CN104673823A - 多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法，属于提高酶蛋白在毕赤酵母中分泌表达量的领域。本发明通过单因素实验发现分别在其N端融合蛋白质标签、内质网驻留信号突变或酸稳定性突变均可在一定程度上提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量。本发明进一步发现，将上述三种方案组合在一起后，甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量呈显著的提升，三者的协同效应非常显著。本发明方法在应用毕赤酵母表达酶蛋白等方面具有重要的应用前景。

Description

多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法

技术领域

本发明涉及甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达，尤其涉及提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法，属于综合应用多策略叠加提高酶蛋白在毕赤酵母中分泌表达量领域。

背景技术

毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前最成功的外源基因真核表达系统。毕赤酵母表达系统具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠，翻译后修饰，易于操作，高密度发酵等。同时，毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最小生长培养基中只有少量的蛋白，这可以简化目的蛋白的纯化，极大降低目的蛋白的生产成本。

尽管科研人员从基因剂量、启动子选择、密码子优化、异源蛋白改造等方面提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量，然而，不是所有的蛋白在毕赤酵母表达时都能很好的分泌到胞外。因此，以外源蛋白甲基对硫磷水解酶(MPH)为例，研究其内在序列对其在酵母中分泌的影响，对于提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法，通过N端融合细胞色素结合结构域蛋白，内质网驻留信号突变以及酸稳定性突变，显著提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明公开了一种提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达量的方法，包括以下步骤：

(1)将野生型甲基对硫磷水解酶C端内质网驻留信号的编码基因进行突变，获得甲基对硫磷水解酶基因突变体；(2)将甲基对硫磷水解酶基因突变体与毕赤酵母表达载体可操作的连接，构建得到重组毕赤酵母表达载体；(3)将重组毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母，进行分泌表达，即得。

其中，步骤(1)所述内质网驻留信号是野生型甲基对硫磷水解酶N端第249位赖氨酸或第250位赖氨酸；所述突变是将野生型甲基对硫磷水解酶N端第249位赖氨酸或第250位赖氨酸的编码基因突变为其它任意一种氨基酸的编码基因；

优选的，步骤(1)所述突变是将野生型甲基对硫磷水解酶N端第249位赖氨酸的编码基因突变为精氨酸的编码基因；

或者，将野生型甲基对硫磷水解酶N端第250位赖氨酸的编码基因突变为精氨酸的编码基因；

或者，将野生型甲基对硫磷水解酶N端第249位赖氨酸的编码基因突变为谷氨酰胺的编码基因，同时将N端第250位赖氨酸的编码基因突变为精氨酸的编码基因。

本发明野生型甲基对硫磷水解酶的编码基因的核苷酸序列为SEQID No.4所示，其氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达时，内质网会通过蛋白C-端内质网驻留信号(KKXX，X：任意氨基酸)将本应该驻留在内质网内部或内质网膜上的蛋白进行回收，以阻止蛋白进入运输小泡而停留于内质网中，或者在在其进入转运小泡后重新运回内质网。外源蛋白在异源表达时，若是其C-端也带有KKXX时，如果该信号暴露在蛋白质的三维结构表面，可能会被毕赤酵母蛋白分泌途径的COPI被膜囊泡识别，从而将本该分泌的外源蛋白返回内质网膜或腔内。本发明通过对甲基对硫磷水解酶(MPH)的蛋白序列进行分析，发现其C-端249，250位氨基酸(该位点位于甲基对硫磷水解酶的C-端，从N端计数是第249、250位)及后两位氨基酸序列形成了KKXX驻留信号。

本发明分别将野生型MPH的C-端的249、250位氨基酸(K)突变，构建了K249R-MPH、K250R-MPH、K249Q/K250R-MPH三个突变体，用来评估破坏KKXX分选信号对MPH在毕赤酵母中分泌表达的影响。实验结果表明，破坏KKXX分选信号后，三个突变体的毕赤酵母转化子的中位线处的MPH活力都高达0.30U/mL，而MPH野生型仅为0.03U/mL。本发明综合考虑酶活数据和催化效率两个方面，最终选定K249Q/K250R突变类型。

