JP4426725B2 - ホモシステイン測定法 - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、１９９８年１１月１２日に提出された、米国仮特許出願第６０／１０８，０９９号の恩典を請求する。
発明の背景
血漿または血清などの体液中の総ホモシステイン濃度は、疾患の重要なマーカーである。例えば、ホモシステイン定量化は、心臓血管疾患の重要なリスク指標となる可能性があり、コバラミンおよび葉酸欠乏の高感度マーカーである可能性があり、そしてホモシスチン尿症として知られる代謝中の先天的な誤りを診断するのに用いられる可能性がある。ホモシステイン定量化はまた、妊娠女性において先天性欠損症を、そして老人において認識障害を評価するのに有用であるとも報告されてきている。Ｆｒａｎｔｚｅｎら， Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｔａｌ Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｏｒ Ｓｅｒｕｍ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：２， ３１１−３１６（１９９８）を参照されたい。現在のアッセイ、例えばＨＰＬＣまたはＧＣ−ＭＳを用いるものは、高価であり、そして非常に熟練した技術スタッフを必要とする。非常に熟練した人員または複雑な分析化学装置を必要とせず行うことが可能な、効率的でそして正確なアッセイが必要とされてきている。
発明の概要
本発明は、患者の血漿、血清または他の体液に見られるホモシステインに関するアッセイを提供する。本アッセイにしたがい、酵素シスタチオニンβ−シンターゼを用い、ホモシステイン含有試料を縮合し、シスタチオニンを形成する。このシスタチオニンを別の酵素、シスタチオニンβ−リアーゼにさらし、ピルビン酸およびアンモニア、並びにホモシステインを遊離させる。患者試料中の総ホモシステイン濃度は、遊離されたピルビン酸および／またはアンモニアの検出および相関に基づき、測定することが可能である。
【０００２】
本発明の別の態様において、患者試料を、試料中に遊離ホモシステインを産生するのに適した量のジチオスレイトールまたは他の還元剤による処理にさらす。
さらに別の態様において、酵素シスタチオニンβ−シンターゼおよびシスタチオニンβ−リアーゼは、本発明のアッセイにおけるその機能を最適にするため、ビタミンＢ６のリン酸化型で処理してもよい。
【０００３】
本発明のさらに別の態様は、試料中のホモシステイン濃度を測定するためのキットであって、酵素シスタチオニンβ−シンターゼおよびシスタチオニンβ−リアーゼ、並びにセリンを含む、前記キットである。こうしたキットは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤、およびピリドキサール５’リン酸（ＰＬＰ）などの酵素補因子をさらに含んでもよい。
発明の詳細な説明
血漿、血清または他の体液由来の総血漿ホモシステインの測定は、酵素シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）（酵素分類[ＥＣ]４．２．１．２２）を用い、ベータ置換反応により、セリンと共にホモシステインを縮合し、シスタチオニンを形成することにより、行うことが可能である。シスタチオニンはその後、シスタチオニンβ−リアーゼ（ＣＢＬ）（ＥＣ ４．４．１．８）により触媒され、ピルビン酸および／またはアンモニアを遊離させ、そしてホモシステインを再生するベータ脱離反応を経る。再生されたホモシステインはその後、ＣＢＳ（ＥＣ ４．２．１．２２）により、自由に別のセリン分子と縮合し、そして再びシスタチオニンを形成し、そして再びＣＢＬ（ＥＣ ４．４．１．８）を用いたベータ脱離によりピルビン酸およびアンモニアを遊離させるであろう。
【０００４】
この再循環は、血漿または血清試料中の総ホモシステイン濃度により決定される速度で続くであろう。血漿および血清に見られるホモシステイン濃度が低ければ、反応速度は遅く、そしてホモシステイン濃度に対し非常に直線関係に近いであろう。記載される２つの酵素活性に関するミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ）は、天然に１０^-3モル／リットルの範囲で存在し、一方、血漿および血清は、１０^-5モル／リットルの範囲である傾向がある。これは、反応速度および血漿濃度の間のゆっくりした直線相関を指示する。固定時間長に渡り、ピルビン酸および／またはアンモニアの産生を測定することにより、反応速度を測定し、そして試料中の総ホモシステイン濃度に関連付けることが可能である。
【０００５】
商業的に入手可能な標準的な診断試薬法により、アンモニアおよび／またはピルビン酸の存在を測定する、多くの方法がある。ホモシステインは血漿中に非常に低い濃度で出現するが、例えば、単数または複数の、商業的に入手可能な選択された方法により、正確に測定されるように、適切な量のピルビン酸および／またはアンモニアが産生されるまで、セリンの存在下で、反応を反復することにより、感受性を克服することが可能である。
【０００６】
本発明のアッセイは、酵素反応を再循環させることなく行うことが可能であることが、当業者に認識されるであろう。これは、適切な発色団、呈色アッセイ試薬の選択、またはアンモニアおよび／またはピルビン酸を測定する高感度法の選択により、達成することが可能である。これらの要素の選択は、当業者の能力の範囲内であろう。
【０００７】
