CN112763561B - 一种检测gⅱ.4诺如病毒的电化学传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及GⅡ.4诺如病毒的检测材料、合成方法、检测方法；所述的材料包括Fe3O4@COF(TpDA)或AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)或WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)，三种材料依序合成；分析物为水体样本或食品样本或呕吐物或粪便样本；以及使用本发明方法制造的电化学免疫传感器。本发明制备得到的传感器的线性检测范围是2.51copies/mL‑105.4copies/mL，最低检测下限为0.84copy/mL。

Description

一种检测GⅡ.4诺如病毒的电化学传感器
技术领域
本发明属于电化学免疫传感领域，具体涉及了一种人诺如病毒检测的方法。
背景技术
人类诺如病毒(HuNOV)是引起世界范围内病毒性胃肠炎的主要原因。与全世界95％的非细菌性和50％的胃肠炎爆发有关。NoV共分为7个基因组群(GI-GVII)，每个基因型进一步划分为几个基因型。人类病原体只限于GI、GII和GIV的基因型，GII.4亚型在感染人的诺如病毒中是最常见的，占世界范围内诺沃克病毒感染病例的80％。
传统的检测方法有Real-time RT-PCR和ELISA，Real-time RT-PCR是通过提取病毒RNA，设计并合成引物和探针，用定量PCR仪进行荧光定量；ELISA即酶联免疫吸附测定法，此方法可以直接使用抗体捕获诺如病毒，并通过携带探针的抗体进行显色测定，Real-timeRT-PCR 法的特点是可以具有目的性的检测单一基因型的诺如病毒，对于多基因型的检测比较繁琐， ELISA法具有检测快速的特点，但是具有成本高，前期试剂准备复杂的缺陷。
公开号：CN111254217A，申请人：株式会社岛津制作所，申请名称：诺如病毒的检测方法的申请，其采用逆转录-聚合酶链式反应检测诺如病毒，检测的试剂盒包含二甲基亚砜(DMSO)。但二甲基亚砜(DMSO)含水时对铁、铜等金属有腐蚀性，且会因操作不当，而对眼睛、呼吸道和皮肤有强刺激作用。
公开号：CN111187861A，申请人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，申请名称：一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法的申请，将RT-LAMP反应产物加入到经Fe3+淬灭后的氧化钒量子点溶液中，分两次观察结果，以确认检测。但由于其涉及观察，可能存在人为主观因素差异影响。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供GⅡ.4诺如病毒的检测材料、合成方法、检测方法。
在本发明中，磁性复合共价有机框架纳米材料(WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA))作为新一代符合纳米材料，具有良好的吸附性，能溶于水，可以结合抗体、适配体、多肽等具有识别作用的生物分子等特点。同时，WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)复合材料具有良好的导电性，并对信号分子亚甲基蓝(MB)具有优良的富集作用。
特异性识别诺如病毒多肽(NoroBP)是一种新型多肽，近年来在诺如病毒的检测方面已有相关报道。在这里，我们利用其可以组装在金电极并可以特异的识别GⅡ.4亚型诺如病毒的特点与磁性复合共价有机框架纳米材料共同作用构建了一个具有较高的灵敏度、较宽的检测范围、较快的检测速度、较低的检出限以及操作方便等优点的HuNOV电化学免疫传感器。
本发明的目的在于通过把多肽(NoroBP)组装在金电极上，构成一种可以捕获HuNOV GⅡ.4的电极表面，将病毒颗粒捕获并固定在电极表面。然后用已合成的负载了HuNOV GⅡ.4 适配体且具有优良电化学性能磁性复合共价有机框架纳米材料来识别电极表面的病毒颗粒，同时利用复合材料对亚甲基蓝优良的吸附能力将亚甲基蓝溶液滴加在电极表面进行孵育，最后在10mL浓度为0.1mol/L的pH为7.0-8.0的缓冲溶液中进行测试，构成一种可快速有效检测样品中诺如病毒的浓度的电化学传感器。
本发明采用如下技术方案实现。
1.合成Fe3O4@COF(TpDA)，并表征。
Figure BDA0002858534760000021
(1.1)合成Fe3O4，用乙二醇(70mL)溶解六水合氯化铁(1.35g)、醋酸铵(3.85g)和柠檬酸钠(0.4g)。混合液在160℃下搅拌1h，形成均匀的黑色溶液，然后转移到不锈钢高压釜(容量100mL)中，在200℃条件下反应16h，反应终止后自然冷却至室温。将产物用乙醇和水清洗，黑色产物在60℃真空环境下干燥。
(1.2)进一步合成Fe3O4@COF(TpDA)，取1,3,5-三甲酰间苯三酚(TP,0.3mmol,63mg)， 2,6-二氨基蒽醌(DA,0.43mmol,107mg)和Fe3O4(80mg)，用3.0mL二氧杂环乙烷溶解。将混合物转移到玻璃反应管中，将反应管中液体悬浊液在液氮环境中冷冻抽真空，重复三次，除去反应体系中的氧气。将装有悬浊液的玻璃反应管置于温度为120℃油浴锅中，密封反应3天，反应结束后，自然冷却至室温。棕色产物用N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃依次洗涤3次，冷冻干燥12h，得到Fe3O4@COF(TpDA)棕色粉末。
