CN116359200A - 一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法及肌氨酸检测方法 - Google Patents
一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法及肌氨酸检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法，包括：将硅藻培养到所需的细胞密度后将金和铜经过硅藻的生长代谢插入到硅藻壳中得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu‑DF，使得硅藻壳新陈代谢过程中产生的氧化还原产物将含有金和铜的金属溶液还原成为金和铜沉积至硅藻壳表面形成纳米颗粒；将可以靶向硅藻壳成分的硅亲和标记标签T8标签和R5标签与肌氨酸氧化酶进行融合得到重组后的T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶；将T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶固定在包含金和铜纳米颗粒的硅藻壳上进行组装形成双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器。通过改变固定化酶的类型来简单扩展，为量化复杂生物样本中的特定生物标志物设定指导方针。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法及肌氨酸检测方法。
背景技术
表面增强拉曼(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)是一种强大的光谱技术，具有高灵敏度和选择性的优势，可以检测感兴趣的物质。据报道，一些纳米复合材料充当SERS基材，用于原位监测催化反应过程。然而，很少有报道涉及纳米材料同时充当SERS基材和催化剂。
SERS基材的特点是分布具有严格排列和精度的纳米图案，这意味着只能依赖非常昂贵的自上而下的纳米制造技术。而硅藻，一种身披硅质细胞壁外壳的单细胞藻类，给SERS基材提供了独特的机会。硅藻壳具有独特的理化特性，孔隙率高，壳面分布着微米级至纳米级的孔径，比表面积大，良好的机械硬度及特殊的光谱吸收。能够通过自我复制而产生大量具有相同复杂微结构和纳米结构的二氧化硅硅藻壳。硅藻壳的高再现率保证了大量非常复杂的微结构和纳米结构的可用性，可以安全、低廉的生产方式获得SERS基材。
适当的金属化修饰，能够提供纳米材料类似过氧化物酶的催化性能同时提高SERS性能。硅藻壳不仅可以为纳米颗粒的沉积提供支撑，而且作为纳米颗粒沉积的基底，能显著提高金属纳米颗粒的催化活性，同时硅藻壳的多孔晶体结构也增强了纳米酶的酶活性。AuNPs(Au nanoparticles)和Ag NPs(Ag nanoparticles)分别沉积至硅藻壳的应用，已证实其增强表面拉曼光谱的能力。然而金属化修饰过程通常需要通过化学方法合成对应金属纳米颗粒，再通过有机试剂将金属纳米颗粒与硅藻壳进行连接。现有的制备过程繁琐且具有相对较长的反应时间，使用的试剂对人有害。需要寻找更为绿色、酶活更高的形式，将金属纳米颗粒与纳米材料进行结合。以此，获得能够应用至临床癌症筛查的技术中去。
前列腺癌临床筛查主要依靠前列腺特异抗原(PSA)的定量检测、穿刺活检术及直肠指检。虽然前列腺特异性抗原(PSA)的检测被广泛应用，但它的存在仅能提示前列腺疾病的存在(前列腺炎症、良性增生等因素都会造成PSA水平的异常)，而不具有前列腺癌特异性。对于穿刺活检和直肠指检，这两种筛查方法操作繁琐，具有侵入性，患者就医体验较差。
开发体外诊断技术(in vitro diagnostics,IVDs)以指导早期诊断和更有效的临床干预，可以很好的弥补当前侵入性诊断技术的不足。由于各种原因，癌症的IVDs发展缓慢。部分原因是缺乏已知的强大的生物标志物，可以作为诊断的目标。在快速筛查前列腺癌的相关专利中，多使用核酸标志物进行研究，未检索到以肌氨酸为筛查标志物进行设计的专利。
