NO326477B1 - Fremgangsmate for analysering av homocystein, metionin, cystein eller o-acetyl-L-serin, sett, antistoff, polynukleotidfragment, rekombinant nukleinsyremolekyl, prokaryot eller eukaryot vertscelle, rekombinant homocysteindesulfurasepolypeptid og anvendelse derav. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for analysering av homocystein, metionin, cystein eller o-acetyl-L-serin, sett,

antistoffpolynukleotidfragment, rekombinant nukleinsyremolekyl, prokaryot eller eukaryot vertscelle, rekombinant homocysteindesulfurasepolypeptid og anvendelse derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for analysering for bestemmelse av homocystein, cystein, o-acetyl-L-serin og/eller metionin nivårer i en biologisk prøve ved anvendelse av et enzym som katalyserer degradering av homocystein, cystein, o-acetyl-L-serin og/eller metionin, idet enzymet spesielt er homocysteindesulfurase; et polynukleotidfragment kodende for protozohomocysteindesulfurase, en rekombinant vektor omfattende et slikt polynukleotidfragment, en vertscelle innholdene nukleotidfragment eller nevnte rekombinante vektor, protozohomocysteindesulfurasedepolypeptid og farmasøytiske sammensetninger omfattende rekombinant homocysteindesulfurase som kan anvendes innen medisin eller veterinærmedisin.

Et forhøyet nivå av homocystein i blodet ser ut til å være en viktig indikator i mange humane sykdomstilstander. Homocystein er et prediktiv på vaskulær sykdom slag, Ueland, P.M. (1992) og Kluijtmans L.A.J, et al., (1996); er korrelert med former av diabetes og alkoholisme, Cravo M.L. et al., (1996); blir anvendt for å registrere lever og nyreskade, Bostom, A.G. et al., (1996) og neurale rørdefekter, Steegers-Theunissen, R.P.N (1992) og er assosiert med visse medfødte feil i metabolismen Mudd, S.H.

(1989).

Homocysteinnivåene i blodet blir konvensjonelt bestemt ved anvendelse av høy ytelse væskekromatografi (HPLC) metoder, se for eksempel Poele-Pothoff M.T.B, et al,

(1995). HPLC metodene anvender derimot omfattende og arbeidskrevende maskineri, er generelt sofistikerte og regnes som upraktiske innen mange rutinemessige analyser.

Patentpublikasjon W093/15220 (Cockbain) beskriver en fremgangsmåte for analysering av homocystein i blodet ved anvendelse av et homocysteinomdannende enzym, S-adenosyl homocystein hydrolase (SAH-hydrolase). SAH-hydrolase katalyserer omdanningen av homocystein med et kosubstrat, adenosin, til S-adenosyl-homocystein. Det er følgelig mulig ved å bestemme mengden av konsumert adenosin og gjøre en korrelasjon med mengden av konsumert homocystein. Mengden av homocystein i en prøve blir deretter bestemt ut i fra forskjeller i adenosinkonsentrasjon. En slik analyse krever derimot anvendelse av to opprinnelige substrater (homocystein og adenosin) og to enzymer, som gjør dette relativt omfattende. Det innbefatter også bestemmelser av en reduksjon i konsentrasjon av adenosin, som ikke behøver å være tilfredsstillende.

US 4940658 (Allen et al) beskriver en fremgangsmåte for å bestemme sulfhydrylaminosyrer, inkludert homocysteinnivåer, i prøver av kroppsvev, fremgangsmåte for detektering av kobalamin og folinsyremangel ved anvendelse av en anaylse for totale homocysteinnivåer, og fremgangsmåter for å skjelne kobalamin fra folinsyremangel ved anvendelse av en analyse for totale homocysteinnivåer i sammenheng med en analyse for metylmalonsyre. Analysen omfatter kombinering av en prøve med en referansestandard omfattende en kjent mengde av en sulfydrylaminosyre som skal bli analysert, merket med en egnet markør og måling av de relative mengdene av merket og umerket sulfydrylaminosyre tilstede i hver art med et massespektrometer. Fordi mengden av merkede arter er kjent, er det derfor mulig ut i fra beregningen av forholdet mellom merkede og umerkede arter å bestemme mengden av sulfydrylamino-yren som er tilstede i prøven.

US 5438017 beskriver en gasskromatografi/massespektrometrimetode for analysering av sulfydrylaminosyrer i en prøve av kroppsfluid. Analysen bygger på anvendelse av en merket referansesulfydrylaminosyre, som den som er beskrevet i US 4940658, men har ytterligere behandlings- og/eller rensingstrinn før anlysering av prøven ved gasskromatografi/massespektrometri.

Thong et al; Experimental Parasitology, vol 3, nr. 2,1987, s143-151 beskriver at Thrichomonas vaginalis har høye aktiviteter av homocysteindesulfurase og serinsulfhydrase. Det beskrevne, rensede native proteinet synes å være en blanding av isoenzymer.

Det er å bemerke at i likhet med HPLC metodene er analyser beskrevet ovenfor som anvender gasskromatografi/massespektrometri generelt sofistikerte og anvender dyrt og arbeidskrevende maskineri, og er betraktet å være upraktiske i mange rutinemessige analyser.

Det er en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte som forebygger og/eller lindrer minst noen av de ovennevnte ulemper.

Det er en ytterligere hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et rekombinant enzym som har evne til å katalysere degradering av homocystein, inkludert anvendelse av nevnte analyse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et polynukleotidfragment så som et DNA fragment, kodende for protozo homocysteindesulfurase. Oppfinnelsen tilveiebringer videre et rekombinant protozo homocysteindesulfurasepolypeptid.

"Homocysteindesulfurase" som anvendt heri referer til et enzym som har evne til å katalysere degradering av homocystein til å frigjøre oc-ketobutyrat, hydrogensulfid og ammoniakk.

Et slikt enzym kan også inneha en affinitet for andre substrater så som metionin, cystein og O-acetyl-L-serin. Dersom for eksempel metionin blir anvendt som et substrat er sluttproduktene ved katabolismen av enzymet oc-ketobutyrat, ammoniakk og metanetiol.

Det er å bemerke at det kan være flere former (for eksempel fra forskjellige organismer) eller isoformer, av "homocysteindesulfurase" og alle slike former/isoformer og anvendelse derav er innbefatter deri.

"Polynukleotidfragment" som anvendt heri referer til en kjede av nukleotider så som deoksyribosenukleinsyre (DNA) sekvenser og transkripsjonsprodukter derav, så som RNA, som har evne til å gi opphav til en homocysteindesulfurase eller et fysiologisk funksjonelt derivat derav. Et fysiologisk funksjonelt derivat er et hvor enzymets funksjonalitet identifiserer et enzym som en homocysteindesulfurase som definert ovenfor. Denne betegnelsen innbefatter følgelig dobbelt og enkelttrådet DNA, og RNA sekvenser avledet derifra. Betegnelsen ekskluderer hele det naturlig forekommende genomet omfattende polynukleotidfragment, som for eksempel tilstede i protozoon Trichomonas vaginalis.

Polynukleotidet vil generelt være i vesentlig isolert form. Dette vil si vesentlig fri for biologisk materiale som hele genomet normalt er assosiert med in vivo.

Generelt referer betegnelsen "polynukleotid" til en kjede eller sekvens aminosyrer som utviser en biologisk aktivitet som vesentlig ligner den biologiske aktiviteten til homocysteindesulfuras og referer ikke i seg selv til en spesifikk lengde av produktet. Polypeptidet kan om nødvendig bli modifisert in vivo og/eller in vitro, for eksempel ved glykosilering, amidiering, karboksylering, fosforylering og/eller posttranslasjonell spaltning og peptider, oligopeptider, proteiner og fusjonsproteiner er følgelig omfattet. Fagfolk innenfor dette området er klar over at modifisert polypeptid bør beholde den fysiologiske funksjonen, dvs. ha evne til homocysteindesulfuraseaktivitet.

DNA fragment kodende for homocysteindesulfurase kan bli oppnådd ved anvendelse av et delvis homocysteindesulfurase cDNA. cDNA kan bli oppnådd ved revers transkripsjon av RNA etterfulgt av amplifikasjon som vanligvis anvender polymerasekjedereaksjon (PCR) teknikker kjent innenfor fagområdet, for eksempel, anvendelse av primere konstruert mot konserverte regioner av beslektede enzymer så som cystation y-lyase kodende sekvenser, for eksempel human, rotte og/eller gjær-cystation y-lyase. Amplifisert fragment inneholdende en del av homocysteindesulfurasegenet kan deretter bli anvendt for å klone hele homocysteindesulfurasegenet fra et cDNA bibliotek omfattende et slikt gen. cDNA biblioteket kan være fra en protozo, for eksempel et Trichomonas vaginalis cDNA bibliotek. Polynukleotidfragmenter inneholdende homocysteindesulfurasegener oppnådd på en slik måte er angitt i figurene 1 og 2.

DNA fragmentet ifølge figur 1 koder for et gen etla (deretter omdefinert til mgl 1) omfattende en åpen leseramme (ORF) med 396 aminosyrer nedenfor referert til som CTLa (deretter redefinert til MGL1). DNA fragmentet ifølge figur 2 koder for et gen ctip

(deretter omdefinert til mg12) omfattende en ORF med 398 aminosyrer nedenfor referert til som CTL(3 (deretter omdefinert til MGL2). En sammenligning av prosent identitet ( på aminosyrenivå) av MGL1 og MGL2 som angitt i figurene 1 og 2 med metionin y-lyase fra Pseudomonas putida og cystationin y-lyase fra gjær og menneske (EMBL database-ekspresjonstall, henholdsvis D30039, P31373 og S52784) er vist i tabell 1. Sekvens-sammenlignende analyser ble anvendt ved anvendelse av "gap" og "pileup" programmer ved anvendelse av GCG Wisconsin package (Deverux, H. Hacberli, P. Smithies, O.

