CN105717309A

CN105717309A - 一种检测同型半胱氨酸的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN105717309A
Application number: CN201610213527.1A
Authority: CN
Inventors: 胡海艳; 黄魁英; 夏枫耿; 谢鹏; 甘祥武
Original assignee: GUANGZHOU CITY INSTITUTE OF MICROBIOLOGY
Current assignee: GUANGZHOU CITY INSTITUTE OF MICROBIOLOGY; Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2016-04-07
Filing date: 2016-04-07
Publication date: 2016-06-29

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体公开了一种检测同型半胱氨酸的方法及试剂盒。所述试剂盒包括同型半胱氨酸脱硫酶、反应液、显色液I、显色液Ⅱ、Hcy对照品和质控品血清；所述同型半胱氨酸脱硫酶为保藏号为CCTCC NO：M209255的重组工程菌菌株的分泌产物。本试剂盒的检测方法灵敏，快速，操作简单，且可以在分光光度计，酶标仪，荧光检测器，半/全自动生化仪上使用，另外酶冻干粉的设计，不仅可以大大提高酶的活力，而且可以根据样本量的多少称量酶粉，不仅适合大型医院、检测公司使用，还适合缺乏大型设备、样本量少的基层医院与医务室和实验室使用，有利于促进将Hcy作为临床检测的常规项目和实验研究的开展，与发达国家接轨。

Description

一种检测同型半胱氨酸的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测同型半胱氨酸的方法及试剂盒。

背景技术

同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)，又称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，为蛋氨酸代谢的中间产物，目前已被国际医学界认为是一种新的独立治病因子。早在1969年就有学者发现同型半胱氨酸能够影响动脉粥样硬化进程，在医学界受到了广泛关注。随后进行了大量的动物试验、体外试验、临床试验以及流行病学调查。动物试验结果已表明高Hcy能诱导胚胎发生神经管畸形，某些先天性疾病，弱智，慢性肾病，Ⅱ型糖尿病也常伴有同性半胱氨酸代谢异常。越来越多的研究证实体内同型半胱氨酸水平升高与冠脉疾病、心肌梗死、颈动脉内膜厚度等心脑血管疾病密切相关。高同型半胱氨酸血症被认为是心脑血管疾病的独立危险因素之一。发达国家中，已经把Hcy作为临床检测的常规项目，我国今年来也加强了Hcy的临床研究，将其列入国家“863”高科技项目和自然科学基金项目。

目前体内Hcy的定量测定主要有液相色谱-荧光衍生化法和免疫法。两种方法的灵敏度和准确度较高，但成本较高，需要特殊的仪器和专业的操作人员且操作复杂，对于常规检测是不切实际的。循环酶法是近几年发展起来的一种生化测试方法，相对于传统检测方法来说，此方法能在全自动生化仪上检测，操作简单且具有较好的灵敏度和精密度，已被市场慢慢接受。目前，循环酶法主要包括两种方法，一种是Hcy与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷，腺苷立即产生氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD，样本中的Hcy浓度与NADH转化速率成正比。然而，这种测定需要使用两种起始底物(同型半胱氨酸和腺苷)和四种酶，使其相对复杂，它还涉及测定腺苷浓度的下降，可能不尽人意。另外一种循环酶法是胱硫醚循环法，Hcy在胱硫醚β-合成酶(CBS)催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚，L-胱硫醚在胱硫醚β-分解酶(CBL)的催化下又生成Hcy、丙酮酸和氨。该循环反应生成的丙酮酸可以用乳酸脱氢酶LDH和NADH检测，NADH转变成NAD的速率与样品中Hcy含量成正比。此法设计上是靠测量Hcy转化为β-胱硫醚时产生的胱硫醚，但是却不能够消除内生胱硫醚，而恰恰很多人，特别是肾脏疾病患者的β-胱硫醚的水平非常高(可高达300umol/L，大部分小于20umol/L)，它测的是同型半胱氨酸和胱硫醚的总和，而不仅仅是Hcy，造成Hcy假阳性的错误结果而给实验室带来巨大的医疗风险。两种循环酶法都只适合自动生化仪上操作。