作为本发明的优选方案，步骤(1)还包括将甲基对硫磷水解酶基因突变体与蛋白质标签编码基因融合得到融合基因。

其中，所述蛋白质标签包括：细胞色素结合结构域蛋白、谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白或纤维素结合结构域；所述融合是在甲基对硫磷水解酶的N端融合蛋白质标签；优选为，在蛋白质标签编码基因与甲基对硫磷水解酶基因突变体之间引入Kex2蛋白酶识别位点，通过在标签和目的蛋白之间引入Kex2位点使得蛋白标签在分泌途径中被切除，从而降低了N端融合对其酶学性质的影响。

所述细胞色素结合结构域蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示；所述Kex2蛋白酶识别位点的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示。

作为本发明的进一步优选方案，步骤(1)还包括将野生型甲基对硫磷水解酶N端第242位赖氨酸的编码基因突变为天冬氨酸的编码基因，以增加目的蛋白MPH的酸稳定性，提高其在毕赤酵母中表达时的分泌量。

本发明通过N端融合CHBD标签、破坏KKXX分选信号(K249Q/K250R)和酸稳定性突变(K242D)，最终获得的甲基对硫磷水解酶基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

蛋白的N端对其表达和分泌都有非常重要的影响。本发明选择在N端融合帮助分泌表达的标签，并且通过在标签和目的蛋白之间引入Kex2蛋白酶识别位点使得蛋白标签在分泌途径中被切除，从而降低了N端融合对其酶学性质的影响。

本发明分别通过融合细胞色素结合结构域蛋白(CHBD)、谷胱甘肽转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或纤维素结合结构域(CBD)于甲基对硫磷水解酶(MPH)的N端，分别得到CHBD-MPH、GST-MPH、MBP-MPH及CBD-MPH融合蛋白。酶活性测定结果表明，CHBD-MPH和GST-MPH转化子的中位线处的MPH活力分别为0.34和0.32U/mL，而MPH野生型仅为0.027U/mL。N端融合CHBD标签时提升分泌量最大，达到12.5倍，融合MBP和CBD并没有帮助MPH分泌到胞外，最终本发明选择CBHD为融合标签。

毕赤酵母表达外源基因时，诱导培养基的pH通常低于5.5。当异源蛋白不耐酸时，从毕赤酵母分泌的蛋白可能会因为其不耐酸，而导致蛋白失活，甚至因其结构不稳定而导致其易被降解。所以，增加目的蛋白MPH的酸稳定性，能够有效提高其在毕赤酵母中表达时的分泌量。

本发明构建了K242D突变体用来评估提高酸稳定性对MPH在毕赤酵母中分泌表达的影响。实验结果表明，MPH酸稳定性增强后，其毕赤酵母转化子的中位线处的MPH活力达到0.20U/mL，而MPH野生型仅为0.03U/mL；表明酸稳定性的提高帮助了MPH在毕赤酵母中分泌表达。

本发明在CHBD-MPH突变体基础上添加K249Q/K250R突变型得到重组毕赤酵母表达载体pPIC9-CHBD-K249Q/K250R-MPH(CHBD-QR)，进一步在CHBD-QR基础上整合酸稳定性突变型K242D得到重组毕赤酵母表达载体pPIC9-CHBD-K242D-K249Q/K250R-MPH(CHBD-DQR)，分别转化毕赤酵母获得阳性重组子。酶活性测定结果表明，重组菌株CHBD-QR相比CHBD-MPH的分泌量提升了1.2倍，达到0.41U/mL；而重组菌株CHBD-DQR进一步提升，达到0.48U/mL。利用T-Test分析发现，在单因素逐步累积过程中，N端融合标签CHBD，KKXX信号突变(K249Q/K250R)以及酸稳定性的K242D突变，均可显著提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量(p＝0.00)，各个单因素之间具有很好的累积效应。