(1984) Nucleic Acids Reasearch 12, 387-395).

Tabell 1 viser at antatte homocysteindesulfuraseenzymer som angitt i figurene 1 og 2 har en identitet på bare 42-45%, på aminosyrenivå, med tidligere sekvenserte metionin y-lyase og cystationin y-lyase. Til tross for at MGI1 og MGL2 kan ha blitt klonet ved anvendelse av primere konstruert mot konserverte regioner av cystationin y-lyase, er de ikke vesentlig like innenfor polypeptidene.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også polynukleotidfragmenter med minst 80%, spesielt 90% og spesielt minst 95% likhet med fragmentet eksemplifisert i figur 1 og 2. Foreliggende oppfinnelse innbefatter også polypeptidsekvenser med minst 80% likhet med polypeptidet eksemplifisert i figurene 1 og 2. "Likhet" referer til både identisk og konservativ erstatning av nuklotider eller aminosyrer, forutsatt at den enzymatiske funksjonaliteten til homocysteindu-sulfurase er vesentlig uforandret.

Fagfolk er klar over at det er mulig å genetisk manipulere genet eller derivatet derav, for eksempel, å klone genet ved rekombinante DNA teknikker som generelt er kjent innenfor fagområdet og å uttrykke polypeptidene som derved blir kodet in vitro eller in vivo. Polynuklotidfragmenter med nukleotidsekvenser angitt i figurene 1 og 2, eller derivater derav, blir fortrinnsvis anvendt for ekspresjon av homocysteindesulfurase.

Det er å bemerke at spesielle homocysteindesulfurasepolypeptider omfattet heri kan variasjoner (naturlige eller andre) eksistere. Disse variasjonene kan bli demonstrert ved aminosyreforskjeller i den totale sekvensen eller ved delesjoner, substitusjoner, inskutt, inversjoner eller addisjoner av aminosyrene i nevnte sekvens. Alle slike derivater er innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse forutsatt at derivatene er fysiologisk funksjonelle (dvs. utviser homocysteindesulfuraseaktivitet som definert heri). For eksempel kan konservative erstatninger i foreliggende oppfinnelse være mellom aminosyrer, innenfor følgende grupper: (I) alanin, serin og treonin; (II) glutaminsyre og asparginsyre; (III) arginin og lysin; (IV) asparagin og glutamin; (V) isoleucin, leucin og valin;

(VI) fenylalanin, tyrosin og tryptofan.

Spesifikke erstatninger av aminosyrer identifisert å være innenfor antatte funksjonelle domener av homocysteindesulfurase kan bli utført. For eksempel kan aminosyrer identifisert innenfor en antatt substratbindende domene bli erstattet med konservative eller ikke-konservative aminosyrer for å observere eventuelle forandringer i enzymets kinetikk som en slik erstatning gjør. Slike forandringer kan for eksempel resultere i en økning i den spesifikke aktiviteten til homocystein, eller redusere den spesifikke aktiviteten, mens Km til homocystein reduseres, eller øke den spesifikke aktiviteten til andre substrater så som cystein og O-acetyl-L-serin.

Foreliggende oppfinnere har vist at en cysteinrest C113 i MGL1 og C116 i MGL2 spiller en viss rolle i homocysteindesulfurasekatalytisk aktivitet. De har vist at erstatning av cystein 113/116 med glycin fortsatt resulterer i en katalytisk aktiv homocysteindesulfurase. Til tross for at denne mutasjonen generelt resulterer i et enzym med redusert spesifik aktivitet overfor alle substrater resulterer mutasjon av cystein 116 i MGL2 til glycin i et enzym med øket spesifik aktivitet overfor cystein og O-acetyl-L-serin. Mutasjon av cystein 116 i MGL2 til glycin resulterer i et enzym med lavere Km for homocystein.

I tillegg er MGL1 og MGL2 sekvensene blitt observert å ha et 7 aminosyre-innskudd i forhold til cystation y-lyaser overfor N-terminusen (residiene 49-55 i MGL1). En slik region kan være egnet for mutasjonsstudier.

Mutasjonsstudier kan muliggjøre at forskjellige homocysteindesulfuraser blir produsert med forskjellige katalytiske aktiviteter som kan være egnde i et antall forskjellige anvendelser.

Rekombinant DNA teknologi kan bli anvendt for å fremstille nukleinsyresekvenser kodende for disse derivatene som angitt ovenfor.

Det er velkjent innenfor dette fagområdet at degenerasjonen til den genetiske koden muliggjør substitusjon av baser i et kodon som resulterer i et annet kodon som har evne til å kode for samme aminosyre, for eksempel kodonet for aminosyren glutaminsyre er både GAT og GAA. Det er følgelig klart at for ekspresjon av et polypeptid med aminosyresekvensen vist i figurene 1 eller 2, eller et fragment derav, kan det anvendes en derivatnukleinsyresekvens med en slik alternativ kodonsammensetning som er forskjellig fra nukleinsyresekvensen vist i figurene 1 eller 2.

Fragmenter avledet fra homocysteindesulfurase eller peptider eller fra aminosyresekvenser angitt i figurene 1 og 2 som utviser homocysteindesulfuraseaktivitet, eller fragmenter avledet fra nukleotidsekvensen kodende for nevnte homocysteindesulfurasepolypeptid eller avledet fra nukleotidsekvensen angitt i figurene 1 og 2 kodende for fragmenter av nevnte homocysteindesulfurasepolypeptider er også innbefatter i foreliggende oppfinnelse.

Fagfolk innen dette området vet at slike modifikasjoner som nevnt ovenfor resulterer i enzymatiske aktive derivater av nevnte homocysteindesulf urasepolypeptid eller gen og er omfattet av foreliggende oppfinnelse. Nevnte homocysteindesulfurase-polynukleotidfragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis koblet til regulatoriske kontrollsekvenser. Slike kontrollsekvenser kan omfatte promotere, operatorer, indusere, ribosombindingseter, terminatorer osv. Egnede kontrollsekvenser til en gitt vert kan bli valgt av fagfolk innenfor dette området. Såkalte "taggins sekvenser" så som ytterligere aminosyrer kan i tillegg bli tilsatt til N eller C terminus til polypeptidet, for å tilveiebringe et såkalt fusjonsprotein ved ekspresjon av polypeptidet.

Et polynukleotidfragment ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli legert til hvilket som helst av en mengde ekspresjonskontrollerende DNA sekvenser og resulterer i et såkalt rekombinant DNA molekyl. Foreliggende oppfinnelse innbefatter følgelig en ekspresjonsvektor omfattende et uttrykkbart nukleinsyremolekyl. Slike rekombinante nukleinsyremolekyler kan deretter bli anvendt for transformasjon av en egnet vert. Ekspresjonsvektorene er fortrinnsvis hybride DNA molekyler avledet fra for eksempel plasmider, eller fra nukleinsyresekvenser avledet fra bakteriofag eller viruser og er betegnet "vektormolekyler".

Spesifikke vektorer kan bli anvendt for å klone nukleinsyresekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse er kjent innenfor fagområdet (for eksempel Rodriguez, R.L. og D.T. Denhardy, Edit., Vectors, A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, 1988).

To spesifikke bakterielle ekspresjonsvektorer pQEE60 og pQE30 (Qiagen Hiiden, Germany) er blitt anvendt for homocysteindesulfuraseekspresjon. pQE serier av ekspresjonsvektorene (for eksempel pQE60 og pQE30) koder for en 6 histidinmarkør (6xhis-markør) som muliggjør rensing av fusjonsproteinet ved anvendelse av metallsalt-chelataffinitetskromatografi og hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC).

Fremgangsmåtene anvendt for konstruksjon av et rekombinant nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse er kjent for fagfolk og er blant annet angitt i Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1989).

Transformert celle inneholdende nukleinsyremolekylet i uttrykkbar form er referert til. Transformasjon som anvendt heri, refererer til innføring av en heterolog nukleinsyresekvens inn i en vertscelle, uansett fremgangsmåte som blir anvendt, for eksempel direkte opptak, transfeksjon eller transduksjon. Heterologt polynukleotidfragment kan bli opprettholdt gjennom autonom replikasjon eller kan alternativt bli integrert inn i vertens genom. Rekombinant nukleinsyremolekyl er fortrinnsvis utstyrt med en hensiktsmessig kontrollsekvens kompatibel med en angitt vert som kan regulere ekspresjonen av et innskutt polynukleotidfragment for eksempel T7 promoter, taqpromoter, lakpromoter og trp promoter.

Egnede verter anvendt for ekspresjon av rekombinante nukleinsyremolekyler kan være prokaryotiske eller eukaryotiske av opprinnelse. De mest anvendte vertene for ekspresjon av rekombinante nukleinsyremolekyler kan bli valgt fra bakterier, gjær, insektsceller og pattedyrceller. Kloning og ekspresjon av rekombinant homocysteindesulfurase letter også fremstilling av reagenser for produksjon av for eksempel prober for in situ ekspresjonsstudier, produksjon av anti-homocysteindesulfuraseantistoffer (spesielt mot monoklonal antistoffer) og vurdering av in vitro og in vivo biologisk aktivitet til rekombinant homocysteindesulfurase.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre rekombinant homocysteindesulfurase for fremstilling av reagenser som kan anvendes som profylaktiske og/eller terapeutiske midler. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer spesielt farmasøytiske sammensetninger som omfatter rekombinant homocysteindesulfurase sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer derav. Sykdomstilstander så som cancer kan dra nytte av homocysteindesulf uraseterapi og/eller profylaktisk behandling på en måte som ligner den som er beskrevet av Hori, H. et al., (1996) for metionin y-lyase. Homocysteindesulfurase kan vanligvis bli anvendt for utvikling av antitrikomonale medikamenter, forbindelsene har også nyttig aktivitet overfor andre patogener som inneholder homocysteindesulfurase og/eller metionin y-lyase. Disse innbefatter både anvendelse av rekombinant homocystein for å screene for inhibitorer i for eksempel kombinatoriske bibliotek og også analyser av enzymets struktur for å tilveiebringe konstruksjon av spesifikke inhibitorer eller promedikamenter.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer metoder hvorved homocysteinnivåer kan bli analysert.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte for analysering av homocystein i en prøve, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: a) kontakting av prøven med et enzym som katalyserer degraderingen av homocystein for å frigjøre reaksjonsproduktene: a-ketobutyrat, hydrogensulfid og

ammoniakk, og

b) bestemmelse av hvilke som helst av nevnte reaksjonsprodukter dannet ved enzymdegradering av homocystein av nevnte enzym.