兴起的生化检查方法除了循环酶法外，还有少数使用能够与同型半胱氨酸反应的酶来检查Hcy的含量。授权专利CN1200105C(格雷厄姆等)介绍了一种来自阴道毛滴虫的高半胱氨酸脱硫酶的序列，以及利用此酶来催化同型半胱氨酸、半胱氨酸、邻乙酰-L-丝氨酸和或甲硫氨酸的方法。专利CN102901720A公布了一种血液同型半胱氨酸的检测方法和试剂盒，利用同型半胱氨酸与酶反应生成H₂S，通过检测H₂S的量来计算血液中同型半胱氨酸的含量。该酶与授权专利CN1200105C使用的酶均来自于阴道毛滴虫。

目前市售的试剂盒中的酶均以溶液形式4℃保存，而酶属于蛋白类生物制品，其生物活性易受到多种环境条件的影响，也会受到运输过程中剪切张力的影响，容易使得酶结构改变，溶解度降低，有蛋白絮状沉淀析出等问题，最终导致酶活下降，而不能准确测试。研究表明，在纯化过程中，几乎所有的同型半胱氨酸酶或甲硫氨酸裂解酶的粗酶液共同存在的问题是酶稳定性差、易失活。例如在进行T.vaginalis粗酶纯化的过程中会因为一个冻融循环损失25％酶活，对没有添加PLP的酶液进行透析则会使酶活损失高达50％。酶的不稳定性导致其保存期较短，市售的酶试剂盒最长保存期为12个月。因此，迫切需要一种更好保存酶的条件，进而延长酶的保存期，减少误差。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测同型半胱氨酸的方法。

本发明的另一个目的是提供一种检测同型半胱氨酸的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的。

一种检测同型半胱氨酸的试剂盒，包括同型半胱氨酸脱硫酶、反应液、显色液I、显色液Ⅱ、Hcy对照品和质控品血清；所述同型半胱氨酸脱硫酶为保藏号为CCTCCNO：M209255的重组工程菌菌株的分泌产物；所述反应液为添加有1umol/L～100mmol/L的1、4-二硫苏糖醇或三羧乙基膦、0.1umol/L～10mmol/L磷酸吡哆醛、pH7.5～10.0的磷酸钾缓冲溶液；所述显色剂Ⅰ为含有1～100mmol/L的二甲基对苯胺硫酸盐的1mol/L的H₂SO₄溶液；所述显色液Ⅱ为0.001～1mol/L的Fe(NH₄)₂SO₄溶液。

优选地，同型半胱氨酸脱硫酶可以为液体酶溶液或冻干粉末。

更优选地，同型半胱氨酸脱硫酶为冻干粉末的制备方法为：

S1.同型半胱氨酸脱硫酶溶液在冻干前加入保护剂进行保护，保护剂配方为：5mmPBS缓冲液、10umol/L的PLP、2％甘露醇、1％蔗糖、15mmol/L的甘氨酸；

S2.将加入保护剂的同型半胱氨酸脱硫酶溶液冷冻至-10℃～-70℃进行预冻，后保温2～8小时；

S3.抽真空，加热至-20℃～-40℃进行升华干燥，升华干燥过程至升华界面达到瓶底并消失，再保温2h之后结束；

S4.再加热至10℃～50℃进行解析干燥，升温后再保温4～6小时，最终获得稳定性高的酶粉。

优选地，S2中冷冻至-40℃～-50℃进行预冻，后保温4～6小时。

优选地，S3中抽真空使压力到达15～20pa。

优选地，S3中加热至-25℃～-35℃进行升华干燥。

优选地，S3中升温的时间为4～10小时；更优选为5～7小时。

优选地，S4中加热至15℃～25℃进行解析干燥，升温的时间为5～9小时，更优选6～8小时。

优选地，所述显色剂Ⅰ为含有1～10mmol/L的二甲基对苯胺硫酸盐的1mol/L的H₂SO₄溶液。

优选地，所述显色液Ⅱ为0.1～0.5mol/L的Fe(NH₄)₂SO₄溶液。

利用如上所述试剂盒检测同型半胱氨酸的方法，包括如下步骤：向待测样品和标准品中分别加入反应液，37℃水浴锅中反应5分钟，再分别加入显色液反应10分钟，测定反应后的样品和对照品在670nm的吸光值；按照下列公式计算待测样品中同型半胱氨酸的浓度；

