CN105358682A - 蛋白质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

在高效率的蛋白质合成中，mRNA上附着多数的核糖体的多核糖体形成的促进被认为非常地有效，但不清楚p180蛋白质的多核糖体形成的促进功能的结构。本申请的发明人新发现，作为与作为p180蛋白质的多核糖体形成促进功能的责任区域的卷曲螺旋结构域特异性地相互作用的蛋白质、作为促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的SF3b4蛋白质，然后知，在高表达促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质(例如SF3b4蛋白质)和p180蛋白质的两方的细胞中，mRNA的向小胞体上的定位显著地升高，使培养细胞的分泌功能升高变得可能。另外显示，通过在表达质粒中插入特定的核苷酸序列，将有表达蛋白质的增强效果的SF3b4蛋白质在小胞体膜上定位、及使多核糖体中mRNA重量化变动变得可能，经其可增强细胞的分泌能力。

Description

蛋白质的制造方法
【技术领域】
本申请涉及用于使重组细胞中的自外来性基因的蛋白质的表达亢进的重组细胞、以及涉及利用那样的细胞的发明。更具体涉及，利用使p180蛋白质的表达、及/或SF3b4蛋白质的表达均亢进的细胞、或者有这样的特征的细胞，使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进，作为结果提供制造蛋白质的方法。利用有上述特征的细胞，使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进，在作为其结果制造蛋白质的方法中，在用于作为目的物的蛋白质表达的载体中利用顺式-元件也作为另外的特征。
【背景技术】
应用基因重组技术的生物技术药品，近年、特别在抗体药品市场急速扩大，向其医疗费的负荷也变得危险，常常要求可相比以往更有效进行蛋白质生产，成本更低的生物技术药品的制造技术的开发。
作为用于利用基因重组技术的蛋白质生产的宿主，至今利用，动物细胞、酵母、大肠杆菌等。大肠杆菌等可以低成本生产作为目的物的蛋白质，但无法进行糖链修饰等的翻译后修饰，在糖蛋白质的生产不适宜。另外，大肠杆菌有易制作含生产的蛋白质的包含体的性质，在作为目的物的蛋白质的取得中，合成后，进一步增溶过程变得必要，存在作业负荷高的缺点。
特别是，抗体等的糖蛋白质的情况中，附加的糖链由于对作为目的物的蛋白质的水溶性、对蛋白酶的抵抗性、组织目标性、还有其生物活性也有影响，必要使用作为高等真核生物的动物细胞的生产技术，近年其技术大大进步。那样的状况的原来、现在的抗体药品的多数在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产，但其制造过程的优化依然是重要的课题。
从含哺乳动物细胞的真核生物细胞向细胞外分泌的蛋白质在作为被内膜隔开的细胞器的小胞体中合成。小胞体被大分为在表面具有由RNA-蛋白质的巨大复合物组成的蛋白质合成装置的核糖体的粗面小胞体和无核糖体的滑面小胞体的2种，但不知粗面小胞体的详细的形成结构。
在活体内，存在专门从事特定的蛋白质的分泌的专门分泌细胞(professionalsecretorycells)，在它们的细胞中粗面小胞体显著地发达，被认为可进行高效率的蛋白质生产。例如分泌胶原的成纤维细胞、分泌消化酶组的胰腺线房外分泌细胞等对应于那样的专门分泌细胞。与这些的专门分泌细胞比较，多用于现在基因工程学蛋白质生产的CHO细胞、HEK293细胞等有粗面小胞体非常地少量，分泌活性低的问题。
在利用基因重组技术生产生物技术药品时，作为目的物的蛋白质的基因在表达载体中显示高的转录活性的启动子的控制化，预计其mRNA以高水平表达。但是，即使置于那样的状况下，也屡屡发生mRNA水平和蛋白质表达量本身不相关的情况，作为其一原因可举在小胞体膜上的翻译效率的低。
即认为，在多用于现在这些的基因工程学蛋白质生产的细胞中，只要可对于在小胞体膜上的翻译装置易利用的形式提供mRNA，就与成纤维细胞的情况同样地，留有可越发增强蛋白质合成能力的余地。
在恒定分泌胶原的成纤维细胞中，编码胶原蛋白质的mRNA时常高水平表达，其大部分在分泌蛋白质的生物合成的场所的小胞体膜上被检测(非专利文献1)。但是，为了使胶原合成活化，仅在小胞体上存在其mRNA是不充分的，使翻译效率高的多核糖体形成变得必要。
由发明人的至今的解析知，在胶原基因等的一部分的蛋白质的mRNA中，具备易形成附着多个作为蛋白质合成装置的核糖体的多核糖体的性质(专利文献1、非专利文献2)。从这些推测可能是，在利用基因重组技术生产生物技术药品时，无关于编码目的蛋白质的基因转录产物高水平表达，发生其蛋白质合成/分泌量低的问题是在利用的细胞中mRNA无法以易在小胞体膜上的翻译装置中利用的形式提供。
【现有技术文献】
【非专利文献】
非专利文献1:Ueno，T.，etal.，(2010).JBiolChem285(39)，29941-50。
非专利文献2:Ueno，T.，etal.，(2012).Regulationofpolysomeassemblyontheendoplasmicreticulumbyacoiled-coilprotein，p180.NucleicAcidsRes。
【专利文献】
专利文献1:特愿2011-227462
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
小胞体中的蛋白质合成中，向小胞体的mRNA的定位(多核糖体形成)是必须的。为了再高效率的蛋白质合成，多数的核糖体附着于mRNA的多核糖体形成的促进被认为是非常地有效的，但不知p180蛋白质的多核糖体形成的促进功能的结构。
【解决课题的技术方案】
本申请的发明人进行详细的解析的结果新发现，与作为p180蛋白质的多核糖体形成促进功能的责任区域的卷曲螺旋结构域(非专利文献2)特异性地相互作用，促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质、剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质。然后，在制出高表达SF3b4蛋白质和p180蛋白质的两方的细胞时，在有这样的特征的细胞中，mRNA的向小胞体上的定位显著地升高，知可使培养细胞的分泌功能升高变得可能。结果，完成本申请发明。
本发明的发明人显示可提供，在细胞中，促进p180蛋白质的全长或其部分的表达、然后mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达亢进，在细胞内的作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进的重组细胞。
本发明的发明人另外显示，可在本发明的第2实施方式中，使p180蛋白质的全长或其部分的表达亢进，然后在使促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达亢进的重组细胞中，通过转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白质的产生量增加，可使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进，作为结果提供制造蛋白质的方法。
在本发明中提供这样的特征性的重组细胞，或者利用那样的特征性的重组细胞，显示通过使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进，可解决上述的课题。
[1]在细胞中，促进p180蛋白质的全长或其部分的表达、mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达、或者这两方的表达均亢进，在细胞内的作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进的重组细胞。
[2][1]所述的重组细胞，其中p180蛋白质选自：
(a)由与人来源的p180蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:2)有至少70％的序列相同性的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(b)由在人来源的p180蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:2)中缺失、取代、或者附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(c)由与编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)有至少70％的序列相同性的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(d)由在编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)中缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、及
(e)由可和与编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)互补的核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质。
[3][1]或[2]所述的重组细胞，其中p180蛋白质是哺乳动物来源的。
[4][3]所述的重组细胞，其中哺乳动物的p180蛋白质的全长或其部分是人p180蛋白质(SEQIDNO:2)、小鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.NP_077243)、大鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_230637)、中国仓鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.XM_003496471)、狗p180蛋白质(GenBank登录号No.NP_001003179)、马p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_001915027)、猴p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_002798281)、黑猩猩p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_514527)、猪p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_001926148)、或者它们的部分。
[5][1]～[4]之任一项所述的重组细胞，其中p180蛋白质的部分选自，含对应于由有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人p180蛋白质)的第27～157氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、含对应于由第623～737氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、含对应于由第738～944氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、含对应于由第945～1540氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分。
[6][1]～[5]之任一项所述的重组细胞，其中促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质,自剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质的全长或其部分(SEQIDNO:4的全长氨基酸序列424AA；作为RRM1的SEQIDNO:4的13～91AA；作为.RRM2的SEQIDNO:4的100，。
[7][6]之任一项所述的重组细胞，其中SF3b4蛋白质选自
