CN108267584B - 一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，主要包括如下步骤：(1)斑马鱼选取；(2)斑马鱼的最佳发育阶段的确定；(3)斑马鱼的最佳数量的确定；(4)待测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性检测。本发明还涉及了一种运用该方法在筛选、评价胰脂肪酶抑制剂中的应用，主要包括如下步骤：(1)斑马鱼选取；(2)供试品处理；(3)测定吸光值并计算胰脂肪酶活性抑制率。本发明提供的检测方法，具有简单、高效、快速等优点，可应用于筛选胰脂肪酶抑制剂，实现体内高通量筛选胰脂肪酶抑制剂，对肥胖症或体重超重患者的治疗有着重要意义。
Description
技术领域
本发明属于药物评价与筛选的技术领域，具体涉及一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶的方法，以及运用该方法在筛选胰脂肪酶抑制剂中的应用。
背景技术
肥胖可引发心血管疾病(心力衰竭和中风)、糖尿病、高血脂症、阻塞性睡眠呼吸暂停、哮喘、肌肉骨骼疾病、癌症等，严重危及人类健康[1]。近年来，通过减少脂肪吸收而达到减肥，已经成为有效治疗肥胖症的手段之一[2]。胰脂肪酶(lipase)是一种由胰腺分泌的脂肪分解酶，能够分解人体摄入的脂肪类物质，脂肪分解后被人体吸收。因此，具有抑制胰脂肪酶活性的物质具有减少人体脂肪吸收的作用，通过研究胰脂肪酶抑制剂可以获得防治肥胖的物质[3]。胰脂肪酶抑制剂作为一种作用于肠道内的减肥药物，不进入血液，不会产生中枢神经性副作用，不影响矿物质代谢，已成为近年来研究的热点。
目前，唯一上市的减肥药奥利司他(Orlistat)，通过抑制胰脂肪酶活性，减少饮食中脂肪的吸收从而达到减轻体重的目的[4]，为肥胖症的治疗开辟了新的途径，但是存在胃肠道不良反应，表现为油性斑点、带便性胃肠排气、大便紧急感[5-7]等；所以开发出安全性更高，副作用更小的新型胰脂肪酶抑制剂意义重大；在本专利中提出一种新型的高通量胰脂肪酶抑制剂筛选的方法；
斑马鱼是一种新颖的模式生物，与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85％左右，实验结果可比性强，与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[8-11]。更重要的是，斑马鱼具有与生俱来的优点[12]：①饲养成本低，性成熟周期短；②繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200～300枚卵；③生长发育速度快，在受精24h后，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免供试品处理时供试品与食物成份的相互作用；⑥胚胎体积小，幼鱼体长只有1-4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单：溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。斑马鱼幼鱼之所以适合整体动物研究脂质代谢，是因为斑马鱼与哺乳动物相比拥有许多相同胃肠器官，而且脂质代谢过程高度相似[13-14]。
目前，评价减肥药物的胰脂肪酶抑制作用，通常采用鼠类、犬类等哺乳动物模型进行评价，其缺点在于：动物饲养成本高、评价模型的建模复杂、评价实验周期长、难以高通量筛药等；而应用斑马鱼模型去检测胰脂肪酶的活性，并应用该检测方法去筛选、评价胰脂肪酶抑制剂的功效，现有技术并未涉及。
因此，如何建立一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，并以此用于筛选、评价胰脂肪酶抑制剂的功效，是本领域技术人员急需借鉴的技术难题。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，并用于筛选、评价胰脂肪酶抑制剂的功效，解决了上述现有技术中所提到相关缺陷。
为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，包括如下步骤：
(1)斑马鱼选取
取4～5对斑马鱼亲本交配、孵化，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；
(2)斑马鱼的最佳发育阶段的确定
用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理不同发育阶段的斑马鱼，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同发育阶段的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼发育阶段；
所述不同发育阶段的斑马鱼为受精后3天(3dpf)、受精后4天(4dpf)或受精后5天(5dpf)的斑马鱼；
所述最佳发育阶段的斑马鱼为受精后5天(5dpf)的斑马鱼；
(3)斑马鱼的最佳数量的确定
用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理不同数量的斑马鱼，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同数量的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼数量；
所述不同数量的斑马鱼为2尾/孔、4尾/孔；