表征方法有：红外光谱，扫描电镜图像，透射电镜图像，EDS元素分析，Zeta电位，XRD粉末X射线衍射图谱，XPS光电子能谱。
2.合成并表征AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料。
(2.1)合成AuNPs，将1.07mL浓度为23.46mmol/L的HAuCl4溶液加入到100mL去离子水中，在110℃下加热搅拌5min，加入10ml浓度为14.53mmol/L的柠檬酸钠溶液，回流20-40min，直至溶液变为酒红色，自然冷却至室温，并于4℃下储存。
(2.2)Fe3O4@COF(TpDA)粉末分散在去离子水中，超声作用2h。然后，通过在离心获得Fe3O4@COF(TpDA)的悬浮液，用来去除较大的颗粒，离心后冷冻干燥12h，于4℃储存备用。
(2.3)将得到Fe3O4@COF(TpDA)的加水配制成浓度为1mg/mL的Fe3O4@COF(TpDA) 溶液，取1mL Fe3O4@COF(TpDA)溶液滴加在10mL浓度为0.0002mol/L金纳米粒子溶液中，4℃搅拌12h，离心洗涤，得到Au@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料。
表征方法有：透射电镜图像，EDS元素分析，Zeta电位，XRD粉末X射线衍射图谱，XPS光电子能谱。
3.合成并表征WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料。
配制0.5mg/mL的水溶性柱芳烃(WP5)溶液，将上一步得到的Au@Fe3O4@COF(TpDA)加水配置成1mg/mL的溶液，取1mL的WP5溶液滴加在2mL的 AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)中，4℃搅拌4h，离心洗涤，得到 WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料。
表征方法有：红外光谱，Zeta电位。
4.合成APT@WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料。
将30μL 10μmol/L的诺如病毒适配体(APT)加入到50μL 1mg/mL的 WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料溶液中，室温震荡12h，离心洗涤备用。
5.工作电极的制备方法。
将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在50％硝酸溶液、50％无水乙醇、超纯水中超声清洗；在10mmol/L的HAuCl4中用Amperometric i-t Curve进行富集，参数设置：初始电位0V，反应时间200s。
6.探究工作电极的反应条件。
(6.1)配制0.1-1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液，取10μL滴加在处理好的电极表面，4℃育温0-3h，用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，在0.1mol/L KCl，1mmol/L K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗谱分析(EIS)，同时进行对应的循环伏安法 (CV)验证。检测结果为1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液育温2h是多肽(NoroBP)组装在金电极上的最优条件。
(6.2)配制1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液，取10μL滴加在处理好的电极表面，4℃育温2h后，滴加10μL 1mmol/L的己硫醇(HT)，室温育温30min，用0.1mol/L pH 7.0PBS 清洗电极3次，待电极干燥后，将10μL浓度为103copies/mL的诺如病毒溶液滴加到处理好的电极上，4℃育温0-50min，用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，在0.1mol/LKCl，1mmol/L K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗谱分析(EIS)，同时进行对应的循环伏安法(CV)验证。检测结果为育温30min是多肽(NoroBP)捕获诺如病毒的最优条件。
(6.3)将10μL浓度为1mg/mL的APT@WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料滴加在经过多肽/HT/诺如病毒处理后的电极表面，室温育温0-90min，用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，在0.1mol/L KCl，1mmol/L K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6] 溶液中进行电化学阻抗谱分析(EIS)，同时进行对应的循环伏安法(CV)验证。检测结果为育温45min是APT@WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)探针结合的最优条件。
7.诺如病毒的测定步骤。