本发明将四株重组菌株(MPH、CHBD-MPH、CHBD-QR、CHBD-DQR)进行摇瓶诱导表达120h，结果表明，120h时CHBD-MPH毕赤酵母重组菌株的培养基上清酶活性达到1.27U/mL，约是野生型MPH毕赤酵母重组菌株培养基上清酶活性的29倍；而CHBD-QR和CHBD-DQR毕赤酵母重组菌株的培养基上清酶活性分别为3.34和5.71U/mL，分别是野生型MPH毕赤酵母重组菌株培养基上清酶活性的99倍和169倍。将酶活性测定对应的培养基上清样品进行SDS-PAGE分析，三个融合蛋白毕赤酵母重组菌株(CHBD-MPH、CHBD-QR、CHBD-DQR)分泌的MPH都随着诱导时间的增加在积累，并且随着单因素的叠加，蛋白条带也更加明显。

综上所述，N端融合标签CHBD，KKXX信号突变(K249Q/K250R)以及酸稳定性的K242D突变，均可有效提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量，而且各单因素逐步整合具有很好的协同效应。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“可操作的连接”意指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

附图说明

图1为重组毕赤酵母表达载体pPIC9-CHBD-DQR的图谱；

图2为对硝基酚含量测定标准曲线；

图3为各个单因素毕赤酵母表达初筛菌株诱导上清酶活分布箱须图；其中，a：N端融合标签；b：破坏KKXX分选信号；c：酸稳定性突变体；箱外圆圈表示异常值，箱三条横线代从下至上分别代表第一四分位数(初筛的重组毕赤酵母总体数目中，诱导培养基上清酶活从低至高计数，1/4倍初筛菌株总体数目的酶活值为第一四分位线)，中位数(初筛的重组毕赤酵母中，诱导培养基上清酶活数据中除异常值外其他酶活数的平均值)，第三四分位数(初筛的重组毕赤酵母总体数目中，诱导培养基上清酶活从低至高计数，3/4倍初筛菌株总体数目的酶活值为第一四分位线)；箱外下横线分别代表酶活数据分布状态的最小值，箱外上横线分别代表酶活数据分布状态的最大值；箱面积越小，代表酶活值越集中；

图4为MPH、CHBD-MPH、CHBD-QR、CHBD-DQR毕赤酵母表达初筛菌株诱导上清酶活分布箱须图；箱外圆圈表示异常值，箱三条横线代从下至上分别代表第一四分位数(初筛的重组毕赤酵母总体数目中，诱导培养基上清酶活从低至高计数，1/4倍初筛菌株总体数目的酶活值为第一四分位线)，中位数(初筛的重组毕赤酵母中，诱导培养基上清酶活数据中除异常值外其他酶活数的平均值)，第三四分位数(初筛的重组毕赤酵母总体数目中，诱导培养基上清酶活从低至高计数，3/4倍初筛菌株总体数目的酶活值为第一四分位线)；箱外下横线分别代表酶活数据分布状态的最小值，箱外上横线分别代表酶活数据分布状态的最大值；箱面积越小，代表酶活值越集中；

图5为融合蛋白毕赤酵母重组菌株摇瓶培养诱导培养基上清酶活；

图6为融合蛋白毕赤酵母重组菌株摇瓶培养诱导120h时培养基上清SDS-PAGE分析；其中，M:Marker；1为MPH；2为CHBD-MPH；3为CHBD-QR；4为CHBD-DQR。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、实验材料