此外肌氨酸已被证明是早期PCa的临床标志物，其在尿液中的水平允许简单和非侵入性的早期诊断。一般来说，在正常生理条件下，肌氨酸在人类尿液中以1-3×10-6mol·L-1的浓度产生，而在PCa的病理过程中，肌氨酸只会增加不到一个数量级。此外，探针通常容易受到临床样本中可能共存生物分子的大量干扰。因此，很难准确区分肌氨酸的微小浓度变化，导致错误阳性/阴性诊断的风险。这些问题使临床样本中对肌氨酸的敏感和特异性检测具有挑战性，但意义重大。
发明内容
本发明实施例提供一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法，包括：
步骤一、将硅藻培养到所需的细胞密度后将金和铜经过硅藻的生长代谢插入到硅藻壳中得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu-DF，使得硅藻壳新陈代谢过程中产生的氧化还原产物将含有金和铜的金属溶液还原成为金和铜沉积至硅藻壳表面形成纳米颗粒；
步骤二、将可以靶向硅藻壳成分的硅亲和标记标签T8标签和R5标签与肌氨酸氧化酶进行融合得到重组后的T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶；
步骤三、将T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶固定在包含金和铜纳米颗粒的硅藻壳上进行组装形成双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器。
进一步地，步骤一包括：
在培养基中加入预设浓度的Si得到f/2+Si培养基，将硅藻细胞在f/2+Si培养基中生长，当可用的硅被消耗掉时达到所需细胞密度的硅藻；
将氯金酸和偏硅酸钠共同输送到培养基中，在25摄氏度，光暗周期12小时的条件培养3天，以不同地时间间隔向培养基中加入氯金酸，直至氯金酸的最终浓度为5μmol/L，且培养基颜色完全变成紫红色后将硅藻转移到新鲜的f/2培养基中；
向培养基中加入CuSO4，直至浓度为5μmol/L且当培养基颜色完全变为暗黑色时培养结束；
离心培养液，收集含金和铜纳米颗粒的硅藻细胞，用EDTA/SDS和H2O2/HCl处理细胞，去除有机成分，分离得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu-DF。
进一步地，步骤二包括：
将肌氨酸氧化酶单体的C端和N端序列插入二氧化硅亲和肽以及组蛋白标签histag，其中，his tag用于蛋白质纯化；
将硅亲和标记T8标签和R5标签融合到肌氨酸氧化酶得到T8重组肌氨酸氧化酶和R5T8重组肌氨酸氧化酶，其中，R5 tag来组硅藻Claviceps fusiformis的全长R5肽，T8 tag来自硅藻Thalassiosira pseudonana的SiI3 T8，R5 tag和T8 tag能够靶向硅藻壳silaffin-3成分。
进一步地，步骤三包括：
使用缓冲盐溶液配置硅藻壳溶液，超声；
向硅藻壳溶液中加入T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶使浓度介于0.05-0.5mg/mL之间，涡旋振荡混合，置于室温沉淀，离心，得到双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器。
一种肌氨酸的检测方法，包括：
将待检测的肌氨酸、TMB和MES缓冲液加入到权利要求1-4任一项所述的构建方法制备得到的双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器悬浮液中反应至少15min，离心，使用UV-vis检测上清液在652nm处的吸光度；
在96孔板中加入双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器和TMB的混合物，吹打混匀后加入不同浓度的肌氨酸，孵育至少10min后，滴在清洗干净的干燥的载玻片上，室温干燥；
