CN114152757B - 一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法 - Google Patents

一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法，属于磁吸附生物传感技术领域。本发明以AuNPs@ZnFe2O4@COF为磁性纳米复合材料，具有良好的吸附性，与β银环蛇毒的第一抗体结合，所得生物材料能够特异性识别并吸附捕获β银环蛇毒抗原，避免相似毒素成分的干扰，提高β银环蛇毒检测结果的灵敏性和准确度。本发明利用CuO2‑Apt酶材料特异性识别β银环蛇毒并催化CuO2的显色底物显色，随着β银环蛇毒的浓度增加，紫外分析检测到的吸光度增强，且在0.0001～100ng/mL的β银环蛇毒浓度范围内具有良好的线性关系，最低检测下限为0.1fg/mL。

Description

一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环 蛇毒的方法
技术领域
本发明涉及磁吸附生物传感技术领域，特别涉及一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法。
背景技术
银环蛇是陆地上第四大毒蛇，也是我国境内毒性最强的蛇，一条成年银环蛇的1毫克毒素可以致十几人死亡。银环蛇毒液中所含毒素，主要成分为蛋白质和多肽，以神经毒素为主，包括α-银环蛇毒素(α-BGT)、β-银环蛇毒素(β-BGT)、κ-银环蛇毒素(κ-BGT)、γ-银环蛇毒素(γ-BGT)和磷脂酶A等酶类等。被银环蛇咬时不会感到疼痛反而嗜睡，轻微中毒时身体局部产生麻痹现象，若是毒素作用于神经肌肉交接位置，则会阻绝神经传导路线，致使横纹肌无法正常收缩，导致呼吸麻痹，作用时间约40分钟至2小时，或长达24小时。在抗蛇毒血清应用以前，银环蛇咬伤死亡率极高。
目前传统的检测蛇毒的方法有ELISA法(酶联免疫吸附测定法)，此法将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。此方法可以直接使用抗体捕获β银环蛇毒抗原，并通过携带探针的抗体进行显色测定。然而，现有ELISA法检测β银环蛇毒时，易受相似毒素成分(如α-银环蛇毒，眼睛王蛇毒，金环蛇毒，蝮蛇毒)的干扰，影响测试结果的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法。本发明提供的β银环蛇毒检测用生物材料能够特异性吸附β银环蛇毒，提高β银环蛇毒检测结果的灵敏性和准确度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种β银环蛇毒检测用生物材料，包括β银环蛇毒的第一抗体和与所述β银环蛇毒的第一抗体结合的AuNPs@ZnFe2O4@COF材料，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料包括ZnFe2O4@COF和负载于所述ZnFe2O4@COF表面的金纳米粒子，所述ZnFe2O4@COF包括COF基体和负载于所述COF基体表面和内部的ZnFe2O4。
优选的，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料中，金纳米粒子与ZnFe2O4@COF的质量比为(2.5～4.5):(7～9)；
所述ZnFe2O4@COF中，ZnFe2O4与COF基体的质量比为12～20:1。
优选的，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料的制备方法，包括以下步骤：
将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛、ZnFe2O4与有机酸催化剂混合，进行反应，得到ZnFe2O4@COF；
将所述ZnFe2O4@COF与金纳米颗粒混合，得到AuNPs@ZnFe2O4@COF材料。
本发明提供了上述β银环蛇毒检测用生物材料的制备方法，包括以下步骤：
将β银环蛇毒的第一抗体与AuNPs@ZnFe2O4@COF材料混合，得到β银环蛇毒检测用生物材料。
本发明提供了一种β银环蛇毒检测用试剂盒，包括上述β银环蛇毒检测用生物材料、负载β银环蛇毒适配体的CuO2、CuO2的显色底物。
优选的，所述CuO2的显色底物为2,4-二氯苯酚(2,4-DP)和4-氨基安替比林(4-AP)。
优选的，还包括缓冲溶液和洗涤液。