ホモシステインは、大部分、別の化合物に共有ジスルフィド結合した分子の形で体液中に見られる。この点については、ホモシステインは、別のホモシステイン分子に（ホモシスチンを形成する）、システイン分子に、またはタンパク質分子中のシステイン残基に結合した形で見られる可能性がある。ホモシステインの７０パーセントは、アルブミン分子上のシステイン残基にジスルフィド結合している。すべてのホモシステインのわずか１パーセントのみが、別の分子にジスルフィド結合していない、非結合分子として存在する。したがって、上述の酵素反応を最適化するため、ホモシステイン分子をそのジスルフィド相互作用から自由にし、そして遊離ホモシステインとして存在することを可能すべきである。これは、ジスルフィド結合を還元することにより、達成することが可能である。これを助長する最も簡単な方法の１つは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの化学的還元剤を用いることであるが、やはり適切にジスルフィド結合を還元するであろう、多くの入手可能なこうした化学剤がある。本化合物は、酵素周期中の酵素の機能またはピルビン酸および／またはアンモニアを測定するアッセイに干渉することなく、ジスルフィド結合を破壊することが可能な、最低の濃度で存在するべきである。高レベルのＤＴＴは、例えば、分析試薬に干渉し、そしてアッセイ遂行を妨げる可能性がある。この点については、ホモシステイン再循環酵素は、一般的に、およそ３０ミリモルまでのＤＴＴ濃度を許容することが可能である。より好ましくは、そして用いる検出法に応じ、ホモシステインジスルフィド相互作用の還元は、およそ１０ミリモルまでのＤＴＴ量で、そして最も好ましくは、２ないし１０ミリモルのＤＴＴで、達成することが可能である。
【０００８】
ホモシステインを再循環する酵素の最適機能は、ＣＢＳ（ＥＣ ４．２．１．２２）およびＣＢＬ（ＥＣ ４．４．１．８）に関し上述されるように、低濃度の酵素補因子、例えばピリドキサール５’リン酸（ＰＬＰ）、ビタミンＢ６のリン酸化型を使用し、得ることが可能である。これらの酵素は、ＰＬＰに関し５Ｘ１０^-6モル／ＬのＫｍを有し、そしてしたがって、典型的には、約５マイクロモルの濃度のＰＬＰを用いてもよい。しかし、本発明のアッセイを行うために、他の量のＰＬＰ、および同様の特性を有する他の酵素補因子を用いてもよいことが理解されるであろう。
【０００９】
図１は、本発明にしたがい、ホモシステインの測定を可能にする反復反応を例示する。
本発明の１つの態様において、ＣＢＳ（ＥＣ ４．２．１．２２）を用い、遊離ホモシステインをセリンと共に縮合し、シスタチオニンを形成する。その後、シスタチオニンをＣＢＬ（ＥＣ ４．４．１．８）で処理し、ピルビン酸およびアンモニアを遊離させ、そしてホモシステインを再生する。
【００１０】
別の態様において、適切な量のＤＴＴまたは他の還元剤の使用は、結合タンパク質試料からの遊離ホモシステイン、タンパク質およびシステインの産生を助長する。このホモシステインはその後、セリンとの縮合、およびＣＢＳ（ＥＣ ４．２．１．２２）での処理に利用可能である。好ましくは、ＰＬＰもまた本反応混合物に添加してもよい。最適には、ＰＬＰはさらに、シスタチオニンおよびＣＢＬ（ＥＣ ４．４．１．８）に添加してもよい。これらの最適化反応の例は、以下のように書くことが可能である：
（１）（タンパク質にジスルフィド結合しているホモシステイン、ホモシスチン、ホモシステイン、およびシステインに結合しているホモシステインのいずれかまたはすべてを含む試料）＋ＤＴＴ＝遊離ホモシステイン＋タンパク質＋システイン＋酸化ＤＴＴ；
（２）遊離ホモシステイン＋セリン＋ＰＬＰ＋ＣＢＳ＝シスタチオニン＋ＰＬＰ＋ＣＢＳ；
（３）シスタチオニン＋ＰＬＰ＋ＣＢＬ＝遊離ホモシステイン＋ピルビン酸＋アンモニア。
【００１１】
これらの段階を繰り返し、測定を可能にするのに十分な量のピルビン酸および／またはアンモニアを産生する。
固定した期間の後、商業的に利用可能なアッセイを用い、ピルビン酸および／またはアンモニアを測定する。この点については、ピルビン酸および／またはアンモニア検出は、ピルビン酸酸化酵素、乳酸デヒドロゲナーゼまたはアンモニア試薬を用い、達成されうる。ピルビン酸および／またはアンモニア濃度を検出するための他の方法もまた、用いてもよいことが理解されるであろう。
【００１２】
本発明のこれらの反応を反復して行うことにより、時間に渡るピルビン酸および／またはアンモニア産生の測定を行ってもよく、これをその後、試料中の総ホモシステイン濃度と相関させてもよい。
【００１３】
総ホモシステインの検出は、以下のように達成することが可能である：
血漿、血清、または他の体液の試料１００マイクロリットルに、１０ミリモルのジチオスレイトール、１マイクロユニットのＣＢＳ、１マイクロユニットのＣＢＬ、５マイクロモルのＰＬＰおよび１ミリモルのセリンを添加する。ピルビン酸および／またはアンモニアの比色検出のための商業的に入手可能な試薬もやはり添加する。ゼロ時点で、商業的試薬の指定にしたがい、ピルビン酸および／またはアンモニアを測定する。その後、試料を温度調節チャンバー（およそ３７℃）で１０分間、インキュベーションし、そしてその後、ピルビン酸および／またはアンモニアを再び測定する。この過程は、正確な読み取りのため、適切な量のピルビン酸および／またはアンモニアが集積するまで、何回か行う必要がある可能性がある。各商業的キットの感度に適した、再現可能にピルビン酸および／またはアンモニアの量を測定するであろう時間長が確立されたら、その後、試料は、常にその時間長でインキュベーションされるであろう。ホモシステインおよびピルビン酸および／またはアンモニアの間の相関は、血漿中の既知のホモシステイン値の一連の標準を用い、確立されるであろうし、そして一次曲線が確立されるであろう。未知の試料は、直線回帰により、測定されるであろう。
【００１４】
本発明はまた、試料中のホモシステイン濃度を測定するための診断キットであって、酵素シスタチオニンβ−シンターゼおよびシスタチオニンβ−リアーゼ、並びにセリンを含む、前記キットも提供する。該キットは、還元剤、例えばＤＴＴ、および酵素補因子、例えばＰＬＰをさらに含んでもよい。
