CN103952386A

CN103952386A - 利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶ppl的方法

Info

Publication number: CN103952386A
Application number: CN201410211857.8A
Authority: CN
Inventors: 赵华; 汤加勇; 陈丹; 贾刚; 刘光芒; 陈小玲
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-05-20
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明公开了一种利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，包括如下步骤：（1）提供密码子优化后猪胰腺脂肪酶rePPL基因序列；（2）构建酵母细胞中表达猪胰腺脂肪酶PPL的重组质粒pPICZαA-rePPL；（3）重组质粒pPICZαA-rePPL转化毕赤酵母X-33细胞；（4）筛选高表达转化菌，鉴定；（5）培养转化菌，获得猪胰腺脂肪酶PPL；（6）重组猪胰腺脂肪酶PPL的鉴定以及酶学活性分析。本发明方法对猪胰腺脂肪酶PPL的前534个碱基进行密码子优化后，使得其在毕赤酵母中得以高效表达且酶学活性与商品酶活性相当。同时本发明通过密码子优化，提高了酵母表达体系中重组猪胰腺脂肪酶的表达量，从而具有大规模发酵，商业化生产重组猪PPL的潜力和价值。

Description

利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程领域，具体涉及利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法。

背景技术

①动物特殊生理状况使体内分泌消化酶不足，不能很好的消化利用饲料中的营养物质。②饲料中的植物性抗营养因子的影响。因此，开发和应用饲用酶制剂可以极大的缓解饲料资源不足，饲料利用率低等问题，为我国养殖业找寻一条可持续发展的道路。

添加外源消化性的酶制剂可以弥补畜禽内源消化酶的不足，利于动物对饲料的消化吸收，提高饲料的利用率；添加外源非消化性的酶制剂可以降低或消除饲料中的植物性抗营养因子的影响，提高动物对饲料的消化利用率。胰脂肪酶作为动物体内分泌的一种消化水解酶类，在动物消化利用饲料脂肪方面起着重要作用。胰脂肪酶属于酶制剂中的一种，将其应用于动物生产中特别是动物幼龄阶段具有良好的经济效益和社会效益。

相比于纤维素酶制剂、蛋白酶制剂和淀粉酶制剂，脂肪酶制剂在动物营养的酶制剂研究中所占比重较小，还有很多工作需要做。

酵母表达系统具有生长快、操作简单，利于大规模发酵生产等优点，同时真核生物能对表达的外源蛋白质进行翻译后修饰，使得表达的蛋白具有生物学活性等优点。研究发现，毕赤酵母遗传背景清楚，易操作；与日常生活密切，安全，无毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；工艺简单成本较低等特点。目前未见关于毕赤酵母分泌表达猪胰腺脂肪酶制剂的报道。

发明内容

鉴于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，该方法通过毕赤酵母分泌表达获得猪胰腺脂肪酶；并且通过密码子优化提高猪胰腺脂肪酶的表达量，表达的重组猪胰腺脂肪酶具有与商品脂肪酶相同的酶学活性，同时本方法对猪胰腺脂肪酶的真核表达研究具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种利用毕赤酵母分泌表达猪胰腺脂肪酶PPL的方法，包括以下步骤：

（1）提供猪胰腺脂肪酶基因PPL序列，以及密码子优化后的基因序列rePPL；

（2）构建酵母细胞中表达rePPL的重组质粒pPICZαA-rePPL；

（3）重组质粒pPICZαA-rePPL转化毕赤酵母X-33细胞；

（4）鉴定并筛选出高表达转化菌株；

（5）培养转化菌，获得重组猪胰腺脂肪酶rePPL；

（6）重组猪胰腺脂肪酶rePPL的鉴定以及酶学活性分析。

所述步骤（1）中猪胰腺脂肪酶基因序列（不含信号肽序列）如SEQ ID NO:1所示。

所述步骤（1）中密码子优化后的基因序列rePPL是对SEQ ID NO:1序列的前534bp的碱基进行毕赤酵母密码子优化，得到序列oPPL：SEQ ID NO:2，然后利用527-533bp处的BamH I酶切位点，把SEQ ID NO:1的前533bp序列换成SEQ ID NO:2，得到优化后的基因序列rePPL：SEQ ID NO:3。

