CN113655005A - 一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌o157:h7的检测方法 - Google Patents

一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌o157:h7的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法，属于微生物检测技术和前处理技术领域。本发明以核壳型金铂纳米团簇作为模拟酶，将链霉亲和素通过静电作用吸附在金铂纳米团簇表面，然后结合生物素化的特异性适配体作为探针，进而促进对大肠杆菌O157:H7的特异性识别。本发明基于夹心法策略，利用适配体修饰的磁珠作为捕获探针，通过磁吸作用降低样品中复杂基质对检测结果的干扰，并采用生物素‑亲和素系统将适配体修饰在金铂纳米团簇表面，减少空间位阻，提高识别分子的负载量。本发明实现同步识别大肠杆菌O157:H7，简化操作步骤，极大缩短了反应时间，使检测灵敏性提高至102CFU/mL，降低成本、减小样品基质影响、提升检测效率，具有良好的应用前景。

Description

一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测 方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术和前处理技术领域，具体涉及一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法。
背景技术
大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）属于肠杆菌科埃希氏菌属，革兰氏阴性杆菌，无芽孢，有鞭毛；耐酸、耐低温，其中血清型O157：H7为肠出血性和肠炎的主要致病菌；可通过牛奶、鸡肉、牛肉及水果等食品进行传播，其产生的Vero毒素和类志贺氏毒素可造成感染者出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征和血栓性血小板减少性紫癜等症状，易感人群为儿童和老年人为主。该菌的感染剂量极低、感染力强、繁殖迅速、感染途径广泛，严重者可导致死亡。因此，建立快速、灵敏且成本较低的检测手段是有效防治大肠杆菌O157:H7的重要技术前提。
现有技术中，对大肠杆菌O157:H7的检测方法主要包括常规法（增菌培养、分离、鉴定）、以分子生物学为基础的检测方法以及免疫学为基础的检测方法。常规法通常需要进行增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定等，其结果准确可靠，但是需经过增菌和一系列复杂繁琐的操作，检测周期长（约5~7天）。因此传统的培养检测技术无法满足对食品中大肠杆菌O157:H7的快速筛查及风险检测。以高灵敏度为特点的分子生物学检测方法包括核酸探针技术、滚环扩增（RCA）技术、环介导等温扩增（LAMP）技术以及聚合酶链式反应（PCR）技术等手段，由于该类技术依赖于昂贵的仪器设备和专业的操作人员，并且样品前处理复杂，无法满足现场实地检测的需求。免疫学方法主要是基于抗原抗体识别技术的快速筛查，具有高通量、无需贵重的仪器设备和检测快速等优点，近年来得到大量的推广和应用，但是抗体获取需经免疫动物等步骤，抗体制备过程中的不同批次之间质量差异较大，且抗体和标记物酶均属蛋白质，其活性及储存条件易受环境因素影响，无法满足检测成本低、稳定性高等要求。
近年来，为提高检测稳定性和降低检测成本，分子印迹、抗生素类以及核酸适配体等新型的分子识别技术被报导，同时，一些具有类天然酶活性的纳米粒子被发现，如金、铂等贵金属纳米粒子、氧化石墨烯及稀土纳米粒子等，能够催化双氧水生成羟基自由基，进而氧化无色的底物四甲基联苯胺形成蓝色产物，于650nm波长处记录吸光度值。该类具有模拟酶活性的纳米粒子具有良好的抗变性能力，催化活性高，成本较低和易于存储等优点。然而，选用何种识别分子、模拟酶及其二者之间的偶联方法，既能够保证材料易合成又能够保证显色反应的灵敏性及稳定性，实现大肠杆菌O157:H7的快速灵敏检测，具有较高的技术难度且未见报道。
发明内容
为了提高检测稳定性、降低检测成本、简化检测步骤，本发明提供一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法。
一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测操作步骤如下：
（1）包被卵清蛋白
在酶标板上以磷酸盐缓冲液作为包被液，稀释卵清蛋白至30～50mg/mL，包被过夜，得到包被卵清蛋白的酶标板；
