CN107014934B - 尿液有机酸滤纸片质控品及其制备方法 - Google Patents

尿液有机酸滤纸片质控品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种尿液有机酸滤纸片质控品及其制备方法，制备方法包括如下步骤：(1)配制有机酸标准溶液：分别配制甲基丙二酸、戊二酸、异戊酰甘氨酸、苯丙酮酸、乳清酸以及4‑羟基苯乳酸的标准溶液；(2)配制工作液：以尿液为溶剂，加入所述有机酸标准溶液，得所述工作液；(3)将所述工作液滴加于滤纸片，晾干，即得所述尿液有机酸滤纸片质控品。采用本发明提供的制备方法制得的尿液有机酸滤纸片质控品在‑20℃的条件下可保存至少2个月，从‑20℃条件取出恢复常温后的均一性、稳定性都能符合质控品要求。

Description

尿液有机酸滤纸片质控品及其制备方法
技术领域
本发明涉及分析检测领域，特别是涉及一种尿液有机酸滤纸片质控品的制备方法。
背景技术
遗传代谢病是指一类有生理代谢缺陷的遗传病，包括代谢大分子类疾病：包括溶酶体贮积症(三十几种病)、线粒体病等等，代谢小分子类疾病：氨基酸、有机酸、脂肪酸等。患儿临床表现个体差异很大，临床诊断困难，容易被漏诊或误诊。如不能及时诊断和治疗，死亡率很高。因此，早期诊断、合理治疗是挽救患者生命的关键。
尿液作为人体重要的代谢物质之一，由于无创性、丰富、易于收集、可以提供诊断代谢紊乱的信息等优势，是遗传代谢病检测诊断中非常重要而关键的生物样品。自1966年，Tanaka应用气相色谱-质谱联用技术诊断的检测出尿液中的异戊酰甘氨酸，诊断了异戊酸血症后，这一技术开始应用于有机酸血症的筛查。目前尿液有机酸检测已经成为新生儿筛查中的常规手段了。
有机酸项目共检测132个指标(例如：乳酸、甲基丙二酸、3－羟基丙酸、丙二酸、戊二酸、异戊酰甘氨酸、苯丙酮酸、乳清酸、4－羟基苯乳酸等有机酸)，可诊断多种有机酸血症，辅助诊断氨基酸代谢病和脂肪酸代谢病。但尿液中的化学成分非常复杂且不稳定。根据文献调研，尿液的储存条件十分苛刻，需添加防腐剂以及-70℃冷冻保存，虽然在冷冻条件下可抑制细菌活动，但仍不可避免化合物分解、细菌繁殖而引起基质改变等问题。且由于质控配制数量较大，储存空间也是一个需要重点考虑的问题。另外，目前市面上还未有商品化的尿有机酸滤纸片质控可用于临床实验室检测，故需要一种既能方便保存，又能稳定作为质量监控的质控品的配制方法。
发明内容
基于此，本发明提供一种尿液有机酸滤纸片质控品的制备方法。
具体的技术方案如下：
一种尿液有机酸滤纸片质控品的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制有机酸标准溶液：
分别配制甲基丙二酸、戊二酸、异戊酰甘氨酸、苯丙酮酸、乳清酸以及4-羟基苯乳酸的标准溶液；
(2)配制工作液：
以尿液为溶剂，加入所述有机酸标准溶液，得所述工作液，所述工作液中有机酸的含量为：100-150mg/L的甲基丙二酸，100-150mg/L的苯丙酮酸，100-150mg/L的戊二酸，100-150mg/L的异戊酰甘氨酸，80-120mg/L的4-羟基苯乳酸以及100-150mg/L的乳清酸；
(3)将所述工作液滴加于滤纸片，晾干，即得所述尿液有机酸滤纸片质控品。
在其中一个实施例中，所述有机酸标准溶液的浓度为20-30mg/mL。
在其中一个实施例中，所述工作液中有机酸的含量为：120-130mg/L的甲基丙二酸，120-130mg/L的苯丙酮酸，120-130mg/L的戊二酸，120-130mg/L的异戊酰甘氨酸，90-110mg/L的4-羟基苯乳酸以及120-130mg/L的乳清酸。
在其中一个实施例中，所述工作液中有机酸的含量为：125mg/L的甲基丙二酸，125mg/L的苯丙酮酸，125mg/L的戊二酸，125mg/L的异戊酰甘氨酸，100mg/L的4-羟基苯乳酸以及125mg/L的乳清酸。
