CN104316692A

CN104316692A - 一种新生儿总半乳糖检测试剂盒、其使用方法及制备方法

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Publication number: CN104316692A
Application number: CN201410577365.0A
Authority: CN
Inventors: 冯健明
Original assignee: Guangzhou Fenghua Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Fenghua Biological Co.,Ltd.
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-10-24
Also published as: CN104316692B

Abstract

本发明公开了一种新生儿总半乳糖检测试剂盒，包括实验缓冲液，碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉、半乳糖脱氢酶冻干粉、半乳糖滤纸干血片校准品、质控品、铜试剂和白色反应板。本发明还公开了新生儿总半乳糖检测试剂盒的使用方法和制备方法。本发明的新生儿总半乳糖检测试剂盒经济、省时、省工，可用于新生儿半乳糖血症筛查，为新生儿筛查的普及奠定良好的技术基础。

Description

一种新生儿总半乳糖检测试剂盒、其使用方法及制备方法

技术领域

本发明涉及新生儿半乳糖血症的筛查领域，尤其涉及一种利用总半乳糖与氧化型辅酶Ⅱ反应生成荧光物质还原型辅酶Ⅱ的原理，快速检测新生儿总半乳糖的试剂盒、其使用方法及制备方法。

背景技术

半乳糖血症是由于半乳糖代谢过程中酶缺陷导致半乳糖利用障碍、有害代谢产物积累，属于常染色体隐性遗传疾病。在临床上较为少见,不同的地区发病率存在一定的差异。沙特阿拉伯东部地区的发病率为12/10万，爱尔兰永久居民的发病几率为1/3万，美国的发病率约为1/5.9万。据报道我国香港地区的发病率为0.25/10万。

在肝脏中，半乳糖在半乳糖激酶(galactokinase，GALK)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(galactose-1-phosphate uridyl-transferase，GALT)和半乳糖尿苷二磷酸-4-表异构酶(uridine-diphosphate galactose-4’epimerase，UDPGa-4-E)的作用下，通过Leloir途径，转变为葡萄糖和能量被组织利用。该代谢过程中任何一种酶的缺陷都将导致半乳糖的异常堆积，堆积的半乳糖分别在醛糖还原酶和脱氢酶的作用下生成半乳糖醇和半乳糖酸。半乳糖及其异常代谢产物的沉积导致半乳糖血症的发生。

(1)经典的半乳糖血症(I型)即半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(galactose-1-phosphate uridyl-transferase，GALT)缺陷，占95％。该类型患儿常在围生期即发病，表现为进食奶类后出现呕吐、拒食、体重不增、腹泻、嗜睡和肌张力减低等症状，随后出现黄疸及肝脏肿大，如未得到及时诊治，患儿可出现腹水、肝功能衰竭、出血等终末期症状，多于新生儿期夭折。

(2)Ⅱ型半乳糖激酶(GALK)缺陷，较罕见。病情比I型半乳糖血症轻，白内障常见，智力发育正常或迟缓，血中半乳糖浓度增高，尿中出现半乳糖或半乳糖醇，但无氨基酸和蛋白。

(3)Ⅲ型半乳糖尿苷二磷酸-4-表异构酶(UDPGal-4-E)缺陷，罕见。临床表现不一，可无症状或类似于I型半乳糖血症。

因半乳糖血症的临床表现无特异性，故其诊断多依赖于实验室检查。目前常用的诊断方法主要为酶学检测、血和尿中半乳糖及其代谢产物的检测和基因诊断。

(1)酶学检测：主要是针对GALT缺陷的检测。检验原理主要依赖于Beutler试验中间接检测红细胞中GAIT酶活性的方法。此方法在全血或者血滤纸片中加入混有尿苷-二磷酸葡糖、l-磷酸半乳糖(Ga-1-P)、三磷酸吡啶核苷酸(TPN)的混合物，孵育一段时间，如果GAIT活性正常，则Gal-1-P和尿苷二磷酸葡糖可以在GALT的作用下生成α-1-磷酸葡糖。α-1-磷酸葡糖在变位酶的作用下生成β-1-磷酸葡糖，进而在葡糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)存在的情况下可以还原TPN生成还原型的TPN，后者被波长为465μm的紫外灯激发可以产生荧光。该测定方法具有季节差异性，容易受到酶活性抑制因素的影响，且反应依赖G6PD的存在，易造成假阳性结果。同时，半乳糖代谢主要在肝内进行，而目前酶学检测都是检测红细胞内对GALT的活性，并不能完全反映肝内半乳糖的代谢水平。