（2）加入适配体修饰的磁珠和金铂纳米团簇
将适配体修饰的磁珠、适配体修饰的金铂纳米团簇与待测样品在包被卵清蛋白的酶标板中混合，于30～37℃条件下、反应40～70min，洗涤；
所述适配体修饰的磁珠用量为50～150μg/孔，适配体修饰的金铂纳米团簇用量为10～20pmol/L；
所述适配体修饰的磁珠为氨基化适配体修饰的磁珠，所述氨基化适配体的核酸序列为5′NH2-TTT TTT CCG GAC GCT TAT GCC TTG CCA TCT ACA GAG CAG GTG TGA CGG-3′；
所述适配体修饰的金铂纳米团簇为生物素化的适配体修饰的金铂纳米团簇，所述生物素化的适配体的核酸序列为5′Biotin-C6-TTT TTT CCG GAC GCT TAT GCC TTG CCATCT ACA GAG CAG GTG TGA CGG-3′；
以核酸适配体作为识别元件，以金铂纳米团簇作为类过氧化物酶；
（3）加入底物显色
加入200μL TMB显色液，于30～37℃条件下，反应20～30min；得到反应产物；
所述TMB显色液含有双氧水和四甲基联苯胺；
（4）检测吸光度值
利用酶标仪检测所述反应产物的吸光度值，设定酶标仪的读取波长为650nm；
以波长650nm处的吸光度值为纵坐标y，以大肠杆菌O157:H7的浓度为横坐标x，绘制标准曲线，标准曲线为y = 0.0727ln(x)-0.387，R 2 = 0.9868；
进行实际样品检测时，将待测样品的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出对应的待测样品的浓度，乘以其对应的稀释倍数，即得到待测样品中大肠杆菌O157:H7的实际浓度。
进一步的具体技术方案如下：
步骤（1）中，在酶标板上以0.01～0.02mol/L、pH值9.0～9.6的磷酸盐缓冲液作为包被液，稀释卵清蛋白至30～50mg/mL，于4℃条件下、包被过夜，弃去包被液，利用洗涤液洗涤酶标板，得到包被卵清蛋白的酶标板。
步骤（2）中，制备适配体修饰的磁珠和适配体修饰金铂纳米团簇的具体操作如下：
（2.1）制备适配体修饰的磁珠
取5mg 羧基化磁珠在磷酸盐缓冲液（PBS）下洗涤三次，加入4～8mg 碳二亚胺（EDC）、2～5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化30～60min；洗涤；加入1～2nmol氨基化适配体继续反应1～2h，加入牛血清白蛋白封闭，洗涤，重悬至终浓度为1～3mg/mL，即得到所述的适配体修饰的磁珠；
（2.2）制备适配体修饰的金铂纳米团簇
首先通过种子生长法制备金铂纳米团簇，向1mL 15～20nm种子金中加入10%～20%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和80～150mg/mL抗坏血酸，充分混匀后加入70～120mmol/L氯铂酸置于60～70℃中反应30～50min，对产物进行离心洗涤分散在超纯水中，即得到金铂纳米团簇；
取0.5～1nmol的链霉亲和素与1mL金铂纳米团簇反应，连续震荡3h，加入10～20mg/mL牛血清白蛋白封闭1h，反应结束离心洗涤，加入1～2nmol生物素化的适配体继续反应2h，反应结束后离心洗涤，沉淀分散于PBS中，即得到大肠杆菌O157:H7适配体修饰的金铂纳米团簇。
步骤（2）中，所述洗涤是利用磷酸盐缓冲液在外加磁场环境下进行冲洗。
步骤（3）中，所述TMB显色液为单组分混合液。
步骤（3.1）中，所述洗涤为用含有体积浓度0.05%吐温-20的PBS溶液洗涤；所述PBS溶液的浓度为0.005～0.02mol/L，PBS溶液的pH值为7.0～7.5。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1、本发明方法使用更为灵敏的具有过氧化物酶活性的金铂纳米团簇代替传统的辣根过氧化物酶，金铂纳米团簇是基于种子生长法合成的具有过氧化物酶活性的双金属纳米粒子，由于电子结构和表面原子排列的变化使得金铂纳米团簇在如氧化还原反应和甲酸氧化反应中更加活跃，其对底物TMB的灵敏度是辣根过氧化物酶的500倍，因此从机理上分析，采用金铂纳米团簇替代天然酶可提高检测灵敏度，从检测结果上分析，该方法相对于传统的基于辣根过氧化物酶检测大肠杆菌的显色方法至少提高了2-3个数量级。另一方面，相对于辣根过氧化物酶的蛋白本质，金铂纳米团簇具有制备简单、颗粒大小可控、受环境条件影响小、稳定性高、不易失活和成本较低等优点。
2、本发明方法涉及基于磁回收技术，使用磁珠作为适配体的载体进行大肠杆菌O157:H7的捕获，增加识别分子的负载量，通过磁回收技术可降低复杂样品中的基质对模拟酶催化活性的干扰，提高实验结果重复性，进而提高检测稳定性。
