CN103235143A - 一种时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17α-OHP的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种时间分辨免疫荧光分析法定量测定新生儿17α-羟孕酮(1-α-hydoxyprogesterone，17α-OHP)的试剂盒，特别涉及竞争时间分辨免疫荧光分析法快速检测新生儿体内17α-OHP浓度水平的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对新生儿足跟血干血片样品中的17α-OHP浓度水平进行快速检测，从而辅助新生儿先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia，CAH)的诊断。

Description

一种时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17α-OHP的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种时间分辨免疫时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17α-羟孕酮(1-α-hydoxy progesterone，17α-OHP)的试剂盒，特别涉及竞争免疫时间分辨免疫荧光法快速检测新生儿体内17α-OHP浓度水平的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对新生儿足跟血干血片样品中的17α-OHP浓度水平进行快速检测，从而辅助新生儿先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia，CAH)的诊断。

背景技术

新生儿筛查是指在新生儿群体中，用快速、敏感的实验室方法对新生儿的遗传代谢病、先天性内分泌异常以及某些危害严重的遗传性疾病进行筛查的总称，其目的是对那些患病的新生儿在临床症状尚未表现之前或表现轻微时通过筛查，得以早期诊断、早期治疗，防止机体组织器官发生不可逆的损伤。避免患儿发生智力低下、严重的疾病或死亡。新生儿筛查一般是在婴儿出生后三天采取脐血或足跟血的纸片进行。

先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是一组常染色体隐性遗传、内分泌代谢失调病，分别由21-羟化酶、11b羟化酶、3b类固醇脱氢酶、17a羟化酶等缺陷所造成的，其中21-羟化酶缺乏症是CAH中最为多见的一种(90％～95％)，其共同特点是皮质醇合成障碍，引起促肾上腺皮质激素(ACTH)分泌增加导致肾上腺增生，出现脱水、失盐、外生殖器性别不清、生长加速、皮肤黏膜色素沉着、不同程度的男性化等各种不同临床表现。但可通过检测新生儿17α-OHP浓度水平筛查出大部分CAH患儿，并经过及时及早的治疗，病情可以得到有效的控制。17α-羟孕酮(1-α-hydoxy progesterone，17α-OHP)是一种内源性孕激素，由肾上腺皮质及性腺产生，目前是最常用的筛查CAH的敏感指标。

CAH发病率在不同人群中差异很大。有学者对无锡地区新生儿CAH发病率进行统计，其结果为1/15321(4/61284)(吴志君，朱云霞，陈道桢.无锡地区新生儿先天性肾上腺皮质增生症的发病情况探讨[J].中国优生与遗传杂志，2006，14(10)：72)。孙亦骏等亦对南京地区新生儿CAH发病率进行过调查，发现该地区的CAH发病率为1/25000(2/50000)(孙亦骏，张瑾，张汝帆.新生儿疾病筛查中先天性肾上腺皮质增生症的检出[J].中国优生与遗传杂志，2000，8(1)：74-80)。据新生儿筛查资料统计，经典型(21-羟化酶缺乏症)CAH的发病率在欧洲为1∶14000～1∶10000(Therrell BL Jr，Berenbaum SA，Manter-Kapanke V，et al.Results of screening1.9million Texas newborns for 21-hydroxylase-deficient congenital adrenal hyperplasia[J].Pediatrics.1998Apr；101(4Pt 1)：583-90.)，日本为1∶15000(Tajima T，Fujieda K，Nakae J，et al.Molecular basis of nonclassical steroid 21-hydroxylase deficiency detected by neonatal massscreening in Japan[J].J Clin Endocrinol Metab.1997Jul；82(7)：2350-6.)

近年由于环境污染、食品卫生等问题导致该病发病率呈一定上升趋势。我国是世界上人口最多的国家，进行新生儿筛查的人群基数很大，开发本项目具有较大的市场前景。目前常用的新生儿血片筛查主要是雷勃公司(Ani Labsystems)的新生儿17α-OHP检测试剂盒(荧光酶免疫分析法)，但酶标记物不稳定、反应本底较高，另外实验耗时较长，约需18-20小时，且价格昂贵，购买周期长，不利于大规模的新生儿筛查工作的进行。

本发明人利用时间分辨免疫时间分辨免疫荧光法(Time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA)技术发明一种定量测定新生儿17α-OHP的试剂盒，应用于新生儿体内17α-OHP含量的检测，辅助新生儿先天性肾上腺皮质增生症(CAH)的诊断。

TRFIA具有灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、多标记、无放射性污染等优点，灵敏度超过放射免疫(RIA)2～3个数量级。现已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。有利于疾病筛查工作的大规模顺利开展。