1.1菌株、工具酶、质粒、试剂

大肠杆菌Top10菌株和毕赤酵母GS115购自Invitrogen公司；质粒pPIC9-CHBD-mph，pGEXT4-1，pMAL-4X，pTWIN，pET22b(+)-CHBD和pPIC9-mph由本发明人实验室保存。Fast Pfu购自全式金生物技术有限公司；dNTP、Taq polymerase、DNA纯化回收试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；ClonEZ重组试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司；限制性内切酶BglⅡ购自Takara；蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast extract)购自英国Oxford公司；YNB购买自北京经科宏达生物技术有限公司；甲基对硫磷购于国家农药质量监督检验中心；1Kb的DNA分子量标准购于北京博艾永华生物科技有限公司；琼脂糖购于Sigma公司，其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2培养基及有关溶液的配制

LB培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，用3M的氢氧化钠调节至pH7.0(固体培养基配制时添加1.5％的琼脂粉)，121℃，15min高压蒸汽灭菌。

3M醋酸钠(NaAc)缓冲液(pH 5.2)：量600mL的蒸馏水，称取408.24g NaAc·3H₂O，用冰醋酸调至pH 5.2，定容至1L。

TAE(50×)：242g Tris碱，57.1mL冰乙酸，100mL 0.5M EDTA(pH8.0)，无菌水定容至1L。

YPD：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，108℃，30min高压蒸汽灭菌。

BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氢钾11.9g/L，磷酸氢二钾3g/L，甘油10mL/L，121℃，15min高压蒸汽灭菌，待冷却至室温加入YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L，0.5％的甲醇。

BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氢钾11.9g/L，磷酸氢二钾3g/L，121℃，15min高压蒸汽灭菌，待冷却至室温加入YNB13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇5mL/L。

MD培养基：琼脂糖20g/L，葡萄糖20g/L，108℃，30min高压蒸汽灭菌，冷却后加入YNB13.4g/L，生物素4×10^-4g/L。

SDS-PAGE上样缓冲液(5×)：500mM Tris-HCl(pH6.8)、5％β-巯基乙醇、10％SDS、0.1％溴酚蓝、25％甘油。

30％丙烯酰胺溶液：29g丙烯酰胺，1g N,N′-亚甲叉丙烯酰胺，溶于100mL水。

Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM Tris碱，250mM甘氨酸(pH8.3)，0.1％SDS。

考马斯亮蓝染液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇:水(1:1，v/v)和10mL冰乙酸。

脱色液：90mL甲醇:水(1:1，v/v)与10mL冰乙酸混合至100mL。

实施例1单因素及单因素整合对甲基对硫磷水解酶(MPH)在毕赤酵母中分泌表达效果的评估

1、实验方法

1.1构建重组毕赤酵母表达载体

1.1.1pPIC9-CHBD-K249Q/K250R-MPH(CHBD-QR)和pPIC9-CHBD-K242D-K249Q/K250R-MPH(CHBD-DQR)的构建

通过设计带有同源序列的引物，PCR扩增出具有同源臂的基因片段，再利用重组酶将带同源臂的扩增片段进行同源重组。

根据pPIC9-CHBD-mph重组质粒设计引物(见表1)。这些引物中，pPIC9_F_4804与pPIC9_R_4798有互相重叠的序列，KK-MPH-QR-F与KK-MPH-QR-R有互相重叠的序列，K242D-F与K242D-R有互相重叠的序列。

表1 构建突变体所用的引物

以pPIC9-CHBD-mph重组质粒DNA为模板，用引物pPIC9_F_4804与KK-MPH-QR-R，扩增大小约为5.5kb的目的片段；用引物KK-MPH-QR-F与pPIC9_R_4798，扩增大小约为3.7kb的目的片段。将两个目的片段进行同源重组得到pPIC9-CHBD-K249Q/K250重组质粒。以pPIC9-CHBD-K249Q/K250重组质粒DNA为模板，用引物pPIC9_F_4804与K242D-R，引物K242D-F与pPIC9_R_4798分别配对进行PCR，同样的方法得到pPIC9-CHBD-K242D-K249Q/K250R-MPH重组质粒。