3、本发明方法使用核酸适配体代替昂贵的抗体，检测成本降低了约65%。
4、本发明采用了修饰适配体的磁珠和金铂纳米团簇同步识别大肠杆菌O157:H7，简化操作步骤，检测时间缩短至2小时内，检测效率提高了50%。
附图说明
图1是本发明检测方法原理图。
图2是本发明中核壳型金铂纳米团簇透射电镜图。
图3是本发明实施例1中吸光度-菌浓度标准曲线图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
以下实施例中，羧基化磁珠购买于阿拉丁试剂有限公司；金铂纳米团簇合成所涉及到的原料均购买于美国Sigma-Aldrich公司；氨基化/生物素化的核酸适配体购买于上海生工生物工程股份有限公司；链霉亲和素购买于华蓝生物有限公司；单组分TMB显色液购买于碧云天生物技术有限公司。
实施例1
本发明在检测牛奶中的大肠杆菌O157:H7含量中的应用
本发明用于检测牛奶中的大肠杆菌O157:H7含量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用本发明所述方法进行检测、结果分析。
（一）样品前处理
取购得的无菌牛奶样品1mL，加入到9mL无菌PBS中，充分混匀后加入不同浓度的菌制备菌悬液备用。
（二）用本发明检测方法进行上述样品中大肠杆菌O157:H7含量的检测
（1）包被卵清蛋白
在酶标板上以0.01mol/L、pH值为9.0的磷酸盐缓冲液作为包被液，稀释卵清蛋白至30mg/mL，于4℃条件下、包被过夜，弃去包被液，利用洗涤液洗涤酶标板，得到包被卵清蛋白的酶标板；
（2）加入适配体修饰的磁珠和适配体修饰的金铂纳米团簇
取包被有卵清蛋白的酶标板，已知浓度菌的标准品100μL/孔加到对应的酶标板微孔中；加所制备的实际样品100μL/孔到对应的酶标板微孔中；再加入大肠杆菌O157:H7适配体修饰的磁珠100μL/孔，轻轻振荡混匀；继续加入20μL/孔的大肠杆菌O157:H7适配体修饰的金铂纳米团簇，再次轻轻振荡混匀，盖上盖板，于37℃环境中反应60min；
（3）加入底物显色
揭开盖板后小心地将酶标板放于96孔磁力板上，在磁场的作用下对孔内液体进行磁吸洗涤，磁吸时间为5min，用洗涤工作液320μL/孔，充分洗涤三次，洗涤期间小心地将酶标板从磁力板上取下。加入单组分TMB显色液200μL/孔，轻轻振荡混匀，盖上盖板，于37℃环境中反应20min，得到反应产物。TMB显色液含有双氧水和四甲基联苯胺；
（4）检测吸光度值
设定酶标仪于波长为650nm处检测，测定每孔吸光度值（3min内读取完数值）；以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中大肠杆菌O157:H7的含量。
步骤（1）中，卵清蛋白包被的酶标板的制备是用浓度为0.01mol/L pH值为 9.0的磷酸盐（PBS）缓冲液作为包被液，将卵清蛋白配置成3%的浓度、320μL/孔，4℃放置过夜，取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤工作液320μL/孔，洗涤3次，30s/次，拍干后的酶标板放置恒温间（25℃）晾干；抽检合格，将酶标板真空密封后置4℃下保存。
步骤（2）中，大肠杆菌O157:H7适当浓度梯度分别为101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL。
步骤（2）中，大肠杆菌O157:H7适配体修饰的磁珠是通过以下方法获得的：将5mg羧基化磁珠用PBS洗涤三次，复溶至5mL PBS中，加入5mg EDC和3mg NHS活化1 h；洗涤三次后加入1nmol氨基化适配体反应2h，加入200μL 2%牛血清白蛋白封闭1h，洗涤三次后重悬至磁珠终浓度为1mg/mL；4℃保存备用。
步骤（2）中，适配体修饰金铂纳米团簇是通过以下方法获得的：首先通过种子生长法制备金铂纳米团簇，向1mL 20nm种子金中加入15%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和100mg/mL抗坏血酸，充分混匀后加入80mmol/L氯铂酸置于65℃中反应30min，对产物进行离心洗涤分散在超纯水中，即得到金铂纳米团簇；取0.5nmol的链霉亲和素与1mL 1nmol/L金铂纳米团簇混合于pH值为6.0的PBS中，连续震荡3h，加入200μL2%的牛血清白蛋白封闭1h，反应结束后在6500rpm/min 10min条件下离心洗涤三次，加入1mL1μmol/L生物素化的适配体继续反应2h，在6500rpm/min 10min下离心洗涤三次，沉淀分散于0.01mol/L pH 为7.4的PBS（含有0.1%BSA、1%PVP）中。
