JP3360833B2 - 原生動物トリコモナス・バギナリスからのホモシステインデスルフラーゼ - Google Patents

原生動物トリコモナス・バギナリスからのホモシステインデスルフラーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ホモシステイン、システイン、Ｏ−アセチ
ル−Ｌ−セリンおよび／またはメチオニンの分解を触媒
する酵素を用い、生物学的試料中のホモシステイン、シ
ステイン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンおよび／またはメ
チオニンのレベルを測定するアッセイ（該酵素は特にホ
モシステインデスルフラーゼである）；原生動物ホモシ
ステインデスルフラーゼをコードするポリヌクレオチド
断片、このようなポリヌクレオチド断片を含む組換えベ
クター、該ポリヌクレオチド断片または該組換えベクタ
ーを含有する宿主細胞、原生動物ホモシステインデスル
フラーゼポリペプチド、および医療または動物医療で使
用するための組換えホモシステインデスルフラーゼを含
む医薬組成物に関する。
血液中のホモシステインの上昇したレベルは、多くの
ヒトの病気状態の重要なインジケーターであるらしい。
ホモシステインは血管病および発作の指標であり（Uela
nd,P.M.（1992）およびKluijtmans L.A.J.ら（199
6）；糖尿病およびアルコール症の形態に関連し（Crav
o,M.L.ら（1996））；肝臓および腎臓障害（Bostom,A.
G.ら（1996））および神経管欠陥（Steegers−Thenisse
n,R.P.N.（1992））をモニターするのに使用され、ある
種の天性性代謝異常に関連する（Mudd,S.H.（198
9））。
血液中のホモシステインレベルは、便宜的には、高速
液体クロマトグラフィー（HPLC）法を用いて測定される
（例えば、Poele−Pothoff M.T.S.ら（1995）参照）。
しかしながら、HPLC法は高価で精巧な機械を使用し、一
般に、込み入っており、多くのルーチン的分析では非現
実的であると考えられている。
特許公報WO93/15220（Cockbain）には、ホモシステイ
ン変換酵素であるＳ−アデノシルホモシステインヒドロ
ラーゼ（SAH−ヒドロラーゼ）を用いる血液中のホモシ
ステインを検定する方法が記載されている。SAH−ヒド
ロラーゼは共基質のアデノシンによるホモシステインの
Ｓ−アデノシル−ホモシステインへの変換を触媒する。
次いで、消費されたアデノシンの量を測定することによ
って、消費されたホモシステインの量と関連付けること
ができる。次いで、試料中のホモシステインの量をアデ
ノシン濃度の差異から決定することができる。しかしな
がら、このようなアッセイは、２種の初期の基質（ホモ
システインおよびアデノシン）および２種の酵素を必要
とし、それを比較的複雑にする。また、それはアデノシ
ンの濃度の減少を測定することを含み、これは満足でき
るものではない。
US4940658（Allenら）には、身体組織の試料中のホモ
システインレベルを含めたスルフィドリルアミノ酸を測
定する方法、全ホモシステインレベルに対するアッセイ
を用いるコバラミン欠乏と葉酸欠乏を検出する方法、メ
チルマロン酸についてのアッセイと組み合わせて全ホモ
システインレベルのアッセイを用いる葉酸欠乏からコバ
ラミン欠乏を区別する方法が記載されている。該アッセ
イは、適当なマーカーで標識したアッセイすべきスルフ
ィドリルアミノ酸の既知量を含む参照標準と試料とを合
わせ、マススペクトロメーターで、各試料につき存在す
る標識されたおよび未標識のスルフィドリルアミノ酸の
相対的量を測定することを含む。標識された試料の量は
既知であるので、従って、未標識試料に対する標識試料
の比率を計算することから、試料中に存在するスルフィ
ドリルアミノ酸の量を決定することができる。
US5438017には、体液の試料中のスルフィドリルアミ
ノ酸の分析のためのガスクロマトグラフィー／マススペ
クトロメトリー法が記載されている。該アッセイは、US
4940658に記載されているものと同様に、標識された参
照スルフィドリルアミノ酸の使用に依拠するが、ガスク
ロマトグラフィー／マススペクトロメトリーによる試料
の分析に先立ってさらなる処理および／または精製工程
を有している。
HPLC法と同様に、ガスクロマトグラフィー／マススペ
クトロメトリーを使用する前記アッセイは、一般に、込
み入っており、高価で精巧な機械を使用し、多くのルー
チン分析では非現実的と考えられると認められている。
本発明の目的は、前記不利の少なくともいくつかを軽
減しおよび／または緩和するアッセイを提供することに
ある。
本発明のさらなる目的は、該アッセイでの使用を含め
た、ホモシステインの分解を触媒できる組換え酵素を提
供することにある。
本発明は、原生動物ホモシステインデスルフラーゼを
コードするDNA断片のごときポリヌクレオチド断片を提
供する。本発明は、さらに、組換え原生動物ホモシステ
インデスルフラーゼホリペプチドを提供する。
本明細書で用いる「ホリペプチドデスルフラーゼ」と
は、ホモシステインの分解を触媒できα−ケトブチレー
ト、硫化水素およびアンモニアを放出する酵素をいう。
HS−CH2−CH2−CH（NH2）COOH→ CH3CH2−Ｃ（Ｏ）COOH＋H2S＋NH3 また、このような酵素は、メチオニン、システインお
よびＯ−アセチル−Ｌ−セリンのごとき他の基質に対す
る親和性も保有する。例えば、もしメチオニンが基質と
して使用されれば、該酵素による代謝の最終生成物はα
−ケトブチレート、アンモニアおよびメタンチオールで
ある。
「ホモシステインデスルフラーゼ」のいくつかの形態
（例えば、異なる生物からのもの）またはイソフォーム
があり得、全てのこのような形態／イソフォームおよび
それらの使用がここに含まれることが認識されるべきで
ある。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド断片」とは、ホ
モシステインデスルフラーゼまたはその生理学的機能誘
導体を生起できる、デオキシリボヌクレオチド（DNA）
配列およびRNAのようなその転写産物をいう。生理学的
機能誘導体とは、前記定義のようにホモシステインデス
ルフラーゼとして酵素を機能的に同定することができる
ものである。かくして、この用語は二本鎖および一本鎖
DNA、およびそれから誘導されたRNA配列を含む。該用語
は、例えば、原生動物トリコモナスバギナリス（Tricho
monas vaginalis）で見出される、ポリヌクレオチド断
片を含む天然に生じる全ゲノムを排除する。
一般に、ポリヌクレオチドは実質的に単離された形態
である。すなわち、全ゲノムが通常イン・ビボで会合す
るような生物学的物質は実質的に含まれていない。
一般に、「ポリペプチド」なる用語は、ホモシステイ
ンデスルフラーゼの生物学的活性と実質的に同様の生物
学的活性を呈するアミノ酸の鎖または配列を指し、生成
物自体の特定の長さを指さない。必要であれば、該ポリ
ペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボ
キシル化、リン酸化および／または翻訳後の切断によっ
てイン・ビボおよび／またはイン・ビトロで修飾するこ
とができ、従って、とりわけ、ペプチド、オリゴペプチ
ド、蛋白質および融合蛋白質はそれにより包含される。
当然に、当業者ならば、修飾ポリペプチドは生理学的機
能を保持する、すなわち、ホモシステインデスルフラー
ゼ活性が有することを認識するであろう。
ホモシステインデスルフラーゼをコードするDNA断片
は、ホモシステインデスルフラーゼcDNAの一部を利用す
ることによって得ることができる。該cDNAは、メセンジ
ャーRNAの逆転写、続いての、典型的には当該分野で知
られている、例えば、ヒト、ラット、および／または酵
母シスタチオニンγ−リアーゼの配列をコードするシス
タチオニンγ−リアーゼのような関連する酵素の保存領
域に対して指定されたプライマーを用いるポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）技術を用いて増幅することによって得
ることができる。次いで、ホモシステインデスルフラー
ゼ遺伝子の一部を含有する増幅断片を用いて、このよう
な遺伝子を含むcDNAライブラリーから全長ホモシステイ
ンデスルフラーゼ遺伝子をクローン化することができ
る。該cDNAライブラリーは原生動物、例えば、トリコモ
ナスバギナリス（Trichomonas vaginalis）のcDNAライ
ブラリーからのものであってもよい。そのようにして得
られたホモシステインデスルフラーゼ遺伝子を含有する
ポリヌクレオチド断片を図１および図２に示す。
図１のDNA断片は、以後CTLα（その後、MGL1と再命名
された）という396個のアミノ酸のオープンリーディン
グフレーム（ORF）を含む遺伝子ctlα（その後、mgl1と
再命名された）をコードする。図２のDNA断片は、以後C
TLβ（その後、MGL2と再命名された）という398個のア
ミノ酸のORFを含む遺伝子ctlβ（その後、mgl2と再命名
された）をコードする。シュードモナスプチダ（Pseudo
monas putida）からのメチオニンγ−リアーゼおよび酵
母およびヒトからのシスタチオニンγ−リアーゼ（各
々、えMBLデータベースイクセション番号D30039、P3137
3およびS52784）と図１および２に示したMGL1およびMGL
2の（アミノ酸レベルでの）同一性のパーセントの比較
を表１に示す。配列比較解析は、GCG ウィスコンシン
パッケージ（GCG Wisconsin package）を用いて、ギャ
ップとパイルアップ・プログラム（gap and pileup pro
grams）を使用して行った（Devereux,H.,Hacberli,P.Sm
ithies,O.（1984）Nucleic Acids Research 12,387
−395）。
表１は、図１および２に示した推定ホモシステインデ
スルフラーゼ酵素が、アミノ酸レベルで、従前に配列決
定されているメチオニンγ−リアーゼおよびシスタチオ
ニンγ−リアーゼと42−45％しか同一でないことを示
す。かくして、MGL1およびMGL2はシスタチオニンγ−リ
アーゼの保存領域に対してのプライマーを用いてクロー
ン化されたものではあるが、それらはポリペプチドの長
さ全体にわたって実質的に同一ではない。
また、本発明は、図１および２に例示した断片と少な
くとも80％、好ましくは少なくとも90％、特に少なくと
も95％の同一性を有するポリヌクレオチド断片を含む。
また、本発明は、図１および２に例示したポリペプチド
と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、特に少
なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列を含
む。「同一性」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸が同
一の場合と保存的置換の場合の双方をいう。但し、ホモ
システインデスルフラーゼの酵素機能は実質的に損なわ
れていないものとする。
当業者ならば、該遺伝子またはその誘導体を遺伝子的
に操作して、当該分野で一般に公知の組換えDNA技術に
よって該遺伝子をクローン化し、イン・ビトロまたはイ