(2)血和尿中半乳糖及其代谢产物的检测：由于半乳糖代谢途径的阻断及旁路代谢的不完全，人体内可以出现半乳糖、1-磷酸半乳糖、半乳糖醇、半乳糖酸等代谢产物堆积。由于1-磷酸半乳糖是半乳糖血症的主要致病物质，因此常通过检测半乳糖、1-磷酸半乳糖的浓度来诊断半乳糖血症。代谢物的检测依赖于半乳糖的摄入，容易产生假阴性。此外，在保证假阴性率的前提下，通过代谢物检测无法判断属于哪一种酶缺陷。

(3)基因诊断：目前已经发现了近20种GALK基因突变，160余种GALT基因突变，近10种UDPGal-4-E基因突变，通过对致病突变的检测可以诊断半乳糖血症。基因突变因人种而异，具有地域性，而我国人群中尚未有半乳糖血症常见突变的报道。同时由于基因诊断耗时相对较长，因此主要用于辅助诊断。

发明内容

本发明的目的在于解决现有的新生儿半乳糖血症筛查准确性差，检测速度慢，工作强度高的问题。

因此，本发明提供了一种新生儿总半乳糖检测试剂盒，包括实验缓冲液，碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的冻干粉、半乳糖脱氢酶冻干粉，半乳糖滤纸干血片校准品、质控品，铜试剂和白色反应板。

在上述技术方案中，由于人体中的半乳糖主要是D-半乳糖，这里总半乳糖是指D-半乳糖和D-半乳糖-1-磷酸。无论是三种酶(GALT、GALK、UDPGal-4-E)中的哪一种的缺陷引起的半乳糖血症，患者体内的D-半乳糖或者D-半乳糖-1-磷酸的量会升高，换句话说，其体内总的半乳糖量是升高的，因此通过测量总半乳糖的量，可以筛查新生儿半乳糖血症。

在上述技术方案中，利用试剂盒检测新生儿总半乳糖的原理为:首先，在试剂盒中的碱性磷酸酶的作用下，D-半乳糖-1-磷酸转化成D-半乳糖，D-半乳糖和氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)在半乳糖脱氢酶的作用下转化成D-半乳糖酸内酯和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)在355nm的激发光的作用下会发射出波长为460nm的蓝色荧光，还原型辅酶Ⅱ的荧光强度与总半乳糖含量成正比，通过检测蓝色荧光的强度，结合标准曲线，即可得出总半乳糖的含量。其中，半乳糖脱氢酶又名半乳糖1-脱氢酶。本发明的试剂盒测定新生儿滤纸干血片中总半乳糖的原理简单概括如下：

在上述技术方案中，碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的冻干粉可以是两者的混合冻干粉，也可以是独立冻干粉，碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉使用起来更为方便。

在上述技术方案中，试剂盒中的半乳糖滤纸干血片校准品、质控品是由D-半乳糖溶解在校准品和质控品基质中，并滴加在滤纸上制得。半乳糖滤纸干血片校准品、质控品的基质优选脱纤维绵羊全血，其中基质的血细胞比容为45％～90％，以50％～55％为佳。半乳糖滤纸干血片校准品上设有3～10个校准位点，每个校准位点的D-半乳糖浓度不同，且各浓度呈梯度分布，优选为6个校准位点。半乳糖滤纸干血片质控品上设有1～5个质控位点，每个质控位点的D-半乳糖浓度不同，优选为2个质控位点。半乳糖滤纸干血片校准品用来绘制标准曲线，以便用来计算待测样品中的总半乳糖浓度。半乳糖滤纸干血片质控品用来校准结果测定的准确性。校准品和质控品所使用的干血滤纸片具有用血量少、保存简单、便于运输等优点。

在上述技术方案中，铜试剂的作用是作为荧光检测时的荧光稳定剂，铜试剂中起到荧光稳定效果的主要物质是重金属Cu²⁺，由于Cu²⁺比较容易得到，成本低廉，故在此选择铜试剂作为荧光稳定剂。在此，铜试剂优选为含有硫酸铜、碳酸钠和酒石酸钾钠的铜试剂。

在上述技术方案中，实验缓冲液主要用于溶解碱性磷酸酶、氧化型辅酶Ⅱ、半乳糖脱氢酶，保持溶液的pH稳定，以维持酶活性的稳定，在此不对缓冲液的种类不作限定。为了保持试剂盒中各试剂的稳定性，试剂盒应于2～8℃下保存。

