0.790
33μm                0.06
测定II
测定原理
二硫苏糖醇(DTT)开始用于将高胱氨酸降解为高半胱氨酸并释放结合高胱氨酸(高半胱氨酸)的蛋白质。然后高半胱氨酸在高半胱氨酸脱硫酶的作用下降解为α-丁酮酸，氨和硫化氢。然后利用特异性乳酸脱氢酶同工酶将α-丁酮酸转变为α-羟基丁酸并伴随着释放NAD+。经过使用HCL降低pH去掉任何NADH后，NAD进入含有乙醇，乙醇脱氢酶，心肌黄酶和四氮唑盐的循环机制产生可经光度法测量的有色产物。颜色加深相应于样品中高半胱氨酸的浓度。
测定程序
步骤1：将100ul样品(例如，柠檬酸盐血浆)与500ul 0.1mol/lHEPES，0.1mmol/l NADH，20,000μmoles/min/l高半胱氨酸脱硫酶，50,000U/l乳酸脱氢酶和0.05mol/l二硫苏糖醇，pH8.0混合进杯中37℃培养20分钟。
步骤2：加入500ul 1mol/l HCl，0.55％(v/v)Nonidet P40，1×10-4mol/l氮兰四唑(NBT)。37℃培养5分钟。
步骤3：加入500ul三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)，1mol/l乙醇，随后加入50ul 20,000U/l乙醇脱氢酶，1000U/l心肌黄酶。
加入含有乙醇脱氢酶的试剂后测量5分钟在527nm处吸光度的增加。
测定效果
i)标准曲线
典型的标准曲线在下表中显示：
    高半胱氨酸浓度(μmol/l)     Δ吸光度527nm/10分钟
    01020304050     0.3850.4950.5800.6700.7700.850
经过将高半胱氨酸掺加到血清中产生标准曲线。背景信号部分由内源性高半胱氨酸水平引起。
ii)敏感性
可清楚检测的浓度为＜5μmol/l高半胱氨酸。
iii)回收率
将高半胱氨酸掺加进血浆并测定回收率：
    加入的高半胱氨酸    回收的高半胱氨酸(μmol/l)             (μmol/l)     ％回收率
    255075100                20.753.265.595.7     831068796
iv)直线性
下表说明了反应的直线性：
加入的盐水量(％) 测量的Δ吸光度527nm/10分钟 理论的Δ吸光度527nm/10分钟 占预期信号百分数的信号
    01020304050100     0.520.450.410.350.30.220     0.520.470.420.370.310.260     100％95.7％97.6％94.6％96.8％84.6％-
使用上述量的盐水稀释病人样品(血浆)并测量信号，与理论信号比较。
v)交叉反应性
下表说明了与甲硫氨酸和半胱氨酸的测定交叉反应性：
分析物浓度(μmol/l)            Δ吸光度527nm/10分钟
  高半胱氨酸     甲硫氨酸     半胱氨酸
    0     0.52     0.52     0.52
    25     -     0.51     0.48
    50     -     0.52     0.5
    100     -     0.49     0.51
    200     1.1     0.5     0.49
将高半胱氨酸，甲硫氨酸和半胱氨酸掺加进血浆并测量信号。观察到与半胱氨酸或甲硫氨酸的交叉反应性达不到200μmol/l的水平。
实施例10定点诱变重组MGL1和MGL2
使用以PCR为基础的QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)实现突变rMGL1(C113G)和rMGL2(C116G)的生产。双链mgl1和mgl2 cDNA(以p-Bluescript或pQE30/60表达载体)用作模板。使用一对如下的寡核苷酸引物进行诱变，该引物互补于cDNA克隆的相反链，分别含点突变以便将各自的半胱氨酸密码子(TGC)转变成甘氨酸密码子(GGC)：1)5’-TGCCTTTATGGC GGCACACATGCTCTCT-3’；2)5’-AAGAGAGCATGTGTGC CGCCATAAAGG-3’。对突变的cDNA进行PCR介导的扩增后，使用Dpn-I核酸内切酶选择性消化起始模板cDNA/载体。经过使用基因特异性寡核苷酸引物在两条链上测序可鉴定含有所需突变的cDNA克隆。将在p-Bluescript中突变的cDNA在表达前亚克隆进pQE载体。按前面所述进行重组突变的MGL1和MGL2的生产和纯化。
实施例11重组MGL1，MGL2，和突变的MGL1(C113G)和MGL2(C116G)的酶学研究
以前从阴道毛滴虫   纯化的甲硫氨酸γ-裂解酶对包括甲硫氨酸，高半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的许多底物具有活性，但对胱硫醚没有活性(Lockwood和Coombs，1991)。为了评价MGL1和MGL2以及纯化的天然甲硫氨酸γ-裂解酶之间的相似性，分析了重组酶的酶活性(表2)。发现rMGL1和rMGL2对高半胱氨酸具有相当高的活性且还发现它们迅速降解代谢甲硫氨酸，半胱氨酸和邻乙酰基丝氨酸。两种重组酶不能利用胱硫醚作为底物。还测定了两种重组蛋白质对高半胱氨酸和半胱氨酸的动力学参数(表3)。rMGL1对两种底物的表观Km比rMGL2更高，对甲硫氨酸的差异最大。