样品浓度＝样品吸光度/标准吸光度×标准浓度；

其中，显色液为显色液Ⅰ和显色液Ⅱ按照10:1的体积比混合而成；所述样品：反应液：显色液的体积比为1：5：1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明使用的酶来自深海宏基因组，不同于任何试剂盒所使用的酶，此酶的最适底物为同型半胱氨酸，对L-半胱氨酸及L-胱氨酸几乎无活性，用于体内同型半胱氨酸检测时不会受到其他相关氨基酸的影响，这是此酶的重要酶学特性，可以提高检测的准确性。并首次使用和公开了酶冻干粉的制备，可以提高酶的稳定性，有效延长了试剂盒的使用日期。

本发明的检测方法灵敏，快速，操作简单，且可以在分光光度计，酶标仪，荧光检测器，半/全自动生化仪上使用，酶粉的设计，可以根据样本量的多少称量酶粉，不仅适合大型医院、检测公司使用，还适合缺乏大型设备、样本量少的基层医院与医务室和实验室使用，有利于促进将Hcy作为临床检测的常规项目和实验研究的开展，与发达国家接轨。

附图说明

图1A、B为DNPH与α-丁酮酸反应图。

图2为同型半胱氨酸与不同底物反应的产物薄层层析鉴定图。

图3为酶在不同条件下储存的稳定性。

图4为酶以溶液状态保存和以干粉状态保存稳定性的比较，图4中的酶法状态保藏就是指酶以干粉状态保存。

图5为同型半胱氨酸酶法HPLC图。

图6为同型半胱氨酸冻干后成品图。

图7为用实施例1中的方法测试Hcy标准溶液的线性图。

图8为分别用分光光度计法和HPLC法检测Hcy的比较图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。下列实施例中所用的同型半胱氨酸脱硫酶为保藏号为CCTCCNO：M209255的重组工程菌菌株的分泌产物。

实施例1同型半胱氨酸脱硫酶最适底物的考察

同型半胱氨酸脱硫酶，包括其同工酶，如甲硫氨酸裂解酶、同型半胱氨酸裂解酶等，能与L-甲硫氨酸、DL-同型半胱氨酸、L-半胱氨酸和L-胱氨酸等反应，同型半胱氨酸脱硫酶与四种底物反应均能生成α-丁酮酸，可通过检测α-丁酮酸的生成量来检测其活性大小。不同来源的酶对各底物的亲和力不同，如有些酶虽然对同型半胱氨酸的活性很高，但是对L-半胱氨酸也有较高的活性，这种酶在检测血液样品中的同型半胱氨酸时会受到体内L-半胱氨酸的干扰而限制其应用。因此本实施例的目的是考察本发明所用同型半胱氨酸脱硫酶对四种底物的亲和力。

采用薄层层析(TLC)测试底物特异性，具体步骤如下：

1、TLC板的制备：将硅胶G(60型)和水按1:3的比例混合，在研钵中以同一方向研磨，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在干净的玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2～0.3mm)，取下涂好薄层的玻璃板，放置于水平台上室温晾干，然后在110℃烘箱中烘30分钟，取出后立即放入置有干燥剂的干燥器中冷却备用。

2、样品的制备：在880μL分别含有25mmol/LL-甲硫氨酸、DL-同型半胱氨酸、L-半胱氨酸及L-胱氨酸的底物溶液中加入20μL适当稀释的酶溶液，37℃反应2h，在反应后的溶液中加入100μL2％(m/V)DNPH溶液，混合均匀，加入10mol/LNaOH调节溶液呈碱性，作为薄层层析样品。分别取900μL25mmol/Lα-丁酮酸溶液和25mmol/L丙酮酸溶液，加入100μLDNPH溶液，混合均匀，加入10mol/LNaOH调节溶液呈碱性，作为薄层层析标准品。

3、点样及展开：将距离TLC板底边约2cm处定为点样基线，小心地用毛细管将以上样品和标准品点样于TLC板上，待样品干后，将TLC板放入预先用展开剂饱和的展开室中，展开剂的液面在点样基线以下0.5～1.0cm，切勿浸过样品。展开约30min后，取出TCL板，晾干。测量并按公式计算比移值(Rf)。