作为对上述方案的进一步改进，所述实验缓冲液为含有KCl的Tris-HCl缓冲液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为5～100mmol/L，KCl的摩尔浓度为10～100mmol/L。Tris-HCl缓冲液对生物化学过程干扰很小，且不与重金属离子发生沉淀，其中加入的KCl能够保持酶活性。

作为对上述方案的进一步改进，所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的冻干粉的制备方法为：a)制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液，其包括浓度为0.5～5000U/mL的碱性磷酸酶，浓度为10～1000mg/mL的氧化型辅酶Ⅱ，摩尔浓度为10～20mmol/L的Tris-HCl，摩尔浓度为40～60mmol/L的KCl，摩尔浓度为0.5～1.5mmol/L的MgCl₂，质量百分比浓度为1～3％的海藻糖，质量百分比浓度为2～4％的甘露醇；b)将步骤a)中的混合液进行真空冷冻干燥，即得所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的冻干粉。

在上述技术方案中，所述步骤a)中，碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液的制备是将碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ溶解在Tris-HCl缓冲液中，在此，Tris-HCl缓冲液中加入了KCl、MgCl₂、海藻糖和甘露醇，其中，KCl、MgCl₂的作用是在冻干过程中保持酶的活性，海藻糖和甘露醇的作用不仅是在冻干过程中起到保护剂的作用，它们还构成了混合冻干粉的骨架，保证了混合冻干粉的结构的牢固性和稳定性。

作为对上述方案的更进一步改进，所述步骤a)为：制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液，其包括浓度为1000U/mL的碱性磷酸酶，浓度为46mg/mL的氧化型辅酶Ⅱ，摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HCl，摩尔浓度为50mmol/L的KCl，摩尔浓度为1mmol/L的MgCl₂，质量百分比浓度为2％的海藻糖，质量百分比浓度为3％的甘露醇。U/mL是指液态酶制剂的酶浓度，它是用单位体积酶制剂所含的酶活性单位来表示的。

在上述技术方案中，所述碱性磷酸酶的浓度优选为1000U/mL，氧化型辅酶Ⅱ的浓度优选为46mg/mL，以上浓度的碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ在冻干制备过程中，更容易保证其活性的稳定，同时此浓度的碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ可以保证在分装的过程中，分装体积适量，便于操作。

作为对上述方案的进一步改进，所述半乳糖脱氢酶冻干粉的制备方法为：1)制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为0.05～200U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为0.5～1.5％的BSA，摩尔浓度为0.6～1.0mmol/L的EDTA，摩尔浓度为1.3～5.0mol/L的(NH₄)₂SO₄；2)将步骤1)中的半乳糖脱氢酶溶液进行真空冷冻干燥，即得所述半乳糖脱氢酶冻干粉。为了保证半乳糖脱氢酶的活性，延长其保质期，在此将半乳糖脱氢酶以冻干粉的形式保存，BSA、EDTA和(NH₄)₂SO₄的作用是保持半乳糖脱氢酶活性的稳定。

作为对上述方案的更进一步改进，所述步骤1)为：制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为20U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为1％的BSA，摩尔浓度为0.8mmol/L的EDTA，摩尔浓度为3.2mol/L的(NH₄)₂SO₄。

作为对上述方案的进一步改进，所述半乳糖滤纸干血片校准品、质控品的制备方法为：使用无菌生理盐水洗涤脱纤维绵羊全血调整血细胞比容至50％～55％，向其中加入不同量的D-半乳糖原料以配制不同浓度的校准品和质控品，将配置好的校准品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的A、B、C、D、E、F六个校准位点，将配置好的质控品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的C1、C2两个质控位点上，经室温自然干燥后得到干滤纸片校准品和质控品，用铝箔袋真空密封，各个位点的校准品浓度可如下表所示：

作为对上述方案的进一步改进，所述铜试剂中包括摩尔浓度为0.5～8.0mmol/L的硫酸铜，摩尔浓度为10～250mmol/L的碳酸钠，摩尔浓度为0.5～10mmol/L的酒石酸钾钠。