通过拉曼光谱仪测定反应后双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的拉曼信号。
本发明提供一种同时充当SERS基材和催化剂的纳米材料。利用蛋白质工程提供肌氨酸酶靶向固定至硅藻壳的能力，本发明开发了一种基于生物沉积双金属纳米硅藻壳的简单、无害、灵敏拉曼散射传感器(肌氨酸氧化酶-金属纳米-硅藻壳组合(SOx-Au/Cu-DF)，并将其应用于肌氨酸检测当中，助力前列腺癌早期快速筛查技术的开发。
添加金属离子至硅藻的培养基中，通过硅藻的生长代谢途径，生物合成双金属纳米颗粒，获得金、铜纳米颗粒沉积的硅藻壳(Au/Cu-DF)，增强拉曼光谱信号，同时提供类过氧化物酶的催化性能。通过蛋白质工程将能够靶向硅藻壳silaffin-3成分的T8肽融合至肌氨酸氧化酶中，赋予SOx选择性结合至Au/Cu-DF的能力，提高SOx酶活及稳定性。最后使用新型酶-金属纳米-硅藻壳组合，研究其在尿液中检测肌氨酸的能力。实践证明，该方法可用于肌氨酸检测，结果与穿刺检查和PSA结果相吻合，提示病人患前列腺癌的可能性。
本发明耗时短、特异性高、成本低，这种酶-双金属纳米-硅藻壳辅助底物传感的概念可以通过改变固定化酶的类型来简单地扩展，希望为合理设计多个探针以量化复杂生物样本中的特定生物标志物设定指导方针。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例提供的金和铜金属颗粒修饰的硅藻壳扫描电子显微镜图像；
图2为本发明的实施例提供的金和铜金属颗粒修饰的硅藻壳透射电子显微镜图像；
图3为本发明的实施例提供的生成金和铜金属颗粒硅藻壳的元素分析示意图；
图4为本发明的实施例提供的不同浓度肌氨酸对Au/Cu-DF催化活性的影响示意图；
图5为本发明的实施例提供的双金属硅藻壳的过氧化酶活性与不同对照比较示意图；
图6为本发明的实施例提供的不同反应时长下Au/Cu分散液,Au/Cu-DF和SOx-HRP的催化活性示意图；
图7为本发明的实施例提供的β表面增强拉曼光谱法检测传感器制备各阶段产物对肌氨酸的感应灵敏度示意图；
图8为本发明的实施例提供的基于SOx-Au/Cu-DF检测病人与普通人尿液中肌氨酸含量示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
1.双金属纳米颗粒硅藻壳的制备
采用两步法将硅藻培养到所需的细胞密度，然后将金和铜纳米颗粒经过硅藻的生长代谢插入到硅藻壳中。
硅藻细胞在f/2+Si培养基中生长，直到可用的硅被消耗掉，并达到最终的细胞密度。在生物合成的第一阶段，氯金酸(HAuCl4)和偏硅酸钠共同输送到培养基中，硅藻在25℃，光暗周期12h：12h的条件下培养3d。以不同的时间间隔向培养基中加入HAuCl4，直至最终浓度为5μmol/L。在培养基颜色完全变成紫红色后，将硅藻转移到新鲜的f/2培养基中，按照同样的过程进行第二阶段铜纳米颗粒的培养，向培养基中加入CuSO4，使其终浓度为5μmol/L，当培养基颜色完全变为暗黑色时，培养结束。8000rpm/s，离心6min，收集含金和铜纳米颗粒的硅藻细胞。用EDTA/SDS和H2O2/HCl处理细胞，去除有机成分，分离含金和铜的硅藻壳(Au/Cu-DF)。Au/Cu-DF每干重生物量的平均回收率为0.5g固体/g。通过紫外-可见光谱检测对纳米粒子在硅藻壳上的合成和包覆过程进行全程监测和验证，用扫描电子显微镜表征双金属纳米颗粒在硅藻壳上的形貌结构，如图1、图2和图3所示。
2.重组肌氨酸氧化酶(Sarcosine oxidase,SOx)的设计和表达纯化
基本原理是开发一种仿生方法，通过蛋白质工程将二氧化硅亲和肽插入蛋白质序列中，赋予感兴趣的蛋白质靶向固定至硅藻硅藻壳表面的能力，过程不需要额外的固定步骤或化学试剂。
主要步骤为将SOx单体的C端和N端序列插入二氧化硅亲和肽和组蛋白标签(histag)，his tag用于蛋白质纯化。将两种不同的硅亲和标记(Sil3 T8和R5)融合到SOx酶上。R5 tag和T8 tag分别来自硅藻Claviceps fusiformis的全长R5肽(