(7.1)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在50％硝酸溶液、50％无水乙醇、超纯水中超声清洗；在10mmol/L的HAuCl4中用Amperometric i-t Curve 进行富集，参数设置：初始电位0V，反应时间200s，富集Au之后电极表面呈现出均匀的金色薄膜；
(7.2)配制1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液，取10μL滴加在处理好的电极表面，4℃育温2h；
(7.3)用0.1mol/LpH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，滴加10μL 1mmol/L的己硫醇(HT)，室温育温30min；
(7.4)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，将10μL浓度为 100.4-105.4copies/mL的一系列不同浓度的诺如病毒溶液滴加到步骤(2)处理过的玻碳电极表面，4℃育温30min；
(7.5)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，将10μL浓度为1mg/mL的WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料滴加在电极表面，室温育温45min；
(7.6)用0.1mol/LpH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，滴加10μL10mmol/L 的亚甲基蓝(MB)溶液在电极表面，保持湿润，室温育温30min；
(7.7)用0.1mol/LpH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，在10mLpH 7.0PBS 溶液中用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测，扫描电压范围-0.6-0V，脉冲振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，绘制工作曲线。
除上述技术方案之外，本发明可以用来识别诺如病毒的分子还可以是其他生物分子，比如诺如病毒抗体以及与多肽(NoroBP)主要序列相同经过修饰的其他多肽。
本发明中的TpDA-COF还可用其他共价有机骨架材料替代。
本发明中的柱芳烃WP5还可用其他超分子替代。
本发明的有益效果为，
1、WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料成功制备，并通过红外光谱，扫描电镜图像，透射电镜图像，EDS元素分析，Zeta电位，XRD粉末X射线衍射图谱和XPS光电子能谱证明。
2、COF(TpDA)虽然也具有作为探针分子的潜力，但是其导电性较差；Fe3O4@COF(TpDA) 相比较COF(TpDA)具有更多的催化活性位点，导电性更加优异，但缺乏与APT结合的位点； AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)不仅具有与APT结合作用的Au位点，且具有更加优良的导电性，并且对柱芳烃WP5有良好的吸附作用，但其本身对MB的吸附性较弱； WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料的合成，将四种材料的优良性能有效地结合在一起，充分发挥了作为电化学传感器探针的优良性能。
3、随着电极表面组装层数增加，在0.1mol/L KCl，1mmol/L K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗谱分析(EIS)，同时进行对应的循环伏安法(CV)验证，验证结果为金成功富集，多肽成功修饰，HT封闭效果良好，可以成功捕获溶液中的诺如病毒，探针结合稳定。
4、随着病毒浓度增加，脉冲伏安法(DPV)检测到的电信号增强，且在100.4-105.4copies/mL 的诺如病毒浓度范围内具有良好的线性关系。
5、将诺如病毒溶液替换为其他物质，例如盐溶液，生物蛋白分子，以及同样可以引发肠道疾病的病毒(轮状病毒和萨科奇病毒)，均不能检测到相应的电化学信号。证明用上述方法构建的电化学免疫传感器。
本发明成功制备了WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料。通过电化学阻抗谱分析(EIS)，同时进行对应的循环伏安法(CV)验证，结果表明多肽(NoroBP)可以组装在经过金富集修饰的电极上，并且可以有效的捕获诺如病毒，WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料可以通过APT的连接作用特异性识别诺如病毒并组装到电极上，并且其具备的MB 吸附能力使WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料可以作为优良的探针对诺如病毒进行检测。同时，多肽(NoroBP)与诺如病毒适配体(APT)对于诺如病毒的筛选作用使构建的电化学免疫传感器对诺如病毒具有特异性识别的能力，制备得到的传感器的线性检测范围是2.51copies/mL-105.4copies/mL，最低检测下限为0.84copy/mL。
下面结合具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1为Fe3O4纳米簇的TEM(A)和SEM(B)组合图示。
图2为Fe3O4@COF(TpDA)的TEM(A)和SEM(B)组合图示。
图3为AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的TEM图示。