本发明还提供了一种新生儿总半乳糖检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)准备所需试剂：取出试剂盒，将其中的铜试剂仍于2～8℃下保存，即用即取，试剂盒中其他试剂平衡至室温；配制质量百分比浓度为80％的乙醇溶液；配制反应工作液：将碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的冻干粉加入到实验缓冲液中，再加入半乳糖脱氢酶，混匀备用，其中，半乳糖脱氢酶的最终浓度为0.0015～6U/mL，碱性磷酸酶的最终浓度为0.001～10U/mL，氧化型辅酶Ⅱ的最终浓度为0.13～13mg/mL；

2)将半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和采集的滤纸干血片样本用直径3.0mm自动打孔仪打入塑料排钉上；

3)向洁净的普通反应板的微孔中分别加入100～150μL的质量百分比浓度为80％的乙醇溶液，将半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本浸入乙醇溶液中约1min，然后将挂有半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本的塑料排钉烘干；

4)向白色反应板每孔中分别加入200～300μL反应工作液，将烘干后的半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本放入白色反应板的微孔中，37℃缓慢震荡0.5～1小时；

5)取出铜试剂，向白色反应管的每孔中分别加入100～200μL铜试剂，混合均匀，得到最终反应物；

6)样本中总半乳糖浓度的测定：

(1)将半乳糖滤纸干血片校准品的不同浓度的校准位点的最终反应物分别放入荧光分析仪中，检测各个校准位点的最终反应物在波长为355nm的激发光的作用下，发射出的波长为460nm的蓝色荧光的荧光强度，并根据已知的半乳糖滤纸干血片校准品各个位点的D-半乳糖的浓度，绘制标准曲线；

(2)用荧光分析仪测定滤纸干血片样本的最终反应物在波长为355nm的激发光的作用下，发射出的波长为460nm蓝色荧光的荧光强度，并根据标准曲线，得出滤纸干血片样本中的总半乳糖浓度。

在上述技术方案中，优选地，所述步骤1)中，配制好的反应工作液中，半乳糖脱氢酶的最终浓度为0.03～0.07U/mL，碱性磷酸酶的最终浓度为1.7～2.3U/mL，氧化型辅酶Ⅱ的最终浓度为0.5～0.7mg/mL。所述步骤3)的目的是固定血斑蛋白和红细胞，以便于更为精准的测量总半乳糖的浓度。将塑料排钉烘干时，可于在37℃下烘干20min，也可于60℃，烘干10min，室温静置，冷却至37℃左右。本发明的使用方法操作简单、方便，可实现新生儿半乳糖样本的大批量检测，且检测准确率高。

本发明还提供了所述新生儿总半乳糖检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)配制实验缓冲液、铜试剂、碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ混合溶液、半乳糖脱氢酶溶液；

2)以不同浓度的D-半乳糖纯品加入基质中混合，然后滴加在滤纸上制备半乳糖滤纸干血片校准品、质控品；

3)分装所述实验缓冲液、铜试剂、半乳糖滤纸干血片校准品、质控品；分装所述半乳糖脱氢酶溶液并冻成干粉，分装所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ混合溶液并冻成干粉；

4)贴标签；

5)组装为成品。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明的试剂盒通过测量新生儿总半乳糖含量，即可判断新生儿是否患有半乳糖血症，可提高临床检验速度和检验数量，大幅度降低人为误差，减轻临床工作强度；且待检标本用量少，填补了国内该类试剂的空白，降低了成本。同时，本发明适用于全自动设备，整个实验用时不超过1小时，减少了工作强度，操作简单、省时。本发明的试剂盒使用时，可利用滤纸干血片取新生儿足跟血，通过酶促反应定量分析总半乳糖含量，从而在筛查半乳糖血症时，不必采集大量血液，就能进行初步筛查，更适合应用在新生儿筛查中。本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确性好、精密性好和热稳定性好等优点，本发明的试剂盒的检测灵敏度不高于0.75mg/dL；在特异性方面，检测葡萄糖1200mg/dL，甘露糖10mg/dL，果糖25mg/dL，维生素C3mg/dL，胆红素40mg/dL，血红蛋白25g/dL对总半乳糖的检测无显著影响；在精密度方面，本发明的试剂盒的批内精密度不超过10％，批间精密度不超过15％；在稳定性方面，本发明的试剂盒于37℃烘烤3天后，检测结果仍满足技术性能指标要求。本发明的试剂盒的使用方法中，采用荧光分析技术，实验方法简单快速，可自动化操作，可实现大批量样本检测。