ン・ビボにてそれによりコードされたポリペプチドを発
現させることができるのを認識するであろう。図１およ
び２に示されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チド断片またはその誘導体は、好ましくは、ホモシステ
インデスルフラーゼの発現に使用される。
ここに含まれる特定のホモシステインデスルフラーゼ
ポリペプチドには、変種（天然又はその他）が存在し得
ることが理解されるべきである。これらの変種は配列全
体のアミノ酸の相違によって、または該配列におけるア
ミノ酸の欠失、置換、挿入、反転または付加によって示
すことができる。全てのこのような誘導体は本発明の範
囲に含まれる。但し、該誘導体は生理学的に機能する
（すなわち、ここに定義されたホモシステインデスルフ
ラーゼ活性を呈する）ものとする。例えば、本発明の目
的では、以下のグループ内にて、アミノ酸間で保存的置
換を行うことができる。
（Ｉ） アラニン、セリンおよびトレオニン （II） グルタミン酸およびアスパラギン酸 （III） アルギニンおよびリシン （IV） アスパラギンおよびグルタミン （Ｖ） イソロイシン、ロイシンおよびバリン （VI） フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトフ
ァン さらに、ホモシステインデスルフラーゼの推定機能的
ドメイン内にあると同定されたアミノ酸の特異的な置換
を行うことができる。例えば、推定基質結合ドメイン内
に同定されたアミノ酸は、このような置換がなす酵素動
力学におけるいずれかの変化を観察するために、保存的
または非保存的アミノ酸で置換することができる。この
ような変化は、例えば、ホモシステインに対する比活性
の増加をもたらし、あるいはホモシステインに対するKm
を減少させつつ比活性を低下させ、あるいはシステイン
やＯ−アセチル−Ｌ−セリンのごとき他の基質に対する
比活性を増加させ得る。
本発明者らは、MGL1におけるシステイン残基C113およ
びMGL2におけるシステイン残基C116がホモシステインデ
スルフラーゼ触媒活性である役割を演じていることを示
した。本発明者らは、システイン113/116をグリシンで
の置換の結果、触媒的に活性なホモシステインデスルフ
ラーゼを依然としてもたらすことを示した。この突然変
異は、一般に、全ての基質に対する比活性が減少した酵
素をもたらすが、MGL2におけるシステイン116のグリシ
ンへの突然変異の結果、システインおよびＯ−アセチル
−Ｌ−セリンに対する比活性が増加した酵素が得られ
る。さらに、MGL2におけるシステイン116のグリシンへ
の突然変異の結果、ホモシステインに対するKmが低い酵
素が得られる。
加えて、MGL1およびMGL2配列は、Ｎ−末端（MGL1にお
ける残基49−55）にシスタチオニンγ−リアーゼに対し
て７個のアミノ酸の挿入を有することが観察された。こ
のような領域は突然変異の研究に適当であり得る。
突然変異研究は、異なるホモシステインデスルフラー
ゼが異なる触媒活性で産生されることを可能とし、これ
は多数の異なる用途で適当なものとなる。
さらに、組換えDNA技術を用いて、前記で概説したこ
れらの誘導体をコードする核酸配列を調製することがで
きる。
当該分野でよく知られているように、遺伝暗号の縮重
は、同一アミノ酸をコードできる異なるコドンをもたら
すコドンにおける塩基の置換を可能とし、例えば、アミ
ノ酸グルタミン酸についてのコドンはGATおよびGAA双方
である。結果として、図１または２に示したアミノ酸配
列でのポリペプチド、またはその断片での発現では、図
１または２に示された核酸配列とは異なる別のコドン組
成を持つ誘導核酸配列を用いることができる。
さらに、ホモシステインデスルフラーゼポリペプチド
からまたはホモシステインデスルフラーゼ活性を呈する
図１および２に示したアミノ酸配列から誘導された断
片、あるいは該ホモシステインデスルフラーゼポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列から誘導されたまた
は該ホモシステインデスルフラーゼポリペプチドの断片
をコードする図１および２に示したヌクレオチド配列か
ら誘導された断片も本発明の範囲内のものである。
当然、当業者ならば、該ホモシステインデスルフラー
ゼポリペプチドまたは遺伝子の酵素的に活性な誘導体を
もたらす前記したこのような修飾は本発明に含まれるこ
とを認識するであろう。本発明の該ホモシステインデス
ルフラーゼポリヌクレオチド断片は、好ましくは、調節
的制御配列に連結されている。このような制御配列はプ
ロモーター、オペレーター、インデューサー、リボソー
ム結合部位、ターミネーター等を含むことができる。所
与の宿主にとって適当な制御配列は当業者によって選択
され得る。加えて、付加的アミノ酸のごときいわゆる
「タッギング配列」をポリペプチドのＮまたはＣ末端に
付加して、該ポリペプチドの発現に際していわゆる融合
蛋白質を与えることができる。
本発明によるポリヌクレオチド断片は、１以上のどの
ような種類の発現制御DNA配列にも連結することがで
き、その結果、いわゆる組換えDNA分子が得られる。そ
のため、また本発明は、発現可能な核酸分子を含む発現
ベクターも含む。このような組換え核酸分子は、次い
で、適当な宿主の形質転換で使用することができる。発
現ベクターは、好ましくは、例えば、プラスミドから、
またはバクテリオファージまたはウイルスからの核酸配
列から誘導されたハイブリッドDNA分子であり、「ベク
ター分子」と呼ばれる。
本発明の核酸配列をクローン化するのに使用できる特
定のベクターは当該分野で公知である（例えば、Rodrig
uez,R.L.およびD.T.Denhardt編,Vectors:A Survey of
Molecular Cloning Vectors and Theor Uses,Bu
terworths,1988）。
２つの特定な細菌発現ベクターpQE60およびpQE30（Qi
agen Hilden,ドイツ国）がホモシステインデスルフラ
ーゼ発現で使用された。発現ベクターのpQEシリーズ
（例えば、pQE60およびpQE30）は、金属−キレートアフ
ィニティークロマトグラフィーおよび迅速蛋白質液体ク
ロマトグラフィー（Fast Protein Liquid Chromatograp
hy、FPLC）を用いて融合蛋白質の精製を可能とする６個
のヒスチジンタグ（６×his−tag）をコードする。
本発明の組換え核酸分子の構築で使用した方法は当業
者に知られており、とりわけ、Sambrookらに記載されて
いる。（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor Laboratory,1989）。
また、本発明は、発現可能形態の核酸分子を含有する
形質転換細胞に関する。本明細書で用いる「形質転換」
とは、使用した方法、例えば、直接摂取、トランスフェ
クションまたはトランスダクションを問わず、宿主細胞
への異種核酸配列の導入をいう。異種ポリヌクレオチド
断片は自己複製を通じて維持されるか、あるいは、宿主
ゲノムに組み込まれる。組換え核酸分子は、好ましく
は、挿入されたポリヌクレオチド断片、例えば、T7プロ
モーター、taqプロモーター、lacプロモーターおよびtr
pプロモーターの発現を調節できる所定の宿主に適合す
る適接な制御配列と共に供される。
組換え核酸分子の発現で使用される適当な宿主は起源
が原核生物または真核生物であり得る。組換え核酸分子
の発現用の最も広く使用される宿主は、細菌、酵母、昆
虫細胞および哺乳動物細胞から選択できる。また、組換
えホモシステインデスルフラーゼのクローニングおよび
発現は、例えば、イン・サイチュー発現実験、抗−ホモ
システインデスルフラーゼ抗体（特に、モノクローナル
抗体）の産生および組換えホモシステインデスルフラー
ゼのイン・ビトロおよびイン・ビボ生物学的活性の評価
のためのプローブを産生するための試薬を生産するのを
容易とする。
さらに、本発明は、予防および／または治療薬として
使用される試薬の製造用の組換えホモシステインデスル
フラーゼを提供する。特に、本発明は、そのための医薬
上許容される担体と共に組換えホモシステインデスルフ
ラーゼを含む医薬組成物を提供する。癌のような病気状
態には、メチオニンγ−リアーゼにつきHori,K.ら（199
6）によって記載されたものと同様に、ホモシステイン
デスルフラーゼ療法および／または予防処置から有用で
ある。典型的には、ホモシステインデスルフラーゼは新
しい抗トリコモナス剤や、ホモシステインデスルフラー
ゼおよび／またはメチオニンγ−リアーゼを含む他の病
原体に対する有用な活性も十分に有し得る化合物の開発
で使用できる。これらは、例えば、コンビナトリアルラ
イブラリーにおける阻害剤につきスクリーニングするた
めに組換えホモシステインを使用することおよび特異的
阻害剤またはプロドラッグの設計を供するために酵素の
構造を解析することの双方を含む。
本発明は、ホモシステインレベルをアッセイできる手
段を提供する。
かくして、さらなる態様において、本発明は、 ａ）ホモシステインを分解できる酵素と試料とを接触さ
せ、次いで、 ｂ）該酵素によるホモシステインの酵素的分解によって
形成されたいずれかの反応生成物を測定する工程を含む
ことを特徴とするホモシステインを検定する方法を提供
する。
好ましくは、ホモシステインおよび／または該反応生
成物のクロマトグラフィー分離は行わない。
好ましくは、該酵素はホモシステインデスルフラー
ゼ、より好ましくは、組換え原生動物ホモシステインデ
スルフラーゼである。
好ましくは、ホモシステインデスルフラーゼは図１、
２、６または７のホモシステインデスルフラーゼであ
る。
組換え原生動物ホモシステインデスルフラーゼを用い
て、メチオニン、システインおよびＯ−アセチル−Ｌ−
セリンを含めた、試料中の他の基質を検定することもで
きる。
一般に、生物学的試料は、血液、血漿、糞、唾液、膣
液または尿の試料であり得る。ホモシステインはジスル
フィド結合によって、アルブミンのごとき循環している
蛋白質に結合することができ、またホモシステインは他
のジスルフィド誘導体の形態で存在することもできる
（典型的には、ホモシステイン−システインコンジュゲ
ート）。試料中に存在する全ホモシステインの評価を得
るには、従って、試料を還元剤で処理して、いずれのジ
スルンフィド結合も切断し、遊離ホモシステインを放出
させるのが望ましい。ジスルフィドの還元は、Methods
of Enzymology 143:243−256（1987）にJocelynに
よって総説されており、そこでは、広範な適当な還元剤
がリストされている。このような適当な還元剤を本発明
の教示として引用する。
便宜には、前記した反応の最終生成物、α−ケトブチ
レート、硫化水素およびアンモニアは測定でき、種々の
適当な方法は当業者に知られており、例えば、比色法、
分光法、電気化学法、フルオロメトリーまたはルミネセ
ンス法がある。好ましくは、該方法は試料中の＜５μmo
l/lのホモシステインの濃度を検出するのに十分な感度
である。
ホモシステインの分解によって生じたα−ケトブチレ
ートは、３−メチル−２−ベンゾチアゾロン ヒドラゾ
ン塩酸塩（MBTH）を用いるSodaの方法（Soda,K.（196
8）Anal.Biochem.25:228−235）により検出することが
できる。
α−ケトブチレートを測定するさらなる方法はLi,R.