本发明提供了一种非诊断目的的基于磁性共价有机框架材料的β银环蛇毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)将上述β银环蛇毒检测用生物材料、待测样品进行第一孵育，去除未结合物，得到第一孵育产物；
(2)向所述第一孵育产物中加入负载β银环蛇毒适配体的CuO2，进行第二孵育，去除未结合物，得到第二孵育产物；
(3)向所述第二孵育产物中加入CuO2的显色底物，进行第三孵育，测试所得第三孵育液在400～700nm处的吸光度值；
(4)根据预定的标准曲线和待测样品的吸光度值获得待测样品中β银环蛇毒的浓度；所述标准曲线为β银环蛇毒浓度的对数与吸光度值的线性关系曲线。
优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中去除未结合物的方式独立为：
对孵育后所得孵育液进行磁力吸附分离，得到上清液和下层浊液；
对下层浊液进行洗涤。
优选的，所述β银环蛇毒的检测下限为0.1fg/mL，检测范围为0.0001～100ng/mL。
本发明提供了一种β银环蛇毒检测用生物材料，包括β银环蛇毒的第一抗体和与所述β银环蛇毒的第一抗体结合的AuNPs@ZnFe2O4@COF材料，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料包括ZnFe2O4@COF和负载于所述ZnFe2O4@COF表面的金纳米粒子，所述ZnFe2O4@COF包括COF基体和负载于所述COF基体表面和内部的ZnFe2O4。在本发明中，AuNPs@ZnFe2O4@COF为磁性纳米复合材料，具有良好的吸附性，与β银环蛇毒的第一抗体通过氨基化学结合得到Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF生物材料，结合后的生物材料能够特异性识别并吸附捕获β银环蛇毒抗原，避免相似毒素成分的干扰，提高β银环蛇毒检测结果的灵敏性和准确度。
本发明提供了一种β银环蛇毒检测用试剂盒，包括β银环蛇毒检测用生物材料、负载β银环蛇毒适配体的CuO2(CuO2-Apt)、CuO2的显色底物。在本发明中，β银环蛇毒检测用生物材料、待测β银环蛇毒和CuO2-Apt能够构成抗体-抗原-抗体三明治夹心式生物传感器，其中CuO2-Apt作为探针材料，可以特异性识别β银环蛇毒，且具有良好的酶活性，能够催化显色底物显色，实现对β银环蛇毒的检测。
本发明提供了一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法，本发明利用β银环蛇毒检测用生物材料Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF对待测样品中的β银环蛇毒进行特异性识别和吸附，利用CuO2-Apt酶材料特异性识别β银环蛇毒并催化CuO2的显色底物显色，随着β银环蛇毒的浓度增加，紫外分析检测到的吸光度增强，且在0.0001～100ng/mL的β银环蛇毒浓度范围内具有良好的线性关系，最低检测下限为0.1fg/mL。本发明提供的检测方法抗干扰能力强，将β银环蛇毒替换为其他物质，例如其他蛇毒，生物蛋白分子，均不能检测到相应的光信号；本发明采用酶促比色信号读数，具有更高灵敏度。同时，本发明提供的检测方法具有检测范围宽、检测速度快、操作简单的优点，可用于实际样品的快速检测。
附图说明
图1为实施例1所得ZnFe2O4的透射电镜图；
图2为实施例1所得ZnFe2O4@COF的透射电镜图；
图3为实施例1所得AuNPs@ZnFe2O4@COF的透射电镜图；
图4为实施例1所得CuO2-Apt的透射电镜图；
图5为不同浓度的β银环蛇毒下的吸光度值；
图6为β银环蛇毒浓度的对数与吸光度值的线性关系曲线；
图7为实施例1的最佳条件筛选结果；
图8为Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF材料的稳定性测试结果；
图9为实施例1检测方法的干扰物质测试结果；
图10为实施例1检测方法的平行性实验测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种β银环蛇毒检测用生物材料，包括β银环蛇毒的第一抗体和与所述β银环蛇毒的第一抗体结合的AuNPs@ZnFe2O4@COF材料，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料包括ZnFe2O4@COF和负载于所述ZnFe2O4@COF表面的金纳米粒子，所述ZnFe2O4@COF包括COF基体和负载于所述COF基体表面和内部的ZnFe2O4。