所述最佳数量的斑马鱼为2尾/孔；
(4)待测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性检测
用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理含有不同浓度的待测药物的5dpf斑马鱼，斑马鱼数量为2尾/孔，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为空白对照组；用p-NPP处理不含待测药物的5dpf斑马鱼，作为正常对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同浓度的待测药物在斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定待测药物的最佳浓度。
优选的，所述的养殖用水的环境条件为：水中溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28℃、pH为7.2-7.6、总硬度为200-250mg/L。
优选的，所述的微孔板分析步骤为：先将处理后的斑马鱼放入96孔板，再将微孔板置于多功能微孔板分析仪下测定吸光值。
优选的，所述的待测药物选用奥利司他，步骤(4)中分别选用0.012μg/mL、0.12μg/mL、1.2μg/mL和12μg/mL浓度的奥利司他处理斑马鱼，且待测药物的最佳处理浓度为12μg/mL。
本发明还公开了一种如前所述的检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，在筛选胰脂肪酶抑制剂中的应用。
优选的，该方法应用于筛选胰脂肪酶抑制剂的步骤为：
(1)斑马鱼选取
取4～5对斑马鱼亲本交配、孵化，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；
(2)供试品处理
设如下实验组：
供试品处理组：供试品以溶解的方式给药，初筛浓度为30μM；
底物对照组：用胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理的养殖用水；
正常对照组：用胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理的5dpf、2尾的斑马鱼；
溶剂对照组：用0.1％DMSO处理的5dpf、2尾的斑马鱼；
阳性对照组：用12μg/mL奥利司他处理的5dpf、2尾的斑马鱼；
上述实验组均在96孔板中进行，每孔2尾斑马鱼，100μl反应液，每个实验组处理6个孔，在28℃反应24小时；
(3)测定吸光值并计算胰脂肪酶活性抑制率
反应结束后，测定各实验组的吸光值，并计算胰脂肪酶活性抑制率，计算公式如下：
统计学处理计算结果，比较各实验组在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性抑制水平，判断并确定供试品是否具有抑制胰脂肪酶活性的作用，以评价胰脂肪酶抑制剂的功效。
本发明中，发明人建立了一种检测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性的方法，该方法的重点在于斑马鱼的最佳发育阶段的确定、斑马鱼的最佳数量的确定和作为阳性对照药的最佳给药浓度的确定。本发明提供的检测方法，具有简单、高效、快速等优点，可应用于筛选胰脂肪酶抑制剂，实现体内高通量筛选胰脂肪酶抑制剂，对肥胖症或体重超重患者的治疗有着重要意义。与以往采用哺乳动物建模判断的方法相比，本发明具有如下优点：
(1)体内：斑马鱼作为一种脊椎动物，其药物筛选模型属体内模型，能够真实反映药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，真正反映药物的整体生物活性。
(2)高通量：斑马鱼幼鱼很小，只有1-4毫米，能够在一个标准的6，12，24，48，96或384孔板内进行分析和实验，实验周期短，使斑马鱼成为一种能进行高通量、自动化体内胰脂肪酶抑制剂筛选的理想模式动物。
(3)经济：所需费用低，以犬类为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于10美元，以豚鼠为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于1美元，而以斑马鱼为实验载体的筛选实验每只每天耗费小于0.01美元。
(4)供试品用量少：检测用的供试品用量少，通常只需几毫克，而传统的筛选实验则需几毫克以上的供试品。
(5)简便：实验过程操作简单，斑马鱼经药物处理后，即可进行定量、分析供试品的抑制胰脂肪酶活性，而传统动物实验操作过程复杂，判断指标主观，容易产生假阳性结果。
(6)快速：实验周期短，可在24小时内完成；斑马鱼在受精后72小时内完成胚胎发育；多数的内部器官，包括心血管系统、肠、肝脏和肾，在24-48小时内快速成型；传统的实验载体老鼠和猴子则分别需要21天和9个月可完成胚胎发育。
(7)可靠的预测性：斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85％左右，其生物学功能与哺乳动物及人类高度相似，实验结果可比性强，预测性好。
(8)敏感性高：胰脂肪酶底物p-NPP(即棕榈酸对硝基苯酯)可以快速检测斑马鱼体内的胰脂肪酶水平。
(9)稳定性高、重复性好：本发明重复实验十几次，得到的实验结果基本相同。
附图说明
图1为本发明斑马鱼的最佳发育阶段的确定。
图2为本发明斑马鱼的最佳数量的确定。
图3为本发明奥利司他的最佳给药浓度的确定。