扩增体系见表2。

表2 基因片段PCR扩增体系

扩增条件：94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃2min，每个循环退火温度降低0.5℃，10个循环，94℃30s，53℃30s，72℃2min，25个循环，72℃10min。利用天根生化科技(北京)有限公司的普DNA纯化回收试剂盒回收目的基因片段。

使用CloneEZ重组酶对回收的PCR片段进行同源重组，重组体系见表3。

表3 基因片段重组体系

将体系于25℃反应30min，再置于冰上5min。热击转化Top10感受态菌株，挑取含Amp抗性平皿上的单克隆，过夜培养。用5’AOX1和3’AOX1通用引物进行菌液PCR筛选阳性克隆子，并通过测序确认基因的序列正确。

重组毕赤酵母表达载体pPIC9-CHBD-K242D-K249Q/K250R-MPH(即pPIC9-CHBD-DQR)的图谱见图1。

用引物KK-R和pPIC9-F，以pPIC9-CHBD-mph为模板，扩增目的片段1；以引物KK-F和pPIC9-R，以pPIC9-CHBD-mph为模板，扩增目的片段2；然后利用CloneEZ进行2片段的同源重组，构建重组毕赤酵母表达载体pPIC9-CHBD-K249Q/K250R-MPH；PCR体系同表2，重组体系同表3，引物序列见表4。

表4 构建突变体所用的引物

a：突变位点用黑体标出；构建中用于CloneEZ重组的15bp重叠区域序列用下划线标出。

1.1.2CHBD-MPH、GST-MPH、MBP-MPH及CBD-MPH的构建

用引物MPH-R和pPIC9-F，以pPIC9-mph为模板，扩增大小约为4.3kb的目的片段1；以引物MPH-F和pPIC9-R，以pPIC9-mph为模板，扩增大小约为4.6kb的目的片段2；用引物CHBD-F和CHBD-R，以pET22b(+)-CHBD为模板，扩增大小为300bp的目的片段3。然后利用CloneEZ进行3片段的同源重组。PCR体系见表2，重组体系见表5。

表5 基因片段重组体系

GST-MPH、MBP-MPH及CBD-MPH的构建方法同CHBD-MPH，不同的是，构建过程中GST的基因扩增是以质粒载体pGEXT4-1为模板，MBP的基因扩增是以质粒载体pMAL-4X为模板，CBD的基因扩增是以质粒载体pTWIN为模板；所用引物见表4。

1.1.3K249R-MPH、K250R-MPH、K249Q/K250R-MPH、K242D突变体的构建

用引物K249R-R和pPIC9-F，以pPIC9-mph为模板，扩增目的片段1；以引物K249R-F和pPIC9-R，以pPIC9-mph为模板，扩增大小目的片段2；然后利用CloneEZ进行2片段的同源重组，构建K249R-MPH突变体。PCR体系同表2，重组体系同表3。

K250R-MPH(引物对K250R-F/K250R-R)，K249Q/K250R-MPH(引物对KK-F/KK-R)和K242D突变体(引物对K242D-F/K242D-R)的构建同上，引物序列见表4。

1.2质粒DNA的准备

大量提取重组质粒，将质粒进行定量，保证DNA的量达到8μg以上。Bgl II线性化质粒DNA，体系见表6。

表6 重组质粒酶切线性化体系

将酶切体系置于37℃处理3h，加入1/10体积的3M NaAC(pH5.2)，混匀。再加入两倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30min后，12,000rpm离心10min，75％乙醇洗涤两次，真空冷冻抽干，溶水20μL，备用。