在本发明中，所述β银环蛇毒的第一抗体具有氨基-NH2，能与AuNPs@ZnFe2O4@COF材料中的金纳米粒子发生配位反应，通过配位的方式与AuNPs@ZnFe2O4@COF材料化学结合。本发明对所述β银环蛇毒的第一抗体没有特殊的要求，使用本领域熟知的β银环蛇毒的第一抗体即可。
在本发明中，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料中，金纳米粒子的粒径为10～15nm，更优选为12～14nm；所述ZnFe2O4的粒径优选为130～180nm，更优选为140～160nm。在本发明中，所述金纳米粒子与ZnFe2O4@COF的质量比优选为(2.5～4.5):(7～9)，更优选为(3～4):8；所述ZnFe2O4@COF中，ZnFe2O4与COF基体的质量比优选为12～20:1，更优选为14～18:1。
在本发明中，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料的制备方法，优选包括以下步骤：
将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛、ZnFe2O4与有机酸催化剂混合，进行反应，得到ZnFe2O4@COF；
将所述ZnFe2O4@COF与金纳米颗粒混合，得到AuNPs@ZnFe2O4@COF材料。
本发明将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛、ZnFe2O4与有机酸催化剂混合，进行反应，得到ZnFe2O4@COF。在本发明中，所述有机酸催化剂优选为乙酸。在本发明中，所述反应优选在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选为二甲基亚砜。
在本发明中，所述混合的方式优选为：先将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛、ZnFe2O4超声混合，再加入有机酸催化剂。在本发明中，所述1,3,5-三(4-氨基苯基)苯的质量比优选为1:0.566。
在本发明中，所述反应的温度优选为室温，时间优选为15～30min，更优选为20～25min。
本发明对所述ZnFe2O4的来源没有特殊的要求，使用本领域常规市售的ZnFe2O4或自行制备均可。作为本发明的一个具体实施例，所述ZnFe2O4的制备方法为：
将氯化铁、氯化锌、乙二醇、醋酸钠和聚乙二醇混合，进行溶剂热反应，得到ZnFe2O4。
在本发明中，所述氯化铁、氯化锌、乙二醇、醋酸钠和聚乙二醇的质量比为1.35:0.34:40:3.6:1。在本发明中，所述溶剂热反应的温度为200℃，时间为8h。
得到ZnFe2O4@COF后，本发明将所述ZnFe2O4@COF与金纳米颗粒混合，得到AuNPs@ZnFe2O4@COF材料。在本发明中，所述混合优选在DW缓冲液中进行。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，所述混合的时间优选为8～12h。得到所述AuNPs@ZnFe2O4@COF后，本发明优选将AuNPs@ZnFe2O4@COF分散于DW缓冲液中保存，所得AuNPs@ZnFe2O4@COF分散液的浓度优选为1mg/mL。
本发明对所述金纳米颗粒的来源没有特殊的要求，使用本领域常规市售的金纳米颗粒或自行制备均可。作为本发明的一个具体实施例，当自行制备金纳米颗粒时，所述制备方法优选包括以下步骤：
将HAuCl4、还原剂和水混合，进行还原反应，得到金纳米颗粒。
在本发明中，所述还原剂优选为柠檬酸钠；所述还原反应的温度优选为110℃，时间优选为30min。
本发明提供了上述β银环蛇毒检测用生物材料的制备方法，包括以下步骤：
将β银环蛇毒的第一抗体与AuNPs@ZnFe2O4@COF材料混合，得到β银环蛇毒检测用生物材料。
在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，所述搅拌混合的温度优选为室温，时间优选为8～12h。在本发明中，所述β银环蛇毒的第一抗体(Ab1)与AuNPs@ZnFe2O4@COF材料的质量比优选为1:1000～10000。
在本发明中，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料优选以DW分散液的形式提供，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料DW分散液的浓度优选为1mg/mL；所述β银环蛇毒的第一抗体优选以溶液形式提供，所述β银环蛇毒的第一抗体溶液的浓度优选为1μg/mL。
