CN114858898B - 荧光/电化学双信号模式生物传感器及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品安全快速检测技术领域，具体涉及一种荧光/电化学双信号模式生物传感器及其构建方法和应用。针对单一模式的传感检测容易受到样品基质、生物环境等因素影响的问题，本发明基于锆基‑金属有机框架材料(Zr‑MOF)制备了信号探针MB‑cDNA‑MOF和磁性识别探针Apt‑Fe3O4，利用cDNA和Apt的碱基互补配对制备了双模式复合探针MB‑cDNA‑MOF/Apt‑Fe3O4用于食品中四环素残留的检测。

Description

荧光/电化学双信号模式生物传感器及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及食品安全快速检测技术领域，具体涉及一种荧光/电化学双信号模式生物传感器及其构建方法和应用。
背景技术
四环素(tetracycline，TC)是一种典型的抗生素，不仅具有杀菌抑菌的作用，还可以促进动物的生长，所以其在动物养殖过程中经常使用。而不合理的四环素使用，会导致其在动物性食品中残留，人们长期食用含有四环素残留的食品就会对人体的健康产生危害。目前，对于食品中四环素残留量的分析检测方法已有大量的报道，但基于色谱技术的仪器分析方法使用的仪器昂贵，操作复杂，方法需要复杂的样品前处理，不适用于四环素的现场快速检测。因此，开发一种简便快捷、灵敏可靠的四环素检测方法迫在眉睫。
荧光、电化学传感器由于操作简单，灵敏度高而被广泛使用在气体检测、农兽药残留检测、生物医药等领域。单一模式的传感检测容易受到样品基质、生物环境等因素的影响，而双模式传感检测可以体现每种检测方法的优点，利用双通道信号进行自校准，获得更准确的检测结果。目前，双模式传感检测主要都是基于同一信号发生体系，如荧光-比色，光电化学-电化学发光等，基于不同信号发生体系的双模式传感检测的研究较少，因此，我们旨在开发一种荧光/电化学双信号模式传感器用于食品中四环素残留的检测。
发明内容
针对现有四环素检测技术的缺点和瓶颈问题，本发明的目的在于提供一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的制备方法和应用。本发明首先制备了信号探针MB-cDNA-MOF和识别探针Apt-Fe3O4，然后，由于Apt和cDNA碱基互补配对，制备了双模式复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4。构建了一种基于MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4的荧光/电化学双信号模式生物传感器。本发明制备的传感器可用于四环素的高选择性、高灵敏度检测。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建方法，包括以下步骤：
步骤1，将具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料醛基化，然后与末端氨基修饰的适配体互补短链孵育，孵育后洗涤，再分散于亚甲基蓝溶液中进行吸附、离心、洗涤，制得信号探针；
步骤2，用EDC/NHS共价偶联的方法将末端氨基修饰的适配体与表面羧基化的纳米磁球进行共价偶联，制得磁性识别探针；
步骤3，将步骤1制得的信号探针与步骤2制得的磁性识别探针混合，在摇床下反应，制备双模式复合探针；
步骤4，基于双模式复合探针构建荧光/电化学双信号模式生物传感器。
进一步，所述步骤1中具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料为UiO-66-NH2，其制备方法如下：
将ZrCl4、DMF和浓盐酸混合，超声处理20min，然后加入2-氨基对苯二甲酸和DMF，超声处理20min后，转移至内衬为特氟隆的高压反应釜中，于120℃下加热24h，自然冷却至室温后，将悬浮液用甲醇洗涤，并在50℃真空下干燥6h，得到白色粉末UiO-66-NH2。
进一步，所述信号探针的具体制备方法，包括以下步骤：
(1)将UiO-66-NH2分散在含体积分数2.5％的戊二醛的PBS缓冲溶液中，离心后，用PBS缓冲溶液洗涤，然后转移至含有末端氨基修饰的适配体互补短链NH2-cDNA的容器中，室温孵育3h，最后用PBS缓冲溶液多次洗涤非特异性吸附的cDNA，直至离心后上清液在260nm无紫外吸收，制得偶联物cDNA-MOF，所述cDNA的序列为：5’-CAACGTGCTAGCGAA-3’；