Kromatografisk separasjon av homocystein og/eller nevnte reaksjonsprodukter blir fortrinnsvis ikke utført.

Enzymet er fortrinnsvis homocysteindesulfurase, og er spesielt rekombinant protozo homocysteindesulfurase.

Det er foretrukket at homocysteindesulfurase er homocysteinsulfurase ifølge figurene 1, 2, 6 eller 7.

Rekombinant protozo homocysteindesulfurase kan også bli anvendt for å analysere andre substrater i en prøve, inkludert metionin, cystein og O-acetyl-L-serin.

Generelt kan den biologiske prøven være en prøve fra blod, plasma, avføring, spytt, vaginalfluider eller urin. Homocystein kan bli bundet ved sulfidbindinger til sirkulerende proteiner, så som albumin, og homocystein kan også være tilstede i form av andre disulfidderviater (vanligvis homocystein-cysteinkonjugater). For å oppnå en vurdering av total homocystein som er tilstede i prøven, kan det derfor være ønskelig å behandle prøven med et reduksjonsmiddel for å spalte eventuelle disulfidbindinger og frigjøre fritt homocystein. Disulfidreduksjon blir beskrevet av Jocelyn i Methods of Enzymology 143: 243-256 (1987) hvor en mengde egnede reduksjonsmidler er oppført. Slike egnde reduksjonsmidler er inkorporert i beskrivelsen i foreliggende oppfinnelse.

Sluttproduktene til reaksjonen beskrevet ovenfor a-ketobutyrat, hydrogensulfid og ammoniakk, kan bli bestemt og en mengde egnede metoder er kjente for fagfolk innenfor dette området for eksempel, kolorimetriske, spektrofotometiske, elektro-kjemiske, fluorimetriske eller luminiescensmetoder. Fremgangsmåten er fortrinnsvis sensitiv nok til å detektere konsentrasjonen av <5 u.mol/1 homocystein i en prøve.

a-ketobutyrat dannet ved degradering av homocystein kan bli deteketert ifølge fremgangsmåten til Soda (Soda, K. (1968) Anal. Biochem. 25: 228-235) ved anvendelse av 3-metyl-2-benzotiazolonhydrozonhydroklorid (MBTH).

En ytterligere fremgangsmåte for å bestemme a-ketobutyrat er beskrevet av Li, R. + Kenyon, G.L (1995) A spectrophotometric determination of a-dicarboxyl compounds and its application to the enzymatic formation of a-ketobutyrat. Analytical Biochemistry 230 37-40.

En spesielt foretrukket fremgangsmåte for detektering av a-ketobutyrat er ved tilsetning av NADH og laktat dehydrogenase for omdanne a-ketobutyrat til a-hydroksybutyrat med dannelse av NAD<+.> Nivået av NAD<+> kan deretter bli målt ifølge et antall fremgangsmåter som omfatter omdanning til NADH inkludert spektrofotometrisk ved absorbanse ved 340 nm; ved fluorescens ved eksitasjon ved 365 nm og emisjon ved 460 nm (Palmer T (1991) Understanding Enzymers 3rd Edition, Ellis Horwood, London; kolorimetrisk ved anvendelse av tetrazoliumsalter (Altman, P.F. (1974) Histochemistry 38 p155-171); electrochemicallyt (Morroux J. Elring PJ (1979) Anal Chem 51, 346; Blaedel WJ, Jenkins RA (1975) Anal Chem 47,1335; Juegfeldt H et al (1981) Anal Chem 53,1979; Wang J. Lin MS (1987) Electronal Chem 221, 257); og luminescently (WitheheadTP et al (1979) Clin Chem 25,1531).

Som et alternativ kan pyruvatdehydrogenase bli anvendt istedenfor laktatdehydrogenase for å danne NAD<+> og NAD<+> detektert som beskrevet ovenfor.

Hydrogensulfid dannet ved homocysteindegradering kan bli bestemt for eksempel ved omsetning med blyacetat for å produsere blysulfid ifølge følgende (støkiometriske) ligning.

Blysulfid som dermed blir dannet kan bli målt spektrofotometrisk ved en egnet bølgelengde, så som A360 nm (Thong K.W. + Coombs, G.H. (1985) Homocysteine desulphurase activity in trichomonads. IRCS Medicak Science 13 493-494.

Alternativt kan hydrogensulfid bli målt ved anvendelse av metylen-blå-metoden som beskrevet av Clime, J.D. Limnol, Oceangr. (1969) 14: 454-458. Hydrogensulfid blir omsatt med 0,17 mM N, N-dimetyl-p-fenylendiaminsulfat i syre og jernklorid i syre for å danne metylen blå som kan bli detektert spektrofotometrisk ved 650-670 nm.

Ammoniakk dannet ved degradering av homocystein kan bli omsatt med fenol i nærvær av hypokloritt for å danne indofenol som beskrevet av Horn, D.B. + Squire, CR.

(1967), An improved method for the detection of ammonia in blood plasma Clin. Chem. Acta 17 99-105. Indofenol produsert på denne måten kan deretter bli detektert spektrofotometrisk ved en egnet bølgelengde, for eksempel, 570 nm. Ytterligere fremgangsmåte for detektering av ammoniakk innbefatter: enzymatisk, ved anvendelse av a-ketoglutarat og NAD(P)<+> med glutamatdehydrogenase som beskrevet av Mondzac A et al (1965) J. Lab. Clin. Med. 66 526; elektrokjemisk ved anvendelse av en ammoniakkelektrode som beskrevet av Guilbault et al (9185) Anal. Chem. 57 2110; ved anvendelse av 2-oksoglutarat og NADH for å danne glutamat, vann og NAD<+> og deretter måling av NAD<+> som beskrevet ovenfor; og tilsetning av sølvnitrat til ammoniakk for å danne et svart presipitat. Rekombinant homocysteindesulfurase ifølge foreliggende oppfinnelse utviser aktivitet overfor et antall substrater, i tillegg til ho utviser aktivitet overfor et antall substrater, i tillegg til homocystein, inkludert metionin, cystein og O-acetyl-L-serin. Det er å bemerke at homocysteindesulfurase kan bli anvendt for å analysere for metionin, cystein og/eller O-acetyl-L-serin på en måte som er lik den som er beskrevet ovenfor. Idet rekombinant homocysteindesufurase ifølge foreliggende oppfinnelse utviser aktivitet ovefor en rekke substrater kan enzymet bli anvendt for fremstilling av uvanlige aminosyrer og beslektede molekyler. Ytterligere homocysteindesulfurase kan bli anvendt for å fjerne homocystein, metionin og/eller cystein fra oppløsninger, blant annet fra biologisk medium. Homocysteindesulfurase kan også bli anvendt for å analysere for enzymer som katalyserer reaksjoner som innbefatter homocystein som enten substrat eller produkt (blant annet S-adenosylhomocysteinhydrolase). Homocystein kan bli analysert på måter anvendt for deteksjon derav i biologiske prøver. Likeledes kan homocysteindesulfurase bli anvendt for å analysere enzymer som katalyserer reaksjoner som innbefatter metionin eller cystein eller beslektede forbindelser som substrater eller produkter. Disse metabolitene kan bli analysert via omdanning derav til a-ketosyrer ved homocysteindesulfurase og måling av a-ketosyrer som tidligere beskrevet. Analysen kan også bli anvendt for å vurdere en analyt som først blir nedbrutt til homocystein og deretter blir konsentrasjonen av analyten bestemt ved måling av konsentrasjon av homocystein. Eksempler på slike analyter innbefatter homocystin (hvor homocystin blir omdannet til homocystein ved anvendelse av DTT) eller metionin (som kan bli omdannet enzymatisk til homocystein). I begge tilfellene kan konsentrasjonen av analyten følgelig bli bestemt ved måling av homocystein. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for analysering av metionin, cystein eller o-acetyl-L-serin i en prøve, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: a) kontakting av prøven med en protozo homocysteindesulfurase som har evne til å degradere metionin til ammoniakk, metanetiol og a-ketobutyrat; cystein til ammoniakk, hydrogensulfid og pyruvat; og o-acetyl-L-serin til ammoniakk og pyruvat; og b) bestemmelse av reaksjonsprodukt(er) dannet ved enzymdegradering av metionin, cystein eller o-acetyl-L-serin.

I et ytterligere aspekt er det tilveiebrakt et sett for diagnostisering av in vitro bestemmelse av et homocysteinnivå i en prøve, kjennetegnet ved at settet omfatter: a) et enzym som katalyserer degraderingen av homocystein for å frigjøre reaksjonsprodukter: a-ketobutyrat, hydrogensulfid og ammoniakk, og b) midler for å muliggjøre bestemmelse av hvilke som helst av nevnte reaksjonsprodukter dannet ved enzymdegraderingen av homocystein til nevnte enzym.

Enzymet er fortrinnsvis homocysteindesulfurase, fortrinnsvis rekombinant protozohomocysteindesulfurase.

Settet kan fortrinnsvis være i form av et kuvettebasert testsett for manuell og automatisert anvendelse, mikrotiter skål testsett eller teststrimmel basert analysesett.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre polynukleotidfragment, kjennetegnet ved at det koder for en homocysteindesulfurase som har minst 80% likhet med fragmentet vist i SEKV ID NR:1, SEKV ID NR:3, SEKV ID NR:9 eller SEKV ID NR:11.