在其中一个实施例中，所述滤纸片的面积20-30cm2，其中所述工作液的加样量为750-850μL。
在其中一个实施例中，所述工作液的加样量为800μL。
在其中一个实施例中，甲基丙二酸标准溶液、戊二酸标准溶液以及异戊酰甘氨酸标准溶液的溶剂为水；苯丙酮酸标准溶液和4-羟基苯乳酸标准溶液的溶剂为乙醇；乳清酸标准溶液的溶剂为弱碱性水。
在其中一个实施例中，所述尿液为健康人源尿液。
在其中一个实施例中，所述尿液有机酸滤纸片质控品储存于-(18-22)℃条件下。
本发明的另一目的是提供上述制备方法得到的尿液有机酸滤纸片质控品。
有机酸项目一共检测132个指标(包括：乳酸-2、2-羟基异丁酸-2、己酸-1、乙醇酸-2、草酸-2、2-羟基丁酸-2、乙醛酸-OX-2、3－羟基丙酸-2、丙酮酸-OX-2、丙戊酸-1、3－羟基丁酸-2、3－羟基异丁酸-2、2－羟基异戊酸-2、2－甲基－3－羟基丁酸-1-2、丙二酸-2、3－羟基-异戊酸-2、2－酮－异戊酸-OX-2、甲基丙二酸-2、乙羟基丙酸-2、尿素-2、4－羟基丁酸-2、2－羟基-异葵酸-2、3－羟基戊酸-2、乙酰乙酸、2－羟基－3甲基戊酸-2、安息香酸、乙酰乙酸－OX-2、辛酸-1、2－酮－3－甲基戊酸-2、2－酮－3－甲基戊酸-2、甘油酸-3、磷酸-3、2－甲基－3－羟基戊酸-2(2)、乙基丙二酸-2、2－酮-异己酸－0X-2、乙酰甘氨酸-1、苯乙酸-1、马来酸-2、琥珀酸-2、甲基琥珀酸-2、甘油酸-3(1)、尿嘧啶-2、福马酸-2、丙酰甘氨酸-1、乙酰甘氨酸-1(1)、甲羟戊酸内酯－2、甲羟戊酸内酯－1、异丁酰甘氨酸-1、2－丙基－3－羟基戊酸-2、甲基福马酸-2、戊二酸-2、3－甲基戊烯二酸-2、3－甲基戊二酸-2、2－丙基3－酮-戊酸-2、丙酰甘氨酸-2、异丁酰甘氨酸、2-脱氧－4羟基-乙酰乙酸、丁酰甘氨酸-1、3－甲基戊烯二酸-2(1)、戊烯二酸-2、琥珀酰丙酮-OX-2(1)、癸酸-1、2－丙基－5－羟基戊酸-2、3－甲基戊烯二酸-2(2)、异戊酰甘氨酸-1、丁酰甘氨酸、苹果酸-3、己二酸-2、异戊酰甘氨酸-2、2－己烯二酸-2、5-氧合脯氨酸-2、3-甲基己二酸、亚硫基二乙酸-2、2-丙基-羟基戊二酸－2、7－羟基-辛酸-2、5-羟基-甲基-2-糠酸-1、甲基巴豆酰甘氨酸-2、3-甲基巴豆酰甘氨酸-1、甲基巴豆酰甘氨酸-1、3-甲基巴豆酰甘氨酸-2、2－羟基戊二酸-3、3－羟基戊二酸-3、苯乳酸-2、庚二酸-2、3－羟基－3－甲基戊二酸-3、3－羟基苯乙酸-2、2－酮戊二酸－OX-2(1)、4－羟基安息香酸-2、4－羟基苯乙酸、2－酮戊二酸－OX－2(1)、己酰甘氨酸-1、苯丙酮酸-OX-2、N-乙酰天冬氨酸-2、2-羟基己二酸-3、辛烯二酸-2、3-羟基己二酸-3、辛二酸-2、3－甲基戊烯二酸-2(3)、2-酮己二酸-OX-3、乌头酸-3、乳清酸-3、香草酸-2、高香草酸-2、壬二酸-2、马尿酸－2、异枸橼酸-4、枸橼酸-4、尿黑酸-3、马尿酸－1、甲基枸橼酸-4(1)、3-(3-羟苯基)-3-羟基丙酸-3、甲基枸橼酸-4(2)、3-羟基辛烯二酸-3、3－羟基辛二酸-3、尿香草扁桃酸-3、癸二酸-2、葵二烯酸-3、4－羟基苯乳酸-2、4－羟基苯丙酮酸-OX-2、2-羟基马尿酸-3、吲哚-3-乙酸-2、辛二酰甘氨酸-2、棕榈酸-1、2-羟基葵二酸-3、3-羟基葵二酸-3、2－羟基马尿酸-2、十二烷二酸、N-乙酰酪氨酸-3、尿酸-4、3，6-环氧-十二烷二酸-2、3-羟基-十二烷二酸、3，6-环氧-十四烷二酸-2，其中化合物后的-2代表参加衍生化基团的个数，-OX代表参加肟化反应，-(1)代表不同的结构式)，本案从中选取了6个具有针对性的目标物作为质控指标(甲基丙二酸、戊二酸、异戊酰甘氨酸、苯丙酮酸、乳清酸以及4-羟基苯乳酸)，该6个作为质控的指标是综合考虑气质联用检测方法的特点和这132个有机酸检测指标对疾病的提示的重要性之后选出的，最具代表性。