(i)由与人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:4)有至少70％的序列相同性的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(ii)由在人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:4)中缺失、取代、或者附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(iii)由与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)有至少70％的序列相同性的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(iv)由在编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)中缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(v)由可和与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)互补的核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质。
[8][6]或[7]所述的重组细胞，其中SF3b4蛋白质是哺乳动物来源的。
[9][8]所述的重组细胞，其中哺乳动物的SF3b4蛋白质的全长或其部分是人SF3b4蛋白质(SEQIDNO:4)、小鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_694693.1)、大鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_001011951.1)、中国仓鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_003498680.1)、狗SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_540295.3)、马SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_001488649.2)、猴SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_001097793.1)、黑猩猩SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_513768.2)、猪SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_001926524.1)、或者它们的部分。
[10][1]～[9]之任一项所述的重组细胞，其中作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力通过转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白质的产生量增加亢进。
[11]细胞株，其由保藏号NITEBP-01753(CHO3D5)、保藏号NITEBP-01535(CHOYA7)、或者保藏号NITEABP-01811(CHO1B2)表示。
[12]制造作为目的物的蛋白质的方法，其使p180蛋白质的全长或其部分的表达亢进，使促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达亢进，或在使这些蛋白质两方的表达亢进的重组细胞中，通过转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白质的产生量增加。
[13][12]所述的方法，其中p180蛋白质是哺乳动物来源的。
[14][13]所述的方法，其中哺乳动物的p180蛋白质的全长或其部分是人p180蛋白质(SEQIDNO:2)、小鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.NP_077243)、大鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_230637)、中国仓鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.XM_003496471)、狗p180蛋白质(GenBank登录号No.NP_001003179)、马p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_001915027)、猴p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_002798281)、黑猩猩p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_514527)、猪p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_001926148)、或者它们的部分。
[15][13]或[14]所述的方法，其中哺乳动物的p180蛋白质的部分选自，含由有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人p180蛋白质)的第27～157氨基酸组成的区域的部分、含由第623～737氨基酸组成的区域的部分、含由第738～944氨基酸组成的区域的部分、含由第945～1540氨基酸组成的区域的部分。
[16][12]～[15]之任一项所述的方法，其中促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质が，选自剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质的全长或其部分(SEQIDNO:4的全长氨基酸序列424AA；作为RRM1的SEQIDNO:4的13～91AA；作为.RRM2的SEQIDNO:4的100。
[17][16]所述的方法，其中SF3b4蛋白质是哺乳动物来源的。
[18][17]所述的方法，其中哺乳动物的SF3b4蛋白质的全长或其部分是人SF3b4蛋白质(SEQIDNO:4)、小鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_694693.1)、大鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_001011951.1)、中国仓鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_003498680.1)、狗SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_540295.3)、马SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_001488649.2)、猴SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_001097793.1)、黑猩猩SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_513768.2)、猪SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_001926524.1)、或者它们的部分。
[19][12]～[18]之任一项所述的方法，其中重组细胞是由保藏号NITEBP-01753(CHO3D5)、保藏号NITEBP-01535(CHOYA7)、或者保藏号NITEABP-01811(CHO1B2)表示的细胞株。
[20][12]～[19]之任一项所述的方法，其中作为目的物的蛋白质是糖蛋白质。
[21][20]所述的方法，其中作为目的物的蛋白质是胶原、纤连蛋白或抗体。
[22]使表达系统细胞内的作为目的物的蛋白质的表达量增大的方法，其通过在用于表达作为目的物的蛋白质的表达单位中，向启动子之下游并且编码作为目的物的蛋白质的DNA的核苷酸序列的起始密码子之上游，插入RNA结合蛋白质所识别/结合(或者相互作用)的顺式-元件而使表达系统细胞内的作为目的物的蛋白质的表达量增大。
[23][22]所述的方法，其中顺式-元件是RNA识别基序(RRM)型RNA结合蛋白质所识别/结合(或者相互作用)的元件。
[24][23]所述的方法，其中顺式-元件是SF3b4蛋白质的RNA识别基序(RRM)所识别/结合(或者相互作用)的元件。
[25][22]～[24]之任一项所述的方法，其中顺式-元件的核苷酸序列是含1个或数个9聚体～12聚体的序列基序GAN1-(X)n-ACN2(n＝3～6)(N1及N2也可独立地为A、T、C、G之任何的核苷酸)的序列。
[26][25]所述的方法，其中顺式-元件的核苷酸序列是含1个或数个9聚体～12聚体的序列基序(GAG-(X)n-ACV(n＝3～6)(V表示A或G或C)、SEQIDNO:17～20)的序列。
[27][22]～[26]之任一项所述的方法，其中顺式-元件的核苷酸序列是是选自下列的序列：I型胶原基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、纤连蛋白基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、基质金属蛋白酶14(MMP14)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、脯氨酰4-羟化酶A2(P4HA2)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、脯氨酰4-羟化酶A1(P4HA1)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列。
[28][22]～[27]之任一项所述的方法，其中顺式-元件的核苷酸序列除SEQIDNO:5的全长或SEQIDNO:7的全长之外、是选自SEQIDNO:5之中第1～102核苷酸、第1～78核苷酸、第1～60核苷酸、第61～126核苷酸、第16～57核苷酸、第79～126核苷酸、第103～126核苷酸、第58～78核苷酸、第51～78核苷酸、第1～27核苷酸、第70～78核苷酸的任何的序列。
[29][22]～[28]之任一项所述的方法，其中表达系细胞是无伤的宿主细胞、p180蛋白质的全长或其部分的表达亢进的细胞、SF3b4蛋白质的全长或其部分的表达亢进的细胞、或者这两方的表达均亢进的细胞。
[30]用于通过对SF3b4进行功能阻碍或表达抑制来抑制胶原合成，防止由异常胶原的肺胞上皮、纤维症的重症化的医药组合物。
【发明效果】
得知，利用促进p180蛋白质的全长或其部分的表达、及/或mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质(例如SF3b4蛋白质的全长或其部分)的表达亢进的本发明的重组细胞，转化编码作为目的物的蛋白质的DNA，则作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力飞跃性地增加，有效制造作为目的物的蛋白质。再者显示，向表达单位内附加顺式-元件，则有表达蛋白质的增强效果的SF3b4蛋白质向小胞体膜上定位、及使多核糖体中mRNA重量化变动变得可能，经其可增强细胞的分泌能力。
【附图说明】
【图1】图1是显示关于实施例1中制备的各细胞(CHO细胞、CHO3D5细胞、CHO5g细胞、然后CHOYA7细胞)，将作为促进细胞内的p180蛋白质的表达和mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的SF3b4蛋白质的表达由蛋白印迹研究的结果的图。
【图2】图2是显示对于实施例1中制备的各细胞，比较外来性地导入作为分泌标志物的人胎盘来源分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达质粒时的SEAP蛋白质的表达的结果的图。
【图3】图3是显示对于实施例1中制备的各细胞，比较外来性地导入作为分泌标志物的人胎盘来源分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达质粒时的SEAPmRNA的向膜级分的定位的程度的图。
【图4】图4是显示含顺式-元件的表达载体的插入子部分的概略图(A)以及评价顺式-元件的分泌活化能的结果(B及C)的图。
【图5】图5是显示使胶原表达时的蛋白质的分泌活性的变化的图。
【图6】图6是显示通过插入顺式-元件而抗体的分泌活化发生的图。
【图7】图7是将对kozak序列和顺式-元件#1的分泌活化的效果使用CHO细胞及CHOYA7细胞比较的图。
【图8】图8是显示使用顺式-元件#1、顺式-元件#2、顺式-元件#3、及顺式-元件#4，顺式-元件的结构和表达蛋白质的增强作用的关联性的图。