图4为AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的EDS图示。
图5为AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的XRD图示。
图6为AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的XPS图示。
图7为WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的红外光谱图示。
图8为WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的Zeta电位图示。
图9为材料优化的电流对比图示A：Fe3O4@COF(TpDA)时COF(TpDA)与Fe3O4反应原料投入比例图。
图10为材料优化的电流对比图示B：Fe3O4@COF(TpDA)时不同修饰程度的探针修饰AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)示意图。
图11为材料优化的电流对比图示C：不同超分子修饰AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)示意图。
图12为传感器的线性检测范围图示。
图13为本发明传感器检测原理示意图。
图14为本发明技术流程示意图。
图15为本发明Fe3O4@COF(TpDA)化学式结构示意图。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所使用的化学试剂，溶剂均为分析纯；所使用的多肽，适配体均为商业化方法获得；电化学检测所使用的仪器为电化学工作站CHI 660D。
实验例1：制备和表征Fe3O4@COF(TpDA)的方方法如下：
(1)Fe3O4纳米簇的制备：称取六水合氯化铁(1.35g，3mmol)，醋酸铵(3.85g，50mmol)，柠檬酸钠(0.4g，1.36mmol)，混合后加入70mL乙二醇，在磁子搅拌的条件下溶解，混合物完全溶解后得到深黄色溶液，将溶液转移至圆底烧瓶中，在160℃条件下继续搅拌1h，形成均匀的黑色溶液，然后将溶液转移到不锈钢高压反应釜(容量100mL)中，在 200℃的烘箱中反应16h，反应终止后，将反应产物在室温条件下自然冷却，得到含有黑色沉淀的悬浊液，将悬浊液在8000r/min的条件下离心20min，去上清液，沉淀用去离子水和无水乙醇离心清洗三次，黑色产物在60℃真空环境下干燥，获得粉末状Fe3O4纳米簇。Fe3O4纳米簇的TEM(A)和SEM(B)图示。
(2)进一步合成Fe3O4@COF(TpDA)：取1,3,5-三甲酰间苯三酚(TP,0.3mmol,63mg)，2,6-二氨基蒽醌(DA,0.43mmol,107mg)和Fe3O4(80mg)，用3.0mL二氧杂环乙烷溶解，超声混匀，得到灰棕色溶液。将混合物转移到玻璃反应管中，将反应管中液体悬浊液在液氮环境中冷冻抽真空，重复三次，除去反应体系中的氧气。将装有悬浊液的玻璃反应管置于温度为120℃油浴锅中，密封反应3天，反应管中的灰棕色溶液变成红棕色固体样产物。反应结束后，自然冷却至室温。将棕色产物倒入放有滤纸的抽滤漏斗中，打开真空抽滤泵，将多余的液体出去，然后用N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃依次洗涤 3次，得到棕色固体，将产物冷冻干燥12h，得到Fe3O4@COF(TpDA)棕色粉末。 Fe3O4@COF(TpDA)的TEM(A)和SEM(B)图示。
实验例2：制备和表征AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料的方法：
(1)AuNPs的制备：在搅拌条件下，将1.07mL浓度为23.46mmol/L的HAuCl4溶液加入100mL沸腾的去离子水中，在110℃下加热搅拌5min，缓慢滴加10mL浓度为14.53mmol/L 的柠檬酸钠溶液，冷凝回流30min，直至溶液变为酒红色，溶液在室温条件下搅拌15min，于4℃下储存。
(2)将上一步得到Fe3O4@COF的加水配制成浓度为1mg/mL的Fe3O4@COF溶液，取1mLFe3O4@COF溶液滴加在浓度为0.0002mol/L 10mL金纳米粒子溶液中，4℃搅拌12h，在8000r/min转速下离心10min，弃上清液，继续用去离子水离心洗涤3次，得到 AuNPs@Fe3O4@COF纳米复合材料。
(3)采用透射电镜图像，EDS元素分析，XRD粉末X射线衍射图谱，XPS光电子能谱对AuNPs@Fe3O4@COF纳米复合材料进行了表征：从透射电镜图(A)中可以看出，Fe3O4纳米颗粒外包裹着一层絮状的COF结构，小颗粒状AuNPs均匀的分布在COF结构中，同时，EDS元素分析(B)表明在加入AuNPs之后，纳米复合物的元素中多了Au元素，可表明纳米复合物的成功合成；XRD粉末X射线衍射图谱(C)中，在6.06°，14.07°，16.1°， 23.02°，24.02°，27.81°，28.52°和31.01°，32.02°的衍射峰与COF(TpDA)的衍射峰是一致的，在30-70的2θ区，在36.21°处的衍射峰对应于Fe3O4，在39.02°处的衍射峰对应于 AuNPs；XPS光电子能谱(D)中C\N\O\Fe\Au的特征峰均有显示，表明纳米复合物的成功合成。
实验例3：合成并表征WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料的方法：