图4为不同浓度的奥利司他在斑马鱼体内的胰脂肪酶抑制率比较。
图5为应用本发明检测方法筛选未知成分的供试品是否具有抑制胰脂肪酶活性的作用。
图6为供试品A1～A8在斑马鱼体内的胰脂肪酶抑制率比较。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1：建立检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法
1、斑马鱼选取
取4～5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield[15]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼。
2、斑马鱼的最佳发育阶段的确定
以40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP分别处理3dpf、4dpf和5dpf的斑马鱼，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；实验在96孔板中进行，每孔2尾斑马鱼，每孔100μl反应液，每个实验组处理6个孔；各实验组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，使用多功能微孔分析仪测定各组吸光值。
统计学处理结果以表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，两组间比较采用Dunnett’s T-检验进行统计学处理，通过比较不同发育阶段的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性，判断并确定最佳的斑马鱼发育阶段。
最佳的斑马鱼发育阶段为受精后5天(5dpf)的斑马鱼。
3、斑马鱼的最佳数量的确定
以40μg/mL的p-NPP分别处理2尾/孔、4尾/孔的5dpf的斑马鱼，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；实验在96孔板中进行，每孔100μl反应液，每个实验组处理6个孔；各实验组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，使用多功能微孔分析仪测定各组吸光值。
统计学处理结果以表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，两组间比较采用Dunnett’s T-检验进行统计学处理，通过比较不同数量的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性，判断并确定最佳的斑马鱼数量。
最佳的斑马鱼数量为2尾/孔。
4、待测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性检测
以40μg/mL的p-NPP分别处理含有0.012μg/mL、0.12μg/mL、1.2μg/mL和12μg/mL浓度的奥利司他(待测药物)的5dpf斑马鱼，作为实验组；
底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为空白对照组；
用40μg/mL的p-NPP处理不含待测药物的5dpf斑马鱼，作为正常对照组；
实验在96孔板中进行，每孔2尾斑马鱼，100μl反应液，每个浓度的奥利司他处理6个孔；各实验组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，使用多功能微孔分析仪测定各组吸光值。
统计学处理结果以表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，两组间比较采用Dunnett’s T-检验进行统计学处理，通过比较不同浓度的奥利司他在斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定待测药物奥利司他的最佳处理浓度。
前述实验中，养殖用水的环境条件为：水中溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28℃、pH为7.2-7.6、总硬度为200-250mg/L。
结果显示：
(1)3dpf、4dpf和5dpf的斑马鱼实验组荧光值与斑马鱼实验组吸光值与底物对照组相比，均有统计学意义(p<0.01，p<0.001)；
其中，3dpf的斑马鱼实验组与对照组的荧光值比值的正常对照组与底物对照组的吸光值比值(即信噪比)为1.8，而一般微孔板分析灵敏度要求的信噪比必须大于或等于2，所以最佳发育阶段不选择3dpf。
4dpf和5dpf斑马鱼正常对照组与底物对照组的吸光值比值(即信噪比)分别为2.3和2.5，均大于2，所以斑马鱼发育阶段可选择为4dpf或5dpf，但5dpf的斑马鱼灵敏度更高，对胰脂肪酶活性抑制筛选更明确，因此综合考察后，选择5dpf的斑马鱼作为本检测方法的最佳发育阶段。(图1)
(2)2尾/孔、4尾/孔的斑马鱼正常对照组与底物对照的组吸光值相比，均有统计学意义(分别为p<0.001，p<0.01)，而且呈现线性相关(R2＝0.9939)，说明每尾斑马鱼体内胰脂肪酶活性相当，进一步证明了p-NPP能够灵敏地检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性。
2尾/孔和4尾/孔斑马鱼正常对照组与底物对照组的吸光值比值(即信噪比)分别为2.5和4.4，均大于微孔板分析灵敏度要求的最低信噪比，随着斑马鱼数量的增加，脂肪酶的总活性线性增加，所以斑马鱼的最佳数量可选择2尾/孔或4尾/孔，但为了方便实验操作，节省斑马鱼用量，因此综合考虑后，选择2尾/孔的斑马鱼作为本检测方法的最佳数量。(图2)