【图9】图9是显示顺式-元件内的基序之一例是GAG-(X)n-ACN2(n＝3～6)(A)、及评价各元件的SEAP分泌活性的图(B)的图。
【图10】图10是研究基序GAN1-(X)n-ACN2的核苷酸中的取代、缺失、插入对于该基序的活性的影响的图。
【图11】图11是显示伴随SF3b4的表达抑制而胶原的产生被显著地抑制的图。
【图12】图12是显示与不含顺式-元件时比较，含顺式-元件时，多核糖体级分中的COL1A1cDNA的重量变动到高密度侧的图。
【实施方式】
本发明的发明人显示，可在本发明的第1实施方式中提供，在细胞中，p180蛋白质的全长或其部分的表达及/或剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质的全长或其部分的表达均亢进，在细胞内的作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进的重组细胞。
在本发明的此实施方式中，通过p180蛋白质的全长或部分及/或SF3b4蛋白质的全长或其部分两方均在细胞中表达，作为编码作为在其细胞内的小胞体膜上的目的物的蛋白质的核酸分子的表达产物的mRNA可促进相关的多核糖体形成。其中，多核糖体，对于在细胞内的小胞体膜上存在的多个核糖体，结合1分子的mRNA。作为这样的多核糖体形成的促进的结果，使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进，作为结果可制造蛋白质。
本发明的上述的重组细胞，以在细胞中，p180蛋白质、特别哺乳动物的p180蛋白质的全长或其部分的表达亢进作为第一特征。p180蛋白质是指必须的小胞体膜蛋白质，多在分泌组织中表达，是可促进多核糖体形成的蛋白质。
其中报告，将p180蛋白质的氨基酸序列与人的p180蛋白质(GenBank登录号No.AB287347)比较时知，小鼠的p180蛋白质有87％的类似性、大鼠的p180蛋白质有87％的类似性、中国仓鼠的p180蛋白质有88％的类似性、狗的p180蛋白质有91％的类似性、马的p180蛋白质有89％的类似性、猴的p180蛋白质有91～92％的类似性、黑猩猩的p180蛋白质有98％的类似性、猪的p180蛋白质有86％的类似性，哺乳动物的p180蛋白质全部，有84％以上的范围内的氨基酸类似性，即使范围扩大到其以外的生物的p180蛋白质，氨基酸类似性也在76％以上的范围内。
【表1】表1：与人p180比较时的各种各样的种的p180的序列相同性
从而，在本发明中，当说到“p180蛋白质”时，是指
(a)由与人来源的p180蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:2)有至少70％的序列相同性的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(b)由在人来源的p180蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:2)中缺失、取代、或者附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(c)由与编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)有至少70％的序列相同性的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(d)由在编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)中缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(e)由可和与编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)互补的核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质。
在此实施方式的(a)中，关于氨基酸序列相同性，当说到“与人来源的p180蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:2)有至少70％的序列相同性”时，序列相同性的％值可选择在70％～100％之间的任何值，例如，可选择70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等的序列相同性的％值。
在此实施方式的(b)中，当说到“缺失、取代、或者附加1个或数个氨基酸”时，是指缺失、取代、或者附加的氨基酸数至1～10个左右，可选择1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个的氨基酸的数。
在此实施方式的(c)中，当说到“与编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)有至少70％的序列相同性”时，序列相同性的％值可选择在70％～100％之间的任何值，例如，可选择70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等的序列相同性的％值。
在此实施方式的(d)中，当说到“缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸”时，是指缺失、取代、或者附加的核苷酸数至1～10个左右，可选择1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个的氨基酸的数。再有，通过这样的“缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸”，前提是不导入终止密码子，可规定有作为目的的功能的蛋白质。
在此实施方式的(e)中，当说到“严格的条件下”时，例如，基于基因的核苷酸序列的长度，可由有一般技术的本领域技术人员，容易地确定。基本的条件如在例如，CurrentProtocolsinMolecularBiologyVol.1(JohnWiley及Sons，Inc.)或MolecularCloning2ndedition(Sambrooketal.(1989))中记载，可举出5×SSC、5×Denhardt’ssolution、1％SDS、于25℃～68℃，数小时至一晚等的杂交条件。此时，作为杂交的温度，可举出更优选为45℃～68℃(无甲酰胺)或30℃～42℃(50％甲酰胺)。作为清洗的条件，例如可举出用0.2×SSC在45℃～68℃。通过适宜设定甲酰胺浓度、盐浓度及温度等的杂交条件，可克隆含具有某一定的相同性以上的相同性的核苷酸序列的核酸分子是本领域技术人员公知，如此克隆的核酸分子全部包括在本发明的范围之中。
人p180蛋白质的全长是有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质(GenBank登录号No.AB287347)、此蛋白质由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码(GenBank登录号No.AB287347)。此外，上述的小鼠的p180蛋白质由GenBank登录号No.NP_077243所示的核苷酸序列编码，大鼠的p180蛋白质由GenBank登录号No.XP_230637所示的核苷酸序列编码，中国仓鼠的p180蛋白质由GenBank登录号No.XM_003496471所示的核苷酸序列编码，狗的p180蛋白质由GenBank登录号No.NP_001003179所示的核苷酸序列编码，马的p180蛋白质由GenBank登录号No.XP_001915027所示的核苷酸序列编码，猴的p180蛋白质由GenBank登录号No.XP_002798281所示的核苷酸序列编码，黑猩猩的p180蛋白质由GenBank登录号No.XP_514527所示的核苷酸序列编码，猪的p180蛋白质由GenBank登录号No.XP_001926148所示的核苷酸序列编码。
例如，作为p180蛋白质使用人的p180蛋白质时，通过使含由有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人p180蛋白质)的第27～157氨基酸组成的区域、由第623～737氨基酸组成的区域、由第738～944氨基酸组成的区域、由第945～1540氨基酸组成的区域之任何的部分表达，可促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成(专利文献1)。
从而，在本发明中，当说到“p180蛋白质的部分”时，是指含对应于由有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人p180蛋白质)的第27～157氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、含对应于由第623～737氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、含对应于由第738～944氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、含对应于由第945～1540氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分等的部分。含这样的部分可显示促进多核糖体形成的能力。关于人，作为如此规定的p180蛋白质的部分，作为一例含含有含上述的由有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人p180蛋白质)的第27～157氨基酸组成的区域、由第623～737氨基酸组成的区域、由第738～944氨基酸组成的区域、由第945～1540氨基酸组成的区域的部分等的部分本身之外、含与人p180蛋白质的N末端膜贯通结构域的C末端侧邻接的MTB-2结构域、或者核糖体-结合重复结构域的高度碱性的N-末端区域、高度碱性的串联重复结构域、或者微小管结合及束形成结构域(MTB-1结构域)等(专利文献1)。
如前所述，使用其他哺乳动物的p180蛋白质的部分时，人的p180蛋白质的氨基酸序列与其他哺乳动物的p180蛋白质的氨基酸序列全体高度保守，所以在前述(a)～(e)所示的蛋白质的氨基酸序列之中，含对应的部分或区域的片段的氨基酸序列也可另外作为“p180蛋白质的部分”使用。
本发明的上述的重组细胞以在细胞中，促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达亢进作为第二特征。作为这样的促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质，包括SF3b4蛋白质、特别哺乳动物的SF3b4蛋白质的全长或其部分(例如，SEQIDNO:4的全长氨基酸序列424AA；作为RRM1的SEQIDNO:4的13～91AA；.作为RRM2的SEQIDNO:4的100～179AA；。作为C-末端域的180～424AA.)等。
其中、SF3b4蛋白质是通常仅在核内被检测的蛋白质的，但在活跃地分泌胶原的成纤维细胞中，其大部分在核内被检测到，再详细地探讨时知，含细胞质内的小胞体的膜分级分离中存在一部分SF3b4蛋白质。SF3b4蛋白质(也称为SAP49/SF3b49)根据在其氨基末端侧含2个RNA识别基序(RRM)而分类为RNA识别基序(RRM)型的RNA结合蛋白质(RBP)家族，是在羧基末端侧有功能未知的富含脯氨酸的结构域的物质。在正常的剪接反应过程，这2种RNA识别基序(RRM)(RRM1、RRM2)均必要，这些在酵母中也高度保存，被推测是重要的功能结构域。另外，SF3b4蛋白质也与作为SF3b复合物的其他构成蛋白质的SAP145蛋白质结合，在此结合中，SF3b4蛋白质的2个的RNA识别基序(RRM)(RRM1、RRM2)两者也均必要(Champion-Arnaud&Reed，1994)。即认为，SF3b4蛋白质的RRM结构域不仅对于RNA识别必要，还在蛋白质-蛋白质间的相互作用中发挥功能。
其中，比较SF3b4蛋白质的氨基酸序列，则与人SF3b4蛋白质比较时，对于哺乳动物中研究的全部的哺乳动物种显示100％的类似性，知在其他种，酵母的SF3b4蛋白质有40～54％的类似性、昆虫的SF3b4蛋白质有63～81％的类似性，报告是在所有的生物中非常地保守的蛋白质。
【表2】表2：与人SF3b4比较时的各种各样的种的SF3b4的序列相同性
如上，从SF3b4蛋白质的第一次氨基酸序列在跨生物种间广泛地高度保守的事实容易地推测，使用人SF3b4蛋白质确认的功能在使用其他生物种来源的SF3b4蛋白质时也可再现。