所述步骤（3）中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-rad公司电转化仪预设PIC程序。

所述步骤（4）中，筛选转化菌方法是用荧光定量PCR的方法对高表达转化菌进行筛选、鉴定。

所述步骤（5）中，培养转化菌的培养条件为30℃，200 r/min，0.5%的甲醇，3-5天。

所述步骤（5）中，重组猪胰腺脂肪酶rePPL存在于培养酵母菌X-33的菌液上清。

所述步骤（6）中，重组猪胰腺脂肪酶rePPL的鉴定方法是过6×His标签介质，纯化，进行SDS-PAGE电泳。

本发明的有益效果在于：1）通过毕赤酵母分泌表达系统获得重组猪胰腺脂肪酶；2）密码子优化后，高效表达重组猪胰腺脂肪酶，表达产物的酶学活性和商品脂肪酶活性基本相当。3）本发明通过密码子优化，提高了酵母表达体系中重组猪胰腺脂肪酶的表达量，从而具有大规模发酵，商业化生产重组猪胰腺脂肪酶PPL的潜力和价值。

附图说明

图1为重组质粒pPICZαA-rePPL的构建过程示意图。

图2为rePPL基因的PCR产物及酶切电泳图，其中，泳道M为DNA Marker（2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp），泳道1为rePPL的PCR产物，泳道2为pPICZαA-rePPL的双酶切（XhoI和Xba I）产物。

图3为pPICZαA-rePPL转化子在毕赤酵母中的mRNA表达情况图，其中第9、13、23转化子表达量高，进行甲醇诱导表达。

图4为工程菌诱导上清SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为Protein Marker（97.2kDa，66.4kDa，44.3kDa，29.0kDa，20.1kDa，14.3kDa），泳道1为空载上清25μL，泳道2为未优化诱导上清25μL，泳道3为优化后诱导上清25μL，泳道4为过柱纯化蛋白5μL。

图5为工程菌表达上清纯化后与商品脂肪酶活性比较检测图一。

图6为工程菌表达上清纯化后与商品脂肪酶活性比较检测图二。

图7为工程菌表达上清纯化后与商品脂肪酶活性比较检测图三。

具体实施方式

下面将结合实施例以及图1-图7所示，对本发明作进一步的阐述。但本发明并不局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例：

实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J. 黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中所用毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33购自Invitrogen公司。pPICZαA表达载体购自Invitrogen公司。pPICZαA表达载体（Invitrogen公司）为本实验室保存。

1. 猪胰腺脂肪酶基因序列的获得（SEQ ID NO:1）：

1）从NCBI网站上收索猪胰腺脂肪酶序列（GenBank Accession No. NM000239），设计上下游引物：

PPL-F：5'AGCTGAATTCAGCGAAGTCTGTTTCCCAA3' （引入Xho I限制性酶切位点）

PPL-R：5 'TTGTTCTAGAAACAGGGGTTGAGGGTG3' （引入Xba I限制性酶切位点）

2）从猪胰腺组织中采用Trizol法提取RNA，然后反转录成cDNA。

3）用PCR扩增猪胰腺脂肪酶基因，PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1.5 min30个循环，72℃ 10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