1.3GS115感受态制备

(1)挑取GS115单菌落到含20mL YPD液体培养基中，28℃摇床过夜培养。

(2)将过夜培养菌以1/100的接种量转接至含100mL YPD液体培养基中培养至菌体浓度达到OD₆₀₀为1.3～1.5。

(3)将GS115菌液倒入两个50mL的离心管中，4℃、4000rpm离心5min，弃离心后上清。

(4)用等体积的冰预冷的去离子水重悬沉淀，4℃、4000rpm离心5min，弃离心后上清。

(5)用半体积的冰预冷的去离子水重悬沉淀，4℃、4000rpm离心5min，弃离心后上清。

(6)用1/10体积冰预冷的1M山梨醇轻柔重悬沉淀，4℃、4000rpm离心5min，弃离心后上清。

(7)用200μL预冷的1M山梨醇轻柔重悬沉淀，按每管80μL分装成备用的毕赤酵母感受态细胞，保存于-70℃。

1.4电击转化毕赤酵母

各取线性化的pPIC9-mph、pPIC9-CHBD-mph、CHBD-QR(即pPIC9-CHBD-K249Q/K250R-MPH)、CHBD-DQR(即pPIC9-CHBD-K242D-K249Q/K250R-MPH)、CHBD-MPH、GST-MPH、MBP-MPH、CBD-MPH、K249R-MPH、K250R-MPH、K249Q/K250R-MPH、K242D突变体重组质粒DNA约8μg分别加入一管毕赤酵母感受态中，用枪头轻柔搅动混匀于冰上静置2min后，用移液枪转移至干净的直径为0.2cm的预冷电击杯(BioRad)底部，电击仪电压设置为2.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω的程序进行电击操作。

电转后，立即向电击杯中加入1mL预冷的1M山梨醇，混匀后取200μL涂布MD平板，将平板倒置于30℃温箱静置培养。

1.5酶活测定体系标准曲线的绘制

甲基对硫磷水解酶将甲基对硫磷农药水解为等摩尔的对硝基酚(p-nitrophenol)及二乙基硫代磷酸酯，测定产物中的对硝基酚的含量即可计算出甲基对硫磷水解酶的酶活性。

准确称取对硝基酚0.0835g，先用少量95％乙醇溶解，然后用水定容至100mL，终浓度为6mM。如表7所示，将6mM的母液用Tris-HCl(pH8.0)稀释成不同浓度的900μL体系，再加入10％TCA终止液，10％的Na₂CO₃显色液，取200μL于96孔板中，用酶标仪测量96孔板中样品在405nm下吸光值，并且绘制酶活性标准曲线。

表7 对硝基酚含量测定的标准曲线制作

1.6酶活性单位的定义

取100μL酶液加入含有5μL 10mg/mL的甲基对硫磷农药和900μL50mM Tris-HCl(pH8.0)Buffer的反应体系中，37℃反应10min，加入1mL10％TCA终止液，混匀后加入1mL10％Na₂CO₃显色液。混匀后，取200μL于96孔板中，利用酶标仪测量样品在405nm下的吸光值，计算水解产物(对硝基酚)的含量及酶活。一个甲基对硫磷水解酶活性单位定义为：在上述反应条件下，每分钟释放出1μM对硝基酚所需的酶量。

1.7阳性重组子筛选

从MD平皿上挑取毕赤酵母单菌落，进行外源基因诱导表达筛选阳性重组子。

(1)从转化平皿上挑取已有的单克隆到3mL的BMGY中，于28℃，200rpm摇床培养48h。

(2)4℃，4000rpm离心，弃去培养上清，加入1mL的BMMY培养基，继续置于28℃，200rpm摇床诱导48h。

(3)将诱导后的菌液从摇床取出，先取菌液进行有机磷农药降解酶活性分析，确定阳性克隆子。

(4)将有活性的菌液进行12,000rpm离心5min，分析测定上清分泌的有机磷降解酶活性。

1.8毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导培养的酶活性测定

对初筛中有活性的毕赤酵母重组菌株进行摇瓶水平连续诱导培养120h，每12h取样一次进行酶活力测定。

(1)选取1.7步骤中得到的阳性菌株，用45mL的BMGY培养48h，之后将培养基置换成15mL的BMMY进行诱导培养。

(2)从诱导第24h开始取样，每隔12h从诱导培养物中取500μL诱导菌液，并且每隔24h按补加甲醇至终浓度为0.5％。

(3)对取样的菌液的培养上清进行有机磷降解酶活性测定，比较诱导的菌株分泌至上清的酶活随诱导时间的变化。

(4)与步骤(3)同时进行的是，每次取样后测定完上清的同时，取上清液40μL，加入5×SDS-PAGE上样Buffer，沸水浴10min，为SDS-PAGE分析进行样品制备。