＋Keyon,G.L.（1995）α−ジカルボキシル化合物の分光
学的測定およびα−ケトブチレートの酵素的生成への適
用（A spectrophotometric determination of α−dica
rboxyl compounds and ots application tp the enzyma
tic formation of α−ketobutyrate）,Analytical Bi
ochemistry 230 37−40によって記載されている。
α−ケトブチレートを検出する特に好ましい方法は、
NADHおよびラクテートデヒドロゲナーゼを添加してNAD+
の生成でα−ケトブチレートをα−ヒドロキシブチレー
トに変換することによる。次いで、NAD+のレベルを、34
0nmにおける吸光度により分光学的に;365nmにおける励
起と460nmにおける発光とによる蛍光的に（Palmer T.
（1991）Understanding Enzymes、第３版,Ellis Horw
ard,ロンドン）；テトラゾリウム塩を用いる比色法に
（Altman,O.F.（1974）Histochemistry 38 155−171
頁）；電気化学的に（Morroux J.Elring PJ（1979）A
nal Chem 51,146;Blaedel WJ,Jenkins ＆ RA（197
5）Anal Chem 47,1335（1987）Electroanal Chem 2
21,257）；およびルミネセンス的に（Whitehead TPら
（1979）Clin Chem 25,1531）行うことを含む、NADH
への変換を包括する多数の方法によって測定することが
できる。
別法として、ピルベートデヒドロゲナーゼをラクテー
トデヒドロゲナーゼの代わりに用いてNAD+を生成させ、
NAD+を上述したように検出することもできる。
ホモシステイン分解によって生じた硫化水素は、例え
ば、以下の（化学量論的）式に従い酢酸鉛と反応させて
硫化鉛を生じさせることによって測定することができ
る。
H2S＋Pb（CH2COOH）３→PbS＋2CH3COOH 次いで、生じた硫化鉛は、A360nmのごとき適当に波長
で分光光学的に測定することができる（Thong K.W.＋C
oomb,G.H.（1985）、トリコモナドにおけるホモシステ
インデスルフラーゼ活性（Homocysteine desulphurase
activity in trichomonads）,IRCS Medical Science
13 493−494）。
別法として、硫化水素は、Clime,J.D.Limnol,Oceanog
r.（1969）14:454−458によって記載されているごとく
にメチレンブルー法を用いて測定することができる。略
言すれば、硫化水素は酸および酸中の塩化第三鉄中の0.
17mMのN,N−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン硫酸塩
と反応してメチレンブルーを生じ、これを650−670nmで
分光光学的に検出することができる。
ホモシステインの分解によって生じたアンモニアは、
Horn,D.B.＋Squire,C.R.（1967），血漿中のアンモニア
の検出のための改良された方法（An improved method f
or the detection of ammonia in blood plasma）、Cli
n.Chem.Acta 17 99−105によって記載されているごと
く次亜塩素酸塩の存在下でフェノールと反応させてイン
ドフェノールを生じさせることができる。かく生成した
インドフェノールを、次いで、例えば、570nmの適当な
波長で分光光学的に検出することができる。
NH3＋OCl＋フェノール→インドフェノール アンモニアを検出するさらなる方法は、Mondzac Ａ
ら（1965）J.Lab.Clin.Med.66 526によって記載されて
いるごとくグルタメートデヒドロゲナーゼと共にα−ケ
トグルタレートおよびNAN（Ｐ）＋を酵素的に用い;Guil
baultら（1985）Anal.Chem.57 2110によって記載され
ているごとくアンモニア電極を用いて電気化学的に;2−
オキソグルタレートおよびNADHを用いてグルタメート、
水およびNAD+を生じさせ、上述したようにNAD+を測定し
て；および硝酸銀をアンモニアに添加して色黒沈殿を生
成させて行うことを含む。
本発明の組換えホモシステインデスルフラーゼは、ホ
モシステインに加えて、メチオニン、システインおよび
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを含めた多数の基質に対して
活性を呈する。従って、ホモシステインデスルフラーゼ
を用いてメチオニン、システインおよび／またはＯ−ア
セチル−Ｌ−セリンを前記したようにアッセイすること
ができると認識することができる。
さらに、本発明の組換えホモシステインデスルフラー
ゼは広範囲の基質に対する活性を呈するので、該酵素は
通常のアミノ酸および関連分子の合成に用いることがで
きる。
加えて、ホモシステインデスルフラーゼを用いて、ホ
モシステイン、メチオニンおよび／またはシステインを
溶液、例えば、生物学的培地から除去することができ
る。
また、ホモシステインデスルフラーゼを用いて、基質
または生成物いずれかとしてホモシステインを含む反応
を触媒する酵素（例えば、５−アデノシルホモシステイ
ンヒドロラーゼ）をアッセイすることができる。ホモシ
ステインは生物学的試料中のその検出に適用する方法で
検定することができる。同様に、ホモシステインデスル
フラーゼを用いて、基質または生成物としてメチオニン
またはシステインまたは関連化合物を含む反応を触媒す
る酵素を検定することができる。これらの代謝産物は、
ホモシステインデスルフラーゼによるそれらのα−ケト
酸への変換および前記したα−ケト酸の測定を介して検
定することができる。
また、該アッセイを用いて分析物を評価することがで
き、これは、まずホモシステインに分解し、次いで、分
析物の濃度をホモシステインの濃度を測定することによ
って決定するされる。このような分析物の例は、ホモシ
ステイン（ここに、ホモシスチンはDTTを用いてホモシ
ステインに変換される）またはメチオニン（これは、酵
素的にホモシステインに変換することができる）を含
む。両方の場合、かくして、分析物の濃度はホモシステ
インの測定によって決定することができる。
なおさらなる態様において、試料中のホモシステイン
レベルのイン・ビトロでの診断測定用のキットが提供さ
れ、該キットは、 ａ）ホモシステインを分解できる酵素、および ｂ）酵素によるホモシステインの分解によって生じた反
応生成物を測定できる手段を含む。
好ましくは、該酵素はホモシステインデスルフラー
ゼ、より好ましくは組換え原生動物ホモシステインデス
ルフラーゼである。
典型的には、該キットは、手動および自動用途のため
のキュベットをベースとしたテストキット、マイクロタ
イタープレートテストキットまたはテストストリップを
ベースとしたアッセイキットの形態とできる。
試料中のホモシステインレベルのイン・ビトロでの診
断測定用の特に好ましいキットは、 ａ）組換え原生動物ホモシステインデスルフラーゼ、お
よび ｂ）前記ホモシステインデスルフラーゼによるホモシス
テインの分解によって生じたα−ケトブチレートを、NA
D+の同時放出を伴って、α−ヒドロキシブチレートに変
換するためのラクテートデヒドロゲナーゼとNADHとを含
み、前記NAD+の該放出は適当な手段によって測定され
る。
以下の非限定的実施例によって本発明をさらに説明す
る。
実施例１ トリコモナス・バギナリス ホモシステイン
デスルフラーゼをクローン化するのに使用するプライマ
ーの設計 図３は、ヒト、ラットおよび酵母からのシスタチオニ
ンγ−リアーゼについての多数の蛋白質配列の配列を示
す（各々、Luら,1992,Ericksonら,1990およびOnoら,199
2）。際立つものは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にお
いてプライマーとして用いるための縮重オリゴヌクレオ
チドの設計用に選択した相同性の領域である。5'オリゴ
ヌクレオチドプライマーの設計用に選択した相同性の第
１の領域は、異なるシスタチオニンγ−リアーゼ分子の
間の配列が高度に相同である領域である（V163−N17
0）。3'プライマーの設計用に選択した第２の領域は、
ピリドキサール5'−ホスフェート（PLP）結合ドメイン
（A222−G228）であった。これらの相同領域に基づいて
設計した縮重オリゴヌクレオチドの配列を図４に示す。
クローニングを容易にするために、Hind IIIおよびXho
Iにおける酵素に対する制限部位を、各々、２つの縮重