【００１５】
【実施例】
１：ＣＢＬ酵素
Ａ．ＣＢＬクローニング法
ｍｅｔＣ遺伝子を持つｐＬＣ４−１４プラスミドを、Ｍａｎｉａｔｉｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される技術を用い、ＡＴＣＣクローン＃３７３８４（Ｊ．Ｒ． Ｕｒｅｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６８：３６７−３７１， １９７１）から単離した。ｍｅｔＣ遺伝子は、公表されているＤＮＡ配列にしたがって合成したプライマーを用いたＰＣＲにより、該プラスミドからクローニングした。さらに、適切な発現ベクターにｍｅｔＣ ｃＤＮＡをクローニングするのに適した制限酵素部位を、Ｎ−およびＣ−末端に付加した。ＰＣＲプライマーが合成され、そして以下の５’−３’配列を有した：順方向プライマー（ｍｅｔＣのＡＴＧ開始コドンにＮｄｅＩ部位を付加）ＧＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＡ ＴＧＧ ＣＧＧ ＡＣＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＣＴＣ、逆方向プライマー（ｍｅｔＣの停止コドンの後にＢａｍＨＩ部位を付加）ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＣＧ Ｃ。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして同じ酵素で消化されているｌａｃプロモーター発現ベクター（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ケンブリッジのｐＧＢ３Ｎｄｅ）に連結した。その後、生じたプラスミドを、細胞と共に提供されたプロトコルにしたがい、Ｔｏｐ １０大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン＋０．５％グルコース上に蒔き、そして一晩増殖させた。適切なプラスミドおよび酵素活性の存在に関し、コロニーをスクリーニングした。
【００１６】
Ｇｅｎｚｙｍｅ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのｐＧＢ３Ｎｄｅベクターは、部分的に、米国特許第５，２３６，８３８号の「ｐＧＢ３」として記載される。記載されるｐＧＢ３ベクターを修飾し、Ｎｄｅ部位を付加し、ｐＧＢ３Ｎｄｅと称された現在使用するベクターを形成している。本方式でのベクターの修飾の方法論は、Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， およびＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、およびＦ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）に見出すことが可能である。同様の基本ベクター、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤから入手可能である可能性があるものなどもまた、使用してもよいことが認識されるであろう。
【００１７】
Ｂ．ＣＢＬ精製法
ＣＢＬのため用いられる精製法は、公表されている方法（Ｄｗｉｖｅｄｉ，Ｃ．Ｍ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８２， ２１， ３０６４−３０６９）の適合法である。ＣＢＬクローン由来の培養菌を増殖させ、そしてイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用い、ＣＢＬの発現を誘導した。細胞懸濁物を遠心分離し、そして生じた細胞ペレットを、氷上で１ｍｇ／ｍｌのリゾチームで１５分間処理した後、超音波により、溶解した。溶解物をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に装填し、そして塩勾配（０−０．５Ｍ 塩化ナトリウム）で溶出した。活性分画をヒドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ １ ４０μＭ）上で精製し、そしてリン酸勾配（１０−４００ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ ６．８）で溶出した。溶出物をＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に装填し、そして塩勾配（０−１．０Ｍ 塩化ナトリウム）でＣＢＬを溶出した。Ｍｏｎｏ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、酵素を濃縮した。活性分画をプールし、グリセロールで５０％に希釈し、そして−２０℃に貯蔵した。
【００１８】
ＣＢＬ酵素のクローニングおよび精製のための代替法は、以下に記載される。
Ｃ．ＣＢＬ−ＭＢＰタンパク質融合体のクローニング法