Det er videre beskrevet rekombinant nukleinsyremolekyl, kjennetegnet ved at det omfatter et polynukleotidfragment ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 20.

Oppfinnelsen vedrører også prokaryot eller eukaryot vertscelle, kjennetegnet ved at den er transformert med et polynukleotidfragment eller rekombinant molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 24.

Det er videre beskrevet rekombinanat homo cysteindesulf urase polypeptid, kjennetegnet ved at det utviser homocysteindesulfurase aktivitet og har minst 80% likhet med polypeptidet vist i SEKV ID NR:2, SEKV ID NR:10 eller SEKV ID NR:12.

Oppfinnelsen vedrører også antistoff, kjennetegnet ved at det er immunoreaktivt med et polypeptid eller et fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28.

Det er videre beskrevet anvendelse av et rekombinant polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28 for fremstilling av et medikament for anvendelse i terapi, i cancer terapi, for screening for inhibitorer derav, for å fjerne homocystein, metionin og eller cystein fra en prøve og for å bestemme tilstedeværelse av enzymer og katalysereaksjoner som involverer homocystein, metionin eller cystein som enten substrat eller produkt.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet i lys av følgende eksempler.

Eksempel 1 Konstruksjon av primere anvendt for å klone Trichomonas vaginalis homocysteindesulfurase

Figur 3 viser multippel proteinsekvens oppstilling for cystationin y-lysase fra menneske, rotte og gjær (Lu et al., 1992, Erickson et al., 1990 og Ono et al., 1992 henholdsvis). Regioner med homologi valgt for konstruksjon av degenererte ogligonukleotider for anvendelse som primere i polymerasekjedereaksjoner (PCRs) er uthevet. Den første regionen med homologi valgt for konstruksjon av 5' oligonukleotid-primer var en region hvor sekvensen mellom forskjellige cystation y-lyasemolekyler og er meget homolog. Den andre regionen valgt for konstruksjon av 3' primer var pyridoksal 5'-fosfatat (PLP) bindende domene (A22-G228). Sekvensene til degenererte

oligonukleotider som blir konstruert basert på disse homologe regionene er vist i figur 4. For å lette kloning ble restriksjonsseter for enzymene i Hind III og XO I merket på enden av de to degenererte oligonukleotidene. De to oligonukleotidene ble betegnet Cyst 5' og Cyst 3'. Cyst '5 har en lengde på 31 nukleotider og inneholder 3 inosiner (I) og Cyst 3' er 28 nukleotide i lengde og inneholder 2 inosinresidier. Inosinene ble innført i et antall posisjoner som ville ha inneholdt fire ganger degenerasjon for å redusere den resulterende samlingen av oligonukleotider som er blitt syntetisert. Oligonukleotidene

ble syntetisert ved anvendelse av en Applied Biosystems DNA syntesemaskin iføge standardprotokoller.

Eksempel 2 PCR ved anvendelse av degenererte oligonukleotider

RNA isolasjon

En klonal cellelinje (G3) fra T- vaginalis ble dyrket i modifisert Diamonds medium som tidligere beskrevet, Lockwood et al. (1984). Cellene ble høstet (2300 g i 15 minutter ved 4°C) i sen-fase av veksten (1-2 x 10<6>/ml) og ble vasket to ganger i 0,25 M sukrose. DNA ble isolert ved anvendelse av et nukleon II sett (Scotlab, Coatbridge, Scotland).

Total RNA ble isolert fra T. vaginalis i et enkelt trinn ved anvendelse av kommersiell tilgjengelig TRIZOL (RTM) reagens (tilgjengelig fra Gibco, Paisley, Scotland), som er en monofasisk oppløsning av fenol og guanidinisotiocyanat ifølge forhandlerens instruksjoner.

poly [A]<+> RNA ble isolert fra total RNA for anvendelse som et templat for cDNA syntese. Poly [A]<+> RNA ble isolert ved anvendelse av Poly [A]<+> Quik kolonner, (tilgjengelig fra Strangene, La Jolla, California, USA) ifølge forhandlerens instruksjoner.

Ett mikrogram poly [A]<+> RNA fra T. vaginalis sammen med revers transkriptase ble anvendt for å syntetisere T. vaginalis cDNA første tråd ifølge fremgangsmåter som beskrevet i Sambrook et al (1989). cDNA ble deretter anvendt som et templat i PCR med degenerert oligonukleotider.

Betingelsene for PCR var som følger: opprinnelig denaturering ved 94°C i fire minutter etterfulgt av 30 amplifikasjonssykluser bestående av: 94°C i ett minutt, 42°C i ett minutt og 72°C i ett minutt, etterfulgt av endelig ekstensjonssyklus ved 72°C i fem minutter. Deler av regionene ble elektroforert i en agarosegel (1,5%) sammen med hensiktsmessige kontrollreaksjoner. To PCR produkter ble observert ved farging av agarosegelen, en med omtrent 200 basepar (bp) i størrelse (lavere båndfragment) og et annet med omtrent 250 bp i størrelse (øvre båndfragment).

Ytterligere identiske PCR ble utført for å oppnå tilstrekkelig materiale for kloning.

Eksempel 3 Kloning av amplifiserte PCR produkter

Materiale fra flere PCR reaksjoner (omtrent 1 u.g DNA) ble kombinert sammen og PCR amplifisert DNA ble fenol/kloroformekstrahert, etanol presipitert og resuspendert i H20, for å fjerne kontaminerende nukleotider og Taq polymerase. Amplifisert DNA blir deretter fullstendig spaltet med Hind III og Xho I restriksjoner (restriksjonsseter for disse var blitt omkonstruert på endene av amplifisert DNA ved inklusjon derav ved termini til Cyst 5' og Cyst 3' degenererte oligonukleotider) for å danne "klebrige ender" som vil lette direksjonen kloning. DNA ble renset ytterligere ved elektroforese på en 2% TAE agorosegel etterfulgt av farging med etidiumbromid og visualisering under UV lys med lang bølgelengde. Amplifiserte bånd av interesse (øvre og lavere båndprodukter) ble spaltet ut fra gelen ved anvendelse av et rent skalpellblad, og DNA ble eluert fra agarosegelbiter ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige Spin X kolonne (tilgjengelige fra Costar, Cambridge, MA, USA) ifølge forhandlerens instruksjoner. Spaltet, renset DNA (individuelt øvre bånd og lavere båndprodukter og en kombinasjon av de to) som oppstår fra PCR med degenererte primere, ble deretter kombinert med pBluescript (Stratagene, La Jolla, California, USA), som også var blitt tidligere spaltet med Hind III og Xho I og renset gjennom en 2% TAE agarosegel og eluert ved anvendelse av en spin X kolonne, som før. pBluescript og amplifisert PCR fragmenter med omtrent 200 og 250 bp ble legert i mengder på 200 ng innskudd pluss 200 ng vekor ved anvendelse av Amersham legeringssett (tilgjengelig fra Amersham, Little Chalfort, Bucks, UK), ifølge forhandlerens instruksjoner.

Legeringsreaksjonene ble deretter anvendt for å transformere ultra-kompetente XL1 Blue Escherichia coli celler (tilgjengelige fra Stratagee, La Jolla, California, USA). Omtrent 30-40 ng legert DNA ble anvendt for å transformere kompentente bakterielle celler. Transformeringsblandinger ble sådd ut på LB amp, X-gal, IPTG innholdende skåler og inkubert over natt ved 37°C. Plasmid DNA ble isolert fra hvite bakterielle transformanter ved anvendelse av Wizard plasmid mini-prep prosedyren til Promega (Promega, Madison, Wisconsin, USA) og utsatt for selektiv restriksjonsanalyser for å bekrefte om kloning av amplifisert DNA inn i pBluescript var vellykket.

Transformanter inneholdende klonede PCR produkter ble utsatt for sekvensering og deretter analysering for å bestemme om et genuint fragment av en cystationin y-lyase homolog var blitt amplifisert fra T. vaginalis cDNA.

Eksempel 4 Isolering av fullengde T. vaginalis homocysteindesulfurasegener

To PCR kloner (betegnet cysta 2 og cysta 16) ble anvendt for å isolere korresponderende fullengdegener fra et T. vaginalis AZAP II cDNA bibliotek (Mallinson, D. J., Lockwood, B.C., Coombs, G.H., North, M.J., (1994). Identifikasjon og molekylær kloning av fire cysteinproteniasegener fra patogen protozo Trichomonas vaginalis. J. Gen. Microbiology 140 2725-2735. Totalt 100000 cDNA kloner ble screenet ifølge følgende prosedyre. 100000 bakteriofag ble sådd ut i L-topp agarose, sammen med vertscellene E. coli XL1 blå og bakteriofagplakk ble propagert ved 37°C helt til de akkurat kom bort i hverandre i det bakterielle beddet. Bakteriofagplakk ble deretter overført ved plotting på et Hybond N nylonfilter (tilgjengelig fra Amersham, Little Chalfont, Bucks, UK).

DNA fra bakteriofag ble denaturert in situ og deretter hybridisert med enten cysta 2 eller cysta 16 200 basepar homocysteindesulfurasef ragmenter, radioaktivt merket ved tilfeldig priming.

Primær screening av cDNA biblioteket ved anvendelse av betingelser med høy stringens, 1 t i 0,1 x SSC/0,1% SDS ved 65°C, viste at 25 plakk hybridiserte med cysta 2 probe, mens 18 hybridiserte med cysta 16 probe. Autoradiografifilm som viser positivt hybridiserende plakk ble oppstilt med skåler inneholdende bakteriofag for å muliggjøre at plugger av agarose inneholdende positiv bakteriofag ble fjernet. Pluggene ble plassert i SM buffer og spor av kloroform ved 4°C og fagene ble latt diffundere ut over natt.