本发明的试剂盒作为国内首个新生儿17α-OHP定量测定的试剂盒，选用新生儿足跟血滤纸干血片为检测样本，并利用时间分辨免疫荧光法，其性能已达到并超过对照同类雷勃公司(Ani Labsystems)和PE公司的进口新生儿筛查17α-OHP定量测定试剂盒，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便及成本低廉等显著优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用时间分辨免疫荧光分析技术进行新生儿17α-OHP定量测定的试剂盒。时间分辨免疫荧光法(TRFIA)定量测定17α-OHP(17α-hydoxy progesterone)试剂盒是应用竞争免疫时间分辨免疫荧光法，采用羊抗兔IgG的多克隆抗体包被反应板，捕获定量加入的抗17α-OHP的抗体，检测时加入参考标准品或待测样品和17α-OHP-BSA-Eu，标本中的17α-OHP和17α-OHP-BSA-Eu竞争结合被羊抗兔IgG捕获的抗17α-OHP抗体，形成二抗-抗17α-OHP-17α-OHP-BSA-DTTA-Eu复合物。当铕在增强液中从复合物上解离后发出强的荧光，荧光强度与样品中的17α-OHP浓度成反比。通过标准曲线拟合，从而对新生儿体内17α-OHP含量进行定量测定。

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

1)根据和对照同类进口试剂盒进行临床测值比较：

为了实现本发明，需要对试剂盒所使用的原料进行筛选，从而确定最佳的原料，这一筛选过程包括校准品配制原料纯度、校准品配制基质、抗体的稀释比例、铕标记物的稀释比例以及包被反应板的本底及变异大小等。

2)确定试剂盒的组分及配方，包括：分析缓冲液配方等，并公开了浓缩洗液配方。

本发明提供的一种时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17α-OHP试剂盒，包括：

1)校准品滤纸干血片

2)质控品滤纸干血片

3)抗体

4)铕标记物

5)分析缓冲液

6)浓缩洗液

7)包被反应板，和分隔并集中包装这些试剂瓶、板、片的包装盒。

根据本发明一个优选的实施方案，校准品滤纸干血片和质控品滤纸干血片由17α-OHP溶解在校准品和质控品基质中，并滴在市售滤纸上。校准品和质控品滤纸干血片根据17α-OHP浓度不同分别编号A-F和C1、C2、C3，其中17α-OHP可使用市售产品，市售滤纸优选Whatman903^#滤纸。编号A-F的校准品滤纸干血片和C1-C3的质控品干血片加入17α-OHP如表1所示：

根据本发明所述的校准品滤纸干血片，其中校准品基质由脱纤维绵羊全血，使用生理盐水洗涤5-6次后，并采用生理盐水调整红细胞压积至0.55，轻轻混匀制备而成，其中脱纤维绵羊全血选用市售产品。

根据本发明一个优选的实施方案，反应缓冲液为Tris-HCl(50mmol/L)，NaCl(0.9％)，BSA(0.1％)与Danazol(1μg/ml)，pH 7.8。

根据本发明一个优选的实施方案，抗体的稀释比例为1∶50000，稀释液主要组分为0.1％BSA，Tris-HCl(50mmol/L)。

根据本发明一个优选的实施方案，铕标记物使用时为液态，稀释比例为1∶1000，稀释液组分为：Tris-HCl(50mmol/L)、Procline-300(0.05％)与BSA(0.02％)，pH＝7.4。

根据本发明一个优选的实施方案，浓缩洗液25×为Tris-base(7.5％)，NaCl(21％)，Tween-20(1.5％)，pH＝7.8。

本发明的试剂盒采用样本类型为新生儿足跟血滤纸干血片。

利用本发明的试剂盒进行检测，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测范围宽、无放射性污染的特点，非常适用于临床检测。