Deutzmann etal.1999)，和硅藻Thalassiosira pseudonana的Sil3 T8(Poulsen,Scheffel etal.2013)。R5 tag和T8 tag能够靶向硅藻壳silaffin-3成分。再在E.coli BL21(DE3)Rosetta II中表达SOx-T8和SOx-R5以及SOx(无标签)，并通过his tag亲和Ni-NTA层析纯化三种酶蛋白。
含有肌氨酸氧化酶表达序列的pET24a质粒由(公司名称)合成。相同的质粒也被用于T8 tag和R5 tag序列也同样载入pET24a质粒。T8和R5与His-tag在C端和N端与SOx融合。
在表达蛋白质之前，含有所需质粒的BL21(DE3)大肠杆菌在20mL Luria肉汤(LB)的初始培养基中过夜生长。然后，将隔夜培养的200μL菌液转移到20μL含青霉素(10μL，100毫克/mL)的LB培养基中，并在37℃的摇床中过夜。该培养物与青霉素(100μL，100mg/mL)转移到200mL的LB培养基中，并在摇床中孵化3h。然后，添加异丙基-β-d-1-硫代乳吡啶苷(IPTG)诱导蛋白的表达，继续孵化4-5h后，以4300rpm/min的4℃下离心20min。去上清，保留沉淀的菌体，储存在4℃。通过超声破碎仪，以100W的功率，在20min内，开5s，停3s，破碎菌体。该混合物在4℃下以13,000rpm/min的离心20min，含有粗蛋白质的上清液在4℃下储存。
使用镍His-Bind树脂(Novagen)进行蛋白纯化，提纯T8-SOx和R5-SOx。按照试剂盒说明书进行一下步骤，用5×体积的平衡缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl,20mM咪唑，pH7.8)清洗色谱柱，然后加载粗蛋白上清液。用3×体积的结合缓冲液(缓冲液A加20mM咪唑)和5×体积的洗涤缓冲液(缓冲液A加50mM咪唑)洗涤去除杂质。目的蛋白用5×体积的洗脱缓冲液(缓冲液a含250mM咪唑)洗脱。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-page,8％ SDS)对变性蛋白进行尺寸分析，确认纯化蛋白。用Bradford法测定粗裂解液中总蛋白的产量，如图4。
3.T8-Sox/R5-Sox在硅藻壳上的固定
测量带标签肌氨酸氧化酶固定化至硅藻壳后的酶活性，也就是测量T8-SOx-DF、R5-SOx-DF与游离SOx-DF的酶活性。
使用缓冲盐溶液中(100mM Na2HPO4,150mM NaCl,pH 7.5)配置5mg/mL DF悬浊液，超声1h。向5mg/mL DF中添加一定量的纯化蛋白(T8-SOx、R5-SOx或SOx粗酶液)，使蛋白质混合的终浓度介于0.05-0.5mg/mL之间。涡旋震荡混合1h，置于室温沉淀，然在13000rpm下离心5min，获得T8-SOx-DF、R5-SOx-DF和SOx-DF。
对照组为使用化学试剂NHS/EDC将肌氨酸氧化酶固定至DF。用H2O2/HCl处理DF，并用APTES进行功能化后，通过NHS/EDC(NHS:n-羟基琥珀酰亚胺和EDC:1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳-二亚胺偶联蛋白。EDTA功能化后，经酰胺化反应接枝到DF上。简单来说，将Na2EDTA溶解在含有DF悬浊液的圆底烧瓶中，然后在混合物中加入EDC/NHS(2:1)，在37℃下进一步搅拌30min。通过EDC和NHS活化Na2EDTA的-COOH基团。然后向烧瓶中加入0.5mg/L肌氨酸氧化酶，磁力搅拌2h，收集得到的固体DF(即NHS/EDC-Sox-DF)，用去离子水冲洗。