同时，该6个作为质控的指标的浓度(工作液中有机酸的含量为：100-150mg/L的甲基丙二酸，100-150mg/L的苯丙酮酸，100-150mg/L的戊二酸，100-150mg/L的异戊酰甘氨酸，80-120mg/L的4-羟基苯乳酸以及100-150mg/L的乳清酸)也是非常关键的，同样是综合考虑气质联用检测的信号值的响应和疾病的该目标物的量后得出的。
配置流程需要严格控制，包括选用低吸附性的玻璃容器以及严格按照流程要求操作，以保证标准品不产生吸附以及定量转移到质控品的滤纸片上。
上述尿液有机酸滤纸片质控品的制备方法成本低，操作简单，浓度适中。通过该方法，可以制得稳定性、均一性和基质效应都符合要求的尿液有机酸滤纸片质控品，且能够较大量的进行配制，使用周期较长，不需频繁更换质控批号，方便日常质控分析，从而满足临床和日常检测对质控品的需求。采用上述提供的制备方法制得的尿液有机酸滤纸片质控品在-20℃的条件下可保存至少2个月，从-20℃条件取出恢复常温后的均一性、稳定性都能符合质控品要求。
附图说明
图1为甲基丙二酸的趋势性分析图；
图2为戊二酸的趋势性分析图；
图3为苯丙酮酸的趋势性分析图；
图4为乳清酸的趋势性分析图；
图5为异戊酰甘氨酸的趋势性分析图；
图6为4-羟基苯乳酸的趋势性分析图；
图7为尿肌酐的趋势性分析图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本实施例尿液有机酸滤纸片质控品的制备方法，包括如下步骤：
一、配制标准溶液：
(1)甲基丙二酸标准溶液：称取250mg甲基丙二酸标准品至10mL烧杯中，用超纯水溶解并转移至10ml容量瓶中，再用超纯水润洗三次烧杯并全部转移容量瓶中，最后加入超纯水进行定容，浓度为25mg/mL；
(2)戊二酸标准溶液：称取250mg戊二酸标准品至10mL烧杯中，用超纯水溶解并转移至10mL容量瓶中，再用超纯水润洗三次烧杯并全部转移容量瓶中，最后加入超纯水进行定容，浓度为25mg/mL；
(3)异戊酰甘氨酸标准溶液：称取250mg异戊酰甘氨酸至10mL烧杯中，用超纯水溶解并转移至10mL容量瓶中，再用超纯水润洗三次烧杯并全部转移容量瓶中，最后用超纯水进行定容，浓度为25mg/mL；
(4)苯丙酮酸标准溶液：称取250mg苯丙酮酸至10mL烧杯中，加入乙醇溶解并转移至10mL容量瓶中，再用乙醇润洗三次烧杯并全部转移容量瓶中，浓度为25mg/mL；
(5)乳清酸标准溶液：称取250mg乳清酸至10mL烧杯，加入300μLNaOH溶液及3mL超纯水超声完全溶解后，转移至10mL容量瓶中，再用超纯水润洗三次烧杯并全部转移容量瓶中，最后用超纯水进行定容，浓度为25mg/mL；
(6)4－羟基苯乳酸标准溶液：称取250mg 4－羟基苯乳酸至10mL烧杯中，用1mL乙醇溶解并转移至10mL容量瓶中，再用乙醇润洗三次烧杯并全部转移容量瓶中，最后用乙醇进行定容，浓度为25mg/mL；
(7)将配制好的溶液转移至棕色试剂瓶上，贴上标签，写上试剂名称、储存条件、配制人、配制日期、有效期等信息。
二、工作液配制：
收集健康人源尿液，要求无明显血尿、蛋白、外观呈淡黄色液体，尿液有机酸检测结果显示无显著异常。
分别取5mL甲基丙二酸标准溶液、5mL苯丙酮酸标准溶液，5mL戊二酸标准溶液、5mL异戊酰甘氨酸标准溶液、4mL 4-羟基苯乳酸标准溶液及5mL乳清酸标准溶液至1L容量瓶中，加入尿液定容后振荡混匀备用。
三、样品制备：
取903#滤纸片(面积为25.2cm2)，用移液器加入800μL所述工作液，使滤纸片完全润湿后，避光过夜自然晾干，晾干后装进耗材包纸袋中，即得所述尿液有机酸滤纸片质控品。然后于-20℃以下条件避光保存，在密封袋上写上配制人、质控品名称、配制时间、暂定有效期、储存要求并进行后续的评估实验。