本发明提供了一种β银环蛇毒检测用试剂盒，包括上述β银环蛇毒检测用生物材料或上述制备方法制备得到的β银环蛇毒检测用生物材料、负载β银环蛇毒适配体的CuO2、CuO2的显色底物。
在本发明中，所述CuO2的显色底物为2,4-二氯苯酚(2,4-DP)和4-氨基安替比林(4-AP)。在本发明中，所述2,4-DP和4-AP的质量比优选为1:1。
在本发明中，所述负载β银环蛇毒适配体的CuO2(CuO2-Apt)的制备方法，优选包括以下步骤：
将CuO2水分散液与β银环蛇适配体混合，得到负载β银环蛇毒适配体的CuO2。
在本发明中，所述CuO2水分散液的浓度优选为1mg/mL。在本发明中，所述β银环蛇适配体优选为3’端修饰了-SH(巯基)的β银环蛇适配体。在本发明中，所述β银环蛇适配体的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为5’至3’，gttttccccttgtcgcttttggttcgttctgcctctatct，在3’端修饰了-SH(巯基)。
在本发明中，所述CuO2与β银环蛇适配体的质量比优选为1:1000～10000，更优选为1:10000。
在本发明中，所述混合的时间优选为8～12h。
在本发明中，所述混合后，本发明优选洗去未负载的β银环蛇毒适配体；在本发明中，所述洗去未负载的β银环蛇毒适配体的洗涤剂优选为PBST缓冲液，洗涤的次数优选为5次。
在本发明中，所述β银环蛇毒检测用试剂盒还包括缓冲溶液和洗涤液。在本发明中，所述缓冲溶液优选为PBS缓冲溶液和MES缓冲液，所述PBS缓冲溶液的pH值优选为7.4，所述MES缓冲液的pH值优选为6.8。
在本发明中，所述洗涤液优选为PBST洗涤液。
本发明提供了一种非诊断目的的基于磁性共价有机框架材料的β银环蛇毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)将上述β银环蛇毒检测用生物材料、待测样品进行第一孵育，去除未结合物，得到第一孵育产物；
(2)向所述第一孵育产物中加入负载β银环蛇毒适配体的CuO2，进行第二孵育，去除未结合物，得到第二孵育产物；
(3)向所述第二孵育产物中加入CuO2的显色底物，进行第三孵育，测试所得第三孵育液在400～700nm处的吸光度值；
(4)根据预定的标准曲线和待测样品的吸光度值获得待测样品中β银环蛇毒的浓度；所述标准曲线为β银环蛇毒浓度的对数与吸光度值的线性关系曲线。
本发明将上述β银环蛇毒检测用生物材料、待测样品进行第一孵育，去除未结合物，得到第一孵育产物。在本发明中，所述待测样品优选为血清样品。
在本发明中，所述第一孵育优选在离心管中进行。在本发明中，所述第一孵育优选在pH为7.4的PBS缓冲溶液中进行。在本发明中，所述第一孵育的温度优选为4℃，时间优选为1～2h，更优选为1.5h。
在本发明中，所述去除未结合物的方法优选为：
对孵育后所得孵育液进行磁力吸附分离，得到上清液和下层浊液；
对下层浊液进行洗涤。
本发明优选将装有所述孵育液的离心管置于磁力吸附架上进行磁力吸附。本发明通过磁力吸附将Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF和β银环蛇毒结合物固定在离心管一端，形成下层浊液，而未结合的物质处于上清液中。
本发明优选使用PBST缓冲液洗涤。本发明优选重复所述磁力吸附分离-洗涤过程，所述重复的次数优选为5次。去除所述未结合物后，本发明优选将所述第一孵育产物置于pH为7.4的PBS缓冲溶液中。
得到所述第一孵育产物后，本发明向所述第一孵育产物中加入负载β银环蛇毒适配体的CuO2，进行第二孵育，去除未结合物，得到第二孵育产物。在本发明中，所述第二孵育的温度优选为4℃，时间优选为1～2h，更优选为1.5h。
在本发明中，所述去除未结合物的方式与步骤(1)中去除未结合物的方式相同，在此不再赘述。
得到所述第二孵育产物后，本发明向所述第二孵育产物中加入CuO2的显色底物，进行第三孵育，测试所得第三孵育液在400～700nm处的吸光度值。在本发明中，所述CuO2的显色底物为2,4-二氯苯酚(2,4-DP)和4-氨基安替比林(4-AP)。
在本发明中，所述2,4-DP和4-AP的质量比优选为1:1。本发明还优选加入pH值为6.8的MES缓冲溶液。
在本发明中，所述第三孵育的温度优选为37℃，时间优选为40～60min，更优选为40min。
本发明优选使用紫外分光光度计测试所得第三孵育液在400～700nm处的吸光度值。
得到所述吸光度值后，本发明根据预定的标准曲线和待测样品的吸光度值获得待测样品中β银环蛇毒的浓度；所述标准曲线为β银环蛇毒浓度的对数与吸光度值的线性关系曲线。