(2)将偶联物cDNA-MOF分散在亚甲基蓝溶液中,室温下静置24h，离心后，用PBS缓冲溶液洗涤以去除未吸附的亚甲基蓝溶液，制得MB-cDNA-MOF。
更进一步，所述PBS缓冲溶液的pH为7.4。
进一步，所述步骤2中磁性识别探针的具体制备方法，包括以下步骤：
将Fe3O4用pH为6.0的PBS缓冲溶液洗涤后，分散到含EDC和NHS的PBS缓冲液中，室温下超声处理30min，与Apt室温孵育3h，最后，用pH为7.4的PBS缓冲溶液多次洗涤非特异性吸附的Apt，直至离心后上清液在260nm无紫外吸收，得到磁性识别探针Apt-Fe3O4，所述Apt的序列为：5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’。
进一步，所述步骤3中摇床的温度为23～44℃，反应时间为30～90min。
进一步，所述步骤4中基于双模式复合探针构建荧光/电化学双信号模式生物传感器，具体方法为：
步骤3.1，特异性识别：将所述双模式复合探针加入到待测样品中，37℃孵育50～70min，完成目标物的特异性识别，磁分离后取上清液；
步骤3.2，丝网印刷电极的预处理和电化学检测：将丝网印刷电极浸泡在无水乙醇中10～30min后，用超纯水反复冲洗，然后用氮气吹干，吸取步骤3.1的上清液滴涂到处理好的丝网印刷电极表面，构建电化学传感器，采用差分脉冲伏安法进行检测，检测条件为：扫描电压范围为-0.5～0V，电位增量为0.01V，振幅为50mV；
步骤3.3，荧光检测：吸取步骤1的上清液加入微量比色皿中，进行荧光检测，检测条件为：激发波长为370nm，发射波长为415～450nm。
一种所述构建方法得到的荧光/电化学双信号模式生物传感器。
一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的应用，用于食品中四环素残留检测。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明利用Apt和cDNA碱基互补配对，制备了双模式复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4，该复合探针对四环素具有特异性识别功能，结合荧光检测和差示脉冲伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)，对样品中的四环素进行分析测定。对不同浓度的四环素，可获得不同的荧光值和电流值。四环素不存在时，荧光值和电流值都较低，这是由于适配体仅与少量四环素结合，磁分离后，只有少量信号探针MB-cDNA-MOF释放到上清液中。而随着四环素浓度的增加，荧光值和电流值不断增大，归因于Apt优先与四环素结合，信号探针MB-cDNA-MOF释放到上清液中，使荧光值和电流值增大。
本发明基于双模式复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4，构建了一种荧光/电化学双信号模式生物传感器并将其应用于四环素的检测。重点解决了目前基于色谱技术的四环素检测方法中存在的样品前处理过程繁琐、仪器昂贵，操作复杂等缺点，避免单一模式的传感检测容易受到样品基质、生物环境等因素的影响出现假阳性的问题，为高灵敏高特异性荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建提供了新的思路和方法。
附图说明
图1为实施例10中荧光/电化学双信号模式生物传感器检测不同浓度四环素的荧光和DPV图，a-g依次对应浓度为0，1×10-9g/mL，1×10-8g/mL，1×10-7g/mL，1×10-6g/mL，1×10-5g/mL，1×10-4g/mL的四环素溶液；
图2为实施例10中荧光/电化学双信号模式生物传感器检测不同浓度四环素的荧光值和DPV电流值与1×10-9g/mL～1×10-4g/mL范围内四环素浓度对数值的标准曲线图谱；
图3为实施例10中荧光/电化学双信号模式生物传感器对四环素的选择性能图，其中四环素浓度为1×10-8g/mL，结构类似物(盐酸金霉素(AM)、盐酸强力霉(DOXY)、土霉素(OTC))浓度为1×10-6g/mL；