在以DL-同型半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和L-胱氨酸为底物的同型反应溶液以及α-丁酮酸和丙酮酸溶液中加入DNPH后，α-丁酮酸和丙酮酸溶液中出现了黄色浑浊(图1-A，样品1和4)，以L-甲硫氨酸、DL-同型半胱氨酸为底物的反应溶液中出现了橙红色浑浊(图1-A，样品2和3)，以L-半胱氨酸和L-胱氨酸为底物的反应溶液仍然保持澄清(图1-A，样品5和6)。用碱液调节溶液pH呈碱性后，有沉淀形成的样品1～4沉淀溶解并呈红棕色，而没有沉淀形成的样品5和6则仍旧呈黄色(图1-B)。

取上述1～6样品溶液点样于制备好的TLC板上，用两种展开剂进行薄层层析，层析结果如图2所示。图2左边的箭头所示位置为α-丁酮酸与DNPH反应生成相应的2,4-二硝基苯腙(样品1)在层析中的迁移位置，右边的箭头为丙酮酸与DNPH反应生成对应的2,4-二硝基苯腙(样品4)在层析中的迁移位置，Rf＝0.65。图中，以L-甲硫氨酸、DL-同型半胱氨酸为底物的酶反应溶液中生成的酮酸与DNPH反应生成对应的2,4-二硝基苯腙(样品2和3)在层析中的迁移位置与左边箭头所示位置相近；加入DNPH后的以L-半胱氨酸和L-胱氨酸为底物的反应溶液(样品5和6)则在上述两个位置均没出现斑点。

4、相对活性的测定：以L-甲硫氨酸、DL-同型半胱氨酸、L-半胱氨酸及L-胱氨酸为底物，按照酶活测试方法，以同型半胱氨酸脱硫酶对L-甲硫氨酸底物的活性为100％，对其他底物的活性以相对活性表示。

酶活性测试方法按照Tanaka等的方法进行，稍有改动：取2.0mL底物溶液于37℃水浴预热，用反应液(为添加有1umol/L～100mmol/L的1、4-二硫苏糖醇或三羧乙基膦、0.1umol/L～10mmol/L磷酸吡哆醛、pH7.5～10.0的磷酸钾缓冲溶液)将同型半胱氨酸脱硫酶溶液稀释到合适浓度，取0.02mL加入到底物溶液中，立刻计时开始反应，恰好反应10min，加入0.25mL反应终止液混合均匀，终止反应。取上述反应混合液1.0mL，加入2.0mL的1mol/L的NaAc(pH5.0)和0.8mL、0.1％(m/v)MBTH混合均匀，50℃水浴加热30min，然后于25℃温育30min。用紫外分光光度计测定320nm的吸光度。取不含酶的酶稀释缓冲液

同样进行上述操作，作为空白对照调零。酶活性单位的计算如下：

U n i t s / v i a l e n z y m e = \frac{(A_{320} T e s t - A_{320} B l a n k) (2.27) (3.8) (d f)}{(15.74) (10) (0.02) (1)}

结果显示同型半胱氨酸脱硫酶不仅能作用于DL-同型半胱氨酸，也能催化L-甲硫氨酸的裂解，对DL-同型半胱氨酸的活性约为对L-甲硫氨酸活性的1.4倍；但几乎不能作用于L-半胱氨酸及L-胱氨酸。

同型半胱氨酸脱硫酶催化DL-同型半胱氨酸反应生成α-丁酮酸、氨和H₂S；与L-甲硫氨酸反应生成α-丁酮酸、氨和甲硫醇。检测血液中同型半胱氨酸浓度时，可以通过检测H₂S的生成量来排除血液中L-甲硫氨酸的干扰。因此，此发明中的同型半胱氨酸脱硫酶用于检测血液中同型半胱氨酸浓度时将不会受到体内L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸及L-胱氨酸的干扰，这是此酶的一个重要特性。

实施例2同型半胱氨酸脱硫酶稳定性考察

现市场上试剂盒中的酶是以液体形式存在，放在4℃冰箱中保存。现通过测定酶活来比较不同储存条件下酶的活性。酶活的测定方法按照实施例1进行。

实验表明：当酶贮存在4℃时，贮存在100mmol/L磷酸钾缓冲液中的酶在30天后相对活性下降到原始酶活的40％左右(图3中C曲线)；贮存在含有20μmol/LPLP的100mmol/L磷酸钾缓冲液中，30天后酶的相对活性保持原始酶活的50％以上(图3中B曲线)；贮存在酶稀释缓冲液(添加有1umol/L～100mmol/L的1、4-二硫苏糖醇或三羧乙基膦、0.1umol/L～10mmol/L磷酸吡哆醛、pH7.5～10.0的磷酸钾缓冲溶液)中(图3中A曲线)，30天后酶的相对活性仍能保持原始酶活的60％。