4）扩增产物经回收纯化后，连接到pMD19-T载体上，转化于大肠杆菌TOP10中，图板于AMP培养基平板，37℃培养过夜。

5）对转化子进行PCR鉴定，对阳性菌株进行摇菌培养，然后测序，测序正确的提取质粒pMD19-T-PPL，-20℃保存备用。

2. 猪胰腺脂肪酶部分密码子优化后序列oPPL的获得（SEQ ID NO:2）：

1）分析SEQ ID NO:1，发现在195bp和527bp处各有个BamHⅠ，于是对前527bp的序列按照酵母密码子偏好性（http://www.kazusa.or.jp/codon），进行密码子优化。同时在前面加入Xho I酶切位点以及kex2和Ste13信号切割位点（ATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT），然后在最后加入保护碱基AGCT，得到oPPL（SEQ ID NO:2）。送公司合成该片段，并将其克隆到载体PUC57上，得PUC57-oPPL。

3. 分泌表达型重组质粒pPICZαA-rePPL的构建

如图1和图2所示，将pMD19-T-PPL经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后回收830bp左右的片段产物、将合成的PUC57-oPPL经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后回收560bp左右的片段、表达载体pPICZαA经XhoⅠ和XhaⅠ双酶切后回收大片段，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，用T4 DNA连接酶在16℃水浴中进行连接并过夜，过夜后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。同时设计合成引物rePPL-F：5'CTGGGAAAACAAACGGAGTGA3'，用rePPL-F和PPL-R引物对转化菌落经菌液PCR鉴定后测序验证，从而得到重组rePPL的序列（SEQ ID NO:3）。

4. 重组质粒pPICZαA-rePPL转化毕赤酵母X-33

(1)制备毕赤酵母X-33感受态细胞

①接种30 μL毕赤酵母X-33冻存甘油菌至3 ml YPD液体培养基中，30℃、200 r/min，摇瓶过夜活化。

②转接500 μL过夜活化的毕赤酵母X-33菌液到50 ml YPD液体培养基中，30℃、200 r/min，摇瓶培养至OD₆₀₀为1.3-1.5左右。

③4℃、1500 g、5 min，离心收集菌体细胞，用50 ml预冷的无菌水轻轻吹吸悬浮细胞。

④4℃、1500 g、5 min，离心收集菌体细胞，用25 ml预冷的无菌水悬浮细胞。

⑤4℃、1500 g、5 min，离心收集菌体细胞，用25 ml预冷的1M山梨醇轻轻吹吸悬浮细胞。

⑥4℃、1500 g、5 min，离心收集菌体细胞，用2 ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

⑦4℃、1500 g、5 min，离心收集菌体细胞，用200μL预冷的1M山梨醇悬浮细胞，分装到两管2 ml的EP管中，每管100μL。

(2) 转化pPICZαA-rePPL质粒到毕赤酵母X-33感受态细胞中

①用SacⅠ限制性内切酶对10μg pPICZαA-rePPL质粒进行线性化，然后用乙醇沉淀法对线性化片段进行回收，并溶于10μL水中。

②把10μL线性化片段加入到100μL毕赤酵母X-33感受态细胞中，混合均匀，加至预冷的电击杯中，冰上放置5 min。

③根据电击仪推荐的酵母参数设置，进行电击。

④立即向电击杯中加入1 ml预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，30℃静置1.5h。

⑤全部吸出均匀涂于含有Zeocin的YPDS平板。

⑥置于30℃恒温培养箱中，直至长出单克隆。

(3)菌落PCR反应筛选阳性菌落。从YPDS平板上把单菌落做编号标记，用枪头挑取少量菌体溶于20 μL水中，然后-80℃冻5min，沸水煮5min，反复3次，最后取1μL作为模板进行PCR反应，PCR反应条件：94℃ 5min，（94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1.5min）30个循环，72℃ 10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，筛选出阳性菌落，并对阳性菌落进行划线纯化培养。

(4)高表达转化子的筛选。对筛选的阳性菌落进行甲醇诱导表达，4天后，离心收集菌体，提取RNA，对转化子中的rePPL基因进行荧光定量PCR反应，筛选表达量高的转化子进行诱导表达。（如图3所示pPICZαA-rePPL转化子在酵母中的mRNA表达情况图。其中第9、13、23转化子表达量高，于是对其进行甲醇诱导表达。）