从而，在本发明中，当说到“SF3b4蛋白质”时，是指
(i)由与人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:4)有至少70％的序列相同性的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(ii)由在人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:4)中缺失、取代、或者附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(iii)由与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)有至少70％的序列相同性的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(iv)由在编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)中缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(v)由可和与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)互补的核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质。
在此实施方式的(i)中，关于氨基酸序列相同性，当说到“与人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:4)有至少70％的序列相同性”时，序列相同性的％值可选择在70％～100％之间的任何的值，例如，可选择70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等的序列相同性的％值。
在此实施方式的(ii)中，当说到“缺失、取代、或者附加1个或数个氨基酸”时，是指缺失、取代、或者附加的氨基酸数至1～10个左右，可选择1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个的氨基酸的数。
在此实施方式的(iii)中，当说到“与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)有至少70％的序列相同性的”时，序列相同性的％值可选择在70％～100％之间的任何的值，例如，可选择70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等的序列相同性的％值。
在此实施方式的(iv)中，当说到“缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸”时，是指缺失、取代、或者附加的核苷酸数至1～10个左右，可选择1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个的氨基酸的数。再有，通过这样的“缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸”，前提是不导入终止密码子，可规定有作为目的的功能的蛋白质。
在此实施方式的(v)中，当说到“严格的条件下”时，对于可取的条件，如关于p180蛋白质前述。
人SF3b4蛋白质的全长是有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的蛋白质(GenBank登录号No.NP_005841.1)、此蛋白质由SEQIDNO:3所示的核苷酸序列编码(GenBank登录号No.NP_005841.1)。此外，上述的小鼠的SF3b4蛋白质由GenBank登录号No.NP_694693.1所示的核苷酸序列编码，大鼠的SF3b4蛋白质由GenBank登录号No.NP_001011951.1所示的核苷酸序列编码，中国仓鼠的SF3b4蛋白质由GenBank登录号No.XP_003498680.1所示的核苷酸序列编码，狗的SF3b4蛋白质由GenBank登录号No.XP_540295.3所示的核苷酸序列编码，马的SF3b4蛋白质由GenBank登录号No.XP_001488649.2所示的核苷酸序列编码，猴的SF3b4蛋白质由GenBank登录号No.NP_001097793.1所示的核苷酸序列编码，黑猩猩的SF3b4蛋白质由GenBank登录号No.XP_513768.2所示的核苷酸序列编码，猪的SF3b4蛋白质由GenBank登录号No.XP_001926524.1所示的核苷酸序列编码。
将在本发明中要求表达的，编码作为目的物的蛋白质的DNA转化对于蛋白质表达系统中使用的细胞，则自其DNA转录的mRNA(前体)由剪接除去不具有氨基酸的遗传信息的内含子部分，变换为成熟型mRNA。其过程由被称为剪接体的核内低分子RNA(snRNA)-蛋白质组成的巨大复合物担负。在剪接体中，存在5种低分子脂核蛋白质复合物(snRNP)，SF3b4蛋白质是其中的U2-snRNP的构成成分，有RNA结合结构域。
至今，没有有关含SF3b4蛋白质的剪接因子在蛋白质的翻译水平具有任何的功能的报告，由发明人的解析，SF3b4蛋白质在含细胞质内的小胞体的膜级分中显著地增加，随其与mRNA结合的SF3b4蛋白质，通过与p180蛋白质的卷曲螺旋结构域相互作用，促进mRNA的向小胞体的定位，作为结果可使培养细胞的分泌功能升高。
即知，在这样的2个的蛋白质之任何或它们两方的表达亢进的重组细胞中，转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子，则自编码作为目的物的蛋白质的DNA转录的mRNA与在细胞内表达的SF3b4蛋白质作用的结果，或者与p180蛋白质相互作用的结果，或者自编码作为目的物的蛋白质的DNA转录的mRNA与SF3b4蛋白质相互作用，接下来p180蛋白质的卷曲螺旋结构域和SF3b4蛋白质相互作用的结果，促进mRNA的向小胞体的定位，此细胞内作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进。
各种各样的组织经长期伤害而在纤维化了的状态下的纤维症，均不明原因及详细的发症机序、有效的治疗法，是预后不良的疾病。例如特发性肺纤维症对于由各种各样的刺激发生的肺胞上皮的伤害，用于其修复的胶原等增加而发生异常的修复反应，所以被认为纤维化进展，有效的治疗法未确立。在这样的病态中，未得到用于阻止胶原的异常增加的方法，本发明首次确证，至今被讣为作为剪接因子发挥功能的的SF3b4蛋白质对于胶原的合成/分泌实现不可或缺的作用，通过对于SF3b4进行功能阻碍或表达抑制可抑制胶原合成。由SF3b4的表达抑制由于被认为其特异性shRNA等的施用，其功能抑制可由抑制剪接过程的各种药剂进行，由SF3b4的功能阻碍或表达抑制而抑制纤维症中的异常胶原的蓄积而可防止纤维症的重症化的可能性。
本发明中为了制作重组细胞而可使用的细胞，只要是对于蛋白质表达适宜的细胞，就何为任何，例如，成为作为起源的细胞，可使用CHO细胞、HEK293细胞、HeLa细胞等的哺乳动物来源的细胞。对于这些的细胞，将前述的p180蛋白质的全长或其部分及/或SF3b4蛋白质的全长或其部分，使用现有技术领域一般地使用的方法转染，使在这些的细胞内将p180蛋白质的全长或其部分及/或SF3b4蛋白质的全长或其部分两方均可表达。
为了在这些的细胞内中表达前述的p180蛋白质的全长或其部分及/或SF3b4蛋白质的全长或其部分，可使用现有技术领域一般地使用的转化方法。为了进行该转化，将编码p180蛋白质的全长或其部分的DNA及/或编码SF3b4蛋白质的全长或其部分的DNA各自并入例如，pcDNA、pEGFP、pCAGGS等的表达载体中，可对于细胞转化各自的表达载体而使用。
在本发明中，作为稳定表达p180的重组细胞，CHO细胞来源的细胞株CHO5g细胞、作为稳定表达SF3b4蛋白质的基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、重组细胞，CHO细胞来源的细胞株CHO3D5细胞、作为这2种蛋白质的表达同时亢进的重组细胞，制作CHO细胞来源的细胞、CHOYA7细胞(参照后述的实施例1)、将这些的细胞株保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构的专利微生物保藏中心(对于CHO3D5细胞赋予保藏号NITEBP-01753、对于CHOYA7细胞赋予保藏号NITEBP-01535、或者对于CHO1B2细胞赋予保藏号NITEABP-01811)。
本发明的发明人另外显示，在使p180蛋白质的全长或其部分的表达及/或SF3b4蛋白质的全长或其部分的表达均亢进的重组细胞中，通过转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白质的产生量增加，使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进，作为结果可提供制造蛋白质的方法。
在此方法中，使合成能力或分泌能力亢进，作为结果，作为制造蛋白质的目的物的蛋白质也可为以由生物技术的方法产生作为目的的任何的蛋白质。例如，作为作为目的物的蛋白质，可举出糖蛋白质，作为其例，可选择抗体、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白等，但不限于这些。
本发明的发明人，在本发明的第二的实施方式中，通过在用于表达作为目的物的蛋白质的表达单位中，向启动子之下游并且编码作为目的物的蛋白质的DNA的核苷酸序列的起始密码子之上游插入顺式-元件，提供使在表达系细胞内的作为目的物的蛋白质的表达量增大的方法。当向上述的表达单位插入顺式-元件的序列时，例如，除了在目的物的蛋白质的表达质粒内，向启动子之下游并且编码作为目的物的蛋白质的DNA的核苷酸序列的起始密码子之上游插入顺式-元件序列时之外，在已经向细胞内基因导入启动子及目的物时，也包括向启动子之下游并且目的基因的ORF起始密码子之上游位点特异性地插入顺式-元件序列时等。
如在背景技术中也记载，已知在胶原基因等之一部分的蛋白质的mRNA中，具备易形成附着多个作为蛋白质合成装置的核糖体的多核糖体的性质(专利文献1、非专利文献2)。但是，在用编码作为目的物的蛋白质的DNA转染的细胞内，无关于编码作为目的物的蛋白质的基因转录产物以高水平表达，屡屡见到其蛋白质的合成/分泌量低的问题发生，推测可能是在利用的细胞中mRNA无法以易在小胞体膜上的翻译装置中利用的形式提供。
基于这样的探讨进行解析的结果发现，胶原基因的5'非翻译区域中存在的顺式-元件有使蛋白质的表达量增大的作用。更具体而言，通过在成熟mRNA的5'非翻译区域的识别顺式-元件序列的RRM蛋白质与该处结合，有增强向作为分泌蛋白质的合成的场所的小胞体的膜上的mRNA的输送/定位，再有使翻译效率升高的功能。
本发明中确认的顺式-元件，从1型胶原基因的解析的结果可知，此顺式-元件的核苷酸序列在1型胶原基因的5'非翻译区域中存在。从而，在本发明中，作为其样的顺式-元件的核苷酸序列，可举出I型胶原基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列，只要有希望得到的效果，也可为使用纤连蛋白基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、基质金属蛋白酶14(MMP14)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、脯氨酰4-羟化酶A2(P4HA2)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、脯氨酰4-羟化酶A1(P4HA1)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列等的其他基因来源的顺式-元件的序引。
作为可在本发明中使用的顺式-元件的结构的的特征，其表征为用于表达目的物的蛋白质的表达质粒中含的基因的5'非翻译区域中含1个或数个由9个～12个的核苷酸构成的基序“GAN1-(X)n-ACN2”(n＝3～6)(N1及N2可独立地为A、T、C、G之任何核苷酸)。作为具体性的基序的例，作为天然的顺式-元件，可举出存在的基序，这些特征在于，当N1是G时，N2是A或G或C。再详细地，可表示为“GAGxxxACV”(SEQIDNO:17)、“GAGxxxxACV”(SEQIDNO:18)、“GAGxxxxxACV”(SEQIDNO:19)、及“GAGxxxxxxACV”(SEQIDNO:20)(在这些序列中，V表示A或G或C)。例如，已知在1型胶原基因的情况中，其5'非翻译区域中内包4个基序。