オリゴヌクレオチドの末端に付けた。２つのオリゴヌク
レオチドはCyst5'およびCyst3'と命名した。Cyst5'は長
さが31ヌクレオチドであり、３つのイノシン（Ｉ）を含
有し、Cyst3'は長さが28ヌクレオチドであり、２つのイ
ノシン残基を含有する。該イノシンを４重縮重を含むで
あろう多数の位置に導入して、合成されたオリゴヌクレ
オチドの得られたプール数を減少させた。オリゴヌクレ
オチドは標準的プロトコルによりApplied Biosystems
DNA合成器を用いて合成した。
実施例２ 縮重オリゴヌクレオチドを用いるPCR RNAの単離 トリコモナス・バギナリスのクローンの細胞系（G3）
を従前に記載されているごとくに（Lockwoodら（198
4））改変ダイオモンド（Diamond）の培地で増殖させ
た。細胞を増殖後期相（１−２×106/ml）で収穫（４
℃、15分間、2300g）し、0.25Mのスクロース中で２回洗
浄した。Nucleon IIキット（Scotlab,Coatbridge,スコ
ットランド）を用いてDNAを単離した。
フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートの単
一相溶液である商業的な入手可能なTRIZOL（RTM）試薬
（Gibco,Paisley,スコットランド）から入手できる）を
用い、製造業者の指示に従って単一工程で、全RNAをト
リコモナス・バギナリスから単離した。
ポリ［Ａ］+RNAを、cDNA合成用の鋳型として使用する
ために全RNAから単離した。Poly［Ａ］＋ Quikカラム
（Stratagene,La Jolla,カリフォルニア州，米国から
入手可能）を用い、製造業者の指示に従ってポリ［Ａ］
+RNAを単離した。
逆転写酵素と共にトリコモナス・バギナリスからのポ
リ［Ａ］+RNAを１マイクログラムを用いて、Sambrookら
（1989）に記載されている手法に従い、第１鎖のトリコ
モナス・バギナリスcDNAを合成した。次いで、cDNAをPC
Rで鋳型として縮重オリゴヌクレオチドに使用した。
PCRの条件は以下の通りであった。４分間の94℃での
最初の変性、続いての;1分間の94℃、１分間の42℃およ
び１分間の72℃よりなる30回の増幅サイクル、続いての
５分間の72℃での最終伸長サイクル。反応の一部を、適
当な対照反応物と共にアガロースゲル（1.5％）上の電
気泳動に付した。２つのPCR産物が、アガロースゲルを
染色して観察され、１つはサイズがほぼ200塩基対（b
p）であり（小さいバンド断片）および第２のものはサ
イズがほぼ250bpであった（大きいバンド断片）。
さらなる同一PCRを行って、クローニング用の十分な
物質を得た。
実施例３ 増幅されたPCR産物のクローニング いくつかのPCR反応からの物質（約１μｇのDNA）を一
緒に合わせ、PCR増幅したDNAをフェノール／クロロホル
ム抽出し、エタノール沈殿させ、水に再懸濁て、コンタ
ミしているヌクレオチドおよびTaqポリメラーゼを除去
した。次いで、増幅されたDNAをHind IIIおよびXho I制
限酵素で完全に制限切断して（これらのための制限部位
は、各々、Cyst5'およびCyst3'縮重オリゴヌクレオチド
の末端にそれらを含ませることによって、増幅されたDN
Aの末端に作成した）、方向性のクローニングを容易と
する「粘着末端」を生じさせた。該DNAを２％TAEアガロ
ースゲル上の電気泳動することによってさらに精製し、
続いて臭化エチジウムで染色し、長波長紫外光で可視化
した。注目する増幅バンド（大きいおよび小さいバンド
産物）を、清浄な小刀ブレードを用いてゲルから切り出
し、市販のSpin Ｘカラム（Costar,ケンブリッジ、マ
サチューセッツ州、米国から入手可能）を用い、製造業
者の指示に従ってアガロースゲルスライスから溶出させ
た。次いで、縮重プライマーによるPCRから得られた制
限切断され精製されたDNA（個々の大きいバンドと小さ
いバンドとの産物および２つの組合せ）を、予め、Hind
IIIおよびXho Iで制限切断し、２％TAEアガロースゲル
を通して精製し、spin Ｘカラムを用いて溶出してある
pBluescript（Stratagene,La Jolla,カリフォルニア
州、米国から入手可能）と合わせた。Amersham連結キッ
ト（Amersham,Little Chafort,Bucks,英国から入手可
能）を用い、製造業者の指示に従い、pBluescriptとほ
ぼ200および250bpの増幅されたPCR断片を、200ngインサ
ート体＋200ngベクターの量にて連結した。
次いで、連結反応体を用いて、超受容能力を持つXL1
Blue 大腸菌（Escherichia coli）細胞（Stratagen
e,La Jolla,カリフォルニア州，米国から入手可能）を
形質転換した。ほぼ30ないし40ngの連結DNAを用いて、
受容能力のある細菌細胞を形質転換した。形質転換体混
合物を、LB amp、Ｘ−gal、IPTG含有プレート上にプレ
ートし、37℃で一晩インキュベートした。PromegaのWiz
ardプラスミドmini−prep手法（Promega,Madison,ウィ
スコンシン州，米国）を用い、プラスミドDNAを白色の
細菌形質転換体から単離し、選択的制限部位分析に付し
て、pBluescriptへの増幅DNAのクローニングが成功した
か否かを判断した。
クローン化されたPCR産物を含有する形質転換体を配
列決定および引き続いての分析に付して、シスタチオニ
ンγ−リアーゼ同族体の真性断片がトリコモナス・バギ
ナリスcDNAから増幅されたものか否かを判断した。
実施例４ 全長トリコモナス・バギナリスホモシステイ
ンデスルフラーゼ遺伝子の単離 ２つのPCRクローン（cysta2およびcysta16と命名）を
用いて、トリコモナス・バギナリス λZAP II cDNA
ライブラリー（Mallinson,D.J.,Lockwood,B.C.,Coombs,
G.H.,North,M.J.（1994）、病原性原生動物トリコモナ
ス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）からの４つ
のシステインプロテイナーゼの同定および分子クローニ
ング,J.Gen.Microbiology,140,2725−2735）から対応す
る全長遺伝子を単離した。合計100,000個のcDNAクロー
ンを以下の手法に従ってスクリーニングした。100,000
個のバクテリオファージを、宿主細胞大腸菌（E.coli）
XL1 blueと共にＬ−Topアガロース中にプレートし、バ
クテリオファージプラークが細菌ローン中で相互に丁度
接触するまで37℃で増殖させた。次いで、Hybond Ｎナ
イロンフィルター（Amersham,Little Chalfont,Bucks,
英国から入手可能）にブロッティングすることによっ
て、バクテリオファージプラークを移した。
バクテリオファージのDNAをイン・サイチューにて変
性し、引き続いて、ランダムプライミングによって放射
性標識したcysta2もしくはcysta16の200塩基対ホモシス
テインデスルフラーゼ断片いずれかとハイブリダイズさ
せた。
65℃、0.1×SSC/0.1％ SDS中１時間の高ストリンジ
ェンシー条件を用いるcDNAライブラリーの一次スクリー
ニングは、25個のプラークがcysta2プローブとハイブリ
ダイズし、他方、18個がcysta16プローブとハイブリダ
イズしたことを示した。ハイブリダイズする陽性プラー
クを示すオートラグオグラフィーフィルムを、バクテリ
オファージを含有するプレートと整列させて、回収すべ
き陽性バクテリオファージを含有するアガロースのプラ
グできるようにした。該プラグを４℃のSM緩衝液および
痕跡量のクロロホルム中に置き、ファージを一晩拡散し
て出てくるようにした。
第２ラウンドのバクテリオファージ精製を行って、高
ストリンジェンシー条件下でcysta2またはcysta16、200
塩基対の放射性プローブのいずれかとハイブリダイズ個
々のプラークを同定した。
実施例５ Cysta2およびCysta16がハイダリイズするク
ローンの分析 F1ヘルパーバクテリオファージメカニズムを用い、
（製造業者、Stratagene,La Jolla,カリフォルニア
州，米国のプロトコルに従い）、cysta2プローブとハイ
ブリダイズした２つのλクローンおよびctsta16プロー
ブとハイブリダイズした５つのλクローンをpBluescrip
tに直接レスキューさせた。レスキューしたプラスミド
を、引き続いて、制限切断分析によって分析して、クロ
ーン化インサートDNAの大きさを決定した。
cysta2またはcysta16プローブで単離したプラスミド
の制限切断分析の結果、２つのクローン、１つはcysta2
にハイブリダイズするもの（ctlα，後にmgl1と再命名