两种处理方式的酶活比较：处理1为将液体同型半胱氨酸脱硫酶贮存在反应液(配方同实施例1)中，处理2为将同型半胱氨酸脱硫酶制备成冻干粉，然后贮存在反应液(配方同实施例1)中。比较两种不同处理方法后酶的活性，实验显示：液体同型半胱氨酸脱硫酶贮存在反应液中，30天后仍能保持原始酶活的60％，储存6个月时，酶活下降到20％以下，且有絮状沉淀出现。而将同型半胱氨酸脱硫酶制备成冻干粉后溶于反应液中，在保存12个月时依然有80％以上的酶活，保存24个月时，还有60％的酶活，其活性显著提高。如图4所示。

将同型半胱氨酸脱硫酶制备成冻干粉的方法如下：

同型半胱氨酸脱硫酶溶液在冻干前需加入一定保护剂进行保护，优选的保护剂配方为：5mmPBS缓冲液、10umol/L的PLP、2％甘露醇、1％蔗糖、15mmol/L的甘氨酸。

酶的冷冻冻干方法包括以下步骤：

1、将加入保护剂的同型半胱氨酸脱硫酶溶液冷冻至-10℃～-70℃进行预冻，更优选的温度为-40℃～-50℃；后保温2～8小时，优选的时间为3～6小时。

2、抽真空，加热至-20℃～-40℃进行升华干燥，更优选的温度为-25℃～-35℃。优选的方案是抽真空使压力到达15～20pa，升温的时间优选4～10小时，更优选5～7小时。升华干燥过程至升华界面达到瓶底并消失，再保温2h之后结束。

3、再加热至10℃～50℃进行解析干燥，优选温度为15℃～25℃，优选的升温时间为5～9小时，更优选6～8小时，升温后再保温4～6小时。最终获得稳定性高的酶粉。图5所示为冻干后酶法的HPLC图，其纯度达到99％以上。图6所示为冻干后成品，酶粉为饼形，复溶性好，加水溶解后酶液澄清无沉淀。干燥失重控制在5％以内，酶效价为12U/mg。

实施例3

一种检测同型半胱氨酸的试剂盒，包括同型半胱氨酸脱硫酶、反应液、显色液I、显色液Ⅱ、不同浓度的Hcy对照品和质控品血清；所述同型半胱氨酸脱硫酶为保藏号为CCTCCNO：M209255的重组工程菌菌株的分泌产物；所述反应液为添加有1umol/L～100mmol/L的1、4-二硫苏糖醇或三羧乙基膦、0.1umol/L～10mmol/L磷酸吡哆醛、pH7.5～10.0的磷酸钾缓冲溶液；所述显色剂Ⅰ为含有1～100mmol/L的二甲基对苯胺硫酸盐的1mol/L的H₂SO₄溶液；所述显色液Ⅱ为0.001～1mol/L的Fe(NH₄)₂SO₄溶液。

利用上述试剂盒检测同型半胱氨酸的方法，包括如下步骤：在2个试管中分别加入等量的待测样品和标准品，然后向两个试管中分别加入反应液，37℃水浴锅中反应5分钟，向两个试管中分别加入显色液反应10分钟，测定反应后的样品和对照品在670nm的吸光值；按照下列公式计算待测样品中同型半胱氨酸的浓度。其中，显色液为显色液Ⅰ和显色液Ⅱ按照10:1的体积比混合而成；所述样品：反应液：显色液的体积比为1：5：1。

样品浓度＝样品吸光度/标准吸光度×标准浓度。

另外，试剂盒中还配备有质控品，建议每3天校准一次。

实施例4

利用荧光仪检测Hcy浓度。按照实施例3中的方法配置各试剂，样品、反应液、显色液按1：5：1比例反应，在激发波长为615nm，发射波长为685nm下测定样品和标准品的荧光强度，根据实施例3中的计算公式计算同型半胱氨酸的浓度。