使用等量的蛋白质(T8-SOx-DF、R5-SOx-DF、NHS/EDC-Sox-DF和SOx-DF)探究其在Au/Cu-DF上的固定量。通过紫外-可见分析检测T8-SOx、R5-Sox与游离SOx的固定化百分比。并用Bradford法进一步确认了固定起始和固定结束时的蛋白。将孵育后第一次离心取得的上清液20μL加入100μL Bradford试剂(磷酸考马斯亮蓝)中，用紫外分光光度计测定595nm处的吸光度，并与牛血清白蛋白制作的标准曲线进行比较。(在0.5-1M赖氨酸中孵育30-120min可完全洗脱DF上的蛋白质，用于固定量的检测)。在MES缓冲液(90mL,50mM,pH 5)中加入固定量的肌氨酸(800mL,5mM)和TMB(100mL,5mM)，用于比较通过三种方法获得的固定化酶酶活性(100μg/mL T8-SOx、R5-SOx、NHS/EDC-Sox的酶固定至2mg/mL Au/Cu-DF上)，如图5所示。
4.Au/Cu包覆硅藻壳(Au/Cu-DF)的过氧化物酶活性的研究
采用TMB氧化法测定Au/Cu-DF的类过氧化物酶生物催化活性。简单地说，Au/Cu-DF(5mg)、TMB(300mL,25mM)和H2O2(100mL,10mM)与醋酸缓冲液(3.6mL,0.2M,pH 5.0)混合。反应置于摇床中15min，离心收集蓝色上清液，在652nm处进行紫外可见光谱(UV-Vis)检测，如图6所示。同时检测单金属包覆(Au-DF、Cu-DF)和不含纳米颗粒的DF的相同实验，以比较双金属纳米系统的过氧化物酶活性增强或衰减。
5.基于Sox-Au/Cu-DF的SERS检测肌氨酸
将肌氨酸(800uL,5mM)、TMB(100μL,5mM)和MES缓冲液(90mL,50mM,pH 5)加入到SoX-Au/Cu-DF悬浮液(10mL,2mg/mL)中，使最终体积达到1mL。混合物在37℃下反应15min，离心，使用UV-vis检测上清液在652nm处的吸光度。
在96孔板中加入100μL 2mg/mL的SOx-Au/Cu-DF和100μL 5mM TMB的混合物。吹打混匀后加入10μL不同浓度的肌氨酸(0.16、0.32、0.63、1.25、2.50、5.00、6.00、8.00μL/L)。孵育10min后，取10μL滴在清洗干净的干燥载玻片上，室温干燥。通过拉曼光谱仪测定反应后Sox-Au/Cu-DF的拉曼信号，扫描时间为8s，3次平行测量，如图7和图8所示。
1.与野生型肌氨酸氧化酶相比，本发明将二氧化硅亲和肽引入肌氨酸氧化酶(SOx)的蛋白质序列中，该序列编码亲和硅藻壳silaffin3蛋白的肽段，能够将SOx靶向固定至硅藻硅质外壳。可用于肌氨酸氧化酶蛋白的靶向修饰。相比使用NHC/EDC化学方法固定SOx，能够保留更多的酶活位点暴露，提高固定化酶的稳定性、酶活性及使用效率。
2.通过简单的硅藻生长代谢过程，在硅藻壳表面同时沉积Au和Cu纳米颗粒。以一种简单、绿色、高效的方法，获得双金属纳米颗粒沉积的硅藻壳。比起单金属纳米颗粒的应用，有更好的类过氧化物酶效果。且通过本方法沉积得到的双金属纳米，纳米颗粒间呈现良好的分散性，在硅藻壳表面有适当的距离，能够产生更多的热点，从而放大SERS信号。
3.合成过程简单，易重复。
4.双金属纳米颗粒，能够在过氧化氢的存在下氧化TMB，使其变成OxTMB。能够在拉曼光谱下对OxTMB进行分析。在硅藻壳内的多层孔径以及表面沉积的Au/Cu金属确保了SOx和响应单元的协同工作。硅藻壳的纳米孔大大提高了SOx的装载能力，还为肌氨酸的自由扩散腾出了足够的空间。在此基础上，SOx-Au/Cu-DF能够检测出PCa患者和健康人之间尿样中肌氨酸微小浓度变化。
5.Au/Cu-DF的以下优点可能是其催化活性较高的原因:i)三维高孔隙度结构和孔道相互连通，促进了Au/Cu与SOx之间的质量扩散，生成H2O2；ii)双金属包覆的孔道上分布着丰富而均匀的热点，可以通过加速电子转移来显著提高催化活性；iii)硅藻壳的大表面积和多孔结构以及三维截孔网络中丰富的催化活性金属节点iv)过氧化物酶和氧化酶系统的紧密接近加速了催化反应v)SOx与硅藻壳开放扩散通道的静电相互作用。
T8-SOx的DNA序列如下所示，共1437个bp，理论分子量为52.5kDa。
T8 tag sequence with SOx