生产并纯化突变的rMGL1(C113G)和rMGL2(C116G)后，比较其酶活性与相应的野生型酶的酶活性(表2)。在最佳条件下rMGL1(C113G)对所有底物的活性比野生型rMGL1低得多。rMGL2(C116G)对高半胱氨酸和甲硫氨酸的活性也比野生型rMGL2更低，但令人惊奇的是突变酶对半胱氨酸和邻乙酰-L-丝氨酸的活性增加。两种突变酶都不表现出对胱硫醚的活性。
针对突变的和野生型酶在对高半胱氨酸和半胱氨酸的代谢方面进行了比较动力学分析(表3)。rMGL1(C113G)与野生型rMGL1相比Km值略高且Vmax值显著更低表明该突变酶的底物结合效率下降。相反，rMGL2(C116G)对半胱氨酸的表现Km比rMGL2低得多，且这与突变酶对该底物的活性增加(更高的Vmax)相关。意想不到的是rMGL2(C116G)对高半胱氨酸的Km相对于野生型酶下降了许多，尽管突变酶对该底物的Vmax明显更低。
           表2.突变的和野生型重组蛋白质的酶活性比较
底物             rMGL1             rMGL1             突变型/野生型
                                   (C113G)           (％)
高半胱氨酸       370±11(8)        34.5±3.2(14)     9.3
甲硫氨酸         10.4±0.31(4)     0.79±0.17(8)     7.6
半胱氨酸         6.02±0.63(8)     2.33±0.35(8)     38.7
邻乙酰基-L-丝氨  3.74±0.1(4)      1.83±0.12(8)     48.9
酸
胱硫醚           N.D.     (4)      N.D.      (8)     -
底物             rMGL2             rMGL2             突变型/野生型
                                   (C116G)           (％)
高半胱氨酸       128±22(14)       27.0±5.8(19)     21.2
甲硫氨酸         0.67±0.18(11)    0.15±0.05(14)    22.4
半胱氨酸         1.06±0.42(16)    2.31±0.71(17)    217.9
邻乙酰基-L-丝氨  1.51±0.49(12)    2.15±0.17(14)    142.4
酸
胱硫醚           N.D.      (12)    N.D.      (8)     -
活性(以μmol分钟-1mg蛋白质-1表示)是来自括号中所给实验号的平均值±S.D.。经过使用标准方法监测硫化氢生产测定了对高半胱氨酸和半胱氨酸的活性；经过标准α-酮酸生产测定测量了对其它底物的活性。N.D.，活性检测不到(＜0.04μmol分钟-1mg蛋白质-1)。
表3野生型和突变型rMGL1和rMGL2在对高半胱氨酸
         和半胱氨酸代谢方面的动力学参数
              高半胱氨酸              半胱氨酸
           KM 1        Vmax2     Km1        Vmax2
rMGL1      12.2         256        8.5         14.9
rMGL1      15.2         42         9.7         4.6
(C113G)
rMGL2      37.7         132        22.3        2.4
rMGL2      6.2          53         3.6         4.8
(C116G)
使用了至少10种不同的底物浓度，至少重复三次测定。
1mM，2μmol分钟-1mg蛋白质-1。
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Claims (39)

1.一种测定样品中的高半胱氨酸的方法，包括下列步骤：
a)将样品与一种酶接触，所述酶能催化高半胱氨酸的降解，以释放反应产物：α-丁酮酸、硫化氢和氨，和
b)测定由所述酶对高半胱氨酸进行酶促降解所形成的任何一种所述反应产物。
2.根据权利要求1的测定高半胱氨酸的方法，其中该酶是高半胱氨酸脱硫酶。
3.根据权利要求2的测定高半胱氨酸的方法，其中高半胱氨酸脱硫酶是表现出高半胱氨酸脱硫酶活性的重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶。
4.根据权利要求3的测定高半胱氨酸的方法，其中重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶是如图1、2、6或7所示的高半胱氨酸脱硫酶。