ＣＢＬ遺伝子を、発現ベクター（ｐＧＢ３Ｎｄｅ）からｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングし、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）融合タンパク質を生成した。ＣＢＬオープンリーディングフレームをクローニングし、そしてＮ−末端にＳｍａＩ部位を付加するＰＣＲプライマーを設計し、そして合成した。順方向プライマーは、以下の５’−３’配列を有した：ＴＧＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＣＧ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＣＴ ＣＡＡ ＣＴＧ。本部位の付加の結果、ＣＢＬ配列中の第一のメチオニンがグリシンに置き換えられた。逆方向プライマーは以下の５’−３’配列を有した：ＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＴ。ＰＣＲ産物をＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩで消化されているｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクターに連結した。その後、生じたプラスミドを、細胞と共に提供されたプロトコルにしたがい、Ｔｏｐ １０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン＋０．５％グルコース上に蒔き、そして一晩増殖させた。適切なプラスミドおよびＣＢＬ活性の存在に関し、コロニーをスクリーニングした。
【００１９】
Ｄ．ＣＢＬ−ＭＢＰの精製法
ＣＢＬ−ＭＢＰクローン由来の培養菌を増殖させ、そしてＩＰＴＧでＣＢＬ−ＭＢＰの発現を誘導した。細胞懸濁物を遠心分離し、そして生じた細胞ペレットを、１ｍｇ／ｍｌ リゾチームおよび１５０Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩを用い、溶解した。溶解物をＡｍｙｌｏｓｅカラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）上に装填し、そして１０ｍＭ マルトースを含む緩衝液で溶出した。活性分画をプールし、グリセロールで希釈し、そして−２０℃で貯蔵した。
【００２０】
Ｅ．シスタチオニンβリアーゼのためのＤＴＮＢアッセイ
アッセイ原理：
システイン、ホモシステインまたは類似のチオールは、シスタチオニン（ＣＴＴ）、ジェンコール酸（ＤＪＡ）または他のチオエーテル基質の酵素的切断により、産生される。チオール類は、芳香族ジスルフィド５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）とジスルフィド交換を経て、一等量の発色団２−ニトロ安息香酸−５−メルカプチド（ＴＮＢ）を遊離させる。ＴＮＢの遊離を分光測定で追い、そしてＴＮＢのモル吸光係数１３，２００Ｍ^-1ｃｍ^-1を用い、時間に渡る４１０ｎｍの吸光度の傾きから反応速度を計算する：
試薬：
５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（Ｓｉｇｍａ Ｄ−８１３０）
Ｌ−（＋）−シスタチオニン （Ｓｉｇｍａ Ｃ−７５０５）
Ｌ−ジェンコール酸 （Ｓｉｇｍａ Ｄ−９２５５）
Ｔｒｉｓ（塩基） （Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ ４１０９−０２）
ジチオスレイトール（ＤＴＴ） （ＥＭ Ｓｃｉｎｅｃｅ １１４７４−４）
ピリドキサール５’リン酸（ＰＬＰ） （Ｓｉｇｍａ Ｐ−９２５５）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） （Ｓｉｇｍａ Ａ−３０５９）
塩酸（ＨＣｌ）試薬等級
一および二塩基性リン酸カリウム、試薬等級
ストック溶液：
アッセイ緩衝液：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０
室温で無菌貯蔵
基質溶液：０．０１Ｎ ＨＣｌ中の１０ｍＭ Ｌ−ジェンコール酸またはＬ−（＋）−シスタチオニン。ＨＣｌ中に固体を懸濁し、温水中で容器を短時間温め、溶解するまで混合しまたは超音波処理し、室温まで冷却する。−２０℃で貯蔵し、完全に溶解させるため、融解した後、再加熱する。
【００２１】
ＤＴＮＢ溶液：０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０中の１０ｍＭ ＤＴＮＢ。−２０℃に貯蔵する。酵素希釈緩衝液：１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０、１００μＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＰＬＰ、１０ｇ／ｌ ＢＳＡ。
アッセイ法：
１つの９６ウェルプレートに対し、以下の量の試薬カクテルを室温で調合する：
１５．６ｍｌ アッセイ緩衝液
４．０ｍｌ 基質溶液
０．４ｍｌ ＤＴＮＢ溶液
アッセイしようとする酵素試料を、必要に応じ酵素希釈緩衝液で希釈し、そして氷上に維持する。酵素濃度は、０．０２および２５Ｕ／ｍｌの間であるべきである。平底９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに、試薬カクテル２００μｌを等分する。マイクロウェルプレート読み取り装置を、ＯＤ範囲０−２で、４１０ｎｍの１０分間の動力学読み取りのため、セットアップする。アッセイプレートに迅速に１ないし１０μｌのあらかじめ希釈した酵素試料を添加し、そして混合する。プレートを直ちに読み取り装置に移し、そして動力学プログラムを開始する。
ユニット定義：
実験を単純にするため、酵素ユニットは、室温で、Ｌ−ジェンコール酸から１分当たり１モルの遊離チオールの形成を触媒する酵素の量と定義する。シスタチオニンは、大部分のリアーゼにより、Ｌ−ジェンコール酸と同様の速度で切断されるが、いくつかの酵素特異的相違が発生する。活性の相違は、いくつかの公表されている方法に記載されるように、３７℃でのアッセイから生じる可能性がある。
検出限界：