图4为实施例10中荧光/电化学双信号模式生物传感器对四环素的抗干扰性能图，其中四环素浓度为1×10-8g/mL，结构类似物(盐酸金霉素(AM)、盐酸强力霉(DOXY)、土霉素(OTC))浓度为1×10-6g/mL；
图5为实施例10中荧光/电化学双信号模式生物传感器检测四环素的重现性能图，其中四环素浓度为1×10-8g/mL；
图6为实施例10中荧光/电化学双信号模式生物传感器检测四环素的稳定性能图，其中四环素浓度为1×10-8g/mL。
具体实施方式
实施例1
一种复合探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)信号探针MB-cDNA-MOF的制备：将具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料醛基化，然后与末端氨基修饰的适配体互补短链孵育，孵育后洗涤，再分散于亚甲基蓝溶液中进行吸附、离心、洗涤，制得信号探针；
具体如下：
MOF(UiO-66-NH2)的制备：将ZrCl4(0.25g，0.54mmol)、DMF(10mL)和浓盐酸(2mL)加入烧杯中，超声处理20min。然后加入2-氨基对苯二甲酸(0.272g，0.75mmol)和DMF(20mL)，超声处理20min后，转移至内衬为特氟隆的高压反应釜中，于120℃下加热24h。自然冷却至室温后，将悬浮液用甲醇洗涤三次，并在50℃真空下干燥6h，得到白色粉末UiO-66-NH2。
cDNA-MOF的制备：将获得的UiO-66-NH2分散在2mL含2.5％(体积分数)戊二醛的PBS(pH 7.4)溶液中3h。离心后，用PBS(pH 7.4)洗涤，然后转移至含有30μL末端氨基修饰的适配体互补短链NH2-cDNA的试管中，室温孵育3h。最后，用PBS(pH 7.4)多次洗涤非特异性吸附的cDNA，直至离心后上清在260nm无紫外吸收。所得偶联物cDNA-MOF用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
MB-cDNA-MOF的制备：将获得的cDNA-MOF分散在MB(1mL、1mM)溶液中,室温下静置24h。离心后，用PBS(pH 7.4)洗涤以去除未吸附的MB。制得的MB-cDNA-MOF用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
(2)识别探针Apt-Fe3O4的制备：用EDC/NHS共价偶联的方法将末端氨基修饰的适配体与表面羧基化的纳米磁球进行共价偶联，制得磁性识别探针；
具体如下：
将Fe3O4 MNPs(1mg/mL)用PBS(pH 6.0)洗涤后，分散到2mL含EDC(1.5mg)和NHS(1.1mg)的PBS缓冲液中，室温下超声处理30min。与30μL适配体室温孵育3h。最后，用PBS(pH7.4)多次洗涤非特异性吸附的Apt，直至离心后上清在260nm无紫外吸收。所得磁性识别探针Apt-Fe3O4用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
(3)复合探针的制备：
将信号探针MB-cDNA-MOF 2mL和识别探针Apt-Fe3O42 mL混合，在23℃摇床下反应60min得到复合探针，经磁分离后用PBS(pH 7.4)洗涤多次，最后将复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
实施例2
一种复合探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)信号探针MB-cDNA-MOF的制备：将具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料醛基化，然后与末端氨基修饰的适配体互补短链孵育，孵育后洗涤，再分散于亚甲基蓝溶液中进行吸附、离心、洗涤，制得信号探针；
具体如下：
MOF(UiO-66-NH2)的制备：通常，将ZrCl4(0.25g，0.54mmol)、DMF(10mL)和浓盐酸(2mL)加入烧杯中，超声处理20min。然后加入2-氨基对苯二甲酸(0.272g，0.75mmol)和DMF(20mL)，超声处理20min后，转移至内衬为特氟隆的高压反应釜中，于120℃下加热24h。自然冷却至室温后，将悬浮液用甲醇洗涤三次，并在50℃真空下干燥6h，得到白色粉末UiO-66-NH2。