した）および他はcydta16にハイブリダイズするもの（c
tlβ、後にmgl2と再命名した）を選択して十分に配列決
定した。これらの２つのクローンは、それらが最大のイ
ンサート体（ほぼ1.2ないし1.3キロベースのサイズ）を
有し、トリコモナス・バギナリスからのホモシステイン
デスルフラーゼ遺伝子の全長のコピーをコードするのに
十分なサイズであると考えられたので選択した。
実施例６ ２つのトリコモナス・バギナリスホモシステ
インデスルフラーゼ遺伝子の配列決定 ２つのトリコモナス・バギナリスホモシステインデス
ルフラーゼ遺伝子の各々の制限マッピングを行って、各
遺伝子の全長ヌクレオチド配列を得るのに助けとなるよ
り小さい断片のサブクローニングを可能とした。
２つのクローンおよびそれらの各サブクローンの配列
決定は、T7およびT3プライマー（Stratagene,La Joll
a,カリフォルニア州，米国から入手可能）を用いる、Se
quenase(RTM)quick Denatureプラスミド配列決定キッ
ト（Amersham,Little Chalfront,Bucks,英国から入手
可能）により製造業者の指示に従い行った。第１のクロ
ーン（mgl1）の完全なヌクレオチド配列および予測され
るアミノ酸配列と、第２のクローン（mgl2）の完全なヌ
クレオチド配列および予測されるアミノ酸配列とを決定
した。
mgl1およびmgl2の5'非翻訳領域（UTR）を得、そして
およびスタートコドンを確認するために、市販の5'RACE
キット（Gibco,Paisley,スコットランドから入手可能）
を用い、製造業者の指示に従ってcDNA末端の逆転写酵素
迅速増幅（5'Reverse Transcriptase Rapid mplificati
on of cDNA ends、RT−RACE）を行った。得られたmgl1
およびmgl2のRACE産物はサイズがほぼ250塩基対であっ
た。該mgl1およびmgl2のRACE産物を、製造業者の指示に
従い、ligATorキットのpTAgベクター（Ｒ ＆ Ｄ Sys
tem,ミネアポリス，米国から入手可能）に直接クローン
化した。このシステムでは、Taqポリメラーゼの存在で
行ったPCRは、どの増幅断片の末端にも付け加えられた
5'アデノシン突出を有するという特徴を開発する。該シ
ステムは相補的なチミジン残基の突出を有するベクター
へのPCR産物のクローニングを容易とする。
形質転換体の制限切断分析は、5'RACE産物がpTAgベク
ターにクローン化されたことを明らかとした。市販の〜
20プライマーおよびM13逆プライマーを用い、RACEクロ
ーンの配列決定を両ストランドについて行った。
mgl1の5'RACE産物の配列決定は、5'UTRが非常に短い
（13ヌクレオチド長）ことを明らかとしたが、cDNA配列
から同定されたスタートATGコドンを確認した。
２つの独立した5'RACE産物がmgl2に対して得られた
が、両クローンとも、cDNAライブラリーから単離した遺
伝子のコピーでは存在しないATGスタートコドンを保有
していた。より長いmgl2 RACEクローンでは長さがほぼ
14ヌクレオチドの短い5'UTR領域が同定された。
mgl1およびmgl2の5'UTRは、共に、mgl1およびmgl2の
各完全cDNA配列および予測されるアミノ酸配列と共に図
１および２に示す。バイルアップ分析（表１参照）は、
従前に配列決定されているシスタチオニンγ−リアーゼ
に対する推定MGL1およびMGL2のの比較的低いレベルの配
列同一性を明らかとし、トリコモナス・バギナリス シ
スタチオニンγ−リアーゼがクローン化されていなかっ
たようであることを明らかにした。これは、クローン化
遺伝子産物はシスタチオニンγ−リアーゼ活性を有しな
いことによって確認された（表２参照）。
実施例７ ヒスチジンがついたホモシステインデスルフ
ラーゼ融合蛋白質のクローニングおよび発現 QIAexpressシステム（Qiagen,La Jolla,カリフォル
ニア州，米国）をMGL1およびMGL2ポリペプチドの発現お
よび精製に用いた。発現された蛋白質のＮまたはＣ末端
に６−ヒスチジンタグをコードするpQEベクターにmgl1
およびmgl2遺伝子をクローン化した。６−ヒスチジンの
付いた蛋白質を、次いで、Ni2+−NTA樹脂（詳細はQIAex
pressハンドブック参照）を用いてアフィニティー精製
した。
mgl1のクローニング mgl cDNAクローンをプラスミドpBluescript中に維持
した。予備的配列分析では、トリコモナス・バギナリス
mgl1 cDNAがpBluescriptに予測されたと逆方向でクロ
ーン化されていることを示し、従って、pBluescriptか
らpQEベクターへのmgl1の直接的サブクローニングは不
可能であった。pBluescriptにおけるmgl1 cDNAの方向
の問題を克服するために、cDNAが適当なpQEベクターで
クローン化されるようにPCRクローニング戦略を適応さ
せた。
制限エンドヌクレアーゼ部位Nco IおよびBgl IIを、
それぞれ含むmgl1 cDNAの5'および3'末端に対してオリ
ゴヌクレオチドプライマーを設計した。PCR増幅プロセ
スを通じ、これらの２つの制限部位をmgl1 DNAの末端
上に作成し、それらの存在がNco IおよびBgl IIで制限
されたpQEベクターでのDNAのクローニングを容易とす
る。２つのプライマーのヌクレオチド配列を図５に示
す。
それにmgl1 DNAがクローン化されるベクターとしてp
QE60、タイプATG構築体を選択した。ATC構築体は発現さ
れた蛋白質を真性のATGコドンで開始させる。mgl1 cDN
Aはスタートメチオニンをコードし、従って、この特定
のpQEベクターでのクローニングに適すると考えられた
（詳細はQIA発現ハンドブック参照）。
BamH Iを用い、mgl1 cDNAを含有するpBluescriptを
線状化し、線状化DNAを、図５に概略を示す２つのオリ
ゴヌクレオチドと共にPCR用の鋳型として使用した。PCR
ミックスの成分は以下の通りである。
１μｌ（10ng/μｌ）pBluescript/mgl1 BamH I線状化
鋳型 ５μｌ（100ng/μｌ）5'Nco Iプライマー ５μｌ（100ng/μｌ）3'Bgl IIプライマー ５μｌ 10×pfu緩衝液（Stratagene,La Jolla,カリフ
ォルニア州，米国） 2.5μｌ 各々5mMのdATP、dCTP、dCTP、dTTP １μｌ pfuポリメラーゼ（Stratagene,La Jolla,カリ
フォルニア州，米国から入手可能なTaqのプルーフリー
ディングバージョン） 30.0μｌ 水 mgl1 DNAの増幅は以下に概説する条件を用いて行っ
た。
５分間の94℃、 続いて、30サイクルの １分間の94℃、 １分間の42℃、および １分間の72℃ および 最後に５分間の72℃の１回の伸長反応 PCRによる増幅の後、Magic PCR Wizard preps（Pr
omega,Madison,ウィスコンシン州，米国）を用いて、製
造業者の指示に従いコンタミしているヌクレオチドおよ
びポリメラーゼをmgl1 DNAから除去した。今やその5'
末端にNco I部位およびその3'末端にBgl II部位を保有
する清浄したmgl1 DNAを、pQE60ベクターにおけるごと
くにこれらの２つの酵素で制限切断した。制限切断され
たpQEベクターおよびmgl1 DNAを連結し、インサート体
を含有する無傷ベクターでM15［pREP4］細胞を形質転換
した。詳細はQIA発現ハンドブック参照。次いで、mgl1
DNAを含有するpQE60プラスミドを、QIA発現（expres
s）ハンドブックに従って組換え蛋白質の発現テストに
使用した。
mgl2のクローニング pBluescript内に含有されたmgl2 cDNAをpQE30で直接
サブクローンした。mgl2 DNAを含有するpBluescriptを
BamH IおよびXho Iで制限切断し、この制限切断された
インサート体を、BamH IおよびSal Iで制限切断してあ
るpQE30ベクターに連結した。無傷pQE30ベクターおよび
インサート体でM15 pREP4細胞を形質転換した。mgl2
DNAを含有するpQE30ベクターを、次いで、QIA発現ハン
ドブックに従って組換え蛋白質の発現テストに用いた。
mgl1またはmgl2いずれかを含有するpQEプラスミドを
大腸菌（E.coli）株M15［pREP4］に形質転換し、単一コ
ロニーを得た。単一コロニーを、100μg/mlアンピシリ
ンおよび25μg/mlカナマイシンを含有する20mlのLB−ブ
ロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。
次いで、１リットルのLB−ブロスに一晩培養物全部を