2、实验结果

2.1酵母筛选酶活测定体系标准曲线的绘制

按实验方法1.5进行标准曲线测定，测定曲线如图2，根据标准曲线，得出酶活单位计算公式：

酶活性(U/mL)＝(93.361OD₄₀₅-0.022)×(3×10^-3)×N，其中N为酶液稀释倍数。

2.2突变体转化毕赤酵母重组菌株的初筛

2.2.1单因素对MPH在毕赤酵母中分泌表达效果的评估

将线性化的重组质粒电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，通过MD平板筛选，得到表型为His⁺的克隆子。挑取克隆子进行3mL BMGY培养基培养48h，再用0.5％甲醇浓度的BMMY培养基1mL进行诱导培养48h。通过酶活性测定进行初筛各得到100个阳性克隆子。

2.2.1.1N端融合对MPH在毕赤酵母中分泌表达效果的评估

本发明分别构建了CHBD-MPH、GST-MPH、MBP-MPH及CBD-MPH四个N端融合突变体用来评估N端融合对MPH在毕赤酵母中分泌表达的影响。实验结果见图3a，这里采用了箱须图的中位线来表示其在毕赤酵母中分泌表达的能力。CHBD-MPH和GST-MPH转化子的中位线处的MPH活力分别为0.34和0.32U/mL，而MPH野生型仅为0.027U/mL。N端融合CHBD标签时提升分泌量最大，达到12.5倍。与之相反的是，融合MBP和CBD并没有帮助MPH分泌到胞外。最后，本发明选择CBHD为融合标签。

2.2.1.2破坏KKXX分选信号对MPH在毕赤酵母中分泌表达效果的评估

本发明构建了K249R-MPH、K250R-MPH、K249Q/K250R-MPH三个突变体用来评估破坏KKXX分选信号对MPH在毕赤酵母中分泌表达的影响。实验结果见图3b，这里也采用了箱须图的中位线来表示其在毕赤酵母中分泌表达的能力。破坏KKXX分选信号后，三个突变体的毕赤酵母转化子的中位线处的MPH活力都高达0.30U/mL，而MPH野生型仅为0.03U/mL。综合考虑酶活数据和催化效率两个方面，最终本发明选定K249Q/K250R突变类型。

2.2.1.3提高酸稳定性对MPH在毕赤酵母中分泌表达效果的评估

本发明构建了K242D突变体用来评估提高酸稳定性对MPH在毕赤酵母中分泌表达的影响。实验结果见图3c，这里也采用了箱须图的中位线来表示其在毕赤酵母中分泌表达的能力。MPH酸稳定性增强后，其毕赤酵母转化子的中位线处的MPH活力达到0.20U/mL，而MPH野生型仅为0.03U/mL；酸稳定性的提高帮助了其在毕赤酵母中分泌表达，这一结果也被SDS-PAGE结果所证实。