cDNA-MOF的制备：将获得的UiO-66-NH2分散在2mL含2.5％(体积分数)戊二醛的PBS(pH 7.4)溶液中3h。离心后，用PBS(pH 7.4)洗涤，然后转移至含有30μL末端氨基修饰的适配体互补短链NH2-cDNA的试管中，室温孵育3h。最后，用PBS(pH 7.4)多次洗涤非特异性吸附的cDNA，直至离心后上清在260nm无紫外吸收。所得偶联物cDNA-MOF用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
MB-cDNA-MOF的制备：将获得的cDNA-MOF分散在MB(1mL、1mM)溶液中,室温下静置24h。离心后，用PBS(pH 7.4)洗涤以去除未吸附的MB。制得的MB-cDNA-MOF用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
(2)识别探针Apt-Fe3O4的制备：用EDC/NHS共价偶联的方法将末端氨基修饰的适配体与表面羧基化的纳米磁球进行共价偶联，制得磁性识别探针；
具体如下：
将Fe3O4 MNPs(1mg/mL)用PBS(pH 6.0)洗涤后，分散到2mL含EDC(1.5mg)和NHS(1.1mg)的PBS缓冲液中，室温下超声处理30min，与30μL适配体室温孵育3h。最后，用PBS(pH7.4)多次洗涤非特异性吸附的Apt，直至离心后上清在260nm无紫外吸收。所得磁性识别探针Apt-Fe3O4用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
(3)复合探针的制备：
将信号探针MB-cDNA-MOF 2mL和识别探针Apt-Fe3O42 mL混合，在30℃摇床下反应60min得到复合探针，经磁分离后用PBS(pH 7.4)洗涤多次，最后将复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
实施例3
一种复合探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)信号探针MB-cDNA-MOF的制备：将具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料醛基化，然后与末端氨基修饰的适配体互补短链孵育，孵育后洗涤，再分散于亚甲基蓝溶液中进行吸附、离心、洗涤，制得信号探针；
具体如下：
MOF(UiO-66-NH2)的制备：将ZrCl4(0.25g，0.54mmol)、DMF(10mL)和浓盐酸(2mL)加入烧杯中，超声处理20min。然后加入2-氨基对苯二甲酸(0.272g，0.75mmol)和DMF(20mL)，超声处理20min后，转移至内衬为特氟隆的高压反应釜中，于120℃下加热24h。自然冷却至室温后，将悬浮液用甲醇洗涤三次，并在50℃真空下干燥6h，得到白色粉末UiO-66-NH2。
cDNA-MOF的制备：将获得的UiO-66-NH2分散在2mL含2.5％(体积分数)戊二醛的PBS(pH 7.4)溶液中3h。离心后，用PBS(pH 7.4)洗涤，然后转移至含有30μL末端氨基修饰的适配体互补短链NH2-cDNA的试管中，室温孵育3h。最后，用PBS(pH 7.4)多次洗涤非特异性吸附的cDNA，直至离心后上清在260nm无紫外吸收。所得偶联物cDNA-MOF用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
MB-cDNA-MOF的制备：将获得的cDNA-MOF分散在MB(1mL、1mM)溶液中,室温下静置24h。离心后，用PBS(pH 7.4)洗涤以去除未吸附的MB。制得的MB-cDNA-MOF用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
(2)识别探针Apt-Fe3O4的制备：
将Fe3O4 MNPs(1mg/mL)用PBS(pH 6.0)洗涤后，分散到2mL含EDC(1.5mg)和NHS(1.1mg)的PBS缓冲液中，室温下超声处理30min，与30μL适配体室温孵育3h。最后，用PBS(pH7.4)多次洗涤非特异性吸附的Apt，直至离心后上清在260nm无紫外吸收。所得磁性识别探针Apt-Fe3O4用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