作为本发明的一个具体实施例，所述标准曲线的绘制方法优选包括：
提供梯度浓度的β银环蛇毒的标准品溶液，所述梯度浓度包括0、10-4、10-3.5、10-3、10-2.5、10-2、10-1.5、10-1、10-0.5、1、100.5、10、101.5、102ng/mL。
以梯度浓度的β银环蛇毒的标准品溶液作为待测样品，按照本发明的检测方法进行测试，获得梯度浓度的β银环蛇毒的标准品溶液对应的吸光度值，以β银环蛇毒的对数为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘图，得到β银环蛇毒浓度的对数与吸光度值的线性关系曲线，具体数据见表1。
表1标准曲线相关数据
Figure BDA0003424700070000091
在本发明中，所述β银环蛇毒的检测下限为0.1fg/mL，检测范围为0.0001～100ng/mL。
下面结合实施例对本发明提供的一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)制备Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF
①ZnFe2O4的合成
用乙二醇(40mL)溶解六水合氯化铁(1.35g)和无水氯化锌(0.34g)，形成透明溶液，随后加醋酸钠(3.6g)和聚乙二醇20000(1.0g)。混合液剧烈搅拌0.5h后，转移到不锈钢高压釜(容量50mL)中，在200℃条件下反应8h，反应终止后自然冷却至室温。将产物用乙醇和水清洗数次，黑色产物在60℃真空环境下干燥6h，得到ZnFe2O4备用。所得ZnFe2O4的透射电镜图如图1所示。
②ZnFe2O4@COF的合成
随后进一步合成ZnFe2O4@COF，取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB，0.106g)，对苯二甲醛(TPA，0.06g)和ZnFe2O4(0.15g)，用50mL二甲基亚砜溶解。超声分散5min，超声下加入1.5ml无水乙酸，室温反应15min。磁铁收集ZnFe2O4@COF，分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次，60℃真空干燥，得到ZnFe2O4@COF备用。所得ZnFe2O4@COF的透射电镜图如图2所示。
③AuNPs@ZnFe2O4@COF的合成
合成AuNPs：取HAuCl4(8.529mg)溶解于100mL去离子水中，加热到110℃持续5min。取柠檬酸钠(36.24mg)溶解于10mL去离子水中，加入上述水HAuCl4水溶液中，搅拌加热30min，等待反应完全颜色变为酒红色后，室温搅拌15min，得到AuNPs备用。所得AuNPs@ZnFe2O4@COF的透射电镜图如图3所示。
取ZnFe2O4@COF(8mg)分散于8mLDW中，然后加入AuNPs(40mL)搅拌过夜，用DW洗涤三次，随后用DW定容到8mL得到AuNPs@ZnFe2O4@COF的悬浊液备用。
④Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF的合成
合成Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF，取AuNPs@ZnFe2O4@COF悬浊液1mL与100μL浓度为1μg/mL的Ab1混合搅拌过夜，得到Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF备用。
(二)CuO2-Apt的合成
将5g PVP粉末和0.1g CuCl2·2H2O粉末加入到50mL去离子水中，超声10分钟，待粉末完全溶解在去离子水中。在上述溶液中加入50mL浓度为0.02mol/L的NaOH溶液，搅拌均匀，加入1mL浓度为30％的H2O2，室温搅拌30分钟，直至溶液变为棕色，离心除去上层清液，加入DW洗涤，重复三次。将沉淀60℃真空干燥12小时，得到CuO2备用。
CuO2粉末分散在去离子水中，超声作用2h，得到均匀分散的CuO2水溶液。然后，取1mL浓度为1mg/mL的CuO2水溶液加入溶度为1mmol的β银环蛇适配体(β-Apt)100μL。将上述溶液混匀过夜，用PBST洗涤5次除去未负载的β-Apt，最后用无菌水定容到1mL，得到CuO2-Apt纳米复合材料备用。所得CuO2-Apt的透射电镜图如图4所示。
(三)一种基于磁性共价有机框架材料的β银环蛇毒检测方法，包括以下步骤：