5. 重组猪胰腺脂肪酶在毕赤酵母工程菌中的表达，具体步骤如下：

(1) 将mRNA高表达的转化子，接种到含10 ml YPD培养基的50 ml三角瓶中，在28℃、250 r/min的条件下过夜培养；

(2) 取1 ml YPD过夜培养的菌液接种到含100 ml BMGY培养基的500 ml三角瓶中，在28℃、250 r/min的条件下，培养至OD₆₀₀=2-6；

(3) 在4℃、2 500 r/min 的条件下，离心5 min收集菌体置于100 ml BMMY培养基的500 ml三角瓶中，在28℃、250 r/min的条件下进行甲醇诱导表达；每间隔24 h，向培养基中添加0.5-1 ml的甲醇，使其终浓度为0.5-1%。

如图4所示，工程菌诱导上清SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为Protein Marker（97.2kDa，66.4kDa，44.3kDa，29.0kDa，20.1kDa，14.3kDa），泳道1为空载诱导上清25μL，泳道2为未优化诱导上清25μL，泳道3为优化后诱导上清25μL，泳道4为过His柱纯化蛋白5μL。

6. 重组猪胰腺脂肪酶纯化后的酶学活性检测，结果如图5-图7所示。

(1) 将过His柱纯化后的蛋白，参照Bradford（1976）法测定其浓度。

(2) 采用pNPP法定量检测重组蛋白及商品蛋白的活性。

①对硝基苯酚（pNP）标准曲线的制作。

②A液的配置：质量体积分数为0.3%的pNPP溶液，溶于异丙醇中。

③B液的配置：含有0.1%(W/V)的阿拉伯明胶、0.4%(V/V)的Triton X-100的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。

④酶反应底物为A液∶B液（1∶20）。反应时900μL的酶底物和50μL的Tris-HCl缓冲液充分混匀后在40℃预热5 min。

⑤加入50μL的蛋白酶液混匀在40℃反应10 min。

⑥加入2 ml 0.2 M Na₂CO₃溶液终止反应。

⑦测定在410 nm波长处的吸光度值，根据pNP标准曲线计算释放底物的量。脂肪酶活力单位（U）定义为：pH 8.0反应温度40℃时，每分钟水解对硝基苯酚酯产生1μmol对硝基苯酚所用的酶量。

(3) 酶的最适反应温度

测定并记录商品PPL和rePPL在20℃-80℃范围内，不同温度下的酶学活性，筛选其最适反应温度。

(4) 酶的最适pH

使用50 mM pH 4.0至pH 11.0的缓冲体系：pH4-7的柠檬酸缓冲液、pH8-9的Tris-HCl缓冲液和pH9-11的甘氨酸-NaOH缓冲液，测定不同pH条件下脂肪酶的酶活。

(5) 酶的热稳定性

脂肪酶在最适pH缓冲体系中，分别在30℃、40℃、50℃和60℃保温10 min、20 min、30 min和60 min，再测定酶活。

(6) 酶的Km值和Vmax的测定

米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定在Lineweaver和Burk的基础上有所改进（Lineweaver and Burk, 1934），酶活测定是在不同pNPP浓度下（0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.06、0.08、0.1mM）测定Vmax和Km。

(7) 金属离子对酶活的影响

向酶液中加入不同浓度的金属离子Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺，其中Ca²⁺浓度梯度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mM，Zn²⁺浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μM，Cu²⁺浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μM，Fe³⁺浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μM，同时以不加任何金属离子的酶液作为100%对照。在最适温度、最适pH条件下测定酶活。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 1