(3)复合探针的制备：
将信号探针MB-cDNA-MOF 2mL和识别探针Apt-Fe3O42 mL混合，在37℃摇床下反应60min得到复合探针，经磁分离后用PBS(pH 7.4)洗涤多次，最后将复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
实施例4
一种复合探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)信号探针MB-cDNA-MOF的制备：将具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料醛基化，然后与末端氨基修饰的适配体互补短链孵育，孵育后洗涤，再分散于亚甲基蓝溶液中进行吸附、离心、洗涤，制得信号探针；
具体如下：
MOF(UiO-66-NH2)的制备：通常，将ZrCl4(0.25g，0.54mmol)、DMF(10mL)和浓盐酸(2mL)加入烧杯中，超声处理20min。然后加入2-氨基对苯二甲酸(0.272g，0.75mmol)和DMF(20mL)，超声处理20min后，转移至内衬为特氟隆的高压反应釜中，于120℃下加热24h。自然冷却至室温后，将悬浮液用甲醇洗涤三次，并在50℃真空下干燥6h，得到白色粉末UiO-66-NH2。
cDNA-MOF的制备：将获得的UiO-66-NH2分散在2mL含2.5％(体积分数)戊二醛的PBS(pH 7.4)溶液中3h。离心后，用PBS(pH 7.4)洗涤，然后转移至含有30μL末端氨基修饰的适配体互补短链NH2-cDNA的试管中，室温孵育3h。最后，用PBS(pH 7.4)多次洗涤非特异性吸附的cDNA，直至离心后上清在260nm无紫外吸收。所得偶联物cDNA-MOF用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
MB-cDNA-MOF的制备：将获得的cDNA-MOF分散在MB(1mL、1mM)溶液中,室温下静置24h。离心后，用PBS(pH 7.4)洗涤以去除未吸附的MB。制得的MB-cDNA-MOF用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
(2)识别探针Apt-Fe3O4的制备：用EDC/NHS共价偶联的方法将末端氨基修饰的适配体与表面羧基化的纳米磁球进行共价偶联，制得磁性识别探针；
具体如下：
将Fe3O4 MNPs(1mg/mL)用PBS(pH 6.0)洗涤后，分散到2mL含EDC(1.5mg)和NHS(1.1mg)的PBS缓冲液中，室温下超声处理30min，与30μL适配体室温孵育3h。最后，用PBS(pH7.4)多次洗涤非特异性吸附的Apt，直至离心后上清在260nm无紫外吸收。所得磁性识别探针Apt-Fe3O4用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
(3)复合探针的制备：
将信号探针MB-cDNA-MOF 2mL和识别探针Apt-Fe3O42 mL混合，在44℃摇床下反应60min得到复合探针，经磁分离后用PBS(pH 7.4)洗涤多次，最后将复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4用PBS(pH 7.4)分散，4℃保存。
上述实施例1～4中，cDNA序列：5’-NH2-CAA CGT GCTAGC GAA-3’。
Apt序列：5’-NH2-CGTACG GAATTC GCTAGC CCC CCG GCA GGC CAC GGC TTG GGTTGG TCC CAC TGC GCG TGGATC CGA GCT CCA CGT G-3’。
实施例5
一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建及应用，包含以下过程：
步骤1，特异性识别：将所述的复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4200μL加入到待测四环素样品中，37℃孵育60min，完成目标物的特异性识别，磁分离后取上清液；