アッセイに添加すべき酵素の最小量は、約１０μｌの０．０１Ｕ／ｍｌ溶液と概算され、これは１０ｍＯＤ／分の測定値を生じるであろう。逆に、１０分間に渡る、１５０ｍＯＤ／分の概算最大光度計速度は、１μｌの１４Ｕ／ｍｌのストック液を添加することにより、達成されるであろう。最小および最大量の調整は、使用する検出法に応じ、多様であろう。
ＩＩ．ＣＢＳ酵素：
Ａ．ＣＢＳクローニング法：
ＣＢＳ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡからクローニングした。５’末端のＮｄｅＩ部位および３’末端のＢａｍＨＩ部位をコードするプライマーを用い、ＰＣＲを行った。これらの制限酵素でアンプリコンを消化し、そしてその後、同じ制限酵素で消化した発現ベクター（ｐＧＢ３Ｎｄｅ）に連結した。その後、Ｔｏｐ １０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、そして選択培地上に蒔いた。適切な大きさのプラスミドを含むコロニーを選択した。
【００２２】
発現実験を行い、クローンにＣＢＳ活性が存在するかどうか決定した。クローンの培養をチアミンおよびアミノレブリン酸を含む選択培地中で増殖させた。タンパク質産生を誘導するため、ＩＰＴＧを４時間および２１時間添加した。リゾチームおよびＤＮアーゼで細胞ペレットを溶解し、そして溶解物上清を、ＣＢＳ活性に関し、Ｊａｎ Ｋｒａｕｓにより、Ｋｒａｕｓ， ＪＰ， Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ β−Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｈｕｍａｎ）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １４３， ３８８−３９４（１９８７）（以下「Ｋｒａｕｓ刊行物」）に記載される放射能アッセイ、およびニンヒドリンアッセイを用いてアッセイし、溶解物をセリンおよびホモシステインと共にインキュベーションすることにより、シスタチオニン（ＣＴＴ）が形成されるか検出した。両アッセイにより、溶解物はＣＢＳ活性を発現した。
【００２３】
Ｂ．ＣＢＳ精製法：
配列決定および発現結果に基づき、活性を有し、そしてＫｒａｕｓ刊行物と並列比較することにより、配列中に誤りをまったく持たないクローンを選択した。
【００２４】
ＣＢＳクローンを、５０μｇ カルベニシリン、０．００１％ チアミンおよび０．３ｍＭ アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中で、３０℃で増殖させた。１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、そして培養菌を３０℃で２１時間、インキュベーションした。８０００ＲＰＭで８分間遠心分離することにより、細胞を沈殿させた。細胞ペレットを、１０μＭピリドキサール５’リン酸（ＰＬＰ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に再懸濁し、そして再び回転させた。溶解および精製の準備ができるまで、細胞ペレットを凍結させた。
【００２５】
細胞ペレットは、３７℃水槽で、迅速に融解し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０μＭ ＰＬＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１ ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ リゾチームおよび１００単位／ｍｌ ＤＮアーゼＩを含む溶解緩衝液に再懸濁した。溶解物に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、そして遠心分離した。懸濁物を氷中に置き、そして攪拌しながら、最終濃度３０％まで、ゆっくりと硫酸アンモニウムを添加した。懸濁物を３０分間攪拌し、そして遠心分離した。硫酸アンモニウムを最終濃度７０％まで上清に添加し、そして氷中で１時間攪拌した後、懸濁物を遠心分離した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１０μＭ ＰＬＰを含む緩衝液にペレットを再懸濁し、そして同じ緩衝液に対し透析した。透析物を、同じ透析緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱカラム上に装填した。０−１Ｍ ＮａＣｌ勾配で、カラムからＣＢＳを溶出した。Ｋｒａｕｓ刊行物に記載される放射能アッセイを用い、そしてまた本発明の反復法の結果も用い、ＣＢＳ活性に関し、分画をアッセイした。活性を含むものをプールし、そして−２０℃で貯蔵した。
【００２６】
ＣＢＬ酵素のクローニングおよび精製のための代替法を以下に記載する。
Ｃ．ＣＢＳ−ＭＢＰ融合タンパク質融合体のクローニング法
続いて、ＣＢＳ遺伝子を、発現ベクター（ｐＧＢ３Ｎｄｅ）からｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングし、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）融合タンパク質を生成した。ＣＢＳオープンリーディングフレームをクローニングし、そしてＮ−末端にＳｍａＩ部位を付加するＰＣＲプライマーを設計し、そして合成した。順方向プライマーは、以下の５’−３’配列を有した：ＴＧＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＣＴ ＡＡＡ ＴＣＴ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＣＣ ＧＡＴ ＴＣＡ。本部位の付加の結果、ＣＢＳ配列中の第一のメチオニンがグリシンに置き換えられた。逆方向プライマーは以下の５’−３’配列を有した：ＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＴＧＣ ＴＡＡ ＧＴＡ ＧＣＴ ＣＡＧ。ＰＣＲ産物をＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩで消化されているｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクターに連結した。その後、生じたプラスミドを、細胞と共に提供されたプロトコルにしたがい、Ｔｏｐ １０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン＋０．５％グルコース上に蒔き、そして一晩増殖させた。適切なプラスミドおよびＣＢＳ活性の存在に関し、コロニーをスクリーニングした。