附图说明

图1为本发明试剂盒总半乳糖浓度检测剂量-反应标准曲线；

图2为新生儿总半乳糖检测试剂盒制备方法流程图；

图3为热稳定性测试中的荧光值走势图；

图4为Ani Labsystems公司对照试剂与本发明的试剂盒试剂检测结果比较的线性相关图；

图5为PerkinElmer公司对照试剂与本发明的试剂盒试剂检测结果比较的线性相关图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，凡依据本发明内容所作的等同变换，均同理包含在本发明的范围内。

实施例中的所使用的D-半乳糖纯品购于Sigma公司；96孔微孔空白白色反应板(8×12孔)为NUNC产品；氧化型辅酶Ⅱ为Roche进口分装品，碱性磷酸酶、半乳糖脱氢酶及其他化学试剂为国产分析纯；荧光分析仪，恒温振荡器均为广州市丰华生物有限公司。其中，荧光分析仪(型号：Auto TRFIA-2、AutoTRFIA-4、Auto TRFIA-8)可通过建立新生儿半乳糖血症筛查试剂盒检测程序，实现固定干燥、孵育反应、检测判读等步骤的自动化操作。

实施例1

新生儿总半乳糖检测试剂盒

新生儿总半乳糖检测试剂盒包含以下成分：1)实验缓冲液；2)碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉；3)半乳糖脱氢酶冻干粉；4)半乳糖滤纸干血片校准品、质控品；5)铜试剂；6)96孔微孔空白白色反应板。

其中，实验缓冲液为含有KCl的Tris-HCl缓冲液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mmol/L，KCl的摩尔浓度为50mmol/L，pH为8.0。

碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉的制备方法为：a)制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液，其包括浓度为1000U/mL的碱性磷酸酶，浓度为46mg/mL的氧化型辅酶Ⅱ，摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HCl，摩尔浓度为50mmol/L的KCl，摩尔浓度为1mmol/L的MgCl₂，质量百分比浓度为2％的海藻糖，质量百分比浓度为3％的甘露醇；b)将步骤a)中的混合液进行真空冷冻干燥，即得所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉。

铜试剂中包括摩尔浓度为1.02mmol/L的硫酸铜，摩尔浓度为41.7mmol/L的碳酸钠，摩尔浓度为1.78mmol/L的酒石酸钾钠。

半乳糖脱氢酶冻干粉的制备方法为：1)制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为20U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为1％的BSA，摩尔浓度为0.8mmol/L的EDTA，摩尔浓度为3.2mol/L的(NH₄)₂SO₄；2)将步骤1)中的半乳糖脱氢酶溶液进行真空冷冻干燥，即得所述半乳糖脱氢酶冻干粉。

半乳糖滤纸干血片校准品、质控品的制备方法为：使用无菌生理盐水洗涤脱纤维绵羊全血，调整血细胞比容至50％～55％，向其中加入不同量的D-半乳糖原料以配制不同浓度的校准品和质控品，将配置好的校准品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的A、B、C、D、E、F六个校准位点，将配置好的质控品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的C1、C2两个质控位点上，经室温自然干燥后得到干滤纸片校准品和质控品，用铝箔袋真空密封，各个位点的校准品浓度如下：

新生儿总半乳糖检测试剂盒的制备方法

新生儿总半乳糖检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)根据试剂盒中各组分的配比要求，配制实验缓冲液、铜试剂、碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ混合溶液、半乳糖脱氢酶溶液；

2)根据各个校准位点和质控位点对D-半乳糖浓度的要求，将不同浓度的D-半乳糖纯品加入基质中混合，制成不同浓度的校准品和质控品，然后将校准品和质控品分别滴加在相应的校准位点和质控位点上；

3)分装制得的实验缓冲液、铜试剂、半乳糖滤纸干血片校准品、质控品；按照400μL/瓶分装制得的碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ混合溶液并冻成干粉；按照60μL/瓶分装制得的半乳糖脱氢酶溶液并冻成干粉；

4)贴标签；

5)组装为成品。

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出3份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成新生儿半乳糖血症筛查试剂盒(荧光法)。组装完成后还需抽检合格后才能出厂。

新生儿总半乳糖检测试剂盒的制备方法的流程图如图2所示。

新生儿总半乳糖检测试剂盒的使用方法

新生儿总半乳糖检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)准备所需试剂：取出试剂盒，将其中的铜试剂仍于2～8℃下保存，即用即取，试剂盒中其他试剂平衡至室温；将恒温设备打开，温度设定为37℃；配制质量百分比浓度为80％的乙醇溶液；配制反应工作液：将碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉加入到实验缓冲液中，再加入半乳糖脱氢酶，定容至24ml，混匀备用，其中，半乳糖脱氢酶的最终浓度为0.05U/mL，碱性磷酸酶的最终浓度为2U/mL，氧化型辅酶Ⅱ的最终浓度为0.6mg/mL；