步骤2，丝网印刷电极的预处理和电化学检测：将丝网印刷电极浸泡在无水乙醇中10-30min后，用超纯水反复冲洗，然后用氮气吹干。用移液枪吸取70μL步骤1孵育完成的上清液滴涂到处理好的丝网印刷电极表面，构建电化学传感器。采用差分脉冲伏安法进行检测，检测条件为：扫描电压范围为-0.5～0V，电位增量为0.01V，振幅为50mV。
步骤3，荧光检测：用移液枪吸取400μL步骤1孵育完成的上清液加入微量比色皿中，进行荧光检测。检测条件为：激发波长为370nm，发射波长为415nm～450nm。
实施例6
一种荧光/电化学双信号模式生物传感器检测四环素标准曲线的建立，具体步骤如下：
依次配置浓度为1×10-9g/mL，1×10-8g/mL，1×10-7g/mL，1×10-6g/mL，1×10-5g/mL，1×10-4g/mL的四环素溶液，分别取350μL，各加入实施例3制备得到的复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4200μL，按照实施例5的方法对各个浓度的四环素进行荧光检测和差分脉冲伏安法(DPV)测定。并以荧光传感器的荧光值和电化学传感器的DPV电流变化值对1×10-9g/mL～1×10-4g/mL范围内四环素浓度对数值作标准曲线图谱。
图1为所构建的荧光/电化学双信号模式生物传感器检测不同浓度四环素的荧光和DPV图。随着四环素浓度逐渐增加，Apt优先与四环素结合，信号探针MB-cDNA-MOF释放到上清液中，荧光值和电流值增大。如图2所示，所构建的传感器的荧光响应值与四环素浓度对数在1×10-9g/mL～1×10-4g/mL范围内呈现良好的线性关系，其线性方程为：ΔF＝-38.694lgC(g/mL)+382.6，相关系数R2＝0.9908；所构建的传感器的DPV响应值与四环素浓度对数在1×10-9g/mL～1×10-4g/mL范围内呈现良好的线性关系，其线性方程为：ΔI(μA)＝-0.0699lgC(g/mL)+0.7172，相关系数R2＝0.9896。
实施例7
一种荧光/电化学双信号模式生物传感器对四环素的选择性与抗干扰性能实验：
用实施例5的方法对1×10-8g/mL浓度的四环素溶液和1×10-6g/mL三种结构类似物(盐酸金霉素、盐酸强力霉、土霉素)溶液进行荧光检测和DPV测定。对四环素结构类似物进行单独测定，结果如图3所示，峰荧光变化值和峰电流变化值与四环素单独测定时相比差异显著。四环素与干扰物共同存在的情况下，测定结果结果如图4所示峰荧光变化值和峰电流变化值与四环素单独测定时相比没有明显变化说明所构建的电化学传感器对四环素有很好的选择性和抗干扰能力。
实施例8
一种荧光/电化学双信号模式生物传感器对四环素的重现性评价：
用与实施例3相同的方法制备六批不同批次的复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4，按实施例5的方法构建对应的荧光/电化学双信号模式生物传感器，然后对浓度为1×10-8g/mL的四环素溶液进行检测。其结果如图5所示，六批所构建的荧光/电化学双信号模式生物传感器其信号响应差异很小，表明所制备的传感器具有很好的重现性。
实施例9
一种荧光/电化学双信号模式生物传感器对四环素的稳定性评价：
在相同的条件下制备一批复合探针MB-cDNA-MOF/Apt-Fe3O4，4℃保存，每隔一周按实施例5的方法对浓度为1×10-8g/mL的四环素溶液进行检测连续测定四周。其结果如图6所示，第四周测定时荧光/电化学双信号模式生物传感器的信号响应与第一周测定的信号响应差异很小，表明所制备的传感器具有很好的稳定性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料醛基化，然后与末端氨基修饰的适配体互补短链孵育，孵育后洗涤，再分散于亚甲基蓝溶液中进行吸附、离心、洗涤，制得信号探针，所述具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料为UiO-66-NH2；
步骤2，用EDC/NHS共价偶联的方法将末端氨基修饰的适配体与表面羧基化的纳米磁球进行共价偶联，制得磁性识别探针，所述纳米磁球为Fe3O4 MNPs；
步骤3，将步骤1制得的信号探针与步骤2制得的磁性识别探针混合，在摇床下反应，制备双模式复合探针；
步骤4，基于双模式复合探针构建荧光/电化学双信号模式生物传感器，具体方法为：