【００２７】
Ｄ．ＣＢＳ−ＭＢＰの精製法
ＣＢＳ−ＭＢＰクローン由来の培養菌を増殖させ、そしてＩＰＴＧでＣＢＳ−ＭＢＰの発現を誘導した。細胞懸濁物を遠心分離し、そして生じた細胞ペレットを、１ｍｇ／ｍｌ リゾチームおよび１５０Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩを用い、溶解した。溶解物をＡｍｙｌｏｓｅカラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）上に装填し、そして１０ｍＭ マルトースを含む緩衝液で溶出した。活性分画をプールし、そして−８０℃で貯蔵した。
【００２８】
Ｅ．シスタチオニンβシンターゼアッセイ
１．第一の態様：
試薬：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ、ｐＨ８．６
ウシ血清アルブミン、２５ｍｇ／ｍｌ
セリン、０．１Ｍ
ピリドキサール５’リン酸（ＰＬＰ）、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、０．２Ｍ
ＮａＯＨ、５Ｍ
ＨＣｌ、５Ｍ
ホモシステイン混合物
ホモシステインチオラクトン ３０．７２ｍｇ
ＮａＯＨ（５Ｍ） ２４５μｌ
ホモシステインチオラクトンをＮａＯＨに溶解する。３７℃で５分間インキュベーションし、環を壊す。次に：
Ｔｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．６） １００μｌ
ＤＴＴ（０．２Ｍ） １００μｌ
Ｈ₂Ｏ ３５５μｌ
ＨＣｌ（５Ｎ） ２００μｌ
を添加する。ｐＨ試験紙でｐＨを確認し、必要ならば８．５に調整する。
【００２９】
本溶液は、４℃で２４時間安定である。
アッセイ混合物
ストック 量
１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０ １０．０μｌ
ＢＳＡ ２５ｍｇ／ｍｌ ２．０μｌ
０．１Ｍ セリン ５．０μｌ
１０ｍＭ ＰＬＰ １０．０μｌ
０．２Ｍ ｈｃｙ ７．５μｌ
Ｃ¹⁴セリン １．０μｌ
ｄＨ₂Ｏ ５９．５μｌ
総量 ９５．０μｌ
アッセイしようとする試料の総数を各量に乗じる。使用前、氷上でアッセイ混合物を貯蔵する。
酵素試料
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を用い、ＣＢＳ特異的タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように、酵素試料を希釈する。Ｔｒｉｓの代わりにグリセロールもまた用いてもよい。
【００３０】
氷上のガラス試験管（〜５ｍｌ体積）を用い、ブランクを含め、各試験管に９５μｌのアッセイ混合物を添加する。
ブランクを除き、各試験管に５μｌの酵素試料（または２−５μｇに等しい量）を添加し、ブランクに５μｌのｄＨ₂Ｏを添加する。
【００３１】
試験管を含むラックを、３７℃水槽に入れ、そしてゆっくりと３０分間攪拌する。
反応を進める間、Ｗｈａｔｍａｎ＃３クロマトグラフィー紙のシートを準備し、３ｃｍ幅で、各試料のレーンに印をつける。
【００３２】
氷水中で試験管を冷却することにより、反応を終結させる。
３つの無作為のアッセイから５μｌの試料を採取し、アッセイ紙の小さい正方形上にスポットし、これらをシンチレーションバイアルに入れ、クロマトグラムが終了するまで取っておく。紙の上の各レーンの中央の１ｃｍに反応２０μｌをスポットする。紙を乾燥させる。紙の各端のレーン上にシスタチオニン／セリン標準５μｌをスポットする。紙をクロマトグラフィータンクに入れる。
【００３３】
以下の溶媒を用い、一晩（または紙の大きさに適した時間）クロマトグラムを展開する：
イソプロパノール １６０ｍｌ
水 ４０ｍｌ
ギ酸 １２ｍｌ
ギ酸の匂いがなくなるまで、クロマトグラムを乾燥させる。クロマトグラムの端のレーンを切り落とし、片をニンヒドリン溶液に浸し、そして短時間乾燥させる。セリンおよびシスタチオニンのアミノ酸スポットが展開する。
【００３４】
クロマトグラムに対し、染色片を並列させ、シスタチオニンスポットの周りの非染色領域、約１／２ｃｍを含む、シスタチオニンスポット（開始位置に近いスポット）に印をつける。各レーンのシスタチオニン標準に対応する領域を切り出し、シンチレーションバイアルに入れ、シンチレーション液５ｍｌを添加し、そしてまた先の５μｌ試料も含め、計測する。
【００３５】
活性は以下のように計算される：
[Ｓ]、μモル＝％消費基質 ｘ アッセイ混合物中のセリン濃度
％消費基質＝ＣＰＭ−ブランク／総カウント
活性、Ｕ＝[Ｓ]μモル／インキュベーション時間（時間）
比活性、Ｕ／ｍｇ＝活性／反応混合物中の酵素ｍｇ
２．別の態様：
ニンヒドリンをシンチレーションの代わりに用いる別の態様では、アッセイは以下のように行うことが可能である。
方法
酵素希釈緩衝液 ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３