接種し、培養物をA750が0.8に達するまで（ほぼ２−３
時間）37℃で増殖させた。次いで、IPTGを1mMの最終濃
度で添加し、37℃でさらに2.5時間増殖を継続した。
遠心によって細胞を収穫し、−70℃で凍結した。
Qiagen QIA発現（express）プロトコルのプロトコル
５に従い、Ni−NTA superflowのごとき金属キレート樹
脂を用い、発現された蛋白質をFPLCによって精製した。
FPLCによって得られた蛋白質含有画分をSDS−PAGEに
よって分析し、組換えホモシステインデスルフラーゼを
持つものを合わせ、10％グリセロールを含有する超音波
処理用緩衝液（50mM Na−ホスフェート pH8.0、300mM
NaCl）に対して一晩透析し、−20℃で保存した。
実施例８ 組換えトリコモナス・バギナリス・ホモシス
テインデスルフラーゼの精製のための改変手法 後に説明する手順は細菌の増殖、組換え酵素の発現お
よびFPLC/Ni−NTA精製を含む。全ての緩衝液、培地等の
詳細はアペンディックスとして記載する。ベクター、細
菌宿主株およびブロトコルのさらなる詳細は、QIAGEN蛋
白質発現ハンドブックを参照して見出すことができる。
第１日 アンピシリン（100μg/ml）およびカナマイシン（25
μg/ml）を含有するLuria−Bertani（LB）寒天プレート
に（pQE30/トリコモナス・バギナリスcDNAを含有する）
M15［pREP4］細胞の供給されたグリセロールストックの
５μｌを画線する。37℃で一晩増殖させる。［LBプレー
ト上のコロニーは４℃で２週間まで貯蔵できる］。
第２日 500mlフラスコ中、アンピシリンおよびカナマイシン
（前記した最終濃度）を含有するLBブロス50mlに単一コ
ロニーを接種する。オービタルシェイカー中〜200rpmで
震盪しつつ37℃で一晩増殖させる。
第３日 ２リットルフラスコ中の400mlの新鮮LBブロス＋アン
ピシリンおよびカナマイシンに50mlの一晩培養を接種す
る。
37℃で震盪しつつ（200rpm）培養を1.75時間増殖させ
る。滅菌IPTGを（0.2mMの最終濃度まで）添加すること
によって細胞がホモシステインデスルフラーゼを発現す
るのを誘発し、37℃で震盪しつつさらに2.25時間増殖さ
せる。
４℃にて10−15分間、8000gで遠心することによって
細胞をペレット化する。
該ペレットを5mlの超音波処理用緩衝液中に再懸濁
し、15mlのファルコンチューブに移し、ピリドキサール
5'ホスフェート（PLP）を20μＭの最終濃度まで添加す
る。精製、N.B.のために必要となるまで−70℃で再懸濁
した細胞を凍結する。発現が作動したかをチェックする
ため、細菌培養の200μｌ試料を、ａ）IPTG添加の直
前、およびｂ）IPTGの添加の後、2.25時間の誘導期間の
最後に取り出す。細胞をペレット化し（13000rpm/5
分）、Laemliの試料用緩衝液80μｌに再懸濁し、５分間
沸騰させ、10μｌのアリコットを12.5％SDS−PAGEゲル
で泳動させて、IPTGによる誘導後にホモシステインデス
ルフラーゼの発現を確認した。（別法として、大容量の
未誘導および誘導細胞（1ml）をサンプリングし、超音
波処理によって溶解させ、ホモシステインデスルフラー
ゼ活性アッセイを行うこともできる）。
Ni−NTA樹脂カラムを超音波処理用緩衝液で一晩平衡
化させる。典型的には、8mlの充填容量の樹脂／カラム
を使用することができる。
第４日 FPLCによるNi−NTA樹脂上のHisの付いた酵素の
アフィニティー精製 1.−70℃フリーザーから凍結細胞を取り出し、試験管を
冷水のビーカーに入れることによって解凍する。
2.超音波によって細胞を溶解させる。
3.超音波処理した物質を50mlの遠心管に移し、４℃で30
分間10,000gで遠心する。特にまずソニケーターを用い
る場合、ペレットおよび上清画分をSDS−PAGEによって
比較することによって、細菌が適当に溶解したことをチ
ェックするのが有用である。ホモシステインデスルフラ
ーゼはかなり溶解性であって、95％が可溶性画分である
と判明するはずである。
4.遠心の後、（可溶性酵素を含有する）（〜５−6ml全
容量）上清を、直接にFPLCのプライミングノズル（注入
ポート）に取り付けたルーエルロックシリンジに0.22μ
ｍ Milliporeフィルターを通して濾過し、精製を開始
する。
注意：概説した精製はWaters 600Sコントローラーおよ
びWaters 626ポンプを含むWaters FPLCシステムで行
った。基本的に工程は以下の通りである。
試料適用（プライミングノズルを「注入」モードに転
じると、試料は自動的にシリンジからカラムに吸われ
る）。酵素は現実には非常に明るい黄色としてNi−NTA
樹脂に結合していると観察された。
1.超処理用緩衝液で短時間洗浄する。
2.洗浄用緩衝液でより長く洗浄する。
3.直線グラジエントを、０−500mMイミダゾール（100％
の洗浄用緩衝液ないし100％の溶出緩衝液（500mMイミダ
ゾールを含む））を用いて酵素を溶出させる。
注意:FPLC泳動条件（流速、洗浄の時間、グラジエント
等）の十分な詳細については付録参照。
5.カラム流出中の蛋白質濃度は、280nmにセットしたUV
検出器によって連続的にモニターし、画分は該手法の間
中収集する。
6.組換え酵素（それらの明るい黄色−緑色によって容易
に同定される）を含有する画分をプールし、４℃にて１
リットルの透析用緩衝液に対して一晩透析し（要すれば
数回交換する）て、（イミダゾールを除去する）。
7.BCA手法（Pierce Chemical Company BCA（ビシン
コニン酸）試薬キット）を用い、透析した酵素調製物の
小さな試料（〜50μｌ）を蛋白質含有量の測定のために
採取する。調製物の残りは安定化用緩衝液と1:1混合
し、−20℃にて1mlアリコットで貯蔵する。
アペンディックス 必要な試薬および緩衝液 Luria−Bertani培地（LB培地） １リットルにつき： 以下のものを水950mlに溶解させる： バクト−トリプトン 10g バクト酵母エキス 5g NaCl 10g （必要であれば）pHを7.0に調整する。蒸留水で１リ
ットルとする。15 lb/インチ２にて20分間オートクレ
ーブ処理することによって滅菌する。（LB寒天について
は、リットル当たり15gのバクト寒天を含ませる）。
抗生物質 アンピシリン（Sigma Ａ−9518） （蒸留水中100mg/mlストック液） − 0.2μｍのMil
liporeフィルターを通す濾過によって滅菌し、−20℃で
1mlアリコットとして貯蔵。
カナマイシン（Sigma Ｋ−4000） （蒸留水中に25mg/mlストック液） − 上述したよ
うに滅菌し、貯蔵する。
IPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド;Gibco BRL 15529−019） 1Mストック液（蒸留水中） − 濾過滅菌し（0.2μ
ｍフィルター）、−20℃で1mlアリコットとして貯蔵。
ピリドキサル5'−ホスフェート（PLP;Sigma Ｐ−925
5） 蒸留水中1mMストック液。毎回新鮮なものを作成（再
懸濁細胞への添加用に）。
Ni−NTA Superflow樹脂（QIAGEN 30430） 超音波処理用緩衝液:50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH
8.0、300mM NaCl 1M Na3HPO4:46.6ml 1M NaH2PO4: 3.4ml 17.53g NaCl 蒸留水で１リットルとする。
洗浄用緩衝液:50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0,300
mM NaCl、10％グリセロール 1M Na2HPO4:6ml 1M NaH2PO4:44ml 17.53g NaCl 100ml グリセロール 蒸留水で１リットルとする。
溶出用緩衝液:500mMイミダゾールを含有する洗浄用緩衝
液 17.02gのイミダゾールを500mlの洗浄用緩衝液に溶解
する。
（イミダゾール−Sigma Ｉ−0125） 透析用緩衝液:100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5、3
00mM、20％グリセロール、20μＭ PLP、15μＭ ジチ
オスレイトール 1M Na2HPO4:30.35ml 1M NaH2PO4:69.65ml 17.53g NaCl 200ml グリセロール 10mMのPLPストック液 2ml 1Mジチオスレイトールストック液（ジチオスレイトー
ル−Sigma Ｄ−9779） 15μｌ 安定化用緩衝液:100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.