3)向洁净的普通反应板的微孔中分别加入100μL的质量百分比浓度为80％的乙醇溶液，将半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本浸入乙醇溶液中约1min，然后将挂有半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本的塑料排钉在37℃下烘干20min；

4)向白色反应板每孔中分别加入200μL反应工作液，将烘干后的半乳糖滤纸干血片校准品、质控品和滤纸干血片样本放入白色反应板的微孔中，37℃缓慢震荡0.5小时；

5)取出铜试剂，向白色反应管的每孔中分别加入100μL铜试剂，混合均匀，得到最终反应物；

6)样本中总半乳糖浓度的测定：

(1)将半乳糖滤纸干血片校准品的6个不同浓度的校准位点的最终反应物分别放入荧光分析仪中，检测各个校准位点的最终反应物在波长为355nm的激发光的作用下，发射出的波长为460nm的蓝色荧光的荧光强度，并根据已知的半乳糖滤纸干血片校准品各个位点的D-半乳糖的浓度，绘制标准曲线(如图1所示)；

步骤2)中的滤纸干血片样本的采集方法如下：对被采血新生儿足跟进行按摩或热敷，并用75％酒精消毒皮肤后，使用一次性采血针刺足跟内或外侧，深度小于3毫米，用干棉球拭去第一滴血，取第二滴血；将滤纸片接触血滴，切勿触及足跟皮肤，使血自然渗透至滤纸背面，至少采集三个血斑；样本采集后，滤纸应平放室内自然晾干，2～8℃保存。

实施例2

新生儿总半乳糖检测试剂盒

其中，实验缓冲液为含有KCl的Tris-HCl缓冲液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mmol/L，KCl的摩尔浓度为10mmol/L。

碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉的制备方法为：a)制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液，其中，碱性磷酸酶的浓度为25U/mL，氧化型辅酶Ⅱ的浓度为1000mg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为10mmol/L，KCl的摩尔浓度为40mmol/L，MgCl₂0.5mmol/L，海藻糖的质量百分比浓度为1％，甘露醇的质量百分比浓度为2％；b)将步骤a)中的混合液进行真空冷冻干燥，即得所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉。

铜试剂为含有硫酸铜的碳酸钠溶液，其中，硫酸铜的摩尔浓度为0.5mmol/L，碳酸钠的摩尔浓度为10mmol/L，酒石酸钾钠的摩尔浓度为0.5mmol/L。

半乳糖脱氢酶冻干粉的制备方法为：1)制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为50U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为1％的BSA，摩尔浓度为0.8mmol/L的EDTA，摩尔浓度为2.2mol/L的(NH₄)₂SO₄；2)将步骤1)中的半乳糖脱氢酶溶液进行真空冷冻干燥，即得所述半乳糖脱氢酶冻干粉。

半乳糖滤纸干血片校准品、质控品的制备方法为：使用无菌生理盐水洗涤脱纤维绵羊全血，调整血细胞比容至50％，向其中加入不同量的D-半乳糖原料以配制不同浓度的校准品和质控品，将配置好的校准品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的A、B、C、D、E、F六个校准位点，将配置好的质控品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的C1、C2两个质控位点上，经室温自然干燥后得到干滤纸片校准品和质控品，用铝箔袋真空密封，各个位点的校准品浓度如下：

实施例3

新生儿总半乳糖检测试剂盒

其中，实验缓冲液为含有KCl的Tris-HCl缓冲液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为100mmol/L，KCl的摩尔浓度为100mmol/L。

碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉的制备方法为：a)制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液，其中，碱性磷酸酶的浓度为5000U/mL，氧化型辅酶Ⅱ的浓度为10mg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为20mmol/L，KCl的摩尔浓度为50mmol/L，MgCl₂1mmol/L，海藻糖的质量百分比浓度为2％，甘露醇的质量百分比浓度为3％；b)将步骤a)中的混合液进行真空冷冻干燥，即得所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉。