利用I型胶原基因来源的顺式-元件时，可将顺式-元件的核苷酸序列，除SEQIDNO:5的全长或SEQIDNO:7的全长之外、使用选自SEQIDNO:5之中第1～102核苷酸、第1～78核苷酸、第1～60核苷酸、第61～126核苷酸、第16～57核苷酸、第79～126核苷酸、第103～126核苷酸、第58～78核苷酸、第51～78核苷酸、第1～27核苷酸、第70～78核苷酸等的任何的序列。
另外，利用纤连蛋白基因来源的顺式-元件时，可将顺式-元件的核苷酸序列，除SEQIDNO:6的全长及SEQIDNO:8的全长之外、使用选自的任何的序列。
【表3】顺式-元件的序列一览
可将含这样的顺式-元件的表达质粒在不仅是无伤的宿主细胞，还在本申请发明中制备的p180蛋白质的全长或其部分的表达亢进的细胞、剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质的全长或其部分的表达亢进的细胞、或者这两方的表达均亢进的细胞中使用。
在本说明书中，以更具体说明以上说明的本发明作为目的，记载以下的实施例，但是，以下的实施例的记载不以限定本发明作为目的。
【实施例】
【实施例1：共表达SF3b4蛋白质、或者p180蛋白质和SF3b4蛋白质的细胞株的建立】
【质粒的制备】
共表达SF3b4蛋白质、或者p180蛋白质和SF3b4蛋白质的细胞株的建立是通过个别地制备含编码p180蛋白质的核酸的表达质粒和含编码SF3b4蛋白质的核酸的表达质粒，对于CHO细胞顺序转染而进行。
编码人p180蛋白质(GenBank登录号No.AB287347)全长的表达质粒pcDNA-p180/54R基于专利文献1(特开2005-312409)中记载的方法制备。
编码人SF3b4蛋白质全长的表达质粒pEF-SF3b4根据以下的方法制备。即，用PCR扩增编码人SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_005841.1)全长的cDNA序列后，向pEF1/Myc-His载体(LifeTechnologies公司制)的KpnI-EcoRV位点插入连结，得到质粒pEF-SF3b4。
编码中国仓鼠SF3b4蛋白质全长的表达质粒pEF-CHO-SF3b4根据以下的方法制备。即，由CHO细胞提取总RNA，用PCR扩增编码中国仓鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_003498680.1)全长的cDNA序列。其后向pEF1/Myc-His载体的KpnI-EcoRV位点插入连结，得到质粒pEF-CHO-SF3b4。
编码人顺式元件的序列(例如顺式-元件#1～#11)的表达质粒pEF-Cis根据以下的方法制备。即，用PCR扩增编码人顺式-元件(例如、在顺式-元件#1的情况中是SEQIDNO:5)的核酸序列后，向pEGFP载体(clontech公司制)的bglII-HindIII位点插入连结，得到质粒prCMV-cis#-SEAP。含各顺式-元件的表达载体的详细在实施例9中记载。
【稳定表达p180蛋白质的细胞的制备】
稳定表达人p180蛋白质的CHO细胞的建立基于专利文献1中记载的方法进行。即，向CHO细胞由脂转染法转染人p180蛋白质表达质粒pcDNA-p180/54R的后，在Zeocin400μg/ml存在下培养，进行药剂选择。10天培养后，分离对Zeocin具有抗性的细胞株的集落，建立稳定表达p180蛋白质的细胞株CHO5g细胞。
【稳定表达SF3b4蛋白质的细胞的制备】
为了制备稳定表达人SF3b4蛋白质的CHO细胞，向CHO细胞由脂转染法转染人SF3b4蛋白质表达质粒pEF-SF3b4的后，在G418400μg/ml存在下培养，进行药剂选择。10天培养后，分离对G418具有抗性的细胞株的集落，建立稳定表达SF3b4蛋白质的细胞株CHO3D5细胞(独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NPMD)、千叶县木更津市上总镰足2-5-8(日本)、保藏号NITEBP-01753、保藏日2013年11月21日)。
【稳定共表达p180蛋白质和SF3b4蛋白质的细胞的制备】
接下来，为了建立稳定共表达人p180蛋白质和人SF3b4蛋白质的CHO细胞，对于细胞株CHO5g细胞，由脂转染法转染SF3b4蛋白质表达质粒pEF-SF3b4。其后，在G418400μg/ml、Zeocin100μg/ml存在下培养，进行药剂选择。14天培养后，分离对G418和Zeocin具有抗性的细胞株的集落，建立稳定共表达人p180蛋白质和人SF3b4蛋白质的细胞株CHOYA7细胞(独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NPMD)、千叶县木更津市上总镰足2-5-8(日本)、保藏号NITEBP-01535、保藏日2013年2月13日)。
接下来为了建立稳定共表达人p180蛋白质和中国仓鼠SF3b4蛋白质的CHO细胞，向CHO细胞由脂转染法转染表达人p180及中国仓鼠SF3b4的质粒。其后，在潮霉素300μg/ml存在下培养，进行药剂选择。14天培养后，分离对潮霉素具有抗性的细胞株的集落，建立稳定共表达人p180蛋白质和中国仓鼠SF3b4蛋白质的细胞株CHO1B2细胞(独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NPMD)、千叶县木更津市上总镰足2-5-8(日本)、保藏号NITEABP-01811、接收日2014年3月4日)。
【细胞的性状确认】
为了各自确认CHO5g细胞稳定表达p180蛋白质，CHO3D5细胞稳定表达SF3b4蛋白质，CHOYA7细胞及CHO1B2细胞共表达p180蛋白质和SF3b4蛋白质，将CHO5g细胞、CHO3D5细胞、CHOYA7细胞、CHO1B2细胞分别在含5％牛胎儿血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，在5％CO2存在下、于37℃培养。作为对照细胞，也一并培养CHO细胞。
40小时后，由胰蛋白酶处理，由离心回收悬浮的各细胞1×105个，作为解析用的样品。其后，对于细胞内表达的p180蛋白质使用抗p180抗体(参照Ogawa-Goto,K.et.al.,J.Virol.,76(2002)2350-2362)，然后对于SF3b4蛋白质使用抗SF3b4抗体(Santacruz公司制)，由蛋白印迹法各自解析。
如图1所示，CHO细胞的p180表达量在检测界限以下，确认内在性的SF3b4蛋白质的表达在低的水平(泳道1)。CHO3D5细胞是，其p180蛋白质的表达量与CHO细胞同样地，在检测界限以下，但高表达SF3B4蛋白质(泳道2)。确认CHO5g细胞高表达p180蛋白质，SF3b4蛋白质是内在性的表达在低的水平(泳道3)。CHOYA7细胞及CHO1B2细胞一同高表达p180蛋白质和SF3b4蛋白质(泳道4、泳道6)。从这些确认，可建立高表达p180蛋白质的CHO5g细胞、高表达SF3b4蛋白质的CHO3D5细胞、共表达p180蛋白质和SF3b4蛋白质的CHO细胞来源的细胞株、CHOYA7细胞及CHO1B2细胞。
【实施例2：由p180蛋白质的表达及/或SF3b4蛋白质的表达的分泌活化】
使用实施例1中制作的表达p180蛋白质的细胞株CHO5g细胞、表达SF3b4蛋白质的细胞株CHO3D5细胞、及共表达p180蛋白质和SF3b4蛋白质的细胞株CHOYA7细胞，对于p180蛋白质的表达及/或SF3b4蛋白质的表达和蛋白质分泌的活化进行研究。
根据以下方法构建作为分泌标志物的人胎盘来源分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达质粒。即，将编码SEAP蛋白质(GenBank登录号No.NP_001623.3)全长的cDNA片段插入连结到表达哺乳动物细胞用的载体(pEGFP-C3,Clontech公司制)的NheI-XhoI位点，得到SEAP蛋白质表达质粒prCMV-SEAP。
为了评价各自的细胞的SEAP蛋白质分泌能力，对于CHO3D5细胞、CHO5g细胞、CHOYA7细胞、以及CHO细胞各自，将SEAP表达质粒和表达内部标准化用的β-半乳糖苷酶的质粒pEF1-LacZ(Lifetechnologies公司制)使用LipofectamineLTX试剂(Lifetechnologies公司制)共转染。在含0.1％牛胎儿血清的DMEM中培养20小时后，将培养上清和含p-硝基苯基磷酸酯(pNPP、Sigma公司制)的底物溶液混合。于室温反应30分钟后，用吸光度计测定对波长405nm的吸光度。细胞级分的β-半乳糖苷酶活性根据β-半乳糖苷酶测定系统(promega公司制)的定法测定。
用β-半乳糖苷酶测定值标准化的SEAP活性示于图2。在使p180蛋白质单独表达的CHO5g细胞及使SF3b4蛋白质单独表达的CHO3D5细胞中，培养上清中的SEAP分泌活性与CHO比较显著地增加至1.7～2.0倍(图2)。在使CHOYA7细胞中的p180蛋白质和SF3b4蛋白质共表达时，与CHO细胞比较，SEAP活性进一步增加至3.1倍。从这些得知，使p180蛋白质单独表达时及使SF3b4蛋白质单独表达时之任何，均与CHO细胞的情况比较，SEAP分泌活性可显著地升高，通过使p180蛋白质和SF3b4蛋白质共表达，与CHO细胞的情况比较，使细胞的分泌能力显著地升高。
另外以CHO细胞的SEAP活性作为1时的CHO1B2细胞的SEAP活性比是3.1倍，SEAP活性显著地增加。因此显示，与人SF3b4具有高的类似性的中国仓鼠SF3b4具有与人SF3b4同等的分泌增强活性。
【实施例3：由p180蛋白质和SF3b4蛋白质的共表达，mRNA的向膜级分的定位促进】
使用实施例1中制作的表达p180蛋白质的细胞株CHO5g细胞、表达SF3b4蛋白质的细胞株CHO3D5细胞、及共表达p180蛋白质和SF3b4蛋白质的细胞株CHOYA7细胞，对于p180蛋白质的表达及/或SF3b4蛋白质的表达和mRNA的向膜级分的定位的促进的关系进行研究。
向CHOYA7细胞及对照细胞，将上述的SEAP表达质粒使用lipofectamineLTX转染，40小时后，分级分离为细胞质级分和膜级分。分级分离方法基于非专利文献1(Ueno，etal.，(2010)JBiolChem285,29941-29950)中记载的方法进行。从各自的级分根据Trisol-LS试剂(Lifetechnologies公司制)的定法提取RNA。其后，使用SEAP特异性的引物进行定量PCR法，定量SEAPmRNA量(图3)。
结果，在CHO3D5细胞、CHO5g细胞、CHOYA7细胞、CHO细胞中，成为细胞质和膜级分的总和的全mRNA量是大致相同定度。但是，在CHO细胞、CHO3D5细胞、CHO5g细胞中，全体的约3成的mRNA存在于膜级分中，与此相比，在CHOYA7细胞中，约7成定位在膜级分中，mRNA的从细胞质向膜级分的定位显著地变动。
这些显示，共表达p180蛋白质和SF3b4蛋白质的CHOYA7细胞在分泌蛋白质的生物合成时具有使mRNA积极定位到膜级分的特性。
【实施例4：向表达分泌型碱性磷酸酶的单位内插入各种顺式-元件的表达载体的构建】
在本实施例中，使用实施例1中制作的表达SF3b4蛋白质的细胞株CHO3D5细胞、及共表达p180蛋白质和SF3b4蛋白质的细胞株CHOYA7细胞，以进一步升高蛋白质的表达效率作为目的，探讨表达质粒的结构。
根据以下方法构建向实施例2中所示的SEAP表达质粒prCMV-SEAP插入顺式-元件的表达载体。基于非专利文献1(Ueno，etal.，(2010)JBiolChem285,29941-29950)中记载的方法制备人成纤维细胞来源的RNA，以其作为模板进行RT-PCR。扩增时使用在5'、3'侧各自附加BglII和HindIII识别序列的引物(SEQIDNO:15、SEQIDNO:16)，扩增人来源的I型胶原α1来源顺式-元件#1(SEQIDNO:5)。向在prCMV-SEAP的CMV启动子和SEAPORF之间的BglII-HindIII部位，扩增片段用BglII-HindIII处理后插入连结。由此，得到在CMV启动子和SEAP的开始甲硫氨酸之间插入顺式-元件#1的表达质粒prCMV-cis#1-SEAP(图4A)。
【实施例5：由顺式-元件的蛋白质的分泌活化】
由实施例4中制作的含顺式-元件的表达质粒，探讨表达蛋白质对分泌的影响。使用LipofectamineLTX试剂(Lifetechnologies公司制)转染实施例4中制成的2种表达质粒、prCMV-cis#1-SEAP及prCMV-SEAP。细胞使用实施例1中制作的4种细胞株。在含0.1％FBS的DMEM中培养20小时后，混合培养上清和含荧光底物4-甲基伞形花酰磷酸酯(4-MUP、Sigma公司制)的底物溶液。于室温反应30分钟后，用荧光光度计测定荧光强度(激发光360nm、荧光440nm)。另外为了将转染效率用SEAPcDNA总量补正，从细胞级分使用Trizol试剂(Lifetechnologies公司制)提取全mRNA，使用SEAP特异性的引物进行定量PCR，定量SEAPcDNA量。将对用SEAPcDNA量补正的prCMV-cis#1-SEAP的prCMV-SEAP的SEAP活性比示于图4B、图4C。