Annen runde med bakteriofagrensing ble utført for å identifisere individuelle plakk som hybridiserte under meget stringente betingelser med enten cysta 2 eller cysta 16, 200 basepar radioaktiv probe.

Eksempel 5 Analyser av cysta 2 og cysta 16 hybridiserende kloner

To X kloner som hybridiserte med cysta 2 probe og fem X kloner som hybridiserte med cysta 16 probe ble overført direkte i pBluescript ved anvendelse av F1 hjelper bakteriofagmekanismen (ifølge forhandlerens instruksjoner, Stratagane, La Jolla, Californiai USA, protokoller). Oppfangede plasmider ble deretter analyser ved restriksjonsanalyse for å bestemme størrelsen på klonet innskutt DNA.

Som et resultat av restriksjonsanalysen av plasmidene isolert med cysta 2 eller cysta 16 probene ble to kloner, en cysta 2 hybridiserende (etla, deretter omdefinert til mgl1) og den andre en cysta 16 hybridiserende (ctlp deretter betegnet mgl2), ble valgt for å bli fullstendig sekvensert. Disse to klonene ble valgt fordi de hadde størst innskudd (omtrent 1,2 til 1,3 kilobaser i størrelse) og ble antatt å ha tilstrekkelig størrelse for å kode for en fullengde kopi av et homocysteindesulfurasegen fra T. vaginalis.

Eksempel 6 Sekvensering av to T. vaginalis homocysteindesulfurasegener

Restriksjonskartlegging av hver av de to T. vaginalis homocysteindesulfurasegener ble utført for å muliggjøre subkloning av mindre fragmenter som vil assistere ved oppnåelse av hel nukleotidsekvens til hvert gen.

Sekvensering av de to klonene og deres respektive subkloner ble oppnådd ved anvendelse av Sequenase (<RTM>) quick Denature Plasmid sequencing kit (oppnåelig fra Amersham, Little Chalfont, Bucks, UK) med T7 og T3 primere (tilgjengelig fra Stratagene, LA Jolla, California, USA) ifølge forhandlerens instruksjoner. Fullstendig nukleotidsekvens og antatt aminosyresekvens til første klon (mgl1) og fullstendig nukleotidsekvens og antatt aminosyresekvens til andre klon (mgl2) ble bestemt.

For å oppnå 5' utranslaterte regioner (UTR) til mgll og mgl2 og å bekrefte startkodonene ble 5' reverstranskriptase hurtigamplifikasjon av cDNA endene (RT-RACE) utført ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige 5' RACE sett (tilgjengelig fra Gibco, Paisley, Scotland) ifølge forhandlerens instruksjoner. Både mgll og mgl2 RACE produktene som ble oppnådd var omtrent 250 basepar i størrelse. Mgll og mgl2 RACE produkter ble klonet direkte inn i en pTAg vektor fra ligATor settet (tilgjengelig fra R&D Systems, Minneapolis, USA) ifølge forhandlerens instruksjoner. Dette systemet utnytter det trekket at PCR utført i nærvær av Taq polymerase har et 5' adenosinoverheng koblet på endene til hvilke som helst amplifiserte fragmenter. Systemet letter kloning av PCR produkter inn i en vektor som har et komplementært tymidinresidie overheng.

Restriksjonsanalyser av transformantene viste at 5' RACE produktene har blitt klonet inn i pTAg vektoren. Sekvensering av RACE kloner ble utført på begge trådene ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig -20 primer og M13 revers primer.

Sekvensering av 5' RACE produktet til mgll viste at 5' UTR er meget kort (lengde på 13 nukleotider), men bekreftet startkodonet identifisert fra cDNA sekvensen.

To uavhengige 5' RACE produkter ble oppnådd for mgl2, idet begge klonene hadde ATG startkodon som var fraværende fra kopien av genet isolert fra cDNA biblioteket. Lengre mgl2 RACE klon identifiserte en kortere 5' UTR region med lengde på omtrent 14 nukleotider.

Både mgh og mgl2 5' UTR er vist sammen med respektiv fullstendig cDNA sekvens og antatt aminosyresekvenser til mgh og mgl2 i figurene 1 og 2. "Pileup" analyse (se tabell 1) viste det relativt lave nivået med sekvensidentitet til antatt mgll og mgl2 til tidligere sekvenserte cystationin y-lyaser og at det var usannsynlig at en T. vaginalis cystationin y-lyase var blitt klonet. Dette ble bekreftet ved funnet av at klonede genprodukter ikke har cystationin y-lyaseaktivtet (se tabell 2).

Eksempel 7 Kloning og ekspresjon av histidin-merket homocysteindesulfurase fusjonsprotein

QIA ekspressystem (Qiagen, La Jolla, California, USA) ble anvendt for ekspresjon og rensing av MGL1 og MGL2 polypeptider. Mgh og mgl2 genene ble klonet inn i en pQE vektor som koder for en 6-histidinmarkør ved N eller C terminusen til uttrykt protein. 6-histidinmerket protein ble deretter affinitetsrenset ved anvendelse av et Ni<2+->NTA harpiks (se QIA ekspresshåndbok for detaljer).

Kloning av mgll

Mgl cDNA klonen ble opprettholdt i plasmid pBluescript. Preliminær sekvens-analyse indikerte at T. vaginalis mgh cDNA var blitt klonet inn i pBluescript i revers orientering i forhold til det som er ventet og derfor var direkte subkloning av mgll fra pBluescript til en pQE vektor ikke mulig. For å løse problemene med orientering av mgh cDNA i pBluescript ble en PCR kloningsstrategi anvendt for å muliggjøre at cDNA blir klonet inn i en hensiktsmessig pQE vektor.

Oligonukleotidprimere ble konstruert til 5' og 3' endene av mgh cDNA som innbefattet restriksjonsendonukleoasesetene Ncol og Bglll. Gjennom PCR amplifikasjonsprosessen ble disse to restriksjonssetene om konstruert på endene av mgll DNA, idet deres tilstedeværelse letter kloningen av DNA inn iNcol og Bglll spaltet pQE vektor. Nukleotidsekvensen til de to primerene er vist i figur 5.

pQE 60, en type ATG konstruksjon ble valgt som vektor hvori mgh DNA skulle bli klonet. ATG konstruksjonen muliggjør at uttrykt protein begynner med autentisk ATG kodon. Mgh cDNA koder for et startmetionin og blir derfor betraktet egnet for kloning inn i denne bestemte pQE vektoren (se QIA ekspresshåndbok for detaljer).

pBluescript inneholdende mgh cDNA ble linealisert ved anvendelse av Barn Hl og linealisert DNA ble anvendt som templat for PCR sammen med de to oligonukleotidene vist i figur 5. Komponentene til PCR blandingen er vist nedenfor.

1 |il (10 ng/uJ) pBluescript/mgll Barn Hl linealisert templat

5 ut (100 ng/u-l) 5' Ncol primer

5 ut (100 ng/uJ) 3' Bglll primer

5 jil 10x pfu buffer (Stratagene, La Jolla, California, USA)

2,5 ul 5 mm hver av dAPT, dGTP, dCTP, dTTP

1 ul pfu polymerase ( en versjon for korrekturlesning av Taq tilgjengelig fra

Stratagene, La Jolla, California, USA)

30,5 ul vann

Amplifikasjon av mgll DNA ble utført ved anvendelse av betingelsene angitt nedenfor.

94°C i fem minutter etterfulgt av 30 cykluser med

94°C i ett minutt, 42°C i ett minutt og 72°C i ett minutt og til slutt en enkelt ekstensjonsreaksjon med

72°C i fem minutter

Etter amplifikasjon ved PCR ble kontaminerende nukleotider og polymerase fjernet fra mgh DNA ved anvendelse av Magic PCR Wizard preps (Promega, Madison, Wisconsin, USA) ifølge forhandlerens instruksjoner. Opprenset mgh DNA som nå har et Ncol sete ved dets 5' ende og et Bglll sete ved dets 3' ende ble spaltet med disse to enzymene som pQE60 vektoren. Spaltet pQE vektor og mgh DNA ble legert og intakt vektor inneholdende innskudd ble transformert inn i M15 [pREP4] celler, se QIAekspress håndbok for detaljer. pQE 60 plasmid inneholdende mgll DNA ble deretter anvendt for testekspresjon av rekombinant protein ifølge QIAekspresshåndbok.

Kloning av mgl2

mgl2 cDNA innbefattet i pBluescript ble subklonet direkte inn i pQE30. pBluescript inneholdende mgl2 DNA ble spaltet med Barn Hl og Xhol og dette spaltede innskuddet ble legert med pQE30 vektor som var blitt spaltet med Barn Hl og Sali. Intakt pQE30 vektor og innskudd ble transformert inn i M15 pREP4 celler. pQE30 vektor inneholdende mgl2 DNA ble deretter anvendt for testekspresjon av et rekombinant protein ifølge QIA ekspresshåndboken.

pQE plasmider inneholdende enten mgh eller mgl2 ble transformert inn i E. colistamme og enkeltkolonier ble oppnådd. En enkeltkoloni ble inokulert inn i 20 ml LB-kraft inneholdende 100 ug/ml ampicillin og 25 u.g/ml kanamycin dyrket over natt ved 37°C.

En liter LB-kraft ble deretter inokulert med hele over natt-kulturen og kulturen ble dyrket ved 37°C helt til A750 nådde 0,8 (omtrent 2-3 timer). IPTG ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mm og dyrkningen ble fortsatt ved 37°C i ytterligere to og en halv time.

Cellene ble høstet ved sentrifugering og frosset ved -70°C.

Uttrykt protein ble renset ved FPLC ved anvendelse av et metallkelaterings-harpiks, så som Ni-NTA superflow, ifølge protokoll 5 i Qiagen QIAekspressprotokollene.

Protein-innholdende fraksjoner oppnådd ved FPLC ble analysert ved SDS-PAGE og de med rekombinant homocysteindesulfurase ble kombinert og dialysert over natt mot sonikeringsbuffer (50 mm Na-fosfat pH 8,0, 300 mm NaCI) inneholdende 10% glycerol før lagring ved -20°C.