铜试剂为含有硫酸铜的碳酸钠溶液，其中，硫酸铜的摩尔浓度为3.9mmol/L，碳酸钠的摩尔浓度为120mmol/L，酒石酸钾钠的摩尔浓度为5mmol/L。

半乳糖脱氢酶冻干粉的制备方法为：1)制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为200U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为1％的BSA，摩尔浓度为0.8mmol/L的EDTA，摩尔浓度为2.2mol/L的(NH₄)₂SO₄；2)将步骤1)中的半乳糖脱氢酶溶液进行真空冷冻干燥，即得所述半乳糖脱氢酶冻干粉。

实施例4

新生儿总半乳糖检测试剂盒

其中，实验缓冲液为含有KCl的Tris-HCl缓冲液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为15mmol/L，KCl的摩尔浓度为20mmol/L。

碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉的制备方法为：a)制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液，其中，碱性磷酸酶的浓度为100U/mL，氧化型辅酶Ⅱ的浓度为100mg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为15mmol/L，KCl的摩尔浓度为20mmol/L，MgCl₂1mmol/L，海藻糖的质量百分比浓度为2％，甘露醇的质量百分比浓度为3％；b)将步骤a)中的混合液进行真空冷冻干燥，即得所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合冻干粉。

铜试剂为含有硫酸铜的碳酸钠溶液，其中，硫酸铜的摩尔浓度为8.0mmol/L，碳酸钠的摩尔浓度为250mmol/L，酒石酸钾钠的摩尔浓度为10mmol/L。

半乳糖脱氢酶冻干粉的制备方法为：1)制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为0.05U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为1％的BSA，摩尔浓度为0.8mmol/L的EDTA，摩尔浓度为2.2mol/L的(NH₄)₂SO₄；2)将步骤1)中的半乳糖脱氢酶溶液进行真空冷冻干燥，即得所述半乳糖脱氢酶冻干粉。

半乳糖滤纸干血片校准品、质控品的制备方法为：使用无菌生理盐水洗涤脱纤维绵羊全血，调整血细胞比容至55％，向其中加入不同量的D-半乳糖原料以配制不同浓度的校准品和质控品，将配置好的校准品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的A、B、C、D、E、F六个校准位点，将配置好的质控品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的C1、C2两个质控位点上，经室温自然干燥后得到干滤纸片校准品和质控品，用铝箔袋真空密封，各个位点的校准品浓度如下：

实施例5

试剂盒的分析性能评价

以上实施例1制备的新生儿总半乳糖检测试剂盒为例，进行如下性能指标评价：

剂量反应曲线和线性范围

将半乳糖滤纸干血片校准品浓度值与相应反应孔测定的荧光值用LIN-MEAS数学模型进行拟合，绘制标准曲线。在试剂盒的测量范围内，剂量-反应标准曲线线性相关系数应不低于0.9900，在本实施例中，剂量-反应标准曲线线性相关系数达到0.999，如图1所示。

分析灵敏度

将试剂盒校准品A点重复检测20次，计算其荧光值均值()和标准偏差(SD)，求得相对应的浓度值，结果不高于0.75mg/dL，结果如下表所示。

特异性

检测葡萄糖1200mg/dL，甘露糖10mg/dL，果糖25mg/dL，维生素C 3mg/dL，胆红素40mg/dL，谷胱甘肽60mg/dL，血红蛋白25g/dL对半乳糖的检测无显著影响；

准确性

以Ani Labsystems公司新生儿半乳糖试剂盒中的校准品和广州市丰华生物工程有限公司校准品为对照，试剂盒半乳糖滤纸干血片校准品的实测效价与标示效价比平均值应在0.900～1.100范围内，在此实施例中，试剂盒半乳糖滤纸干血片校准品的实测效价与标示效价比平均值为0.97。

精密性

一次实验中分别测定在标准曲线范围内高、低2种不同浓度的质控品，各测定10个平行孔，计算测定结果的平均值()与标准差(SD)，批内不精密度结果应符合批内不精密度(CV％)应不超过15.0％。测定结果如下表所示。

用三批试剂盒分别测定低值质控品，每批试剂盒各测10孔，计算30次测定结果的平均值()与标准差(SD)，批间不精密度结果应符合批间不精密度(CV％)应不超过20.0％。测量结果及分析如下表所示。

综上可知，试剂盒的测量精密性，批内不超过15.0％；批间不超过20.0％。

质控

10孔平行测定2种不同浓度的质控品，计算测定结果的平均值()，结果应在允许范围内。数值及分析如下表所示，两个不同浓度质控，测值均在允许范围内。

热稳定性(加速破坏试验)