结果，由在CHO细胞中顺式-元件#1的插入，SEAP活性增加至2.7倍。由在CHO3D5细胞、CHO5g细胞、以及CHOYA7细胞的各细胞中顺式-元件#1的插入，SEAP活性均增加至3.0～3.2倍。这些结果显示，通过向表达单位内插入顺式-元件#1，可在各种CHO细胞中增加每转录产物的蛋白质合成及分泌量。
为了将以上的各细胞的顺式-元件#1的插入后的SEAP活性比与CHO细胞的顺式-元件#1的未插入SEAP活性比较，将在CHO细胞的prCMV-SEAP导入时的SEAP活性作为1而求出在各细胞的prCMV-cis#1-SEAP导入时的活性(图4C)。使用顺式-元件#1时的CHO3D5细胞、CHO5g细胞的SEAP活性比各自增加至作为对照的CHO细胞的4.7、6.3倍。再者在CHOYA7细胞中，SEAP的分泌活性显著地增加至作为对照的CHO细胞的9.4倍。
如上所述，通过顺式-元件#1与SF3b4蛋白质共存，或者顺式-元件#1与p180蛋白质共存而自表达质粒表达的蛋白质的分泌活性升高，再者，通过顺式-元件#1、SF3b4蛋白质及p180蛋白质的3因子共存而可显著地增强细胞的蛋白质分泌活性。
【实施例6：由顺式-元件#1的胶原的分泌活化】
在本实施例中，探讨含顺式-元件的表达质粒对胶原表达的影响。
根据以下方法构建人I型胶原α1(COL1A1)的表达质粒。即，向表达哺乳动物细胞用载体(pEGFP-C3、Clontech公司制)的NheI-XhoI位点插入连结编码COL1A1(GenBank登录号No.NM_000088.3)全长的cDNA片段，得到在CMV启动子的控制下表达含顺式-元件#1的COL1A1(1～5297)的质粒prCMV-COL1A1。另外，代替COL1A1基因全长，同样地扩增编码仅COL1A1ORF全长的至127～4251、及127～5297的基因片段，构建prCMV-COL1A1-ORF、及prCMV-COL1A1-ORF-UTR。另外根据以下方法构建人II型胶原α1(COL2A1)、人III型胶原α1(COL3A1)的表达质粒。即，将编码COL2A1(GenBank登录号No.NP_001835.3)或COL3A1(GenBank登录号No.NP_000081.1)全长的cDNA片段插入连结到向表达哺乳动物细胞用的载体(pcDNA、Invitrogen公司制)插入顺式-元件#1的pcDNA-cis#1的EcoRV-NotI位点，得到在CMV启动子的控制下表达COL2A1(1～4464)的质粒pcDNA-cis#1-COL2A1、表达COL3A1(1～4401)的质粒pcDNA-cis#1-COL3A1。
为了研究对顺式-元件#1的原胶原的分泌活化能力，向实施例1中制作的3种细胞株，用脂转染法转染prCMV-COL1A1。在含0.1％牛胎儿血清、200μM抗坏血酸的DMEM中培养40小时后，由蛋白印迹法解析培养上清中的COL1A1原胶原量(图5A)。
结果，将作为对照的CHO细胞的原胶原量作为1，则在CHOYA7细胞约20倍增加。另外，为了顺式-元件#1的评价，向对照CHO细胞，也同样地基因导入不含顺式-元件#1的prCMV-COL1A1-ORF、prCMV-COL1A1-ORF-UTR。此时，培养上清中的原胶原量由蛋白印迹法的检测界限以下。
再者，为了研究形成均三聚体的胶原的分泌量，向实施例1中制作的3种细胞株，用脂转染法转染pcDNA-cis#1-COL2A1、pcDNA-cis#1-COL3A1或实施例6中制作的prCMV-COL1A1及prCMV-COL1A1-ORF。在含2％牛胎儿血清、200μM抗坏血酸的DMEM中培养72小时后，回收培养上清，加HCl至成0.1N而作为酸性，加胃蛋白酶(SIGMA公司制)至成0.5mg/ml，于4℃进行16小时消化反应。向其添加NaCl至成1M，在冰上静置3小时后，进行离心分离，将得到的沉淀用1MNaCl和95％乙醇清洗。将此胶原纯化样品用SDS-PAGE电泳而比较各胶原的条带强度。结果，将对照CHO细胞的分泌量作为1时，CHOYA7细胞中的COL1A1、COL2A1、COL3A1的各均三聚体的分泌量各自显著地增加至1.8、1.9、3.7倍(图5B～图5D)。在顺式-元件#1非存在下，在CHO3D5细胞、CHOYA7细胞中，均三聚体分泌量增加至对照的1.5倍、2.1倍。
如上所述，顺式-元件#1在各种CHO细胞中使胶原分子的表达增强，在SF3b4蛋白质及/或p180蛋白质的存在下利用顺式-元件#1，则显示保持3重螺旋结构的胶原分泌量进一步增加。
【实施例7：由顺式-元件的抗体分子的表达增强效果】
如以下一样探讨顺式-元件对抗体表达的影响。
根据以下方法构建抗体重链及轻链全长的表达质粒。即，向抗IL-8抗体表达质粒(p6G425V11N35A.choSD，ATCC209552)由人工基因合成服务(MBL公司)合成编码的抗体重链(Heavychain，HC)及轻链(Lightchain，LC)全长序列。其后，重链ORF全长插入连结到pEF1/Myc-His载体的NheI-SpeI位点，轻链ORF全长插入连结到pEF1/Myc-His载体的KpnI-EcoRV位点。其后，用ClaI切出表达轻链的盒，向表达重链的载体的ClaI位点插入连结，构建抗IL-8抗体(重链、轻链)共表达质粒pEF-HC-LC。再者，也一并构建此质粒的重链及轻链ORF上游插入cis#1的表达质粒pEF-cis#1-HC-LC。
向实施例1中制作的3种细胞株用脂转染法转染pEF-HC-LC、pEF-cis#1-HC-LC。在含0.1％牛胎儿血清的DMEM中培养96小时后，培养上清中的抗体产生量使用人IgGELISAQuantitationSet(Bethyl公司)，由ELISA法定量。结果，由在CHO细胞中顺式-元件#1的插入，抗体分泌量增加至2.7倍。在CHO3D5细胞、CHOYA7细胞的各细胞中也由顺式-元件#1的插入，抗体分泌量各自增加至2.5、1.8倍(图6A)。这些结果显示，通过向表达单位内插入顺式-元件#1，可在各种CHO细胞中增加抗体分泌量。
如图6B所示，将在CHO细胞的pEF-HC-LC导入时的抗体分泌量作为1时导入SF3b4的CHO3D5细胞、导入SF3b4及p180的CHOYA7细胞的抗体分泌量增加至2.5倍、12.6倍，确认由p180蛋白质、及/或SF3b4的导入抗体分泌量的增加。这些倾向如果使用顺式-元件#1，则得到进一步显著的效果，CHO3D5细胞的抗体分泌量增加至对照的CHO细胞的5.6倍，在CHOYA7细胞中显著地增加至21.3倍。
如上所述，顺式-元件#1有效地作用于抗体生产，其活性在SF3b4蛋白质或p180蛋白质，或者其两者的存在下进一步显著地作用。
【实施例8：kozak序列与顺式-元件#1的分泌活化效果的比较】
在本实施例中，为比较在真核细胞的mRNA中作为与翻译的开始相关的共通序列被知的kozak序列显示的分泌活化效果和顺式-元件显示的分泌活化效果作为目的而进行。
由以下方法构建将实施例4中制作的prCMV-SEAP及prCMV-cis#1-SEAP的开始甲硫氨酸密码子ATG之前的6bp的序列TCCTGC取代为GCCACC的表达质粒prCMV-SEAP-kozak、prCMV-cis#1-SEAP-kozak。即，使用SEAP特异性引物进行PCR，扩增在ATG之前附加GCCACC的SEAP片段(1～132)。接下来从prCMV-SEAP及prCMV-cis#1-SEAP用HindIII-PstI除去SEAP(1～132)区域，与用HindIII-PstI处理的扩增片段置换，由此得到在SEAPORF上游插入kozak序列的SEAP表达质粒prCMV-SEAP-kozak和prCMV-cis#1-SEAP-kozak。
向CHO细胞、CHO3D5细胞及CHOYA7细胞转染prCMV-SEAP、prCMV-SEAP-kozak、prCMV-cis#1-SEAP、prCMV-cis#1-SEAP-kozak，用实施例5中记载的方法测定20小时后的培养上清中的SEAP活性。结果确认，与prCMV-SEAP比，在prCMV-cis#1-SEAP、prCMV-cis#1-SEAP-kozak的情况中，CHO细胞的SEAP活性增强至2倍以上(图7)、显示与被知为其效果对于蛋白质表达有效的Kozak序列同等以上。
此增加倾向在CHO3D5细胞或CHOYA7细胞中被明显观察到，附加顺式-元件#1，则SEAP活性比增加至3.3～3.4倍，在附加kozak序列和顺式-元件#1的两者时增加至3.3～4.9倍(图7)。
这些显示，在CHO细胞、CHO3D5细胞及CHOYA7细胞中，由顺式-元件#1的分泌活化的效果相比kozak序列的效果更高，通过将顺式-元件#1、SF3b4蛋白质、及p180蛋白质的3因子与kozak序列联用，可进一步增强分泌活性能。
【实施例9：由顺式-元件附加的表达蛋白质的增强效果】
对于实施例1中制作的细胞，使用各种含顺式-元件的表达质粒，探讨有表达蛋白质的增强作用的顺式-元件序列的详细。
向prCMV-SEAP插入人来源的纤连蛋白基因的顺式-元件序列、顺式-元件#2(SEQIDNO:6)的表达载体prCMV-cis#2-SEAP根据以下的方法构建。即，将人成纤维细胞来源的RNA以基于非专利文献1(Ueno，etal.，(2010)JBiolChem285,29941-29950)中记载的方法制备的RNA作为模板进行RT-PCR。扩增时使用在5'、3'侧各自附加BglII和HindIII识别序列的引物(SEQIDNO:13、SEQIDNO:14)，扩增含顺式-元件#2的片段。扩增片段用BglII-HindIII处理后，向在prCMV-SEAP的CMV启动子和SEAPORF之间的BglII-HindIII位点插入连结。由此，得到在CMV启动子和SEAP的开始甲硫氨酸之间插入顺式-元件#2的表达质粒。
对于prCMV-SEAP，插入人来源的I型胶原α1基因的顺式-元件序列、顺式-元件#3、及人来源的纤连蛋白基因的顺式-元件序列、顺式-元件#4的表达载体prCMV-cis#3-SEAP等根据以下的方法构建。即，将含顺式-元件#3的顺式-元件的引物(SEQIDNO:9、SEQIDNO:10)或含顺式-元件#4的顺式-元件的引物(SEQIDNO:11、SEQIDNO:12)于95℃热处理10分钟后，阶段性地降低至25℃而使2条引物退火而制备各种接头。将各种接头向在prCMV-SEAP的CMV启动子和SEAPORF之间的BglII-HindIII位点插入连结。由此，得到在CMV启动子和SEAP的开始甲硫氨酸之间插入顺式-元件#3(SEQIDNO:7)、顺式-元件#4(SEQIDNO:8)的表达质粒。
向prCMV-SEAP插入顺式-元件#5、#6的表达载体prCMV-cis#5-SEAP、prCMV-cis#6-SEAP根据以下的方法构建。将顺式-元件#1的部分序列使用各自附加BglII和HindIII识别序列的引物(SEQIDNO:28及29、SEQIDNO:30及31)，扩增含顺式-元件#5(1-60)、顺式-元件#6(61-126)的片段。扩增片段用BglII-HindIII处理后，向在prCMV-SEAP的CMV启动子和SEAPORF之间的BglII-HindIII位点插入连结。由此，各自得在CMV启动子和SEAP的开始甲硫氨酸之间插入顺式-元件#5、顺式-元件#6的表达质粒。
向prCMV-SEAP插入顺式-元件#7的表达载体prCMV-cis#7-SEAP根据以下的方法构建。合成COL2A1基因来源序列后，使用末端附加的BglII、HindIII识别序列向在prCMV-SEAP的CMV启动子和SEAPORF之间的BglII-HindIII位点插入连结。由此，得到在CMV启动子和SEAP的开始甲硫氨酸之间插入顺式-元件#7的表达质粒。
向prCMV-SEAP插入作为顺式-元件#2来源序列的顺式-元件#8、#9、#10的表达载体prCMV-cis#8-SEAP、prCMV-cis#9-SEAP、prCMV-cis#10-SEAP根据以下的方法构建。即，将含顺式-元件#8的顺式-元件的引物(SEQIDNO:32、SEQIDNO:33)、含顺式-元件#9的顺式-元件的引物(SEQIDNO:34、SEQIDNO:35)、含顺式-元件#10的顺式-元件的引物(SEQIDNO:36、SEQIDNO:37)于95℃热处理10分钟后，阶段性地降低至25℃而使2条引物退火而制备各种接头。将各种接头向在prCMV-SEAP的CMV启动子和SEAPORF之间的BglII-HindIII位点插入连结。由此，得到在CMV启动子和SEAP的开始甲硫氨酸之间插入顺式-元件#8(SEQIDNO:24)、顺式-元件#9(SEQIDNO:25)、顺式-元件#10(SEQIDNO:26)的表达质粒。