附图说明

图1为试剂盒的新生儿17α-OHP剂量-反应曲线图(平滑样条曲线)。

图2为本发明的试剂盒同国外新生儿17α-OHP定量测定试剂盒(Ani Labsystems公司)临床血样17α-OHP测值比对的相关性分析。

图3为本发明的试剂盒同国外新生儿17α-OHP定量测定试剂盒(PE公司)临床血样17α-OHP测值比对的相关性分析。

具体实施方式

实施例1试剂盒的组成

1)校准品滤纸干血片，5套，分别编号A-F

2)质控品滤纸干血片，5套，分别编号C1-C3

3)抗体，2瓶，液体，1ml/瓶

4)铕标记物，2瓶，液体，1ml/瓶

5)分析缓冲液，1瓶，200ml

6)浓缩洗液(25×)，1瓶，200ml

7)包被反应板，5块

8)封片，10张

9)说明书，1份

实施例2 试剂盒的使用方法

一、样本收集

对被采血新生儿足跟进行按摩或热敷，并用75％酒精消毒皮肤后，使用一次性采血针刺足跟内或外侧，深度小于3毫米，用干棉球拭去第一滴血，取第二滴血；将滤纸片接触血滴，切勿触及足跟皮肤，使血自然渗透至滤纸背面，至少采集三个血斑；将血片置于清洁空气中，避免阳光直射，自然晾干5-12小时，至颜色呈深褐色，并登记造册；将检查合格的滤纸干血片，置于塑料袋内，保存在2-8℃冰箱中。

注：采血时间为出生72小时后，7天之内，并充分哺乳；对于各种原因(早产儿，低体重儿，提前出院者等)没有采血者，最迟不宜超过出生后20天。

二、试剂盒操作流程

步骤1：

试剂的准备：将所有试剂、血片及样本平衡至室温(指20-25℃范围，下同)。

将所需数量的包被反应板条置室温平衡。

步骤2：

1)试剂的准备

试验前，所有试剂及样品均需平衡至室温(指20-25℃范围，下同)。

(1)洗涤液：将50ml浓缩洗液和1200ml去离子水混合(1∶25稀释)，作为工作洗涤液。

(2)17α-OHP试剂铕标记物：使用前1小时内用分析缓冲液1∶50倍稀释作为工作液。

(3)17α-OHP试剂抗体：使用前1小时内用分析缓冲液1∶50倍稀释作为工作液。

2)用打孔器轧下校准品和待测样本的滤纸干血片(每片直径3.0mm左右)，按顺序放入包被反应板小孔中。

3)每孔加入100μl稀释后的17α-OHP抗体工作液。

4)室温缓慢充分振荡孵育5分钟(不超过10分钟)，以保证溶液充分洗脱至底部。

5)每孔加入100μl稀释后的17α-OHP试剂铕标记物，并加贴封片。

6)室温慢速振荡孵育3小时，或慢速振荡1分钟平置于2-8℃孵育18-22小时。

7)甩去板孔内的血片及液体，拍干，用洗涤液冲洗6次，拍干。

8)每孔加增强液200μl，室温振荡孵育5分钟。

9)测定各孔荧光值。以校准品中17α-OHP的浓度值为横坐标，荧光值(CPS值)为纵坐标绘制17α-OHP的剂量-反应曲线(平滑样条曲线)，参见附图1。根据各待测新生儿滤纸干血片样本的CPS值在相应剂量-反应曲线上拟合出该血片中17α-OHP浓度。

实施例3反应体系的建立与优化

分析缓冲液的组分的优化：在反应其它组分不变的情况下，分别使用pH＝7.4-8.6的Tris-HCl以及Tris-HCl、NaCl、BSA、Amaranth混合液，进行新生儿17α-OHP定量测定，经多次重复实验，最终确定最佳的反应缓冲液为Tris-HCl(50mmol/L)，NaCl(0.9％)，BSA(0.1％)与Danazol(1μg/ml)，pH 7.8。

抗体稀释比例的优化：在反应其它条件不变的情况下，用分析缓冲液对液体状态的抗体和冻干状态的抗体分别进行1∶10000，1∶20000，1∶50000，1∶80000稀释，进行新生儿17α-OHP定量测定，经多次重复及37℃3天、7天稳定性实验表明，液体状态的抗体可以使用且稳定性优于冻干状态的抗体，同时液态无需复溶使用更方便，故最终确定选用液态抗体，其最佳的稀释比例为1∶50000。

铕标记物稀释比例的优化：在反应其它条件不变的情况下，用分析缓冲液对液体状态的铕标记物和冻干状态的铕标记物分别进行1∶600，1∶800，1∶1000，1∶1200稀释，进行新生儿17α-OHP定量测定，经多次重复及37℃3天、7天稳定性实验表明，液体状态的铕标记物可以使用且稳定性优于冻干状态的铕标记物，同时液态无需复溶使用更方便，故最终确定选用液态铕标记物，其最佳的稀释比例为1∶1000。

反应步骤2的温度和时间优化：在反应其它组分和步骤不变的情况下，步骤2分别在常温、37℃反应2小时、3小时、4小时，经多次重复实验，最终表明，步骤2最佳反应程序为常温3小时。