(1)取干净的2mL离心管，依次在离心管中加入Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF复合物100μL、50μLβ银环蛇毒抗原、pH为7.4的PBS缓冲溶液100μL，摇床上孵育1小时。
(2)将孵育完全装有上述溶液的离心管转移到磁力吸附架上，通过磁力吸附将Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF复合物固定在离心管一端，吸取清液，再加入PBST洗涤，重复上述步骤5次，最后加入100μL pH为7.4的PBS缓冲溶液；
(3)在上述溶液中加入100μL的CuO2-Apt纳米复合材料，摇床上孵育1小时；
(4)将孵育完全装有上述溶液的离心管转移到磁力吸附架上，通过磁力吸附将复合物固定在离心管一端，吸出清液，再加入PBST洗涤，重复上述步骤5次，最后加入300μL pH值为6.8的MES缓冲溶液，50μL浓度为1mg/mL的4-AP溶液和50μL浓度为1mg/mL的2,4-DP溶液；
(5)将上述溶液置于37℃烘箱孵育40分钟。
将所构建的免疫传感器使用酶标仪在400～700nm条件下对不同浓度的β银环蛇毒进行检测，随着β银环蛇毒浓度的增加，吸光度值逐渐增加，如图5所示。绘制β银环蛇毒浓度的对数与吸光度值的线性关系曲线，所得结果如图6，所示，吸光度与β银环蛇毒浓度的对数具有良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9967，LOD为0.1fg·mL-1(S/N＝3)，检测范围为0.0001～100ng/mL，显示出了良好的线性和较低的LOD值。
测试例
(一)对实施例1进行最佳条件筛选，包括pH最佳筛选、最适浓度筛选、最适反应时间筛选、最适温度筛选。所得结果见图7。
其中，pH最佳筛选是改变上述步骤(4)中的MES溶液的pH值来进行测定，pH选择3、4、5、6、6.8、8、9数值进行筛选，其他条件不变，所得结果见图7中(A)，由图7中(A)可以看出，pH值为6.8时具有最高的吸光度值。
最适浓度筛选是改变步骤(3)中加入的CuO2-Apt的体积来进行测定，控制CuO2-Apt浓度为5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25和30ng/mL进行筛选，其他条件不变，所得结果见图7中(B)，由图7中(B)可以看出，浓度为15ng/mL时具有最高的吸光度值。
最适反应时间是改变上述步骤(5)的孵育时间来进行测定，时间选择15、30、45、60、90、120min进行筛选，其他条件不变，所得结果见图7中(C)，可以看出，孵育时间为60min是具有最高的吸光度值。
最适温度是改变上述步骤(5)中的孵育温度，温度选择30、40、50、60、65、70、80℃进行筛选，其他条件不变，所得结果见图7中(D)，可以看出，孵育温度为65℃时具有最高的吸光度值。
(二)测试Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF材料的稳定性
将实施例1制备得到的Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF材料用冷冻干燥仪干燥后于4℃冰箱保存。在对应的时间取干燥的材料加入DW重新分散，后进行相应的测试，所得结果如图8所示。由图8可以看出，本发明所制备的Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF在60天内保持良好的稳定性。
(三)干扰物质测试
将实施例1检测不同的物质，如图9所示，由图9可以看出，本发明提供的方法β银环蛇毒有良好的特异性，并且不受其他物质干扰。
(四)平行性实验
按照实施例1(三)中β银环蛇毒检测方法，重复实验5次，重复次数与吸光度值的关系见图10。由图10可以看出，本发明提供的检测方法具有良好的稳定性，能够达到对β银环蛇毒的灵敏检测。
实施例2
(一)制备Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF
①ZnFe2O4的合成
按照实施例1的方法合成ZnFe2O4。
②ZnFe2O4@COF的合成
随后进一步合成ZnFe2O4@COF，取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB，0.106g)，对苯二甲醛(TPA，0.06g)和ZnFe2O4(0.3g)，用50mL二甲基亚砜溶解。超声分散5min，超声下加入1.5ml无水乙酸，室温反应15min。磁铁收集ZnFe2O4@COF，分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次，60℃真空干燥，得到ZnFe2O4@COF备用。