(3)奥利司他已经过严格的安全性和有效性检验，并在欧洲、美国和东南亚通过了验证。迄今为止的研究表明，奥利司他是一种非全身作用的、具有良好耐受性和有效性的新型减肥药物；是第一个被FDA审批通过的不用食欲抑制剂治疗肥胖的药物[16]，故可用该药来验证本检测方法的可行性，并可将其作为阳性对照药用于筛选其它未知成分的供试品的胰脂肪酶抑制剂。
正常对照组与底物对照组相比，有统计学意义(p<0.001)，说明模型建立成功；测定结果发现：奥利司他在浓度为0.012μg/mL、0.12μg/mL、1.2μg/mL和12μg/mL时，斑马鱼体内的胰脂肪酶活性水平与正常对照组相比，均有统计学意义(分别为p<0.01，p<0.001，p<0.001，p<0.001)，而且随着奥利司他浓度的增加，抑制胰脂肪酶活性作用越强，呈现抑制胰脂肪酶活性的浓度依赖性；进一步验证了奥利司他的具有抑制胰脂肪酶的作用。由于奥利司他的浓度为12μg/mL时，抑制胰脂肪酶活性最强，为便于评价其它未知成分的供试品是否具有抑制胰脂肪酶活性作用，因此综合考虑后，选择浓度为12μg/mL的奥利司他作为本检测方法的最佳浓度。(图3和图4)
实施例2：应用本检测方法筛选、评价胰脂肪酶抑制剂
1、斑马鱼选取
取4～5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield[9]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼。
2、供试品处理
设如下实验组：
供试品处理组：供试品A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8是肉桂皮分离纯化得到的8种未知成分，以溶解的方式给药，初筛浓度为30μM，共8组；
底物对照组：用胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理的养殖用水；
正常对照组：用胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理的5dpf的斑马鱼；
溶剂对照组：用0.1％DMSO处理的5dpf的斑马鱼；
阳性对照组：用12μg/mL奥利司他处理的5dpf的斑马鱼；
实验在96孔板中进行，每孔2尾斑马鱼，100μl反应液，每个实验组处理6个孔，在28℃反应24小时。
本实验中，养殖用水的环境条件为：水中溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28℃、pH为7.2-7.6、总硬度为200-250mg/L。
3、测定吸光值并计算胰脂肪酶活性抑制率
反应结束后，测定各实验组的吸光值，并计算胰脂肪酶活性抑制率，计算公式如下：
统计学处理结果以表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，两组间比较采用Dunnett’s T-检验进行统计学处理，以正常对照组作为标准，统计学处理计算结果，比较各实验组在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性抑制水平，判断并确定供试品是否具有抑制胰脂肪酶活性的作用，以评价胰脂肪酶抑制剂的功效。
结果显示：
(1)正常对照组与底物对照组相比，有统计学意义(p<0.001)；奥利司他的胰脂肪酶活性抑制率为(60.1±4.1)％，与溶剂对照组相比有统计学意义(p<0.001)；由于正常对照组和阳性对照组均符合要求，说明方法建立成功，实验数据有效、可靠。
(2)供试品A1、A2、A4和A6在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性抑制率分别为：(0.9±3.8)％、(-0.5±4.1)％、(7.7±3.7)％、(-2.0±5.7)％，与正常对照组相比，均没有统计学意义(p>0.05)，说明A1、A2、A4和A6均不具有在体内抑制胰脂肪酶活性的作用。
供试品A3、A5、A7和A8在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性抑制率分别为：(39.5±4.9)％、(40.9±5.0)％、(37.0±5.4)％、(22.8±3.9)％，与正常对照组相比，均有统计学意义(分别为p<0.001，p<0.001，p<0.001，p<0.01)，说明供试品A3、A5、A7、和A8均有体内抑制胰脂肪酶活性的作用，抑制作用从低到高排序为：A8＜A7＜A3＜A5。
综上可见，利用本发明提供的检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，可应用于检测从肉桂皮分离纯化得到的8种未知成分的供试品，从中筛选出有胰脂肪酶抑制作用的供试品为4个，没有抑制作用的供试品为4个。(图5和图6)
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Claims (6)
1.一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，用于判断并确定待测药物的最佳浓度，包括如下步骤：
（1）斑马鱼选取
取4~5对斑马鱼亲本交配、孵化，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；
（2）斑马鱼的最佳发育阶段的确定