(1)WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料的合成：称取1mgWP5粉末，加入 2mL去离子水，配制成0.5mg/mL的WP5水溶液，取1mLWP5水溶液缓慢加入到2mL 1mg/mL的AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)溶液中，4℃搅拌4h，反应结束后，在8000r/min 的条件下离心15min，去除上清液，加入去离子水，重复离心操作，重复洗涤三次，将产物在-50℃条件下冷冻干燥12h。
(2)采用红外光谱，Zeta电位的方法对产物进行表征，在红外光谱(A)中，3430cm-1和 1566cm-1的峰为材料表面吸附的水和羟基峰，与COF(TpDA)相比，在571cm-1处出现的峰是Fe3O4@COF(TpDA)所具有的Fe-O官能团特征峰，与Fe3O4@COF(TpDA)相比， WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料在1401cm-1处有一个COO-特征峰与 WP5在此处的红外吸收峰相对应，这说明带有COO-的WP5成功的复合到纳米复合材料上；Zeta电位的测量结果(B)显示，COF(TpDA)本身为负电(-19.2mV)，负载了带负电的 Fe3O4之后，Fe3O4@COF(TpDA)的电荷降低到-26.2mV，然后负载了带负电的AuNPs，电荷降低到-31.7mV，最后负载了带负电的WP5，电荷降低到-39.3mV，以上结果表明 WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料被成功合成。
实验例4：在WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)上修饰APT：
将公司合成的APT按照说明书的稀释方法用去离子水稀释为10μmol/L ，然后将30μL 10μmol/L的诺如病毒适配体(APT)加入到50μL 1mg/mL的WP5@Au@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料溶液中，室温震荡12h，8000r/min离心后去除上清液用去离子水洗涤备用。
实验例5：不同探针材料的电化学性能研究，具体方法如下：
(1)首先探究合成Fe3O4@COF(TpDA)时COF(TpDA)与Fe3O4反应原料投入比例是否对探针材料的性能有明显影响。首先，分别称取TP 30mg\DA 50mg\Fe3O4 80mg(TP+DA: Fe3O4＝1:1)，TP 60mg\DA 100mg\Fe3O4 80mg(TP+DA:Fe3O4＝2:1)，TP 30mg\DA 50mg\Fe3O4 20mg(TP+DA:Fe3O4＝4:1)，TP 45mg\DA 75mg\Fe3O4 20mg(TP+DA:Fe3O4＝6:1)四份合成 Fe3O4@COF(TpDA)的原料，分别加入3mL二氧杂环乙烷溶解,获得的四份溶液颜色呈现为由深到浅的灰棕色，将混合物转移到玻璃反应管中，将反应管中液体悬浊液在液氮环境中冷冻抽真空，重复三次，除去反应体系中的氧气。将装有悬浊液的玻璃反应管置于温度为120℃油浴锅中，密封反应3天，反应管中的灰棕色溶液变成红棕色固体样产物。反应结束后，自然冷却至室温。将棕色产物倒入放有滤纸的抽滤漏斗中，打开真空抽滤泵，将多余的液体出去，然后用N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃依次洗涤3次，得到棕色固体，将产物冷冻干燥12h，得到Fe3O4@COF(TpDA)棕色粉末。
将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在50％硝酸溶液、50％无水乙醇、超纯水中超声清洗，待电极表面干燥后，将10μL四种COF(TpDA)与Fe3O4比例不同的1mg/mL的Fe3O4@COF(TpDA)滴加在电极表面，待干燥后，滴加10μL 10mmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液在电极表面，保持湿润，室温育温30min后，用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测，检测结果为，在电极表面，按照TP+DA:Fe3O4＝2:1的比例合成的Fe3O4@COF(TpDA) 对MB的吸附能力最优良。
(2)探究不同修饰程度的探针的电化学性能，具体步骤如下：分别合成 COF\Fe3O4\Fe3O4@COF(TpDA)\AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)\WP5 @Fe3O4@COF(TpDA)\WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)，将直径为3mm的玻碳电极用 Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在50％硝酸溶液、50％无水乙醇、超纯水中超声清洗，待电极表面干燥后，将10μL 1mg/mL COF\Fe3O4\Fe3O4@COF(TpDA)\AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)\WP5 @Fe3O4@COF(TpDA)\WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)分别滴加在不同的玻碳电极表面，待干燥后，滴加10μL 10mmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液在电极表面，保持湿润，室温育温30min后，用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测，检测结果为，WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的电化学性能最优良。