步骤4.1，特异性识别：将所述双模式复合探针加入到待测样品中，37℃孵育50~70min，完成目标物的特异性识别，磁分离后取上清液；
步骤4.2，丝网印刷电极的预处理和电化学检测：将丝网印刷电极浸泡在无水乙醇中10~30 min后，用超纯水反复冲洗，然后用氮气吹干，吸取步骤4.1的上清液滴涂到处理好的丝网印刷电极表面，构建电化学传感器，采用差分脉冲伏安法进行检测，检测条件为：扫描电压范围为-0.5～0 V，电位增量为0.01 V，振幅为50 mV；
步骤4.3，荧光检测：吸取步骤4.1的上清液加入微量比色皿中，进行荧光检测，检测条件为：激发波长为370 nm，发射波长为415~450 nm。
2.根据权利要求1所述的一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建方法，其特征在于，所述步骤1中具有荧光特性的氨基功能化多孔MOF材料的制备方法如下：
将ZrCl4、DMF和浓盐酸混合，超声处理20min，然后加入2-氨基对苯二甲酸和DMF，超声处理20min后，转移至内衬为特氟隆的高压反应釜中，于120°C下加热24 h，自然冷却至室温后，将悬浮液用甲醇洗涤，并在50℃真空下干燥6 h，得到白色粉末UiO-66-NH2。
3.根据权利要求2所述的一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建方法，其特征在于，所述信号探针的具体制备方法，包括以下步骤：
（1）将UiO-66-NH2分散在含体积分数2.5%的戊二醛的PBS缓冲溶液中，离心后，用PBS缓冲溶液洗涤，然后转移至含有末端氨基修饰的适配体互补短链NH2-cDNA的容器中，室温孵育3 h，最后用PBS缓冲溶液多次洗涤非特异性吸附的cDNA，直至离心后上清液在260 nm无紫外吸收，制得偶联物cDNA-MOF，所述cDNA的序列为：5’-CAACGTGCTAGCGAA-3’；
（2）将偶联物cDNA-MOF分散在亚甲基蓝溶液中,室温下静置24 h，离心后，用PBS缓冲溶液洗涤以去除未吸附的亚甲基蓝溶液，制得MB-cDNA-MOF。
4.根据权利要求3所述的一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建方法，其特征在于，所述PBS缓冲溶液的pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建方法，其特征在于，所述步骤2中磁性识别探针的具体制备方法，包括以下步骤：
将Fe3O4 MNPs用pH为6.0的PBS缓冲溶液洗涤后，分散到含EDC和NHS的PBS缓冲液中，室温下超声处理30 min，与Apt室温孵育3 h，最后，用pH为7.4的PBS缓冲溶液多次洗涤非特异性吸附的Apt，直至离心后上清液在260 nm无紫外吸收，得到磁性识别探针Apt-Fe3O4，所述Apt的序列为：5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’。
6.根据权利要求1所述的一种荧光/电化学双信号模式生物传感器的构建方法，其特征在于，所述步骤3中摇床的温度为23~44℃，反应时间为30~90min。
7.权利要求1~6任一项所述构建方法得到的荧光/电化学双信号模式生物传感器。
8.根据权利要求7所述的一种荧光/电化学双信号模式生物传感器，其特征在于，线性检测范围为1×10-9 g/mL～1×10-4 g/mL。
9.一种权利要求7所述荧光/电化学双信号模式生物传感器的应用，其特征在于，用于食品中四环素残留检测。
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CN110455896B (zh) * 2019-08-27 2020-02-11 青岛大学 金属有机骨架复合物比率电化学miR3123适体传感器的制备方法
CN110763740B (zh) * 2019-09-06 2021-12-07 南京医科大学 基于Fe3O4@MnO2和碳点的电化学和荧光双信号传感器检测过氧化氢的方法
CN112129818B (zh) * 2020-09-25 2022-01-18 广西师范大学 一种基于Cu-ZrMOF的多模式信号检测蔬菜中毒死蜱含量的方法
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