实施例5

利用半/全自动生化仪检测Hcy浓度。本实施例的同型半胱氨酸试剂盒为双试剂，按样品量配置好反应液和显色液。自动生化仪上设定温度为37℃，加入反应液，反应时间为5分钟，后加入显色液，反应时间为10分钟，测试波长为660nm/700nm，样品、反应液和显色液的体积比为1：5：1。按照实施例3中计算样品浓度。

实施例6方法学验证

线性：在血浆中加入不同量的Hcy标准溶液，配置成0、2.5、5、10、20、30、40、50umol/L的浓度，按照实施例3测试670nm吸光值，以添加的Hcy浓度为X轴，生产产物甲基蓝的670nm吸收值为Y轴，制作标准曲线，进行线性回归，建立回归方程，如图7所示，其标准曲线线性回归方程为Y＝0.0158X+0.0235，R2达到0.998以上，表明线性关系较好。

重复性与精密度：在空白血浆中加入Hcy标准溶液，配置成浓度为7、29.5umol/L的Hcy质控品。每种浓度配置6份，在同一天内按照实施例3条件进行，计算RSD值，结果如表1所示，结果表明本方法的重复性较好，水平1(7umol/L)的精密度(RSD)为4.32％；水平2(29.5umol/L)的精密度为3.72％，符合要求。按上述同样方法，配置7、29.5umol/L的Hcy质控品各18份，每周取样一次按照实施例3进行测试，每次3个样品，共取样6周，结果如表2所示，水平1(7umol/L)的精密度(RSD)为5.38％；水平2(29.5umol/L)的精密度为4.30％，符合测试要求。

表1为Hcy重复性测试

序号	1	2	3	4	5	6
							水平1(7umol/L)	0.126	0.141	0.130	0.137	0.131	0.128
水平2(29.5umol/L)	0.495	0.510	0.472	0.521	0.490	0.517

表2为Hcy精密度测试结果

序号	1	2	3	4	5	6
							水平1(7umol/L)	0.130	0.135	0.142	0.127	0.130	0.145
水平2(29.5umol/L)	0.520	0.472	0.480	0.513	0.482	0.516

实施例8

用本发明的检测方法在分光光度计和生化自动仪上测定血清样品中的Hcy，并将检测的结果与HPLC测定结果进行比较，比较的样本数为20个，结果如图8所示，使用分光光度计的R值平方大于0.98。表明本方法结果可靠，可在分光光度计上使用。

Claims

1.一种检测同型半胱氨酸的试剂盒，其特征在于，包括同型半胱氨酸脱硫酶、反应液、显色液I、显色液Ⅱ、Hcy对照品和质控品血清；所述同型半胱氨酸脱硫酶为保藏号为CCTCCNO：M209255的重组工程菌菌株的分泌产物；所述反应液为添加有1umol/L～100mmol/L的1、4-二硫苏糖醇或三羧乙基膦0.1umol/L～10mmol/L磷酸吡哆醛、pH7.5～10.0的磷酸钾缓冲溶液；所述显色剂Ⅰ为含有1～100mmol/L的二甲基对苯胺硫酸盐的1mol/L的H₂SO₄溶液；所述显色液Ⅱ为0.001～1mol/L的Fe(NH₄)₂SO₄溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，同型半胱氨酸脱硫酶为液体酶溶液或冻干粉末。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，同型半胱氨酸脱硫酶为冻干粉末的制备方法为：

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，S2中冷冻至-40℃～-50℃进行预冻，后保温4～6小时。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，S3中抽真空使压力到达15～20pa；升温的时间为4～10小时。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，S4中加热至15℃～25℃进行解析干燥，升温的时间为5～9小时。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂Ⅰ为含有1～10mmol/L的二甲基对苯胺硫酸盐的1mol/L的H₂SO₄溶液。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液Ⅱ为0.1～0.5mol/L的Fe(NH₄)₂SO₄溶液。

9.利用权利要求1所述试剂盒检测同型半胱氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：向待测样品和标准品中分别加入反应液，37℃水浴锅中反应5分钟，再分别加入显色液反应10分钟，测定反应后的样品和对照品在670nm的吸光值；按照下列公式计算待测样品中同型半胱氨酸的浓度；

样品浓度＝样品吸光度/标准吸光度×标准浓度；

其中，显色液为显色液Ⅰ和显色液Ⅱ按照10:1的体积比混合而成；所述样品：

反应液：显色液的体积比为1：5：1。