向prCMV-SEAP插入顺式-元件#11的表达载体prCMV-cis#11-SEAP根据以下的方法构建。将顺式-元件#1的部分序列使用各自附加BglII和HindIII识别序列的引物(SEQIDNO:38、SEQIDNO:39)扩增含顺式-元件#11(1-113)的片段。扩增片段用BglII-HindIII处理后，向在prCMV-SEAP的CMV启动子和SEAPORF之间的BglII-HindIII位点插入连结。由此，各自得到在CMV启动子和SEAP的开始甲硫氨酸之间插入顺式-元件#11(SEQIDNO:27)的表达质粒。
【表4】用于顺式-元件扩增的引物一览
向CHOYA7细胞转染prCMV-cis#1-SEAP、prCMV-cis#2-SEAP、prCMV-cis#3-SEAP、prCMV-cis#4-SEAP、prCMV-cis#5-SEAP、prCMV-cis#6-SEAP、prCMV-cis#7-SEAP、prCMV-cis#8-SEAP、prCMV-cis#9-SEAP、prCMV-cis#10-SEAP、prCMV-cis#11-SEAP、prCMV-SEAP。将20小时后的培养上清中的SEAP活性用实施例5记载的方法测定。将prCMV-SEAP的情况的SEAP活性作为1，则使用的全部的顺式-元件是SEAP的分泌活性比升高至约2.0～3.4倍(图8A)。用蛋白印迹法解析此时膜级分的SF3b4蛋白质量，由光密度测定法―处理定量，则顺式-元件#1、顺式-元件#2、顺式-元件#3、顺式-元件#4、顺式-元件#5、顺式-元件#6各自的膜级分中的SF3b4蛋白质量显著地增加至对照的2.0～3.6倍(图8B)。
以上的结果显示，向表达单位内附加顺式-元件#1～#11，则有表达蛋白质的增强效果的SF3b4蛋白质向小胞体膜上定位变得可能，经其可增强细胞的分泌能力。
【实施例10：基序内序列链长的效果】
对于在顺式-元件#1上鉴定的基序序列GAN1-(X)n-ACN2，如以下一样进行有效的链长数n的探讨。对于GAG-(X)n-ACV(V表示A或G或C)，用与实施例8同样的方法构建将n变化至1-9聚体的顺式-元件#3来源的变体(图9A)。另外也一并构建使基序缺失的变体(motifdelete)。为了评价各元件的SEAP分泌活性，根据实施例5中记载的方法，评价各自的分泌活性。结果，在n＝3～6时，与顺式-元件#3得到同等的活性(图9B)。从以上的结果确证，在本系统中，分泌活化变得重要的顺式-元件内的基序是GAN1-(X)n-ACN2的X链长n是3～6残基。
【实施例11：由基序序列的碱基取代、插入的影响】
探讨基序内的碱基取代及插入对表达增强活性的影响。对于顺式-元件#3内的基序GAN1-(X)n-ACN2，用与实施例8同样的方法构建将N1及N2各自作为A、G、C、T的顺式-元件#3来源的变体(图10A)。另外也一并构建向多聚A序列、多聚C序列插入基序的变体和对照(图10A)。根据实施例5中记载的方法评价各元件的分泌活性。结果，顺式-元件#3的N2从G取代为A、C、T时的SEAP活性均与顺式-元件#3得到同等的活性(图10B)。将顺式-元件#3的N1从G取代为A、C、T时的SEAP活性均显示与顺式-元件#3同等的活性(图10B)。另外插入基序的元件也有与顺式-元件#3同等的活性。从以上的结果确认，作为有高的活性的基序，是GAN1-(X)n-ACN2(N1及N2可为A、G、C、T之任何的碱基，n＝3～6的整数)。
【实施例12：伴随SF3b4表达抑制的胶原分泌量的降低】
探讨伴随SF3b4的表达抑制对胶原分泌量的影响。向人胎儿肺来源成纤维细胞(HEL)，根据Oligofectamine(Lifetechnologies)的定法转染对SF3b4的siRNA(Lifetechnologies，人SF3b4siRNAHSS115684)。在0.1％FBS-DMEM、抗坏血酸磷酸酯200μM的条件下培养4天。其后，回收培养基，基于实施例6的方法解析培养上清中的COL1A1原胶原量以及细胞级分的SF3b4蛋白质量。结果，细胞内的SF3b4表达量降低至对照的20％时、分泌的COL1A1原胶原量降低至10％(图11)。以上的结果显示，伴随SF3b4的表达抑制而胶原的产生显著地被抑制。
【实施例13：共表达p180/SF3b4的悬浮细胞株中对胶原分泌的影响】
由以下方法建立稳定共表达人p180蛋白质和人SF3b4的CHO-S细胞株。向CHO-S细胞(Lifetechnologies公司)，由脂转染法转染pCDNA-p180/54R，在Zeocin300μg/ml存在下培养14天，进行药剂选择。分离由Zeocin抗性细胞株的集落而用脂转染法转染pEF-SF3b4，在潮霉素600μg/ml的条件下进行药剂选择。14天培养后，分离对于Zeocin及潮霉素的两者具有抗性的细胞株的集落，建立稳定共表达人p180蛋白质和人SF3b4的CHO-S来源细胞株54#160。
作为对照，向CHO-S细胞及制作的54#160细胞，用各自脂转染法转染prCMV-COL1A1、prCMV-COL1A1-ORF。在无血清、含8mML-谷氨酰胺的CDFortiCHO培养液(Lifetechnologies公司)中培养96小时后，由蛋白印迹法解析培养上清中的COL1A1原胶原量。基因导入含顺式-元件#1的prCMV-COL1A1时，将作为对照的CHO-S细胞的原胶原量作为1，则在54#160细胞中增加至约3.5倍。另外，基因导入不含顺式-元件#1的prCMV-COL1A1-ORF时，培养上清中的原胶原量是由蛋白印迹法的检测界限以下。
如上所述，在悬浮化CHO-S细胞中，在无血清条件下，顺式-元件#1可使作为巨大分子的胶原的合成/分泌增强，再者由顺式-元件#1、SF3b4蛋白质及p180蛋白质的3因子可显著地增强悬浮化CHO细胞的分泌活性。
【实施例14：由顺式-元件#1的多核糖体中mRNA的重量化变动】
向CHOYA7细胞各自用脂转染法转染prCMV-COL1A1、prCMV-COL1A1-ORF。40小时后，根据实施例3中记载的方法，制备膜级分。将得到的膜级分向15～50％的蔗糖密度梯度离心分离供给，分级分离多核糖体级分。从各级分基于实施例5中记载的方法提取mRNA，由定量PCR定量COL1A1cDNA量。另外，此时的分泌原胶原量用实施例6中记载的方法解析。结果，多核糖体级分中的COL1A1cDNA在不含顺式元件的prCMV-COL1A1-ORF时，以级分24作为峰的分布，与此相比，含cis#1时成为以级分26作为峰的分布，分布变动至更高密度的级分(图12)。再者确认，伴随峰的变动，原胶原的分泌量在顺式-元件#1存在下增加至对照的4.9倍。在p180及SF3b4存在下，顺式-元件#1有引起mRNA的重量化变动的能力，此重量化变动与表达增加相关。
【工业实用性】
得知，对p180蛋白质的全长或其部分的表达、然后SF3b4蛋白质的全长或其部分的表达亢进的本发明的重组细胞转化编码作为目的物的蛋白质的DNA，则作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力飞跃性地增加。
SEQIDNO:1：编码人p180的核苷酸序列
SEQIDNO:2：人p180蛋白质的氨基酸序列
SEQIDNO:3：编码人SF3b4的核苷酸序列
SEQIDNO:4：人SF3b4蛋白质的氨基酸序列
SEQIDNO:5：顺式-元件#1
SEQIDNO:6：顺式-元件#2
SEQIDNO:7：顺式-元件#3
SEQIDNO:8：顺式-元件#4
SEQIDNO:9：含顺式-元件#3的顺式-元件的引物
SEQIDNO:10：含顺式-元件#3的顺式-元件的引物
SEQIDNO:11：含顺式-元件#4的顺式-元件的引物
SEQIDNO:12：含顺式-元件#4的顺式-元件的引物
SEQIDNO:13：在5'侧附加BglII识别序列，含顺式-元件#2的顺式-元件的引物
SEQIDNO:14：在3'侧附加HindIII识别序列，含顺式-元件#2的顺式-元件的引物
SEQIDNO:15：在5'侧附加BglII识别序列，用于扩增顺式-元件#1的引物
SEQIDNO:16：在3'侧附加HindIII识别序列，用于扩增顺式-元件#1的引物
SEQIDNO:17：顺式-元件的基序(9聚体)
SEQIDNO:18：顺式-元件的基序(10聚体)
SEQIDNO:19：顺式-元件的基序(11聚体)
SEQIDNO:20：顺式-元件的基序(12聚体)
SEQIDNO:21：顺式-元件#5
SEQIDNO:22：顺式-元件#6
SEQIDNO:23：顺式-元件#7
SEQIDNO:24：顺式-元件#8
SEQIDNO:25：顺式-元件#9
SEQIDNO:26：顺式-元件#10
SEQIDNO:27：顺式-元件#11
SEQIDNO:28：在5'侧附加BglII识别序列，含顺式-元件#5的顺式-元件的引物
SEQIDNO:29：在3'侧附加HindIII识别序列，含顺式-元件#5的顺式-元件的引物
SEQIDNO:30：在5'侧附加BglII识别序列，含顺式-元件#6的顺式-元件的引物
SEQIDNO:31：在3'侧附加HindIII识别序列，含顺式-元件#6的顺式-元件的引物
SEQIDNO:32：含顺式-元件#8的顺式-元件的引物
SEQIDNO:33：含顺式-元件#8的顺式-元件的引物
SEQIDNO:34：含顺式-元件#9的顺式-元件的引物
SEQIDNO:35：含顺式-元件#9的顺式-元件的引物
SEQIDNO:36：含顺式-元件#10的顺式-元件的引物
SEQIDNO:37：含顺式-元件#10的顺式-元件的引物
SEQIDNO:38：在5'侧附加BglII识别序列，含顺式-元件#11的顺式-元件的引物
SEQIDNO:39：在3'侧附加HindIII识别序列，含顺式-元件#11的顺式-元件的引物

Claims (30)

1.在细胞内的作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进的重组细胞，在所述细胞中，促进p180蛋白质的全长或其部分的表达、mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达、或者这两方的表达均亢进。
2.权利要求1所述的重组细胞，其中p180蛋白质选自：
(a)由与人来源的p180蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:2)有至少70％的序列相同性的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(b)由在人来源的p180蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:2)中缺失、取代、或者附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(c)由编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)有至少70％的序列相同性的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、
(d)由在编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)中缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质、及
(e)由可和与编码人来源的p180蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)互补的核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进细胞内的在小胞体膜上的多核糖体形成的功能的蛋白质。
3.权利要求1或2所述的重组细胞，其中p180蛋白质是哺乳动物来源的。
4.权利要求3所述的重组细胞，其中哺乳动物的p180蛋白质的全长或其部分是人p180蛋白质(SEQIDNO:2)、小鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.NP_077243)、大鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_230637)、中国仓鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.XM_003496471)、狗p180蛋白质(GenBank登录号No.NP_001003179)、马p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_001915027)、猴p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_002798281)、黑猩猩p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_514527)、猪p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_001926148)、或者它们的部分。