２４０マイクロモル ＰＬＰ
反応カクテル ０．１５４Ｍ ホモシステイン
０．０９９Ｍ セリン
これらの構成要素をｐＨ８．３の０．１Ｍ Ｔｒｉｓで希釈する。
ニンヒドリン試薬 ３３３ｍｇ ニンヒドリン
３３．３ｍｌ 氷酢酸
１１．１ｍｌ リン酸
ニンヒドリンが完全に溶解するまで、よく攪拌する。
シスタチオニン（ＣＴＴ）標準 ３１．２５ｍＭ ＣＴＴ（３１．２５ｍＭないし０．４８８３ｍＭの範囲）
０．１Ｎ ＨＣｌで希釈する。
１．）酵素の連続希釈を作成する。
２．）マイクロタイタープレート（第一のプレート）のウェルに連続希釈酵素５０μｌを、その後、反応カクテル５０μｌをピペッティングし、プレートにふたをする。
３．）攪拌しながら３７℃で４５分間インキュベーションする。
４．）第二のマイクロタイタープレート（最終プレート）上で、ウェルにニンヒドリン試薬２００μｌを、その後、反応カクテル６μｌおよび希釈酵素６μｌを添加することにより、酵素ブランクを調製する。
５．）第一のプレートをインキュベーターから取り出し、そして最終プレートに各試料１２μｌをピペッティングする。連続希釈３１．２５ｍＭ ＣＴＴ標準１２μｌもまた、最終プレートにピペッティングする。
６．）試料および標準にニンヒドリン試薬２００μｌを直ちに添加する。
７．）最終プレートを、プレートウォーマー中で、９５℃で１０分間、インキュベーションする。
８．）プレートウォーマーからプレートを取り出し、そして氷上に５分間置く。
９．）終点吸光度を４５０ｎｍで読み取る。
計算：
ＣＴＴ標準試料に関し、標準曲線を描く。マイクロモル／時間で、形成されたＣＴＴ量を計算するための式は：
[（Ｓ−Ｂ）／（Ａ ｘ ｍｌでの試料体積 ｘ 時間での反応時間）] ｘ ＤＦ
ここで
Ｓ＝試料の吸光度
Ｂ＝ブランクの吸光度
Ａ＝標準シスタチオニン１マイクロモルの吸光度
ＤＦ＝酵素の希釈因数
酵素ユニット
酵素ユニットは、アッセイ条件下で、時間当たりに形成されるシスタチオニンのマイクロモルとして定義される。
ＩＩＩ．ホモシステインアッセイ法
Ａ．第一の態様：
Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬：
構成要素 濃度^*
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０） ０．１Ｍ
４−アミノアンチピリン（４−ＡＰＰ） １．６ｍＭ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ） １．６ｍＭ
チアミンピロリン酸（ＴＰＰ） ０．７７ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ ２．６ｍＭ
ＫＨ₂ＰＯ₄ １９．３ｍＭ
酵素および補因子：
構成要素 濃度^*
ＢＳＡ ０．０１２ｍｇ／ｍｌ
ピリドキサール５’リン酸（ＰＬＰ） ０．１ｍＭ
ペルオキシダーゼ ０．４５Ｕ／ｍｌ
ピルビン酸酸化酵素 １０．７Ｕ／ｍｌ
ＣＢＬ ０．４Ｕ／ｍｌ
ＣＢＳ ９０Ｕ／ｍｌ
セリン：
構成要素 濃度^*
セリン ５ｍＭ
^*濃度は試薬中の最終濃度
酵素および補因子は、使用直前にＴｒｉｎｄｅｒ試薬に添加する。酵素および補因子は、ストックとして貯蔵する。
【００３６】
５μｌのセリンストック（２３０ｍＭ）および２５μｌのホモシステイン含有試料を反応ウェルに添加する。
２００μｌの試薬（Ｔｒｉｎｄｅｒ＋酵素および補因子）を、セリンおよびホモシステイン含有試料に添加する。
【００３７】
反応を３７℃で（混合しながら）２０分間インキュベーションする。
発色を５７０ｎｍで測定する。
ホモシステイン濃度の計算された直線性を図２に示す。本図において、遊離ピルビン酸の吸光度は、ホモシステイン濃度に対し示される。
【００３８】
Ｂ．第二の態様：
ホモシステインを含む血漿および／または血清試料を、１２．５ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．８、１％ Ｔｒｉｔｏｎ、および０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中の２．５ｍＭ ＤＴＴを用い、還元した。処理溶液にふたをし、そして２５℃で２０分間インキュベーションした後、ふたを取り、そして分析装置の車輪上に置いた。試料２０マイクロリットルおよび水５マイクロリットルを７２マイクロリットルの試薬１、および９２マイクロリットルの試薬２に添加した。試薬１は時点Ｔ１（０分）で添加し、そして試薬２はＴ２（約２０秒後）に添加した。読み取り時点は２５および５０（約８分）であった。アッセイはＣｏｂａｓ Ｍｉｒａ分析装置を用い、５５０ｎｍで読み取った。
【００３９】
試薬組成は以下のとおりであった：
Ｒ１試薬組成
２．５６ｍＭ セリン
１．１５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７．３Ｕ／ｍｌピルビン酸酸化酵素
１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
１２７．８ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．８
６．６ｍＭ ＭｇＣｌ₂
３．４ｍＭ ４−ＡＡＰ
４９．３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄
１．９７ｍＭ ＴＰＰ
８０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
Ｒ２試薬組成
２．４２Ｕ／ｍｌ ＣＢＬ
０．２ｍＭ ＰＬＰ
３６０Ｕ／ｍｌ ＣＢＳ
１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．８
３．２ｍＭ ＴＯＯＳ