步骤（3）中，TMB显色液是通过市面上购买所获得的。
所用洗涤工作液是0.01mol/L PBST，是通过向0.01mol/L PBS中加入0.05%吐温-20所获得的，pH值为7.4。
（三）分析结果
用上述制备的6个大肠杆菌O157:H7不同浓度的菌液101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL。在波长为650nm处检测吸光度值。
以650nm处的吸光度值为纵坐标，以大肠杆菌O157:H7浓度（CFU/mL）为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。标准曲线为y = 0.0727ln(x)-0.387，R 2 = 0.9868，见图3。该方法的最低检测限被定义为5×101CFU/mL的吸光度值加上三个标准误差值。通过该标准曲线计算得最低检测限为2×102CFU/mL。当进行实际样本检测时，将样本的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出对应的样本浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中大肠杆菌O157:H7的实际浓度。
实施例2
一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法，该方法是针对大肠杆菌O157:H7抗原的检测，该方法中核酸适配体作为识别元件，金铂纳米团簇作为类过氧化物酶。
参见图1，具体检测操作步骤如下：
（1）包被卵清蛋白
在酶标板上以浓度0.01mol/L、pH值9.0的磷酸盐缓冲液作为包被液，稀释卵清蛋白至30mg/mL，于4℃中包被过夜，弃去包被液，利用洗涤液洗涤酶标板。适配体修饰的磁珠用量为100μg/孔，适配体修饰的金铂纳米团簇用量为10pmol/L。
（2）加入适配体修饰的磁珠和适配体修饰的金铂纳米团簇
适配体修饰的磁珠和适配体修饰的金铂纳米团簇与待测样品加入至步骤（1）的酶标板中混合，于37℃环境中反应60min，洗涤。
适配体修饰的磁珠和适配体修饰的金铂纳米团簇是通过以下方法制备的：
A）制备适配体修饰的磁珠
首先取5mg 羧基化磁珠采用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，在含有5mg EDC、3mgNHS的PBS中活化1h；经洗涤后加入1nmol氨基化适配体继续反应2h，加入4mg牛血清白蛋白封闭1h，洗涤后重悬至终浓度为1mg/mL，即得到所述的适配体修饰的磁珠。
氨基化大肠杆菌O157:H7核酸适配体的序列为5′NH2-TTT TTT CCG GAC GCT TATGCC TTG CCA TCT ACA GAG CAG GTG TGA CGG-3′；
B）制备适配体修饰的金铂纳米团簇
首先通过种子生长法制备金铂纳米团簇，向1mL 20nm种子金中加入15%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和100mg/mL抗坏血酸，充分混匀后加入80mmol/L氯铂酸置于65℃中反应30min，对产物进行离心洗涤分散在超纯水中，即得到金铂纳米团簇，见图2。取0.5nmol的链霉亲和素与1mL 1nmol/L金铂纳米团簇混合于pH值为6.0的PBS中，连续震荡3h，加入200μL2%的牛血清白蛋白封闭1h，反应结束，在6500rpm/min 10min条件下离心洗涤三次，加入1mL1μmol/L生物素化的适配体继续反应2h，在6500rpm/min 10min下离心洗涤三次，沉淀分散于0.01mol/L pH值为7.4的PBS（含有0.1%BSA、1%PVP）溶液中。
所述洗涤液是含有体积浓度为0.05%吐温-20的0.01mol/L PBS溶液，pH值为7.4。
生物素化大肠杆菌O157:H7核酸适配体的序列为5′Biotin-C6-TTT TTT CCG GACGCT TAT GCC TTG CCA TCT ACA GAG CAG GTG TGA CGG-3′。
（3）加入底物显色
加入200μL TMB混合液至上述酶标板孔中，于37℃环境中反应20min，得到反应产物。
（4）检测吸光度值
利用酶标仪检测所述反应产物的吸光度值，设定酶标仪的读取波长为650nm；
以波长650nm处的吸光度值为纵坐标y，以大肠杆菌O157:H7的浓度为横坐标x，绘制标准曲线，标准曲线为y = 0.0727ln(x)-0.387，R 2 = 0.9868；
进行实际样品检测时，将待测样品的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出对应的待测样品的浓度，乘以其对应的稀释倍数，即得到待测样品中大肠杆菌O157:H7的实际浓度。