5、80％グリセロール、40μＭ PLP、30μＭ DTT 10mlにつき:100mMのリン酸ナトリウム緩衝液 1.96m
l、pH6.5、8mlのグリセロール、10mMのPLP 40μｌ、10
0mMのDTT ３μｌ アジ化ナトリウム（Sigma Ｓ−2002）:0.05％溶液 使用後、Ni−NTAカラムにポンプ送液して、細菌の増
殖を防ぐ（精製の間の４℃におけるアジド中での貯蔵カ
ラム） 蒸留水中の10％（w/v）ストック液を作製する（４℃
で貯蔵）。希釈して0.05％作用の濃度を得る。
FPLCで使用する全ての緩衝液は使用に先立って脱気す
べきである。Millipore真空フィルターユニットを用
い、0.2μｍのフィルターを通す緩衝液の濾過によって
脱気は達成される。
精製をモニターするのに使用されるホモシステインデ
スルフラーゼ活性アッセイ ホモシステイン→２−ケトブチレート＋NH3＋H2S 該アッセイはH2Sの生成を測定する;H2Sは酢酸鉛によ
って「捕獲され」、コロイド状スルフィド（深茶色に着
色した化合物）を形成し、これは360nmに最大吸収を有
する。
試薬 アッセイ用緩衝液:100mMイミダゾール緩衝液、pH6.5 D,L−ホモシステイン（Sigma Ｈ−462 ８）；スト
ック溶液 100mM（アッセイ用緩衝液中で作製）。アッ
セイにおける最終濃度＝40mM（ストック液の400μｌ） 酢酸鉛（BDH 10142）；ストック溶液3.3mM（蒸留水
中で作製）。アッセイにおける最終濃度＝0.33mM（スト
ック液の100μｌ） 組換え酵素：スタート時点として、純粋酵素調製物の
100×希釈液の10μｌを使用。（100mMリン酸ナトリウム
緩衝液、pH6.5中に酵素調製物を希釈する）。
アッセイ混合物の最終容量はアッセイ用緩衝液で1.0m
lに調製する。
対照アッセイ混合物を行う:1）マイナス酵素、２）マ
イナス基質 酵素活性の計算 5205M-1cm-1の硫化鉛についてのモル吸光係数を用い
る。
組換えトリコモナス・バギナリスMGL2の精製のためのFP
LCプログラムの詳細 実施例９ ホモシステインアッセイ アッセイＩ 66mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5、0.33mMの酢
酸鉛中の先の実施例に従って調製した組換えホモシステ
インデスルフラーゼを用いて、ホモシステインレベルを
測定した。
ホモシステインデスルフラーゼはホモシステインのα
−ケトブチレート、アンモニアおよび硫化水素への変換
を触媒する。硫化水素は酢酸鉛と反応して硫化鉛を生成
し、これは360nmにおいて分光学的に検出できる （モル吸光係数＝5205M-1cm-1）。
アッセイ試薬 0.1M リン酸ナトリウム 0.5 ml 1mM 酢酸鉛 0.5 ml ホモシステイン100μＭないし10mM 0.49ml （33μＭ−3.3mMの最終濃度） ホモシステインデスルフラーゼ（６μg/ml） 10μｌ −最後に添加 該アッセイを20℃で120分間インキュベートして、発
色させる。次いで、360nmにおける吸光度を測定するこ
とによってホモシステインレベルを決定する。
結果 ホモシステイン濃度 吸光度の変化 （40分） 3.3mM 1.066 333μＭ 0.790 33μＭ 0.06 アッセイII アッセイ原理 ジチオスレイトール（DTT）をまず使用してホモシス
チンをホモシステインに分解し、蛋白質結合ホモシステ
イン（チン）を放出させる。次いで、ホモシステイン
を、ホモシステインデスルフラーゼの作用によってα−
ケトブチレート、NH3およびH2Sに分解する。次いで、特
異的ラクテートデヒドロゲナーゼ イソ酵素を利用して
α−ケトブチレートをα−ヒドロキシブチレートに変換
し、同時にNAD+を放出させる。HClを用いてpHを低下さ
せることによっていずれのNDAHも除去した後、NADを、
エタノール、アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアフォラ
ーゼおよびテトラゾリウム塩を含むサイクリング機構に
供給して着色生成物を生じさせ、これを光学的に測定す
る。色の増加は試料中のホモシステインの濃度に対応す
る。
アッセイの性能 工程1:試料（例えば、クエン加血漿）100μｌと、500
μｌの0.1モル/l HEPES、0.1ミリモル/l NADH、20,00
0μモル／分/l ホモシステインデスルフラーゼ、50,00
0 U/lラクテートデヒドロゲナーゼおよび0.05モル/l
ジチオスレイトール、pH8.0とをキュベット中で混合す
る。37℃で20分間インキュベートする。
工程2:500μｌの１モル/l HCl、0.55％（v/v）Nonid
et P40、１×104モル/l ニトブルーテトラゾリウム
（NBT）を添加する。37℃で５分間インキュベートす
る。
工程3:500μｌのトリス（ヒドロキシメチルアミノメ
タン）（TRIS）、１モル/l エタノールを加え、続いて
50μｌの20,000U/l アルコールデヒドロゲナーゼ、100
0U/l ジアフォラーゼを添加する。
アルコールデヒドロゲナーゼを含有する試薬の添加後
に、527nmで５分間、吸光度の増加を測定する。
アッセイ性能 ｉ）標準曲線 典型的な標準曲線を以下の表に示す。
標準曲線はホモシステインを血清に加えるすることに
よって作製した。バックグラウンドのシグナルはホモシ
ステインの内因性レベルによって部分的に引き起こされ
ている。
ii）感度 ＜５μモル/lホモシステインの濃度を検出できること
は明らかである。
iii）回収 ホモシステインを血漿に加えて、回収率を測定した。
iv）直線性 以下の表は応答の直線性を示す。
患者試料（血漿）を前記量の唾液を用いて希釈し、測
定したシグナルを理論的シグナルと比較した。
ｖ）交差反応性 以下の表はメチオニンおよびシステインでのアッセイ
の交差反応性を示す。
ホモシステイン、メチオニンおよびシステインを血漿
に加え、シグナルを測定した。システインまたはメチオ
ニンいずれの交差反応性も200μモル/lまで観察されな
かった。
実施例10 組換えMGL1およびMGL2の部位特異的突然変異
誘発 PCRベースのQuikChangeTM部位特異的突然変異誘発キ
ット（Stratagene）を用い、突然変異したrMGL1（C113
G）およびrMGL2（C116G）の産生を達成した。（ｐ−Blu
escriptまたはpQE30/60発現ベクター中の）二本鎖mgl1
およびmgl2 cDNAを鋳型として使用した。cDNAクローン
の対向するストランドに相補的なオリゴヌクレオチドプ
ライマーの対を用い（各々は各システインコドン（TG
C）をグリシンコドン（GGC）に変換する点突然変異を含
有する）以下の:1）5'−TGCCTTTATGGCGGCACACATGCTCTCT
−3';2）5'−AAGAGAGCATGTGTGCCGCCATAAAGG−3'を用い
て突然変異誘発を行った。突然変異したcDNAのPCR媒介
増幅により、Dpn−Ｉエンドヌクレアーゼを用い、オリ
ジナル鋳型cDNA/ベクターを選択的に消化した。所望の
突然変異を含有するcDNAクローンを、遺伝子特異的オリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いる両ストランドに対す
る配列決定によって同定した。pBluescript中の突然変
異したcDNAを発現するに先立ってpQEベクターでサブク
ローン化した。組換え突然変異MGL1およびMGL2の生成お
よび精製は上述したように行った。
実施例11 組換えMGL1およびMGL2、および突然変異MGL1
（C113G）およびMGL2（C116G）の酵素的な実験 トリコモナス・バギナリスから従前に精製したメチオ
ニンγ−リアーゼは、メチオニン、ホモシステインおよ
びＳ−アデノシルメチオニンを含めた多数の基質に対し
ての活性を有するが、シスタチオニンに対する活性は有
しなかった（LockwoodおよびCoombs,1991）。MGL1およ
びMGL2および精製天然メチオニンγ−リアーゼの間の同
一性を評価するために、組換え酵素のの酵素活性を分析
した（表２）。rMGL1およびrMGL2はホモシステインに対
して非常に高い活性を有し、また、メチオニン、システ
インおよびＯ−アセチルセリンを迅速に異化することが
判明した。２つの組換え酵素は、シスタチオニンを基質
として利用できなかった。ホモシステインおよびシステ
インにつき２つの酵素蛋白質の動力学パラメーターも測
定した（表３）。２つの基質についてのrMGL1の見掛け
のKmはrMGL2のものよりも高く、最大差異はメチオニン
についてのものであった。
突然変異rMGL1（C113G）およびrMGL2（C116G）の生成
および精製に続き、それらの酵素的活性を、対応する野
生型酵素のそれと比較した（表２）。最適条件下で、全
ての基質に対してのrMGL1（C113G）の活性は、野生型rM
GL1のそれよりもかなり低かった。rMGL2（C116G）もま
た、野生型rMGL2よりもホモシステインおよびメチオニ
ンに対して低い活性を有したが、驚くべきことに、シス
テインおよびＯ−アセチル−Ｌ−セリンに対しての突然
変異酵素の活性は増加した。突然変異酵素はいずれもシ
スタチオニンに対しての活性を呈しなかった。
ホモシステインおよびシステインの異化に関する突然
変異および野生型酵素の比較動力学分析を行った（表
３）。野生型rMGL1のそれと比較したrMGL1（C113G）の
わずかに高いKmおよび顕著に低いVmax値は、この突然変
異酵素の基質結合効率の低下を示唆する。対照的に、シ
ステインについてのrMGL2（C116G）の見掛けのKmは、rM
GL2のそれよりもかなり低く、これは、この基質に対し
ての突然変異酵素の増強された活性（より高いVmax）と
相関する。予期せぬことに、この基質に向けての突然変
異酵素の有意に低いVmaxにも拘わらず、ホモシステイン
についてのrMGL2（C116G）のKmも野生型酵素のそれに対
してかなり低下した。
活性（μモル分-1mg蛋白質-1で）は括弧に入れた実験
数からの、平均値±標準偏差である。ホモシステインお
よびシステインに対する活性は、標準的な手法を用い硫
化水素生成をモニターすることによって検定した；他の
基質に対しての活性は標準的なα−ケト酸生成アッセイ
を介して測定した。N.D.、活性は測定されず（＜0.04μ
モル分-1mg蛋白質-1）。
少なくとも三連のアッセイにて、少なくとも10の異な
る基質濃度を用いた。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:1248 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA ハイポセティカル:NO 起源 生物名:HOMOCYSTEINE DESULPHURASE CLONE 1 細胞の種類:Trichomonas vaginalis セルライン:G3 直接の起源 クローン名:mgl1 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:14..1204 配列 配列番号:2 配列の長さ:397 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:3 列の長さ:1305 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA ハイポセティカル:NO 起源 生物名:HOMOCYSTEINE DESULPHURASE CLONE 2 細胞の種類:Trichomonas vaginalis セルライン:G3 直接の起源 クローン名:mgl2 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:16..1212 配列 配列番号:4 配列の長さ:399 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:5 配列の長さ:31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸/desc＝“oligonucleotide" 起源 生物名:Cyst 5' 配列の特徴 特徴を表す記号:modified_base 存在位置:11 他の情報:/mod_base＝ｉ 配列の特徴 特徴を表す記号:modified_base 存在位置:23 他の情報:/mod_base＝ｉ 配列の特徴 特徴を表す記号:modified_base 存在位置:26 他の情報:/mod_base＝ｉ 配列 配列番号:6 配列の長さ:28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸/desc＝“OLIGONUCLEOTIDE" 起源 生物名:Cyst 3' 配列の特徴 特徴を表す記号:modified_base 存在位置:14 他の情報:/mod_base＝ｉ 配列の特徴 特徴を表す記号:modified_base 存在位置:23 他の情報:/mod_base＝ｉ 配列 配列番号:7 配列の長さ:24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸/desc＝“OLIGONUCLEOTIDE" 起源 生物名:5'Nco I primer 配列 配列番号:8 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸/desc＝“OLIGONUCLEOTIDE" 起源 生物名:3'Bal II primer 配列 配列番号:9 配列の長さ:1249 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 起源 生物名:MUTATED HOMOCYSTEINE DESULPHURASE MGL1（C