agcgaagtct gtttcccaag acttggctgc ttcagtgatg atgccccatg ggcaggaatt 60

gtgcaaagac ccctcaaaat attgccttgg gatccaaaag atgtcaacac ccgcttcctc 120

ctatacacta acgagaacca agacaactat caagaacttg ttgcagatcc atcaactatc 180

acagattcca atttcagaat ggatagaaaa acacgcttta ttattcatgg attcatagac 240

aagggagaag aagactggct gtccaatatt tgcaagaacc tgtttaaggt ggagagcgtg 300

aactgcatct gtgtggactg gaaaggcggc tcccgaactg gatacacaca agcctcacag 360

aacatccgca tcgtgggggc agaagtggcg tattttattg aagttcttaa gtcatcatta 420

ggatattcac cttccaacgt ccatgtcatt ggccacagcc tgggttctca cgctgcaggg 480

gaggcaggaa gaaggaccaa tgggaccatt gaacgaatca cagggctgga tccagctgaa 540

ccttgctttc aaggcacacc tgaattagtc cgattggacc ccagcgatgc caagtttgtg 600

gatgtgattc acacagacgc tgcccccatt atccccaacc tggggtttgg aatgagccaa 660

actgtgggcc acttagattt ctttccaaat ggaggaaaag aaatgcctgg ttgtcagaag 720

aacattctct ctcagattgt tgacatagac gggatctggg aaggaactcg tgactttgtg 780

gcctgtaatc acttaagaag ctacaagtat tatgctgata gcatcctcaa ccctgatggc 840

tttgctggat ttccttgtga ctcttacaat gttttcactg caaataagtg cttcccctgt 900

ccaagtgaag gctgtccaca gatgggtcat tatgctgaca gatttcctgg gaaaacaaac 960

ggagtgagcc aggtatttta tctaaatacc ggtgatgcca gcaatttcgc ccgttggaga 1020

tataaagtgt ctgtcacact atcaggaaag aaggtcacag gacacatact cgtttctttg 1080

tttggaaatg aaggaaactc taggcagtat gagatttaca agggtactct ccaaccagac 1140

aatactcact ccaatgaatt tgactcagat gtagaagttg gagatttgca gaaggtgaaa 1200

tttatttggt acaacaatgt gatcaaccca actctaccca gagtgggggc atccaagatc 1260

accgtggaaa gaaacgatgg aaaagtgtat gacttctgta gccaagaaac tgtgagggaa 1320

gaagttctgc tcaccctcaa cccctgttag 1350

<210> 2

<211> 565

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据毕赤酵母密码子偏好性和猪胰腺脂肪酶的氨基酸序列设计，用于高效表达。

<400> 2

atctctcgag aaaagagagg ctgaagcttc tgaagtttgt tttccaagat tgggttgttt 60

ttctgatgat gctccatggg ctggtattgt tcaaagacca ttgaagattt tgccatggga 120

cccaaaggat gttaacacta gatttttgtt gtacactaac gaaaaccaag ataactacca 180

agaattggtt gctgatccat ctactattac tgattctaac tttagaatgg atagaaagac 240

tagatttatt attcatggtt ttattgataa gggtgaagaa gattggttgt ctaacatttg 300

taagaacttg tttaaggttg aatctgttaa ctgtatttgt gttgattgga agggtggttc 360

cagaactggt tacactcaag cttctcaaaa cattagaatt gttggtgctg aagttgctta 420

ctttattgaa gttttgaagt cttctttggg ttactcacca tctaacgttc atgttattgg 480

tcattctttg ggttctcatg ctgcaggtga agctggtaga agaactaacg gtactattga 540

aagaattact ggtttggatc cagct 565

<210> 3

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tctgaagttt gttttccaag attgggttgt ttttctgatg atgctccatg ggctggtatt 60

gttcaaagac cattgaagat tttgccatgg gacccaaagg atgttaacac tagatttttg 120

ttgtacacta acgaaaacca agataactac caagaattgg ttgctgatcc atctactatt 180

actgattcta actttagaat ggatagaaag actagattta ttattcatgg ttttattgat 240

aagggtgaag aagattggtt gtctaacatt tgtaagaact tgtttaaggt tgaatctgtt 300

aactgtattt gtgttgattg gaagggtggt tccagaactg gttacactca agcttctcaa 360

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ggttactcac catctaacgt tcatgttatt ggtcattctt tgggttctca tgctgcaggt 480