用40 μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理不同发育阶段的斑马鱼，并加入100 μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同发育阶段的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼发育阶段；
所述不同发育阶段的斑马鱼为受精后3天、受精后4天或受精后5天的斑马鱼；
确定最佳发育阶段的斑马鱼为受精后5天的斑马鱼；
（3）斑马鱼的最佳数量的确定
用40 μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理不同数量的斑马鱼，并加入100 μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同数量的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼数量；
所述不同数量的斑马鱼为2尾/孔、4尾/孔；
确定最佳数量的斑马鱼为2尾/孔；
（4）待测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性检测
用40 μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理含有不同浓度的待测药物的5 dpf斑马鱼，斑马鱼数量为2尾/孔，并加入100 μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为空白对照组；用p-NPP处理不含待测药物的5 dpf斑马鱼，作为正常对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同浓度的待测药物在斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定待测药物的最佳浓度；
所述待测药物的不同浓度为0.012 μg/mL、0.12 μg/mL、1.2 μg/mL 或12 μg/mL；
确定待测药物的最佳浓度为12 μg/mL。
2.根据权利要求1所述的检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述的养殖用水的环境条件为：水中溶解氧浓度为6-8 mg/L、水温为28℃、pH为7.2-7.6、总硬度为200-250mg/L。
3.根据权利要求1所述的检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述的微孔板分析步骤为：先将处理后的斑马鱼放入96孔板，再将微孔板置于多功能微孔板分析仪下测定吸光值。
4.根据权利要求1所述的检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述的待测药物选用奥利司他。
5.一种如权利要求1~4中任一项所述的检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，在筛选胰脂肪酶抑制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的筛选胰脂肪酶抑制剂的步骤为：
（1）斑马鱼选取
取4~5对斑马鱼亲本交配、孵化，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；
（2）供试品处理
设如下实验组：
供试品处理组：供试品以溶解的方式给药，初筛浓度为30 μM；
底物对照组：用胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理的养殖用水；
正常对照组：用胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理的5 dpf的斑马鱼；
溶剂对照组：用0.1%DMSO处理的5 dpf的斑马鱼；
阳性对照组：用12 μg/mL奥利司他处理的5 dpf的斑马鱼；
上述实验组均在96孔板中进行，每孔2尾斑马鱼，100 μl反应液，每个实验组处理6个孔，在28℃反应24小时；
（3）测定吸光值并计算胰脂肪酶活性抑制率
反应结束后，测定各实验组的吸光值，并计算胰脂肪酶活性抑制率，计算公式如下：
；
统计学处理计算结果，比较各实验组在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性抑制水平，判断并确定供试品是否具有抑制胰脂肪酶活性的作用，以评价胰脂肪酶抑制剂的功效。
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| CN108267584A (zh) | 2018-07-10 |
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Denomination of invention: A method and application for detecting pancreatic lipase activity in zebrafish Granted publication date: 20230725 Pledgee: Bank of Jiangsu Limited by Share Ltd. Hangzhou branch Pledgor: HANGZHOU HUNTER BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980008399 |