113G） 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:15..1205 配列 配列番号:10 配列の長さ:397 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:11 配列の長さ:1306 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 起源 生物名:MUTATED HOMOCYSTEINE DESULPHURASE MGL2（C
116G） 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置17..1213 配列 配列番号:12 配列の長さ:399 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｑ 1/527 Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｑ 1/527 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/68 5/00 Ａ (72)発明者 モットラム，ジェレミー チャールズ イギリス国 ジー61 １エイチティー ベアーズデン マックスウェル アヴェ ニュー 139 (72)発明者 プリチャード，デイヴィッド ジョン イギリス国 ピーエイチ２ ６エルエル パースシャー スコーン アビーロー ド 41 (72)発明者 キャンベル，ロバート ストュアート イギリス国 ピーエイチ７ ７エスピー パースシャー パース アボッツフォ ード クレセント 25 (56)参考文献 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａ ｓｉｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．63 （1987），ｐ．143−151 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）ホモシステインを分解し、反応生成物
    としてα−ケトブチレート、硫化水素およびアンモニア
    を生じる反応を触媒するホモシステインデスルフラーゼ
    活性を有する酵素に、試料を接触させる工程と、 ｂ）前記酵素によるホモシステインの酵素分解によって
    生成されたいずれかの前記反応生成物を測定する工程と を備える、試料中のホモシステインを検定する方法。
  2. 【請求項２】前記酵素がホモシステインデスルフラーゼ
    である請求項１に記載のホモシステインを検定する方
    法。
  3. 【請求項３】前記ホモシステインデスルフラーゼが、ホ
    モシステインデスルフラーゼ活性を示す組換え原生動物
    ホモシステインデスルフラーゼである請求項２に記載の
    ホモシステインを検定する方法。
  4. 【請求項４】前記組換え原生動物ホモシステインデスル
    フラーゼが配列番号２、配列番号４、配列番号10または
    配列番号12で示されるホモシステインデスルフラーゼで
    ある請求項３に記載のホモシステインを検定する方法。
  5. 【請求項５】前記反応生成物の一つがα−ケトブチレー
    トであり、α−ケトブチレートのレベルを測定する請求
    項１から４のいずれか一項に記載のホモシステインを検
    定する方法。
  6. 【請求項６】前記反応生成物の一つが硫化水素であり、
    硫化水素のレベルを測定する請求項１から４のいずれか
    一項に記載のホモシステインを検定する方法。
  7. 【請求項７】前記反応生成物の一つがアンモニアであ
    り、アンモニアのレベルを測定する請求項１から４のい
    ずれか一項に記載のホモシステインを検定する方法。
  8. 【請求項８】α−ケトブチレートのレベルを、α−ケト
    ブチレートとNADHと、ラクテートデヒドロゲナーゼもし
    くはピルベートデヒドロゲナーゼとを反応させて、α−
    ケトブチレートをα−ヒドロキシブチレートに変換する
    と共に、NAD+を生成させ、NAD+のレベルを決定すること
    によって測定する請求項５に記載のホモシステインを検
    定する方法。
  9. 【請求項９】前記方法が５μモル/L未満の濃度のホモシ
    ステインを検出するのに十分な感度である請求項１から
    ８のいずれか一項に記載のホモシステインを検定する方
    法。
  10. 【請求項１０】最初に、分析物をホモシステインに分解
    し、次いで、請求項１から９のいずれか一項に記載の方
    法によって、生成したホモシステインを評価することを
    含む、ホモシステインに分解可能な分析物を検定する方
    法。
  11. 【請求項１１】前記分析物はホモシスチンまたはメチオ
    ニンである請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ａ）メチオニンをアンモニア、メタンチ
    オールおよびα−ケトブチレートに、システインをアン
    モニア、硫化水素およびピルビン酸塩に、または、Ｏ−
    アセチル−Ｌ−セリンをアンモニアおよびピルビン酸塩
    に分解可能な組換え原生動物ホモシステインデスルフラ
    ーゼと試料とを接触する工程と、 ｂ）メチオニン、システインまたはＯ−アセチル−Ｌ−
    セリンの酵素分解によって生成されたいずれかの反応生
    成物を測定する工程と、 を備える、試料中のメチオニン、システインまたはＯ−
    アセチル−Ｌ−セリンを検定する方法。
  13. 【請求項１３】ａ）ホモシステインを分解し、反応生成
    物としてα−ケトブチレート、硫化水素およびアンモニ
    アを生じる反応を触媒するホモシステインデスルフラー
    ゼ活性を有する酵素と、 ｂ）前記酵素によるホモシステインの酵素分解によって
    生成した前記反応生成物のいずれか一つを測定できる手
    段と、 を備える試料中のホモシステインレベルのイン・ビトロ
    測定用の診断キット。
  14. 【請求項１４】前記酵素がホモシステインデスルフラー
    ゼである請求項13に記載の試料中のホモシステインレベ
    ルのイン・ビトロ測定用の診断キット。
  15. 【請求項１５】前記ホモシステインデスルフラーゼが、
    ホモシステインデスルフラーゼ活性を示す組換え原生動
    物ホモシステインデスルフラーゼである請求項14に記載
    の試料中のホモシステインレベルのイン・ビトロ測定用
    の診断キット。
  16. 【請求項１６】組換え原生動物ホモシステインデスルフ
    ラーゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号10または
    配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するホモシステ
    インデスルフラーゼ、あるいは、配列番号２、配列番号
    ４、配列番号10または配列番号12で示されるアミノ酸配
    列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入ま
    たは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホモシステ
    インデスルフラーゼ活性を呈する、ホモシステインデス
    ルフラーゼである請求項15に記載の試料中のホモシステ
    インレベルのイン・ビトロ測定用の診断キット。
  17. 【請求項１７】配列番号１または配列番号３、配列番号
    ９または配列番号11で示される断片と相補的な塩基配列
    断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
    かつ、ホモシステインデスルフラーゼ活性を有するタン
    パク質をコードするポリヌクレオチド断片。
  18. 【請求項１８】前記断片が、実質的に配列番号１、配列
    番号３、配列番号９または配列番号11で示されるポリヌ
    クレオチド断片。
  19. 【請求項１９】前記ポリヌクレオチド断片が、配列番号
    ２、配列番号４、配列番号10または配列番号12で示され
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求
    項17または18に記載のポリヌクレオチド断片。
  20. 【請求項２０】前記ポリヌクレオチド断片が、配列番号
    １、配列番号３、配列番号９または配列番号11で示され
    るポリヌクレオチド断片と同一である請求項17に記載の
    ポリヌクレオチド断片。
  21. 【請求項２１】請求項17から20のいずれかに記載のポリ
    ヌクレオチド断片を含む組換え核酸分子。
  22. 【請求項２２】組換え核酸分子が、前記ポリヌクレオチ
    ド断片の発現を制御するための前記ポリヌクレオチド断
    片に作動可能に連結された調節制御配列を含む請求項21
    に記載の組換え核酸分子。
  23. 【請求項２３】組換え核酸分子が、プラスミドである請
    求項21または22に記載の組換え核酸分子。
  24. 【請求項２４】組換え核酸分子がウィルスベクターに由
    来する請求項21または22に記載の組換え核酸分子。
  25. 【請求項２５】請求項17から20のいずれか一項に記載の
    ポリヌクレオチド断片または請求項21から24のいずれか
    一項に記載の組換え核酸分子によって形質転換された原
    核生物または真核生物の宿主細胞。
  26. 【請求項２６】配列番号２、配列番号４、配列番号10ま
    たは配列番号12で示されるポリペプチドであって、ホモ
    システインデスルフラーゼ活性を呈する、組換え原生動
    物ホモシステインデスルフラーゼ。
  27. 【請求項２７】配列番号２、配列番号４、配列番号10ま
    たは配列番号12で示されるアミノ酸配列において１〜数
    個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミ
    ノ酸配列からなり、かつホモシステインデスルフラーゼ
    活性を呈する、組換え原生動物ホモシステインデスルフ
    ラーゼ。
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