2.2.2单因素整合对MPH在毕赤酵母中分泌表达效果的影响

所有因素被确认以及选定后，本发明将其依次整合来评估各个单因素之间是否有累积效应。

本发明在CHBD-MPH突变体的基础上依次添加K249Q/K250R突变型得到CHBD-QR，以及在CHBD-QR基础上进一步整合酸稳定性突变型K242D得到最终的突变体CHBD-DQR。这里也采用了箱须图的中位线来表示其在毕赤酵母中分泌表达的能力。从实验结果图4可以看出，重组菌株CHBD-QR相比CHBD-MPH的分泌量提升了1.2倍，达到0.41U/mL，而最终的突变型CHBD-DQR在此基础上进一步提升，达到0.48U/mL。利用T-Test分析发现，在单因素逐步累积过程中，N端融合标签CHBD，KKXX信号突变(K249Q/K250R)以及酸稳定性的K242D突变，均可显著提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量(p＝0.00)；各个单因素之间具有很好的累积效应。

2.3毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导上清酶活性测定及SDS-PAGE分析

将上面选定的四株重组菌株(MPH、CHBD-MPH、CHBD-QR、CHBD-DQR)进行摇瓶诱导表达120h。结果如图5所示，120h时CHBD-MPH毕赤酵母重组菌株的培养基上清酶活性达到1.27U/mL，大约是野生型MPH毕赤酵母重组菌株培养基上清酶活性的29倍。而此时CHBD-QR和CHBD-DQR毕赤酵母重组菌株的培养基上清酶活性分别为3.34和5.71U/mL，分别是野生型MPH毕赤酵母重组菌株培养基上清酶活性的99倍和169倍。

将酶活性测定对应的培养基上清样品进行SDS-PAGE分析，如图6所示，图中约35KDa的条带为毕赤酵母重组菌株分泌的MPH，三个融合蛋白毕赤酵母重组菌株(CHBD-MPH、CHBD-QR、CHBD-DQR)分泌的MPH都随着诱导时间的增加在积累，并且随着单因素的叠加，蛋白条带也更加明显。由此也可以说明，N端融合标签CHBD，KKXX信号突变(K249Q/K250R)以及酸稳定性的K242D突变，均可提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量，各单因素之间具有很好的协同效应。

Claims (10)

1.一种提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将野生型甲基对硫磷水解酶C端内质网驻留信号的编码基因进行突变，获得甲基对硫磷水解酶基因突变体；(2)将甲基对硫磷水解酶基因突变体与毕赤酵母表达载体可操作的连接，构建得到重组毕赤酵母表达载体；(3)将重组毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母，进行分泌表达，即得。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述内质网驻留信号是野生型甲基对硫磷水解酶N端第249位赖氨酸或第250位赖氨酸；所述突变是将野生型甲基对硫磷水解酶N端第249位赖氨酸或第250位赖氨酸的编码基因突变为其它任意一种氨基酸的编码基因。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述突变包括：将野生型甲基对硫磷水解酶N端第249位赖氨酸的编码基因突变为精氨酸的编码基因；

或者，将野生型甲基对硫磷水解酶N端第250位赖氨酸的编码基因突变为精氨酸的编码基因；

或者，将野生型甲基对硫磷水解酶N端第249位赖氨酸的编码基因突变为谷氨酰胺的编码基因，同时将N端第250位赖氨酸的编码基因突变为精氨酸的编码基因。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)还包括将甲基对硫磷水解酶基因突变体与蛋白质标签编码基因融合得到融合基因。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白质标签包括：细胞色素结合结构域蛋白、谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白或纤维素结合结构域；所述融合是在蛋白质标签的编码基因与甲基对硫磷水解酶基因突变体之间引入Kex2蛋白酶识别位点的编码基因。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述细胞色素结合结构域蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述Kex2蛋白酶识别位点的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

7.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：步骤(1)还包括将野生型甲基对硫磷水解酶N端第242位赖氨酸的编码基因突变为天冬氨酸的编码基因。

8.按照权利要求1、4或7所述的方法，其特征在于：野生型甲基对硫磷水解酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；其氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

9.按照权利要求1、4或7所述的方法，其特征在于：甲基对硫磷水解酶基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母表达载体包括：pPIC9-CHBD-K249Q/K250R-MPH和pPIC9-CHBD-K242D-K249Q/K250R-MPH。