③AuNPs@ZnFe2O4@COF的合成
合成AuNPs：取HAuCl4(8.529mg)溶解于100mL去离子水中，加热到110℃持续5min。取柠檬酸钠(36.24mg)溶解于10mL去离子水中，加入上述水HAuCl4水溶液中，搅拌加热30min，等待反应完全颜色变为酒红色后，室温搅拌15min，得到AuNPs备用。所得AuNPs@ZnFe2O4@COF的透射电镜图如图3所示。
取ZnFe2O4@COF(8mg)分散于8mLDW中，然后加入AuNPs(40mL)搅拌过夜，用DW洗涤三次，随后用DW定容到8mL得到AuNPs@ZnFe2O4@COF的悬浊液备用。
④Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF的合成
合成Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF，取AuNPs@ZnFe2O4@COF悬浊液1mL与100μL浓度为1μg/mL的Ab1混合搅拌过夜，得到Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF备用。
(二)CuO2-Apt的合成
将5g PVP粉末和0.1g CuCl2·2H2O粉末加入到50mL去离子水中，超声10分钟，待粉末完全溶解在去离子水中。在上述溶液中加入50mL浓度为0.02mol/L的NaOH溶液，搅拌均匀，加入1mL浓度为30％的H2O2，室温搅拌30分钟，直至溶液变为棕色，离心除去上层清液，加入DW洗涤，重复三次。将沉淀60℃真空干燥12小时，得到CuO2备用。
CuO2粉末分散在去离子水中，超声作用2h，得到均匀分散的CuO2水溶液。然后，取1mL浓度为1mg/mL的CuO2水溶液加入溶度为1mmol的β银环蛇适配体(β-Apt)100μL。将上述溶液混匀过夜，用PBST洗涤5次除去未负载的β-Apt，最后用无菌水定容到1mL，得到CuO2-Apt纳米复合材料备用。
(四)一种基于磁性共价有机框架材料的β银环蛇毒检测方法，包括以下步骤：
(1)取干净的2mL离心管，依次在离心管中加入Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF复合物100μL、50μLβ银环蛇毒抗原、pH为7.4的PBS缓冲溶液100μL，摇床上孵育1小时。
(2)将孵育完全装有上述溶液的离心管转移到磁力吸附架上，通过磁力吸附将Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF复合物固定在离心管一端，吸取清液，再加入PBST洗涤，重复上述步骤5次，最后加入100μL pH为7.4的PBS缓冲溶液；
(3)在上述溶液中加入100μL的CuO2-Apt纳米复合材料，摇床上孵育1小时；
(4)将孵育完全装有上述溶液的离心管转移到磁力吸附架上，通过磁力吸附将复合物固定在离心管一端，吸出清液，再加入PBST洗涤，重复上述步骤5次，最后加入300μLpH值为6.8的MES缓冲溶液，50μL浓度为1mg/mL的4-AP溶液和50μL浓度为1mg/mL的2,4-DP溶液；
(5)将上述溶液置于37℃烘箱孵育40分钟。
(6)用紫外分光光度计测定其在400～700nm区域的紫外吸收情况。
利用工作曲线法，检测不同浓度的β银环蛇毒，结果表明检测范围为0.0001～100ng/mL，最低检测下限为0.1fg/mL。
实施例3
(1)取干净的2mL离心管，依次在离心管中加入Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF复合物100μL、50μL(浓度为10-2，10-1，100，101，102ng/mL)β银环蛇毒抗原、50μL血清、pH为7.4的PBS缓冲溶液100μL，摇床上孵育1小时。
(2)将孵育完全装有上述溶液的离心管转移到磁力吸附架上，通过磁力吸附将Ab1-AuNPs@ZnFe2O4@COF复合物固定在离心管一端，吸取清液，再加入PBST洗涤，重复上述步骤5次，最后加入100μL pH为7.4的PBS缓冲溶液；
(3)在上述溶液中加入100μL的CuO2-Apt纳米复合材料，摇床上孵育1小时；
(4)将孵育完全装有上述溶液的离心管转移到磁力吸附架上，通过磁力吸附将复合物固定在离心管一端，吸出清液，再加入PBST洗涤，重复上述步骤5次，最后加入300μL pH值为6.8的MES缓冲溶液，50μL浓度为1mg/mL的4-AP溶液和50μL浓度为1mg/mL的2,4-DP溶液；