Eksempel 8 Modifisert prosedyre for rensing av rekombinant T. vaginalis homocystein desulfurase

Prosedyrene beskrevet nedenfor omfatter vekst av bakterier, ekspresjon av rekombinant enzym og FPLC/Ni -NTA rensing. Detaljer angående alle buffere, medier osv. er gitt i vedlegget. Ytterligere detaljer angående vektor, bakteriell vertsstamme og protokoller kan finnes med referanse til QIAGEN protein ekspresjonshåndboken.

Dag 1

5 |il av tilført glycerolstammoppløsning av M15[pREP4] celler (inneholdende pQE30/T. vaginalis cDNA) på Luria-Bertani (LB) agarskåler inneholdende ampicillin (100 (ig/ml) og kanamycin (25 jig/ml) strykes ut. Oppvoksing over natt ved 37°C. (Kolonier på LB skålene kan bli lagret ved 4°C i opptil to uker).

Dag 2

I en 500 ml flaske inokuler 50 ml LB kraft inneholdende ampicillin og kanamycin (sluttkonsentrasjon som ovenfor) med en enkeltkoloni. La dette vokse over natt ved 37°C med risting - 200 rpm i en orbitalrister.

Dag 3

I en to liter flaske, inokuler 400 ml frisk LB kraft pluss ampicillin og kanamycin med 50 ml over natt kultur. - Dyrk kulturen i 1,75 timer med risting (200 rpm) ved 37°C. Induser cellene for å uttrykke homocysteindesulfurase ved tilsetning av steril IPTG (for å tilveiebringe en sluttkonsentrasjon på 0,2 mm) og dyrk i ytterligere 2,25 timer med risting ved 37°C.

- Pelleter cellene ved sentrifugering med 8000 g ved 4°C i 10-15 minutter.

- Resuspender pelleten i 5 ml sonikeringsbuffer og overfør til et 15 ml Falconrør, tilsett pyridoksal 5' fosfat (PLP) til en sluttkonsetrasjon på 20 jxm. Frys resuspenderte celler ved -70°C helt til de er nødvendige for rensing.

N.B. For å undersøke at ekspresjonen har virket blir 200 (il prøver av bakteriell kultur fjernet a) like før tilsetning av IPTG og b) etter tilsetning av IPTG, i slutten av 2,25 timer induksjonsperioden. Cellene blir pelletert (13000 rmp/5 min), resuspendert i 80 (il Laemmlis prøvebuffer, kokt i fem minutter og en 10 |il alikvot kjørt på en 12,5% SDS-PAGE gel for å bekrefte ekspresjon av homocysteindesulfurase etter induksjon ved IPTG. (Alternativt kan et større volum av ikke induserte og induserte celler (1 ml) bli tatt prøver av, lysert ved sonikering og en homocysteindesulfuraseaktivitetanalyse kan utføres).

Ekvilibrer Ni-NTA harpikskolonnen over natt med sonikeringsbuffer. Vanligvis kan 8 ml pakkevolum av harpiks/kolonne bli anvendt.

Dag 4

Affinitetsrensing av His-merket enzym på Ni-NTA harpiks ved FPLC.

1. Flytt frosne celler fra -70°C fryseren, tin ved plassering av røret i en beholder med kaldt vann.

2. Lyser cellene ved sonikering.

3. Overfør det sonikerte materialet til et 50 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 10000 g i 30 minutter ved 4°C. Det er nyttig å undersøke at bakteriene er blitt tilstrekkelig lysert, spesielt når man først anvender en sonikator, ved sammenligning av pellet og supernatantfraksjonene ved SDS-PAGE. Homocysteindesulfurase er meget oppløselig og 95% bør finnes i den oppløselige fraksjonen. 4. Etter sentrifugering blir supernatanten (som inneholder oppløselig enzym) (= 5-6 ml total volum) filtrert gjennom et 0,22 jim Millipore filter direkte inn i en luerlock sprøyte kobles til primingdyse (injeksjonsport) til FPLC og rensingen begynner.

Bemerk: Den oppførte rensingsprosedyren ble utført på et Waters FPLC system inkludert en Waters 600S kontrollinnretning og Waters 626 pump. De grunnleggende trinnene er: prøveapplikasjon (prøven blir automatisk trukket fra sprøyten på kolonnen når primingdysen blir satt på "injeksjon"). Enzymet kan sees og bli bundet til Ni-NTA harpiksen som et meget sterkt gult bånd.

1. kort vask med sonikeringsbuffer.

2. lengre vask med vaskebuffer.

3. eluering av enzym ved anvendelse av den lineære gradient 0-500 mm imidazol (100 % vaskebuffer til 100% elueringsbuffer [ink. 500 mm imidazol]).

Bemerk: For fullstendig detaljer angående FPLC kjørebetingelsene

(strømningsrater, varighet til vaskingene, gradienter osv.) se vedlegg.

5. Proteinkonsentrasjonen i kolonneutstrømningen blir registrert kontinuerlig av en UV detektor innstilt på 280 nm, og fraksjonene blir samlet i løpet av prosedyren. 6. Fraksjoner inneholdende rekombinant enzym (lett identifisert ved deres sterke gul-grønne farge) blir slått sammen og dialysert mot en liter dialysebuffer over natt (med flere skift om nødvendig) ved 4°C (for å fjerne imidazol). 7. En liten prøve (= 50 av dialyserrt enzympreparat blir tatt for å bestemme proteininnholdet ved anvendelse av BCA prosedyren (Pierce Chemical Company BCA [Bicinchoninsyre] reagenskit). Gjenværende preparat blir kombinert 1:1 med stabilisasjonsbuffer, og lagret i 1 ml alikvoter ved -20°C.

VEDLEGG

Reagenser og buffere som er nødvendige.

Luria - Bertani medium ( LB medium)

For 1 liter:

Oppløs følgende i 950 ml H20:

Juster pH til 7,0 (om nødvendig). Tilsett dest. H20 til 1 liter. Steriliser ved autoklavering i 20 minutter ved 15 lb/sq.in. (For LB agar, innbefatt 15 g bactoagar pr. liter).

Antibiotika

Ampicillin (Sigma A-9518)

(100 mg/ml stamoppløsning i destillert H20) - sterilisert ved filtrering gjennom et 0,2 u.m Millipore filter, lagret som 1 ml alikvoter ved -20°C.

Kanamycin (Sigma K-4000)

(25 mg/ml stamoppløsning i destillert H20) - sterilisert og lagret som ovenfor.

IPTG ( isoproDvl- B- D- tioaalactoDvranoside: Gibco BRL 15529- 019)

1 M stamoppløsning (i destillert H20) - filtersterilisert (0,2 u.m filter), lagret i 1 ml alikvoter ved -20°C.

Pvridoksal 5'- fosfat ( PLP; Sigma P- 9255)

1 mm stamoppløsning i destillert H20. Lag ny hver gang (for tilsetning til resuspenderte celler).

Ni- NTA superflowharpiks ( QIAGEN 30430)

Sonikeringsbuffer: 50 mm natriumfosfatbuffer. pH 8. 0. 300 mm Nacl

17,53 gNaCI

Tilsett destillert H20 til 1 liter.

Vaskebuffer: 50 mm natriumfosfatbuffer, pH 6. 0. 200 mm Nacl, 10% glvcerol

17,53 gNaCI

100 ml glycerol

Tilsett destillert H20 til 1 liter.

Eluerin<q>sbuffer: vaskebuffer inneholdende 500 mm imidazol

Oppløs 17,0 g imidazol i 500 ml vaskebuffer.

(Imidazol - Sigma 1-0125)

Dialvsebuffer: 100 mm natriumfosfatbuffer. pH 6. 5.

300 mm. 20% alvcerol. 20 um PLP. 15 am ditiotreitol

17,53 gNaCI

200 ml glycerol

2 ml 10 mm PLP stamoppløsning

15 ul1 M ditiotreitolstamoppløsning (ditiotreitol - Sigma D-9779)

Stabliseringsbuffer: 100 mm natriumfosfatbuffer pH

6. 5. 80% alvcerol. 40 um PLP. 30 um DTT

For 10 ml: 1,96 ml 100 mm natriumfosfatbuffer, pH 6,5 8 ml glycerol, 40 ul 10 mm

PLP, 3 ul 100 mm DTT

Natriumazid ( Sigma - S- 2002) : 0. 05% oppløsning

Pump på Ni-NTA kolonne etter anvendelse for å forhindre bakteriell vekst (lagre kolonnen i azid ved 4°C mellom rensingene).

Lag 10% (w/v) stamoppløsning i destillert H20 (lagre ved 4°C). Fortynn for å tilveiebringe 0,05% arbeidskonsentrasjon.

Alle bufferene anvendt på FPLC bør bli avgasset før bruk. Avgassing oppnås ved filtrering av buffer gjennom 0,2 um filter ved anvendelse av Millipore vakuumfilterenhet.

Homocysteindesulfuraseaktivitetsanalyse anvendt for å registrere rensing

Analysen måler produksjon av H2S; H2S blir oppfanget av blyacetatdannende kolloidablysulfid (en mørk brun farget forbindelse) som har maksimal absorbanse ved 360 nm.

Reagenser

Analysebuffer: 100 mm imidazolbuffer, pH 6,5

D,L-homocystein (Sigma H-4628); stamoppløsning 100 mm (dannet i analysebuffer).

Endelig konsentrasjon i analyse = 40 mm (400 ul stamoppløsning)

Blyacetat (BDH 10142); stamoppløsning 3,3 mm (dannet i destillert H20). Endelig konsentrasjon i analyse = 0,33 mm (100 ul stamoppløsning).

Rekombinant enzym: som et utgangspunkt, anvend 10 ul av en 100 x fortynning av ren enzymprep. (Fortynn enzymprep i 100 mm natriumfosfatbuffer, pH 6,5).