８０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
ＨＰＬＣおよびホモシステインの標準化試料の使用と比較した、上述のアッセイで得た結果は、以下のとおりである。ホモシステインを測定するための自動化ＨＰＬＣ法は、Ｔ． Ｆｉｓｋｅｒｓｔｒａｎｄ， Ｈ． Ｒｅｆｓｕｍ， Ｇ． Ｋｖａｌｈｅｉｍ，およびＰ．Ｍ． Ｕｅｌａｎｄ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３９：２６３−２７１（１９９３）にしたがい、行った。これらの結果が示すように、本発明のアッセイは、ホモシステイン定量化解析の標準として当業者に使用されているＨＰＬＣ自動化法に比較して、患者試料中のホモシステイン濃度の正確な測定を提供する。
【００４０】
ホモシステイン
Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａ対ＨＰＬＣ
Ｍｉｒａは、１０マイクロモル／ｌのホモシステイン（ＨＣＹ）コントロール（ＢｉｏＲａｄ １０）で較正した。すべての試料はアッセイ前に還元した。以下のチャートの目的に関し、「μｍｏｌ／ｌ」は、１リットル当たりのマイクロモルを意味するものとする。
【００４１】
【表１】

【００４２】
本発明は、その好ましい態様に関し特に示されそして記載されているが、特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、態様および詳細に多様な変化を作成してもよいことが当業者に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明にしたがった、ホモシステインのためのアッセイ法を例示する。
【図２】 図２は、本発明のアッセイ法にしたがい、ピルビン酸遊離により測定される、ホモシステイン濃度の計算された直線性を例示する。

Claims (20)

1. 試料中のホモシステイン濃度を測定するための方法であって：
   ａ）セリンおよび酵素シスタチオニンβ−シンターゼを用い、試料中のホモシステインを縮合し、シスタチオニンを形成し；
   ｂ）酵素シスタチオニンβ−リアーゼを用い、シスタチオニンからピルビン酸およびアンモニアの少なくとも１つを遊離させ、そしてホモシステインを再生し；そして
   ｃ）段階ａおよびｂを反復し、試料中のホモシステインの濃度に相関させることが可能な速度で、前記のピルビン酸およびアンモニアの少なくとも１つを遊離させる
   段階を含む、前記方法。
2. 前記のピルビン酸およびアンモニアの少なくとも１つの遊離速度を標準ホモシステイン濃度値と相関させる、請求項１の方法。
3. 縮合段階が、遊離ホモシステインを産生するのに十分な量の還元剤に試料をさらすことをさらに含む、請求項１の方法。
4. 還元剤がジチオスレイトールである、請求項３の方法。
5. 前記ジチオスレイトールが３０ミリモル以下の濃度で提供される、請求項４の方法。
6. 酵素シスタチオニンβ−シンターゼおよび酵素シスタチオニンβ−リアーゼの少なくとも１つを酵素補因子にさらす、請求項１の方法。
7. 前記酵素補因子が、少なくとも５マイクロモルの濃度で提供されるピリドキサール５’リン酸である、請求項６の方法。
8. 試料中のホモシステイン濃度を測定するための方法であって：
   ａ）セリンおよび酵素シスタチオニンβ−シンターゼを用い、試料中のホモシステインを縮合し、シスタチオニンを形成し；
   ｂ）酵素シスタチオニンβ−リアーゼの使用により、シスタチオニンからピルビン酸およびアンモニアの少なくとも１つを遊離させ、そしてホモシステインを再生し；そして
   ｃ）遊離されたピルビン酸およびアンモニアの少なくとも１つの量を測定し、そしてその量を試料中に存在するホモシステイン濃度に相関させる
   段階を含む、前記方法。
9. 測定段階が、時間に渡るピルビン酸およびアンモニアの少なくとも１つの遊離量を測定することをさらに含む、請求項８の方法。
10. 前記のピルビン酸およびアンモニアの少なくとも１つの遊離速度を標準ホモシステイン濃度値と相関させる、請求項８の方法。
11. 縮合段階が、遊離ホモシステインを産生するのに十分な量の還元剤に試料をさらすことをさらに含む、請求項８の方法。
12. 還元剤がジチオスレイトールである、請求項１１の方法。
13. 前記ジチオスレイトールが３０ミリモル以下の濃度で提供される、請求項１２の方法。
14. 酵素シスタチオニンβ−シンターゼおよび酵素シスタチオニンβ−リアーゼの少なくとも１つを酵素補因子にさらす、請求項８の方法。
15. 前記酵素補因子が、少なくとも５マイクロモルの濃度で提供されるピリドキサール５’リン酸である、請求項１４の方法。
16. 患者試料中のホモシステインを測定するための方法であって：
    ａ）セリンおよび酵素シスタチオニンβ−シンターゼを用い、試料中のホモシステインを縮合し、シスタチオニンを形成し；
    ｂ）酵素シスタチオニンβ−リアーゼを用い、シスタチオニンからピルビン酸およびアンモニアを遊離させ；そして
    ｃ）酵素シスタチオニンβ−リアーゼを用いた反応により、ホモシステインを再生する
    ここで、段階ａ、ｂおよびｃを繰り返し、患者試料中に存在するホモシステインの濃度に相関させることが可能な速度で、ピルビン酸およびアンモニアを遊離させる
    段階を含む、前記方法。
17. 酵素シスタチオニンβ−シンターゼ、酵素シスタチオニンβ−リアーゼおよびセリンを含む、試料中のホモシステイン濃度の測定のためのキット。
18. さらにピリドキサール５’リン酸を含む、請求項１７のキット。
19. さらに還元剤を含む、請求項１７のキット。
20. 前記還元剤がジチオスレイトールである、請求項１９のキット。

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