(5)将上述溶液置于37℃烘箱孵育40分钟。
(6)用紫外分光光度计测定其在400～700nm区域的紫外吸收情况。
加标回收实验数据如表2：
表2加标回收实验数据
Figure BDA0003424700070000151
由表2可以看出，本发明提供的基于磁性共价有机框架材料的β银环蛇毒检测方法具有良好的准确性，具有良好的实际应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南大学
<120> 一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttttcccct tgtcgctttt ggttcgttct gcctctatct 40

Claims (9)

1.一种β银环蛇毒检测用试剂盒，包括β银环蛇毒检测用生物材料，负载β银环蛇毒适配体的CuO2，以及CuO2的显色底物；
所述β银环蛇毒检测用生物材料，包括β银环蛇毒的第一抗体和与所述β银环蛇毒的第一抗体结合的AuNPs@ZnFe2O4@COF材料，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料包括ZnFe2O4@COF和负载于所述ZnFe2O4@COF表面的金纳米粒子，所述ZnFe2O4@COF包括COF基体和负载于所述COF基体表面和内部的ZnFe2O4。
2.根据权利要求1所述的β银环蛇毒检测用试剂盒，其特征在于，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料中，金纳米粒子与ZnFe2O4@COF的质量比为（2.5~4.5）:（7~9）；
所述ZnFe2O4@COF中，ZnFe2O4与COF基体的质量比为12~20:1。
3.根据权利要求1所述的β银环蛇毒检测用试剂盒，其特征在于，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料的制备方法，包括以下步骤：
将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、对苯二甲醛、ZnFe2O4与有机酸催化剂混合，进行反应，得到ZnFe2O4@COF；
将所述ZnFe2O4@COF与金纳米颗粒混合负载，得到AuNPs@ZnFe2O4@COF材料。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的β银环蛇毒检测用试剂盒，其特征在于，所述β银环蛇毒检测用生物材料的制备方法，包括以下步骤：
将β银环蛇毒的第一抗体与AuNPs@ZnFe2O4@COF材料混合，得到β银环蛇毒检测用生物材料。
5.根据权利要求1所述的β银环蛇毒检测用试剂盒，其特征在于，所述CuO2的显色底物为2,4-二氯苯酚和4-氨基安替比林。
6.根据权利要求1或5所述的β银环蛇毒检测用试剂盒，其特征在于，还包括缓冲溶液和洗涤液。
7.一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法，包括以下步骤：
（1）将β银环蛇毒检测用生物材料、待测样品进行第一孵育，去除未结合物，得到第一孵育产物；
所述β银环蛇毒检测用生物材料，包括β银环蛇毒的第一抗体和与所述β银环蛇毒的第一抗体结合的AuNPs@ZnFe2O4@COF材料，所述AuNPs@ZnFe2O4@COF材料包括ZnFe2O4@COF和负载于所述ZnFe2O4@COF表面的金纳米粒子，所述ZnFe2O4@COF包括COF基体和负载于所述COF基体表面和内部的ZnFe2O4；
（2）向所述第一孵育产物中加入负载β银环蛇毒适配体的CuO2，进行第二孵育，去除未结合物，得到第二孵育产物；
（3）向所述第二孵育产物中加入CuO2的显色底物，进行第三孵育，测试所得第三孵育液在400~700nm处的吸光度值；
（4）根据预定的标准曲线和所述步骤（3）得到的吸光度值，获得待测样品中β银环蛇毒的浓度；所述标准曲线为β银环蛇毒浓度的对数与吸光度值的线性关系曲线。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中去除未结合物的方式独立为：
对孵育后所得孵育液进行磁力吸附分离，得到上清液和下层浊液；
对下层浊液进行洗涤。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述β银环蛇毒的检测下限为0.1fg/mL，检测范围为0.0001~100ng/mL。
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