gaagctggta gaagaactaa cggtactatt gaaagaatta ctggtttgga tccagctgaa 540

ccttgctttc aaggcacacc tgaattagtc cgattggacc ccagcgatgc caagtttgtg 600

gatgtgattc acacagacgc tgcccccatt atccccaacc tggggtttgg aatgagccaa 660

actgtgggcc acttagattt ctttccaaat ggaggaaaag aaatgcctgg ttgtcagaag 720

aacattctct ctcagattgt tgacatagac gggatctggg aaggaactcg tgactttgtg 780

gcctgtaatc acttaagaag ctacaagtat tatgctgata gcatcctcaa ccctgatggc 840

tttgctggat ttccttgtga ctcttacaat gttttcactg caaataagtg cttcccctgt 900

ccaagtgaag gctgtccaca gatgggtcat tatgctgaca gatttcctgg gaaaacaaac 960

ggagtgagcc aggtatttta tctaaatacc ggtgatgcca gcaatttcgc ccgttggaga 1020

tataaagtgt ctgtcacact atcaggaaag aaggtcacag gacacatact cgtttctttg 1080

tttggaaatg aaggaaactc taggcagtat gagatttaca agggtactct ccaaccagac 1140

aatactcact ccaatgaatt tgactcagat gtagaagttg gagatttgca gaaggtgaaa 1200

tttatttggt acaacaatgt gatcaaccca actctaccca gagtgggggc atccaagatc 1260

accgtggaaa gaaacgatgg aaaagtgtat gacttctgta gccaagaaac tgtgagggaa 1320

gaagttctgc tcaccctcaa cccctgttag 1350

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 4

agctgaattc agcgaagtct gtttcccaa 29

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 5

ttgttctaga aacaggggtt gagggtg 27

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 6

atctctcgag aaaagagagg ctgaagct 28

Claims

1.一种利用毕赤酵母分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，包括以下步骤：

（1）提供猪胰腺脂肪酶基因序列，以及密码子优化后的基因序列rePPL；

（2）构建酵母细胞中表达rePPL的重组质粒pPICZαA-rePPL；

（3）重组质粒pPICZαA-rePPL转化毕赤酵母X-33细胞；

（4）筛选高表达转化菌，鉴定；

（5）培养转化菌，获得重组猪胰腺脂肪酶PPL；

（6）重组猪胰腺脂肪酶PPL的鉴定以及酶学活性分析。

2.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，其特征在于所述步骤（1）中猪胰腺脂肪酶基因序列，不含信号肽序列；如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，其特征在于所述步骤（1）中密码子优化后的基因序列rePPL是对SEQ ID NO:1序列的前534bp的碱基进行毕赤酵母密码子优化，得到序列为SEQ ID NO:2，然后利用527-533bp处的BamH I酶切位点，把SEQ ID NO:1的前533bp序列换成SEQ ID NO:2，得到优化后的基因序列rePPL：SEQ ID NO:3。

4.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，其特征在于所述步骤（3）中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-rad公司电转化仪预设PIC程序。

5. 根据权利要求1所述的利用毕赤酵母分泌表达猪胰腺脂肪酶PPL的方法，其特征在于所述步骤（4）中，筛选转化菌方法是用荧光定量PCR的方法对高表达转化菌进行筛选、鉴定。

6.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，其特征在于所述步骤（5）中，培养转化菌培养条件为30℃，200 r/min，0.5%的甲醇，3-5天。

7.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，其特征在于所述步骤（5）中重组猪胰腺脂肪酶PPL存在于培养酵母菌X-33的菌液上清。

8.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，其特征在于所述步骤（6）中，所述的重组猪胰腺脂肪酶PPL的鉴定方法是过6×His标签介质，纯化，进行SDS-PAGE电泳。