本实施例2中，从标准曲线上读出对应的待测样品的浓度为4.3×103CFU/mL，乘以其对应的稀释倍数为50倍，即得到待测样品中大肠杆菌O157:H7的实际浓度为2.15×105CFU/mL。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）包被卵清蛋白
在酶标板上以磷酸盐缓冲液作为包被液，稀释卵清蛋白至30～50mg/mL，包被过夜，得到包被卵清蛋白的酶标板；
（2）加入适配体修饰的磁珠和金铂纳米团簇
将适配体修饰的磁珠、适配体修饰的金铂纳米团簇与待测样品在包被卵清蛋白的酶标板中混合，于30～37℃条件下、反应40～70min，洗涤；
所述适配体修饰的磁珠用量为50～150μg/孔，适配体修饰的金铂纳米团簇用量为10～20pmol/L；
所述适配体修饰的磁珠为氨基化适配体修饰的磁珠，所述氨基化适配体的核酸序列为5′NH2-TTT TTT CCG GAC GCT TAT GCC TTG CCA TCT ACA GAG CAG GTG TGA CGG-3′；
所述适配体修饰的金铂纳米团簇为生物素化的适配体修饰的金铂纳米团簇，所述生物素化的适配体的核酸序列为5′Biotin-C6-TTT TTT CCG GAC GCT TAT GCC TTG CCA TCTACA GAG CAG GTG TGA CGG-3′；
以核酸适配体作为识别元件，以金铂纳米团簇作为类过氧化物酶；
（3）加入底物显色
加入200μL TMB显色液，于30～37℃条件下，反应20～30min；得到反应产物；
所述TMB显色液含有双氧水和四甲基联苯胺；
（4）检测吸光度值
利用酶标仪检测所述反应产物的吸光度值，设定酶标仪的读取波长为650nm；
以波长650nm处的吸光度值为纵坐标y，以大肠杆菌O157:H7的浓度为横坐标x，绘制标准曲线，标准曲线为y = 0.0727ln(x)-0.387，R 2 = 0.9868；
进行实际样品检测时，将待测样品的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出对应的待测样品的浓度，乘以其对应的稀释倍数，即得到待测样品中大肠杆菌O157:H7的实际浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，在酶标板上以0.01～0.02mol/L、pH值9.0～9.6的磷酸盐缓冲液作为包被液，稀释卵清蛋白至30～50mg/mL，于4℃条件下、包被过夜，弃去包被液，利用洗涤液洗涤酶标板，得到包被卵清蛋白的酶标板。
3.根据权利要求1所述的一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，
（2.1）制备适配体修饰的磁珠
取5mg 羧基化磁珠在磷酸盐缓冲液下洗涤三次，加入4～8mg 碳二亚胺、2～5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化30～60min；洗涤；加入1～2nmol氨基化适配体继续反应1～2h，加入牛血清白蛋白封闭，洗涤，重悬至终浓度为1～3mg/mL，即得到所述的适配体修饰的磁珠；
（2.2）制备适配体修饰的金铂纳米团簇
首先通过种子生长法制备金铂纳米团簇，向1mL 15～20nm种子金中加入10%～20%的聚乙烯吡咯烷酮和80～150mg/mL抗坏血酸，充分混匀后加入70～120mmol/L氯铂酸置于60～70℃中反应30～50min，对产物进行离心洗涤分散在超纯水中，即得到金铂纳米团簇；
取0.5～1nmol的链霉亲和素与1mL金铂纳米团簇反应，连续震荡3h，加入10～20mg/mL牛血清白蛋白封闭1h，反应结束离心洗涤，加入1～2nmol生物素化的适配体继续反应2h，反应结束后离心洗涤，沉淀分散于PBS中，即得到大肠杆菌O157:H7适配体修饰的金铂纳米团簇。
4.根据权利要求1所述的一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述洗涤是利用磷酸盐缓冲液在外加磁场环境下进行冲洗。
5.根据权利要求1所述的一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，所述TMB显色液为单组分混合液。
6.根据权利要求3所述的一种基于核壳型金铂纳米团簇对大肠杆菌O157:H7的检测方法，其特征在于：步骤（3.1）中，所述洗涤为用含有体积浓度0.05%吐温-20的PBS溶液洗涤；所述PBS溶液的浓度为0.005～0.02mol/L，PBS溶液的pH值为7.0～7.5。
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