试剂盒在37℃，3天烘烤后，检测结果符合以上性能指标，说明试剂盒具有良好的热稳定性。热稳定性测试中的荧光值走势图如图3所示。

以上性能指标表明“新生儿总半乳糖检测试剂盒(荧光法)”的线性范围宽、灵敏度高、特异性强、准确性好、精密性好和热稳定性好，完全符合要求。

实施例6

与其他试剂盒的比较

使用本发明的试剂盒与市场上Ani Labsystems公司和PerkinElmer公司的新生儿总半乳糖检测试剂盒(荧光法)检测新生儿滤纸干血片样品值的比较

本发明的试剂盒与市场上Ani Labsystems公司的新生儿总半乳糖检测试剂盒(时间分辨荧光免疫法)检测新生儿滤纸干血片样品值的比较，相关系数为|r|应不低于0.9800，如图4所示。

本发明的试剂盒与市场上PerkinElmer公司的新生儿总半乳糖检测试剂盒(时间分辨荧光免疫法)检测新生儿滤纸干血片样品值的比较，相关系数为|r|应不低于0.9800，如图5所示。

Claims

1.一种新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：包括实验缓冲液，碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的冻干粉、半乳糖脱氢酶冻干粉，半乳糖滤纸干血片校准品、质控品，铜试剂和白色反应板。

2.如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述实验缓冲液为含有KCl的Tris-HCl缓冲液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为5～100mmol/L，KCl的摩尔浓度为10～100mmol/L。

3.如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的冻干粉的制备方法为：a)制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液，其包括浓度为0.5～5000U/mL的碱性磷酸酶，浓度为10～1000mg/mL的氧化型辅酶Ⅱ，摩尔浓度为10～20mmol/L的Tris-HCl，摩尔浓度为40～60mmol/L的KCl，摩尔浓度为0.5～1.5mmol/L的MgCl₂，质量百分比浓度为1～3％的海藻糖，质量百分比浓度为2～4％的甘露醇；b)将步骤a)中的混合液进行真空冷冻干燥，即得所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的冻干粉。

4.如权利要求3所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述步骤a)为：制备碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ的混合液，其包括浓度为1000U/mL的碱性磷酸酶，浓度为46mg/mL的氧化型辅酶Ⅱ，摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HCl，摩尔浓度为50mmol/L的KCl，摩尔浓度为1mmol/L的MgCl₂，质量百分比浓度为2％的海藻糖，质量百分比浓度为3％的甘露醇。

5.如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述半乳糖脱氢酶冻干粉的制备方法为：1)制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为0.05～200U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为0.5～1.5％的BSA，摩尔浓度为0.6～1.0mmol/L的EDTA，摩尔浓度为1.3～5.0mol/L的(NH₄)₂SO₄；2)将步骤1)中的半乳糖脱氢酶溶液进行真空冷冻干燥，即得所述半乳糖脱氢酶冻干粉。

6.如权利要求5所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述步骤1)为：制备半乳糖脱氢酶溶液，其包括浓度为20U/mL的半乳糖脱氢酶，质量百分比浓度为1％的BSA，摩尔浓度为0.8mmol/L的EDTA，摩尔浓度为3.2mol/L的(NH₄)₂SO₄。

7.如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述半乳糖滤纸干血片校准品、质控品的制备方法为：使用无菌生理盐水洗涤脱纤维绵羊全血，调整血细胞比容至50％～55％，分别向其中加入不同量的D-半乳糖原料以配制不同浓度的校准品和质控品，将配置好的校准品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的A、B、C、D、E、F六个校准位点，将配置好的质控品以50μL/滴的体积分别滴加在滤纸的C1、C2两个质控位点上，经室温自然干燥后得到半乳糖干滤纸片校准品和质控品，用铝箔袋真空密封。

8.如权利要求1所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒，其特征在于：所述铜试剂中包括摩尔浓度为0.5～8.0mmol/L的硫酸铜，摩尔浓度为10～250mmol/L的碳酸钠，摩尔浓度为0.5～10mmol/L的酒石酸钾钠。

9.如权利要求1～8中任一项权利要求所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

6)样本中总半乳糖浓度的测定：

10.如权利要求1～8中任一权利要求所述的新生儿总半乳糖检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

3)分装所述实验缓冲液、铜试剂、半乳糖滤纸干血片校准品、质控品；分装所述碱性磷酸酶和氧化型辅酶Ⅱ混合溶液并冻成干粉；分装所述半乳糖脱氢酶溶液并冻成干粉；

4)贴标签；

5)组装为成品。