A-F分别代表 COF\Fe3O4\Fe3O4@COF(TpDA)\AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)\WP5 @Fe3O4@COF(TpDA)\WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)。
(3)探究不同超分子修饰AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的电化学性能，具体方法如下：分别称取1mg CP5\CB7\β-CD\SCX6\WP5加入2mL去离子水配制成0.5mg/mL的溶液，分别取1mLCP5\CB7\β-CD\SCX6\WP5滴加在2mL 1mg/mL的AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA) 中，4℃搅拌4h，8000r/min离心洗涤备用。将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在50％硝酸溶液、50％无水乙醇、超纯水中超声清洗，待电极表面干燥后，将10μL不同超分子修饰的复合纳米材料滴加在电极表面，待干燥后，滴加10μL 10mmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液在电极表面，保持湿润，室温育温30min后，用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测，检测结果为，WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)的电化学性能最优良。
实验例6：诺如病毒电化学免疫传感器工作电极的制备方法，具体步骤如下：
(1)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在50％硝酸溶液、50％无水乙醇、超纯水中超声清洗；在10mL 10mmol/L的HAuCl4中用Amperometric i-tCurve 进行富集，参数设置：初始电位0V，反应时间200s，富集Au之后电极表面呈现出均匀的金色薄膜；
(2)配制1mg/mL的多肽(NoroBP)溶液，取10μL滴加在处理好的电极表面，4℃育温2h；
(3)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，滴加10μL 1mmol/L的己硫醇 (HT)，室温育温30min；
(4)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，将10μL浓度为 100.4-105.4copies/mL的一系列不同浓度的诺如病毒溶液滴加到步骤(3)处理过的玻碳电极表面，4℃育温30min；
(5)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，将10μL浓度为1mg/mL的WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料滴加在电极表面，室温育温45min；
(6)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，滴加10μL 10mmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液在电极表面，保持湿润，室温育温30min；
(7)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，在10mL pH 7.0PBS溶液中用脉冲伏安法(DPV)对分析物进行检测，扫描电压范围-0.6-0V，脉冲振幅0.05V，脉冲宽度 0.05s，绘制工作曲线。制备得到的传感器的线性检测范围是2.51copies/mL-105.4copies/mL，最低检测下限为0.84copy/mL。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的配方属于数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
1、所用病毒为患者粪便样品中的病毒，因为涉及患者隐私，所以没有过多介绍。
2、多肽(NoroBP)别人已有报道合成使用，为现有技术。
Figure BDA0002858534760000101

Claims (1)

1.一种检测GⅡ.4诺如病毒的电化学传感器，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成Fe3O4@COF(TpDA)，并表征：
Figure FDA0003500615930000011
(1.1)合成Fe3O4，用乙二醇70mL溶解六水合氯化铁1.35g、醋酸铵3.85g和柠檬酸钠0.4g；混合液在160℃下搅拌1h，形成均匀的黑色溶液，然后转移到不锈钢高压釜，容量100mL中，在200℃条件下反应16h，反应终止后自然冷却至室温；将产物用乙醇和水清洗，黑色产物在60℃真空环境下干燥；