实施例4试剂盒稳定性实验

一、试剂盒准备

使用实施例1的试剂盒。

二、检测方法

将两个试剂盒分别置于4℃和37℃保存3天和7天，比较4℃和37℃试剂盒内校准品荧光值判断试剂盒的稳定性。

三、检测结果

计算校准品荧光值降低的百分率，检测结果见表2。

表2试剂盒的稳定性实验

结论：新生儿17α-OHP试剂盒稳定性较佳，37℃保存7天校准品荧光值仍在同样保存在4℃荧光值的91.3％(仅下降了8.7％)，表明该试剂盒在4℃条件下稳定储存12个月。

实施例5试剂盒的实验室性能

对实施例1的试剂盒进行实验室性能分析，结果如下：

1)最低检测量

0.75ng/ml。

2)准确性

试剂盒校准品与企业标准品同时进行平行双孔分析测定，以企业标准品为对照品，试剂盒校准品的17α-OHP的实测浓度与其标示浓度的比值均在0.8～1.2范围内。

3)剂量-反应曲线的线性

用平滑样条函数数学模型拟合，新生儿17α-OHP在校准品滤纸干血片B(1.5ng/ml)至校准品滤纸干血片F(100ng/ml)之间的浓度范围内，剂量-反应曲线相关系数(r)为0.9993。

4)精密度(CV％)

分析内精密度为5.6％(n＝10)；分析间精密度为8.1％(n＝10)。

5)特异性

17-α羟孕烯醇酮交叉反应率不超过2.0％，11-脱氧皮质醇交叉反应率不超过1.82％，与雌二醇、雌三醇的交叉反应率均小于0.09％。

实施例6试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比较

外购Ani Labsystems公司的新生儿17α-OHP测定试剂盒(Neonatal 17-OH ProgesteroneFEIA，货号：6199870，Grade 903)和PE公司的新生儿17α-OHP测定试剂盒(

Neonatal17α-OHprogesterone kit，货号：A015-110)。收集238例样本(其中正常样本数为233例，阳性样本数为5例)，每例样本采集滤纸干血片至少三份。利用实施例1中的考核试剂盒和分别与Ani Labsystems公司和PE公司对照试剂盒进行同时检测，检测结果参见附图2、图3。以自制考核试剂测定样本的新生儿17α-OHP浓度结果为纵坐标，以Ani Labsystems公司和PE公司对照试剂盒测定样本的新生儿17α-OHP浓度结果为横坐标进行相关性分析，回归方程分别为：①Ani Labsystems公司：Y＝1.0033X+0.0546，相关系数R²＝0.9552；②PE公司：Y＝0.9717X+0.2708，相关系数R²＝0.9550，结果表明，本发明试剂盒同国外同类试剂盒测值具有显著相关性。

Claims (8)

1.一种时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17α-羟孕酮(1-α-hydoxy progesterone，17α-OHP，)的试剂盒，试剂盒包括：分别装有分析缓冲液、抗体、铕标记物、浓缩洗液、增强液等多个试剂瓶，96孔包被反应板、校准品滤纸干血片、质控品滤纸干血片，和分隔并集中包装这些试剂瓶、板、片的包装盒。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于分析缓冲液由Tris-HCl(50mmol/L)，NaCl(0.9％)，BSA(0.1％)与Danazol(1μg/ml)，pH 7.8组成。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于抗体为兔抗-17α-OHP，为液态，分析缓冲液的主要组分为Tris-HCl(50mmol/L)，NaCl(0.9％)，BSA(0.1％)与Danazol(1μg/ml)，pH 7.8。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于铕标记物由17α-OHP-BSA-Eu组成，为液态，稀释比例为1∶1000，稀释液组分为：Tris-HCl(50mmol/L)、Procline-300(0.05％)与BSA(0.02％)，pH＝7.4。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于浓缩洗液25×为Tris-base(7.5％)，NaCl(21％)，Tween-20(1.5％)，pH＝7.8。

6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于校准品滤纸干血片制备方法为：脱纤维绵羊全血，使用无菌生理盐水洗涤5-6次后调整红细胞压积至0.55，加入17α-OHP原料，配制不同浓度的校准品，60μl/滴滴到Whatman903^#滤纸上，滤纸平放室温自然晾干，2-8℃保存，各点校准品浓度如下：

7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于质控品滤纸干血片制备方法为：脱纤维绵羊全血，使用无菌生理盐水洗涤5-6次后调整红细胞压积至0.55，加入17α-OHP原料，配制不同浓度的质控品，60μl/滴滴到Whatman903#滤纸上，滤纸平放室温自然晾干，2-8℃保存，各点质控品浓度如下：

8.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于采用样本类型为新生儿足跟血滤纸干血片。

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