R5 tag的肌氨酸氧化酶DNA序列如下所示，共1329个bp，理论分子量为48.7KDa,。
R5 TAG WITH SOX
SOx-no tag共1191个bp，理论分子量为44.0Kda
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法，其特征在于，包括：
步骤一、将硅藻培养到所需的细胞密度后将金和铜经过硅藻的生长代谢插入到硅藻壳中得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu-DF，使得硅藻壳新陈代谢过程中产生的氧化还原产物将含有金和铜的金属溶液还原成为金和铜沉积至硅藻壳表面形成纳米颗粒；
步骤二、将可以靶向硅藻壳成分的硅亲和标记标签T8标签和R5标签与肌氨酸氧化酶进行融合得到重组后的T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶；
步骤三、将T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶固定在包含金和铜纳米颗粒的硅藻壳上进行组装形成双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤一包括：
在培养基中加入预设浓度的Si得到f/2+Si培养基，将硅藻细胞在f/2+Si培养基中生长，当可用的硅被消耗掉时达到所需细胞密度的硅藻；
将氯金酸和偏硅酸钠共同输送到培养基中，在25摄氏度，光暗周期12小时的条件培养3天，以不同地时间间隔向培养基中加入氯金酸，直至氯金酸的最终浓度为5μmol/L，且培养基颜色完全变成紫红色后将硅藻转移到新鲜的f/2培养基中；
向培养基中加入CuSO4，直至浓度为5μmol/L且当培养基颜色完全变为暗黑色时培养结束；
离心培养液，收集含金和铜纳米颗粒的硅藻细胞，用EDTA/SDS和H2O2/HCl处理细胞，去除有机成分，分离得到含金和铜的硅藻壳Au/Cu-DF。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤二包括：
将肌氨酸氧化酶单体的C端和N端序列插入二氧化硅亲和肽以及组蛋白标签his tag，其中，his tag用于蛋白质纯化；
将硅亲和标记T8标签和R5标签融合到肌氨酸氧化酶得到T8重组肌氨酸氧化酶和R5T8重组肌氨酸氧化酶，其中，R5 tag来组硅藻Claviceps fusiformis的全长R5肽，T8 tag来自硅藻Thalassiosira pseudonana的SiI3 T8，R5 tag和T8 tag能够靶向硅藻壳silaffin-3成分。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤三包括：
使用缓冲盐溶液配置硅藻壳溶液，超声；
向硅藻壳溶液中加入T8重组肌氨酸氧化酶和R5重组肌氨酸氧化酶使浓度介于0.05-0.5mg/mL之间，涡旋振荡混合，置于室温沉淀，离心，得到双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器。
5.一种肌氨酸的检测方法，其特征在于，包括：
将待检测的肌氨酸、TMB和MES缓冲液加入到权利要求1-4任一项所述的构建方法制备得到的双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器悬浮液中反应至少15min，离心，使用UV-vis检测上清液在652nm处的吸光度；
在96孔板中加入双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器和TMB的混合物，吹打混匀后加入不同浓度的肌氨酸，孵育至少10min后，滴在清洗干净的干燥的载玻片上，室温干燥；
通过拉曼光谱仪测定反应后双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的拉曼信号。
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