Sluttvolum til analyseblandingen ble dannet til 1,0 ml med analysebuffer.

Kjør kontrollanalyseblandinger: 1) minus enzum, 2) minus substrat.

Beregning av enzymaktivitet

Anvend molar ekstinksjonskoeffisient for blysulfid på 5205 M"<1> cm"<1>.

forandring i abS(eksp) - forandring i abS(kontroii) x10<6>

tid x proteinkonsentrasjon x 5205 M"<1> cm'<1> x 10<3>

= mol min'<1> mg prot"<1>

Detaljer angående FPLC programmet for rensing av rekombinant T. vaginalis MGL2

Eksempel 9 Homocysteinanalyser

ANALYSE I

Homocysteinnivåene ble målt ved anvendelse av rekombinant homocysteindesulfurase fremstilt ifølge tidligere eksempler i 66 mm natriumfosfatbuffer pH 7,5, 0,33 mm blyacetet.

Homocysteindesulfurase katalyserer omdanning av homocystein til a-ketobutyrat, ammoniakk og hydrogensulfid. Hydrogensulfid reagerer med blyacetat for å produsere blysulfid som kan bli detektert spektrofotometrisk ved 360 nm (Molar ekstinksjonskoeffisient = 5205M"<1>cm'<1>).

Analysereagenser

Analysen ble inkubert ved 20°C i 0-120 minutter for å muliggjøre utvikling av farge. Homocysteinnivåene ble deretter bestemt ved måling av absorbansen ved 360 nm.

Resultater

ANALYSE II

Analyseprinsipp

Ditiotreitol (DTT) blir innledningsvis anvendt for å nedbryte homocystein til homocystein og å frigjøre proteinbundet homocyst (e) in. Homocystein blir deretter nedbrutt til a-ketobutyrat, NH3 og H2S ved virkningen av homocysteindesulfurase. Et spesifikt laktat dehydrogenaseisoenzym blir deretter anvendt for å omdanne a-ketobutyrat til a-hydroksybutyrat med samtidig frigjøring av NAD<+>. Etter fjerning av eventuell NADH ved redusering av pH ved anvendelse av HCI blir NAD tilført i en cykliserings-mekanisme som involverer etanol, alkoholdehydrogenase, diaforase og tetrazoliumsalter for å danne et farget produkt som kan bli målt fotometrisk. Økning i farge tilsvarer konsentrasjonen av homocystein i prøven.

Utførelse av analysen

Trinn 1: Bland 100 ul prøve (for eksempel citratplasma) med 500 ul

0,1 mol/1 HEPES, 0,1 mmol/1 NADH, 20000 umol/min/l homocysteindesulfurase, 50000 U/l Lactatdehydrogenase og 0,05 mol/l ditiotreitol, pH 8,0 inn i en kuvette. Inkuber ved 77°C

i 20 minutter.

Trinn 2: Tilsett 500 ul 1 mol/1 HCI, 0,55% (v/v) Nonidet P40, 1x10"<1> mol/

I nitrobluetetrazolium (NBT). Inkuber ved 37°C i fem minutter.

Trinn 3: Tilsett 500 ul tris(hydroksymetylaminometan) (TRIS), 1 mol/l

etanol etterfulgt av 50 ul 20000 U/l alkoholdehydrogenase,

1000 U/l diaforase.

Mål økning i absorbanse ved 527 nm i fem minutter etter tilsetning av reagens inneholdende alkoholdehydrogenase.

Utførelse av analyse

i) standardkurve

En typisk standardkurve er vist i tabellen nedenfor:

Stanardkurve ble dannet ved tilføring av homocystein til serumet. Bakgrunnssignalet ble delvis forårsaket av endogene nivåer av homocystein.

ii) Sensitivitet

Det er klart mulig å detektere konsentrasjoner av < 5 umol/l homocystein.

iii) Oppnåelse

Homocystein ble ført inn i plasma og oppnåelsen bestemt:

iv) Linearitet

Følgende tabell illustrerer lineariteten til responsen:

En pasientprøve (plasma) ble fortynnet ved anvendelse av ovennevnte mengder saltvann og målt signal sammenlignet med teoretisk signal.

v) Kryssreaktivitet

Følgende tabell illustrerer kryssreaktiviteten til analysen med metionin og cystein:

Homocystein, metionin og cystein ble ført inn i plasma og signalet målt. Ingen kryssreaktivitet hverken cystein eller metionin ble observert opp til nivået på 200 umol/l.

Eksempel 10 Sete-rettet mutagenese av rekombinant MGL1 og MGL2

Produksjonen av mutert rMGL1 (C113G) og rMGL2 (C116G) ble oppnådd ved anvendelse av PCR-basert QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene). Dobbel-trådede mgll og mgl2 cDNA (i enten p-Bluescript eller pQE30/60 ekspresjonsvektorer) ble anvendt som templater. Mutagenese ble utført ved anvendelse av et par oligonukleotidprimere komplementære med motsatte tråder av cDNA klonene, hver inneholdende en punktmutasjon for å omdanne de respektive cysteinkodonene (TGC) til glycinkodoner (GGC), som følger: 1) 5'- TGCCTTTATGGCGGCACACATGCTCTCT -3'; 2) 5'-AAGAGAGCATGTGTGCCGCCATAAAGG -3'. Etter PCR-mediert applikasjon av muterte cDNA ble opprinnelig templat cDNA/vektorer selektivt spaltet ved anvendelse av Dpn-I endonuklease. cDNA klonene inneholdende ønskede mutasjoner blir identifisert ved sekvensering på begge tråder ved anvendelse av genspesifikke oligonukletid-primere. cDNA mutert i p-Bluescript ble subklonet inn i pQE vektorer før ekspresjon. Produksjon og rensing av rekombinant muterte MGL1 og MGL2 ble utført som tidligere beskrevet.

Eksempel 11 Enzymatiske studier av rekombinant MGL1, og MGL2, og mutert MGL1 (C113G) og MGL2 (C116G).

Metionin y-lyase på forhånd renset fra T.vaginalis har aktivitet overfor et antall substrater, inkludert metionin, homocystein og S-adenosylmetionin, men har ingen aktivitet overfor cystationin (Lockwood og Coombs, 1991). For å vurdere likheten mellom MGL1 og MGL2 og renset nativmetionin y-lyase, ble enzymaktivitetene til rekombinante enzymer analysert (tabell 2). rMGL1 og rMGL2 ble funnet å ha meget høy aktivitet overfor homocystein, og også å katabolisere metionin, cystein og O-acetylserin hurtig. De to rekombinante enzymene hadde ikke evne til å anvende cystationin som et substrat. Kinetiske parametere til to rekombinante proteiner ble også bestemt for homocystein og cystein (tabell 3). Tilsynelatende Km til rMGL1 for to substrater ble høyere enn de for rMGL2, idet den største forskjellen er for metionin.

Etter produksjon og rensing av mutert rMGL1 (C113G) og rMGL2 (C116G), ble deres enzymatiske aktiviteter sammenlignet med de til tilsvarende vill-type enzyme

(tabell 2). Under optimale betingelser var aktivitetene til rMGL1 (C113G) overfor alle substrater betraktelig lavere enn de til vill-type rMGL1. rMGL1 (C116G) hadde også lavere aktiviteter overfor homocystein og metionin enn vill-type rMGL2, men det er overraskende at aktiviteten til mutert enzym overfor cystein og O-acetyl-L-serin ble øket. Ingen av de muterte enzymene utviste aktivitet overfor cystationin.

Sammenlignbare kinetiske analyser av muterte og vill-type enzym med hensyn på katabolisme av homocystein og cystein ble utført (tabell 3). De noe høyere Km og betydelig lavere Vmax verdiene til rMGL1 (C113G) sammenlignet med de til vill-type rMGL1 tyder på redusert substratbindingseffektivitet til dette muterte enzymet. Til kontrast til dette var tilsynelatende Km til rMGL2 (C116G) for cystein betraktelig lavere enn for rMGL2, og dette korrolerer med den forsterkede aktiviteten (høyere Vmax) til mutert enzym overfor et substrat. Det er uventet at Km til rMGL2 (C116G) for homocystein også var meget redusert i forhold til den til vill-typen enzym, til tross for betydelig lavere Vmax til muterte enzym overfor dette substratet.

Aktiviteter (i urnol min'<1> mg protein) er gjennomsnittlig ± S.D. fra antallet eksperimenter angitt i parantesene. Aktivtet overfor homocystein og cystein ble analysert ved registrering av hydrogensulfidproduksjonen ved anvendelse av standardprosedyre og aktivitet overfor andre substrater ble målt via stanard oc-ketosyreproduksjonsanalyse. N.D., aktivitet ikke detekterbar (<0,04 urnol min"<1> mg protein"<1>).

Minst 10 forskjellige substratkonsentrasjoner ble anvendt, med minst tre replikatanalyser.

'mM, 2umol min"<1> mg protein'<1>.