5.根据权利要求1至4中任意一项的测定高半胱氨酸的方法，其中一种所述的反应产物是α-丁酮酸且测定α-丁酮酸的水平。
6.根据权利要求1至4中任意一项的测定高半胱氨酸的方法，其中一种所述的反应产物是硫化氢且测定硫化氢的水平。
7.根据权利要求1至4中任意一项的测定高半胱氨酸的方法，其中一种所述的反应产物是氨且测定氨的水平。
8.根据权利要求5的测定高半胱氨酸的方法，其中经过将α-丁酮酸与NADH和乳酸脱氢酶或丙酮酸脱氢酶反应以便将α-丁酮酸转变为α-羟基丁酸且产生NAD+和测定NAD+水平来测定α-丁酮酸的水平。
9.根据权利要求1至4中任意一项的测定高半胱氨酸的方法，其中所述的方法灵敏到足以检测＜5μmol/l高半胱氨酸的浓度。
10.一种测定可降解为高半胱氨酸的分析物的方法，其中包括首先将分析物转化为高半胱氨酸并然后以任意一项前面权利要求的方法估测所产生的高半胱氨酸。
11.根据权利要求10的方法，其中分析物是高半胱氨酸。
12.一种测定样品中的甲硫氨酸、半胱氨酸或邻乙酰基-L-丝氨酸的方法，包括下列步骤：
a)将样品与原生动物高半胱氨酸脱硫酶接触，所述酶能够将甲硫氨酸降解成氨、甲硫醇和α-丁酮酸，将半胱氨酸降解成氨、硫化氢和丙酮酸，将邻乙酰基-L-丝氨酸降解成氨和丙酮酸，
b)测定由甲硫氨酸、半胱氨酸或邻乙酰基-L-丝氨酸的酶降解所形成的任何反应产物。
13.一种用于体外测定样品中高半胱氨酸水平的诊断试剂盒，其中该试剂盒包括：
a)一种酶，所述酶能催化高半胱氨酸的降解，以释放反应产物：α-丁酮酸、硫化氢和氨，和
b)能测定高半胱氨酸被该酶降解产生的任何一种反应产物的工具。
14.根据权利要求13的用于体外测定样品中高半胱氨酸水平的诊断试剂盒，其中该酶是高半胱氨酸脱硫酶。
15.根据权利要求14的用于体外测定样品中高半胱氨酸水平的诊断试剂盒，其中高半胱氨酸脱硫酶是表现出高半胱氨酸脱硫酶活性的重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶。
16.根据权利要求15的用于体外测定样品中高半胱氨酸水平的诊断试剂盒，其中重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶是与图1、2、6或7所示的多肽具有至少80％相似性的高半胱氨酸脱硫酶。
17.编码与图1、2、6或7所示的片段具有至少80％相似性的高半胱氨酸脱硫酶的多核苷酸片段。
18.根据权利要求17的多核苷酸片段，其中所述片段如图1、2、6或7所示。
19.根据权利要求17或18中任意一项的多核苷酸片段，其特征在于所述的多核苷酸片段编码具有如图1、2、6或7所示的氨基酸序列的多肽。
20.根据权利要求17的多核苷酸片段，其特征在于它是相同于图1、2、6或7所示的多核苷酸片段的多核苷酸片段。
21.一种重组核酸分子，包含根据权利要求17-20中任意一项的多核苷酸片段。
22.根据权利要求21的重组核酸分子，其特征在于重组核酸分子含有与所述的多核苷酸片段可操作连接的调控序列，以用于控制所述的多核苷酸片段的表达。
23.根据权利要求21和22中任意一项的重组核酸分子，其中该重组核酸分子是一种质粒。
24.根据权利要求21和22中任意一项的重组核酸分子，其中该重组核酸分子来自病毒载体。
25.用根据权利要求17至20中任意一项的多核苷酸片段或根据权利要求21至24中任意一项的重组核酸分子转化的原核或真核宿主细胞。
26.表现出高半胱氨酸脱硫酶活性的如图1、2、6或7所示的重组阴道毛滴虫高半胱氨酸脱硫酶多肽。
27.一种表现出高半胱氨酸脱硫酶活性的重组高半胱氨酸脱硫酶多肽，其与图1、2、6或7所示的多肽具有至少80％的相似性。
28.根据权利要求27的重组高半胱氨酸脱硫酶多肽，其中所述多肽如图1、2、6或7所示。
29.一种与根据权利要求27和28中任意一项的多肽发生免疫反应的抗体。
30.根据权利要求17至20中任意一项的多核苷酸片段在制备用于治疗的药物中的应用。
31.根据权利要求21至24中任意一项的重组核酸分子在制备用于治疗的药物中的应用。
32.根据权利要求27和28中任意一项的重组原生动物高半胱氨酸脱硫酶在制备用于治疗的药物中的应用。
33.根据权利要求27和28中任意一项的重组多肽在生产用于治疗的药物中的应用。
34.根据权利要求27和28中任意一项的重组多肽在生产用于癌症治疗的药物中的应用。
35.一种药用组合物，包含根据权利要求17至20中任意一项的多核苷酸片段及其药用上可接受的载体。
36.一种药用组合物，包含根据权利要求27和28的多肽及药用上可接受的载体。
37.根据权利要求27和28中任意一项的重组多肽在筛选其抑制剂中的应用。
38.根据权利要求27和28中任意一项的重组多肽在从样品中去掉高半胱氨酸和/或甲硫氨酸和/或半胱氨酸中的应用。
39.根据权利要求27和28中任意一项的重组多肽用于测定催化涉及高半胱氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸作为底物或产物的反应的酶的存在的应用。
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