(1.2)进一步合成Fe3O4@COF(TpDA)，取1，3，5-三甲酰间苯三酚TP，0.3mmol，63mg，2，6-二氨基蒽醌DA，0.43mmol，107mg和Fe3O4 80mg，用3.0mL二氧杂环乙烷溶解；将混合物转移到玻璃反应管中，将反应管中液体悬浊液在液氮环境中冷冻抽真空，重复三次，除去反应体系中的氧气；将装有悬浊液的玻璃反应管置于温度为120℃油浴锅中，密封反应3天，反应结束后，自然冷却至室温；棕色产物用N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃依次洗涤3次，冷冻干燥12h，得到Fe3O4@COF(TpDA)棕色粉末；
表征方法有：红外光谱，扫描电镜图像，透射电镜图像，EDS元素分析，Zeta电位，XRD粉末X射线衍射图谱，XPS光电子能谱；
2)合成并表征AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料：
(2.1)合成AuNPs，将1.07mL浓度为23.46mmol/L的HAuCl4溶液加入到100mL去离子水中，在110℃下加热搅拌5min，加入10ml浓度为14.53mmol/L的柠檬酸钠溶液，回流20-40min，直至溶液变为酒红色，自然冷却至室温，并于4℃下储存；
(2.2)Fe3O4@COF(TpDA)粉末分散在去离子水中，超声作用2h；然后，通过在离心获得Fe3O4@COF(TpDA)的悬浮液，用来去除较大的颗粒，离心后冷冻干燥12h，于4℃储存备用；
(2.3)将得到Fe3O4@COF(TpDA)的加水配制成浓度为1mg/mL的Fe3O4@COF(TpDA)溶液，取1mL Fe3O4@COF(TpDA)溶液滴加在10mL浓度为0.0002mol/L金纳米粒子溶液中，4℃搅拌12h，离心洗涤，得到Au@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料；
表征方法有：透射电镜图像，EDS元素分析，Zeta电位，XRD粉末X射线衍射图谱，XPS光电子能谱；
3)合成并表征WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料：
配制0.5mg/mL的水溶性柱芳烃WP5溶液，将上一步得到的Au@Fe3O4@COF(TpDA)加水配置成1mg/mL的溶液，取1mL的WP5溶液滴加在2mL的AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)中，4℃搅拌4h，离心洗涤，得到WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料；
表征方法有：红外光谱，Zeta电位；
4)合成APT@WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料：
将30μL 10μmol/L的诺如病毒适配体APT加入到50μL 1mg/mL的WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料溶液中，室温震荡12h，离心洗涤备用；
5)工作电极的制备方法：
将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在50％硝酸溶液、50％无水乙醇、超纯水中超声清洗；在10mmol/L的HAuCl4中用Amperometric i-t Curve进行富集，参数设置：初始电位0V，反应时间200s；
6)测定步骤：
(6.1)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在50％硝酸溶液、50％无水乙醇、超纯水中超声清洗；在10mmol/L的HAuCl4中用Amperometric i-t Curve进行富集，参数设置：初始电位0V，反应时间200s，富集Au之后电极表面呈现出均匀的金色薄膜；
(6.2)配制1mg/mL的多肽NoroBP溶液，取10μL滴加在处理好的电极表面，4℃育温2h；
(6.3)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，滴加10μL 1mmol/L的己硫醇HT，室温育温30min；
(6.4)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，将10μL浓度为100.4-105.4copies/mL的一系列不同浓度的诺如病毒溶液滴加到步骤(2)处理过的玻碳电极表面，4℃育温30min；
(6.5)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，将10μL浓度为1mg/mL的WP5@AuNPs@Fe3O4@COF(TpDA)纳米复合材料滴加在电极表面，室温育温45min；
(6.6)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，滴加10μL 10mmol/L的亚甲基蓝MB溶液在电极表面，保持湿润，室温育温30min；
(6.7)用0.1mol/L pH 7.0PBS清洗电极3次，待电极干燥后，在10mL pH 7.0PBS溶液中用脉冲伏安法DPV对分析物进行检测，扫描电压范围-0.6-0V，脉冲振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，绘制工作曲线；所述的分析物为水体样本或食品样本或呕吐物或粪便样本。
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