5.权利要求1～4之任一项所述的重组细胞，其中p180蛋白质的部分选自：
含对应于由有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人p180蛋白质)的第27～157氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、
含对应于由第623～737氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分、
含对应于由第738～944氨基酸组成的区域的氨基酸序列、对应于由第945～1540氨基酸组成的区域的氨基酸序列的部分。
6.权利要求1～5之任一项所述的重组细胞，其中促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质选自剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质的全长或其部分(SEQIDNO:4的全长氨基酸序列424AA；作为RRM1的SEQIDNO:4的13～91AA；作为.RRM2的SEQIDNO:4的100。
7.权利要求6所述的重组细胞，其中SF3b4蛋白质选自：
(i)由与人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:4)有至少70％的序列相同性的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(ii)由在人来源的SF3b4蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:4)中缺失、取代、或者附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(iii)由与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)有至少70％的序列相同性的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(iv)由在来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)中缺失、取代、或者附加1个或数个核苷酸的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质、
(v)由可和与编码人来源的SF3b4蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)互补的核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸序列所规定的氨基酸序列组成，有促进mRNA的向小胞体的定位的功能的蛋白质。
8.权利要求6或7所述的重组细胞，其中SF3b4蛋白质是哺乳动物来源的。
9.权利要求8所述的重组细胞，其中哺乳动物的SF3b4蛋白质的全长或其部分是人SF3b4蛋白质(SEQIDNO:4)、小鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_694693.1)、大鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_001011951.1)、中国仓鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_003498680.1)、狗SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_540295.3)、马SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_001488649.2)、猴SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_001097793.1)、黑猩猩SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_513768.2)、猪SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_001926524.1)、或者它们的部分。
10.权利要求1～9之任一项所述的重组细胞，其中作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力通过转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白质的产生量增加而亢进。
11.细胞株，其由保藏号NITEBP-01753(CHO3D5)、保藏号NITEBP-01535(CHOYA7)、或者保藏号NITEABP-01811(CHO1B2)表示。
12.制造作为目的物的蛋白质的方法，其通过在使p180蛋白质的全长或其部分的表达亢进，使促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的表达亢进，或使在这些蛋白质两方的表达亢进的重组细胞中转化编码作为目的物的蛋白质的核酸分子或使作为目的物的蛋白质的产生量增加。
13.权利要求12所述的方法，其中p180蛋白质是哺乳动物来源的。
14.权利要求13所述的方法，其中哺乳动物的p180蛋白质的全长或其部分是人p180蛋白质(SEQIDNO:2)、小鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.NP_077243)、大鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_230637)、中国仓鼠p180蛋白质(GenBank登录号No.XM_003496471)、狗p180蛋白质(GenBank登录号No.NP_001003179)、马p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_001915027)、猴p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_002798281)、黑猩猩p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_514527)、猪p180蛋白质(GenBank登录号No.XP_001926148)、或者它们的部分。
15.权利要求13或14所述的方法，其中哺乳动物的p180蛋白质的部分选自：
含由有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质(人p180蛋白质)的第27～157氨基酸组成的区域的部分、
含由第623～737氨基酸组成的区域的部分、
含由第738～944氨基酸组成的区域的部分、
含由第945～1540氨基酸组成的区域的部分。
16.权利要求12～15之任一项所述的方法，其中促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质选自剪接因子3B亚基4(SF3b4)蛋白质的全长或其部分(SEQIDNO:4的全长氨基酸序列424AA；作为RRM1的SEQIDNO:4的13～91AA；作为.RRM2的SEQIDNO:4的100。
17.权利要求16所述的方法，其中SF3b4蛋白质是哺乳动物来源的。
18.权利要求17所述的方法，其中哺乳动物的SF3b4蛋白质的全长或其部分是人SF3b4蛋白质(SEQIDNO:4)、小鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_694693.1)、大鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_001011951.1)、中国仓鼠SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_003498680.1)、狗SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_540295.3)、马SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_001488649.2)、猴SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.NP_001097793.1)、黑猩猩SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_513768.2)、猪SF3b4蛋白质(GenBank登录号No.XP_001926524.1)、或者它们的部分。
19.权利要求12～18之任一项所述的方法，其中重组细胞是由保藏号NITEBP-01753(CHO3D5)、保藏号NITEBP-01535(CHOYA7)、或者保藏号NITEABP-01811(CHO1B2)表示的细胞株。
20.权利要求12～19之任一项所述的方法，其中作为目的物的蛋白质是糖蛋白质。
21.权利要求20所述的方法，其中作为目的物的蛋白质是胶原、纤连蛋白或抗体。
22.使在表达系细胞内的作为目的物的蛋白质的表达量增大的方法，其通过在用于表达作为目的物的蛋白质的表达单位中，向启动子之下游并且编码作为目的物的蛋白质的DNA的核苷酸序列的起始密码子之上游插入RNA结合蛋白质所识别/结合(或者相互作用)的顺式-元件而使在表达系细胞内的作为目的物的蛋白质的表达量增大。
23.权利要求22所述的方法，其中顺式-元件是RNA识别基序(RRM)型RNA结合蛋白质所识别/结合(或者相互作用)的元件。
24.权利要求23所述的方法，其中顺式-元件是SF3b4蛋白质的RNA识别基序(RRM)所识别/结合(或者相互作用)的元件。
25.权利要求22～24之任一项所述的方法，其中顺式-元件的核苷酸序列是含1个或数个9聚体～12聚体的序列基序GAN1-(X)n-ACN2(n＝3～6)(N1及N2可独立地为A、T、C、G之任何的核苷酸)。
26.权利要求25所述的方法，其中顺式-元件的核苷酸序列是含1个或数个9聚体～12聚体的序列基序(GAG-(X)n-ACV(n＝3～6)(V表示A或G或C)、SEQIDNO:17～20)。
27.权利要求22～26之任一项所述的方法，其中顺式-元件的核苷酸序列是选自下列的序列：
I型胶原基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、纤连蛋白基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、基质金属蛋白酶14(MMP14)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、脯氨酰4-羟化酶A2(P4HA2)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列、脯氨酰4-羟化酶A1(P4HA1)基因的5'非翻译区域的核苷酸序列来源的序列。
28.权利要求22～27之任一项所述的方法，其中顺式-元件的核苷酸序列除SEQIDNO:5的全长或SEQIDNO:7的全长之外、是选自SEQIDNO:5之中第1～102核苷酸、第1～78核苷酸、第1～60核苷酸、第61～126核苷酸、第16～57核苷酸、第79～126核苷酸、第103～126核苷酸、第58～78核苷酸、第51～78核苷酸、第1～27核苷酸、第70～78核苷酸的任何的序列。
29.权利要求22～28之任一项所述的方法，其中表达系细胞是无伤的宿主细胞、p180蛋白质的全长或其部分的表达亢进的细胞、SF3b4蛋白质的全长或其部分的表达亢进的细胞、或者这两方的表达均亢进的细胞。
30.用于通过对SF3b4进行功能阻碍或表达抑制来抑制胶原合成，防止异常胶原所致的肺胞上皮、纤维症的重症化的医药组合物。
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