REFERANSER

1. Ueland, P.M. (1992) Plasma homocystein and cardiovascular disease. In: Athersclerotic cardiovascular disease (Francis, R.N. ed), pp. 183-230. Marcel Decker, New York. 2. Kluitmans, L.A.J, et al., (1996) Molecular genetic analysis of mild hyperhomocysteinemia: A common mutation in the methylenetetrahydrofolat reductase gene is a genetic risk factor for cardiovascular disease. AM.J. Hum. Genet. 58, 35. 3. Cravo, M.L et al. (1996) Hyperhomocysteinemia in chronic alcoholism: correlation with folate, vitamin B-12 and vitamin B-6 status. Am. J. Clin. Nutr. 63, 220. 4. Bostom, A.G. et al (1996) High dose B-vitamin treatment of hyperhomocysteinemia in dialysis patiens, Kidney International 49,147. 5. Steegers-Theunissen, R.P.M. (1992) Hyperhomocysteinaemia and recurrent spontaneous abortion or abruptioplacentae. Lancent 339,1122. 6. Mudd, S.H. (1989) Disorders of transsulphuration. In: The metabolic basis of inherited disease (Scriver, CR. ed.) pp. 693-734. McGraw-Hill. New York. 7. te Poele-Pothoff, M.T.W.B. et al (1995) Three different methods for the determination of total homocysteine in plasma. Ann.Clin.Biochem. 32, 218. 8. Hori, H., Takabayashi, K., Orvis, L, Carson, D.A., Nobori, T., (1996) Gene cloning and characterisation of Pseudomonas putida L-metionine-alpha-deamino-gamma-mercaptomethan-lyase. Cancer Reaserch 56 No. 9 pp 2116-2122. 9. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, A laboratory manul (2end ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press. 10. Ono, B.I., Tanaka, K., Natio, K., Heike, C, Shinoda, S., Yamamoto, S., Ohmori, S., Oshima, T. and Toh-E, A. (1992) Cloning and characterization of the CYS3 gene of Saccharaomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology 174, 3339-3347. 11. Lu, Y., 0'Dowd, B.F., Orrego, H and Israel, Y. (1992) Cloning and nucleotide sequence of human liver cDNA encoding for cystathionine y-lyase. Biochemical and Biophysical Research Communications 189, 749-758. 12. Lockwood, B.C. and Coombs, G.H. (1991) Purification and characterisation of methionine y-lyase from Trichomonas vaginalis. Biochemical Journal. 279, 675-682. 13. Erickson, P.F., Maxwell, I.H., Su, L.J., Baumann, M. and Glode, LM. (1990) Sequence of cDNA for cystathionine y-lyase and comparison of deduced amino acid sequence with related Esherichia coli enzymes. Biochemical Journal 269, 335-340. 14. Lockwood, B.C, North, M.J. and Coombs, G.H. (1984) Trichomonas vaginalis, Tritrichomonas foetus and Trichomitus Batrachorum: Comparative proteolytic activity. Experimental Parasitology 58, 245-253.

Claims (38)

1. Fremgangsmåte for analysering av homocystein i en prøve, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) kontakting av prøven med et enzym som katalyserer degraderingen av homocystein for å frigjøre reaksjonsproduktene: a-ketobutyrat, hydrogensulfid og ammoniakk, og b) bestemmelse av hvilke som helst av nevnte reaksjonsprodukter dannet ved enzymdegradering av homocystein av nevnte enzym.

2. Fremgangsmåte for analysering av homocystein ifølge krav 1, karakterisert ved at enzymet er homocysteindesulfurase.

3. Fremgangsmåte for analysering av homocystein ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at homocysteindesulfurase er en rekombinant protozo homocysteindesulfurase som utviser homocysteindesulfuraseaktivitet.

4. Fremgangsmåte for analysering av homocystein ifølge krav 3, karakterisert ved at rekombinant protozo homocysteindesulfurase er en homocysteindesulfurase som vist i SEKV ID NR:2, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:10 eller SEKV IDNR:12.

5. Fremgangsmåte for analysering av homocystein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved a t et av nevnte reaksjonsprodukter er a-ketoburyrat og et nivå av a-ketobutyrat bestemmes.

6. Fremgangsmåte for analysering av homocystein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at nevnte reaksjonsprodukter er hydrogensulfid og et nivå av hydrogensulfid bestemmes.

7. Fremgangsmåte for analysering av homocystein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at nevnte reaksjonsprodukt er ammoniakk og et nivå av ammoniakk bestemmes.

8. Fremgangsmåte for analysering av homocystein ifølge krav 5, karakterisert ved at nivået av a-ketobutyrat bestemmes ved omsetning av a-ketobutyrat med NADH og laktat dehydrogenase eller puryvat dehydrogenase for å omdanne a-ketobutyrat til et a-hydroksybutyrat med dannelsen av NAD<+> og bestemmelsen av nivået av NAD<+>.

9. Fremgangsmåte for analysering av homocystein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte er følsomt nok for å detektere en konsentrasjon på <5umol/l homocystein.

10. Fremgangsmåte for analysering av en analytt som er omdannbar til homocystein, karakterisert ved at den omfatter først omdanning av analytten til homocystein og deretter estimering av homocystein produsert ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av de foregående krav.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at analytten er homocystin.

12. Fremgangsmåte for analysering av metionin, cystein eller o-acetyl-L-serin i en prøve, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) kontakting av prøven med en protozo homocysteindesulfurase som har evne til å degradere metionin til ammoniakk, metanetiol og a-ketobutyrat; cystein til ammoniakk, hydrogensulfid og pyruvat; og o-acetyl-L-serin til ammoniakk og pyruvat; og b) bestemmelse av reaksjonsprodukt(er) dannet ved enzymdegradering av metionin, cystein eller o-acetyl-L-serin.

13. Sett for diagnostisering av in vitro bestemmelse av et homocysteinnivå i en prøve, karakterisert ved at settet omfatter: a) et enzym som katalyserer degraderingen av homocystein for å frigjøre reaksjonsprodukter: a-ketobutyrat, hydrogensulfid og ammoniakk, og b) midler for å muliggjøre bestemmelse av hvilke som helst av nevnte reaksjonsprodukter dannet ved enzymdegraderingen av homocystein til nevnte enzym.

14. Sett for diagnostisering av in vitro bestemmelse av et homocysteinnivå i en prøve ifølge krav 13, karakterisert ved at enzymet er homocysteindesulfurase.

15. Sett for diagnostisering av in vitro bestemmelse av et homocysteinnivå i en prøve ifølge krav 14, karakterisert ved at homocysteindesulfurase er en rekombinant protozo homocysteindesulfurase som utviser homocysteindesulfurase aktivitet.

16. Sett for diagnostisering av in vitro bestemmelse av et homocysteinnivå i en prøve ifølge krav 15, karakterisert ved at den rekombinante protozo homocysteindesulfurasen er en homocysteindesulfurase som har minst 80% likhet med polypeptidet vist i SEKV ID NR:2, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:10 eller SEKV ID NR:12.

17. Polynukleotidfragment, karakterisert ved at ved at det koder for en homocysteindesulfurase som har minst 80% likhet med fragmentet vist i SEKV ID NR:1, SEKV ID NR:3, SEKV ID NR:9 eller SEKV ID NR:11.

18. Polynukleotidfragment ifølge krav 17, karakterisert ved at nevnte fragment er som vist i SEKV ID NR:1, SEKV ID NR:3, SEKV ID NR:9 eller SEKV ID NR:11.

19. Polynukleotidfragment ifølge hvilke som helst av kravene 17 eller 18, karakterisert ved at polynukleotidf ragmentet koder for et polypeptid som har en amminosyresekvens som vist i SEKV ID NR:2, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:10 eller SEKVIDNR:12.

20. Polynukleotidfragment ifølge krav 17, karakterisert ved a t det er et polynukleotidfragment som er det samme som polynukleotidfragmentet vist i SEKV ID NR:1, SEKV ID NR:3, SEKV ID NR:9 eller SEKV ID NR:11.

21. Rekombinant nukleinsyremolekyl, karakterisert ved at det omfatter et polynukleotidfragment ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 20.

22. Rekombinant nukleinsyremolekyl ifølge krav 21,karakterisert ved at det rekombinante nukleinsyremolekylet omfatter regulatoriske kontrollsekvenser som er operabelt koblet til nevnte polynukleotidfragment for kontrahering av ekspresjonen av nevnte polynukleotidfragment.

23. Rekombinant nukleinsyremolekyl ifølge hvilket som helst av kravene 21 og 22, k arakterisert ved at det rekombinante nukleinsyremolekylet er et plasmid.

24. Rekombinant nukleinsyremolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 21 og 22, karakterisert ved at det rekombinante nukleinsyremolekylet er avledet fra en vi ral vektor.

25. Prokaryot eller eukaryot vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med et polynukleotidfragment eller rekombinant molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 24.

26. Rekombinant homocysteindesulfurase polypeptid, karakterisert ved a t det utviser homocysteindesulfurase aktivitet og har minst 80% likhet med polypeptidet vist i SEKV ID NR:2, SEKV ID NR:10 eller SEKV ID NR:12.

27. Rekombinant Trichomonas vaginalis homocysteindesulfurase polypeptid ifølge krav 26, karakterisert ved a t det utviser homocysteindesulfurase aktivitet og har en aminosyresekvens som vist i SEKV ID NR:2, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR: 10 eller SEKV ID NR: 12 eller funksjonelt aktivt derivat derav.

28. Rekombinant homocysteindesulfurase polypeptid ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte polypeptid er som vist i SEKV ID NR:2, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:10 eller SEKV ID NR:12.

29. Antistoff, karakterisert ved at det er immunoreaktivt med et polypeptid eller et fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28.

30. Polynukleotidfragment ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 20, karakterisert ved a t det er for anvendelse i terapi.

31. Rekombinant nukleinsyremolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 21 til 24, k a r a k t e r i s e r t ved a t det er for anvendelse i terapi.

32. Rekombinant protozo homocysteindesulfurase ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28, karakterisert ved a t det er for anvendelse i terapi.

33. Anvendelse av et rekombinant polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28 for fremstilling av et medikament for anvendelse i terapi.

34. Anvendelse av et rekombinant polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28 for fremstilling av et medikament for anvendelse i cancer terapi.

35. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et polypeptid eller et derivat derav ifølge kravene 26 og 28 eller et polynukleotidfragment ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 20, samt en farmasøytisk akseptabel bærer.

36. Anvendelse av et rekombinant polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28 for screening for inhibitorer derav.

37. Anvendelse av et rekombinant polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28 for å fjerne homocystein, metionin og/eller cystein fra en prøve.

38. Anvendelse av et rekombinant polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 26 og 28 for å bestemme tilstedeværelse av enzymer og katalysereaksjoner som involverer homocystein, metionin eller cystein som enten substrat eller produkt.