四、评估实验：
(1)均一性实验：
随机抽取尿液有机酸滤纸片质控品20张，按照日常检测流程处理样品，使用GC-MS进行测定，计算RSD；
结果表明，肌酐及有机酸RSD均在25.00％以内，说明上述尿液有机酸滤纸片质控品均一性良好；
表1 尿有机酸滤纸片质控均一性评估数据
Figure BDA0001270184670000071
(2)稳定性实验：
尿液有机酸滤纸片质控品晾干保存后，每次实验采用6天的结果，每天检测1组质控，每隔60天，重复此操作，计算RSD，并进行趋势性分析(如图1-图7)，以初始6天均值为初始值，计算回收率；
使用GC-MS对尿液有机酸滤纸片质控品长期稳定性进行验证，肌酐及有机酸的RSD均在25％以内，回收率均在70％-120％之间，结果表明，尿液有机酸滤纸片质控品保存在-20℃条件下，可稳定保存至少2个月。
表2 尿有机酸滤纸片质控稳定性评估数据
Figure BDA0001270184670000072
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种尿液有机酸滤纸片质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制有机酸标准溶液：
分别配制甲基丙二酸、戊二酸、异戊酰甘氨酸、苯丙酮酸、乳清酸以及4-羟基苯乳酸的标准溶液；
(2)配制工作液：
以尿液为溶剂，加入所述有机酸标准溶液，得所述工作液，所述工作液中有机酸的含量为：120-130mg/L的甲基丙二酸，120-130mg/L的苯丙酮酸，120-130mg/L的戊二酸，120-130mg/L的异戊酰甘氨酸，90-110mg/L的4-羟基苯乳酸以及120-130mg/L的乳清酸；
(3)将所述工作液滴加于滤纸片，晾干，即得所述尿液有机酸滤纸片质控品；
所述甲基丙二酸标准溶液、戊二酸标准溶液以及异戊酰甘氨酸标准溶液的溶剂为水；所述苯丙酮酸标准溶液和4-羟基苯乳酸标准溶液的溶剂为乙醇；所述乳清酸标准溶液的溶剂为弱碱性水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机酸标准溶液的浓度为20-30mg/mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机酸标准溶液的浓度为25mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述工作液中有机酸的含量为：125mg/L的甲基丙二酸，125mg/L的苯丙酮酸，125mg/L的戊二酸，125mg/L的异戊酰甘氨酸，100mg/L的4-羟基苯乳酸以及125mg/L的乳清酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述滤纸片的面积为20-30cm2，其中所述工作液的加样量为750-850μL。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述工作液的加样量为800μL。
7.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述尿液为健康人源尿液。
8.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述尿液有机酸滤纸片质控品储存于-(18-22)℃条件下。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述尿液有机酸滤纸片质控品储存于-20℃条件下。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法得到的尿液有机酸滤纸片质控品。
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