CN103884844A - 测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒 - Google Patents

测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒，属于含量测定的化学方法技术领域。本方法以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品或标准品中的SSa竞争结合一定量的抗SSa的单抗；用稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物。发光增强系统采用以β-二酮体为主的增强液。采用间接竞争法测定柴胡药材等样品中SSa的含量。方法学考察：该方法的灵敏度(检测限)为0.006ug/ml；检测范围为0.01～5ug/ml；批内CV平均值为7.3％；批间CV为9.08％；平均回收率为115.07％；标准曲线相关系数为0.9981。本发明建立的SSa的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒灵敏度高，检测范围宽，稳定性好，无毒性，尤其应用于大样本的检测时快速、高效，有良好开发使用价值。

Description

测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒
技术领域
本发明属于含量测定的化学方法技术领域，具体涉及一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒。
背景技术
柴胡为常用中药，其来源为伞形科植物柴胡(习称“北柴胡”)Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡(习称“南柴胡”)B.scorzonerifolium Willd.的干燥根。其主要成分为柴胡皂苷、挥发油。柴胡皂苷为三萜皂苷类中药成分，许多研究表明柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节内分泌及免疫系统等作用。其中柴胡皂苷a、d含量最高，在2010年版《中国药典》中已经纳入柴胡质量标准含量测定项。
柴胡皂苷的测定方法有很多，传统方法中大致有利用物理性质如泡沫指数法和皂苷指数法；化学测定法包括比色法、薄层色谱扫描法以及生物测定法-溶血指数法。此外还有分离比色法。现在许多新的技术也相继普遍应用于含量测定，如：HPLC法、高效毛细管电泳法等。且已不局限于某一种技术的单独使用，而是两种或多种技术的配合使用。近些年，也有利用单克隆抗体技术制备出抗柴胡皂苷a单克隆抗体，建立测定ssa的含量酶联免疫吸附法。
相比较于酶联免疫吸附法的酶标记物不稳定性，荧光衰变周期短。TRFIA法用稀土元素离子Eu3+作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。我国有丰富的稀土元素资源，本方法稳定性好的同时又合理利用了稀土元素资源。
发明内容
本发明克服现有技术的样品预处理繁、进行大样本测量分析时耗时长、需要使用大量有毒、昂贵的有机试剂、操作复杂、检测范围窄等上述缺陷，提出了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，采用时间分辨荧光免疫分析技术，建立柴胡皂苷a的定量分析方法。本发明方法具有操作简便、时间短、灵敏度高、稳定性好等优点，尤其有利于大样本或低浓度样品的检测。
本发明提出了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品中的柴胡皂苷a(SSa)竞争结合一定量的抗柴胡皂苷a的单抗；用稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物；发光增强系统采用以β-二酮体为主的增强液；采用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，从而测定样品中的柴胡皂苷a含量。其中，所述样品包括待测样品或标准品。
本发明测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，包括如下步骤：
(1)以4ug/ml兔抗鼠IgG100ul/孔包被96孔酶标板，4℃反应过夜；
(2)常温振荡1h，洗涤液清洗3次后，280ul/孔封闭液常温封闭1h，清洗4次，拍干；
(3)取柴胡皂苷a标准对照品(中国药品生物制品检定所)，配制成溶剂为10％甲醇水的标准品，每孔加入25ul标准品，浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml，2000ng/ml、5000ng/ml、，每个浓度3孔。再加入以稀释缓冲液1∶4000倍稀释的抗柴胡皂苷a皂苷单克隆抗体溶液和1∶800倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，于常温下振荡反应1h；
(4)反应结束后，清洗6次，拍干，加入增强液(由南方医科大学抗体技术研究中心提供；成分：冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、Triton X-100、TOPO、β-NTA、纯化水)200ul，振荡5min后，用荧光免疫分析仪Victor1420测定其荧光信号。
(5)根据荧光值，建立标准曲线。
以柴胡皂苷a的标准品建立TRFIA的标准曲线。
以上步骤(3)中以同样方法配制待测样品，经检测，在步骤(5)中测得待测样品中的柴胡皂苷a含量。
SSa-HSA复合物的制备：在1ml10mg/mlNaIO4溶液中，加入0.5ml溶解SSa5.0mg的甲醇溶液，室温避光搅拌反应1h。将反应混合物加至1ml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)中，用1mol/L的Na2CO3溶液调节至pH9左右，搅拌12h，对水透析5次。
铕标记抗原结合物的制备：将合成的SSa-HSA复合物用标记缓冲液来纯化、浓缩，再比例加入Eu-DTTA(抗原∶Eu-DTTA＝2∶1)，充分混匀后放入室温孵育16-20小时后，缓慢加入纯化柱内，然后换成洗脱缓冲液对样品进行洗脱，待蛋白检测仪显示出现蛋白峰时，开始收集样品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1％。分装，部分于-20℃保存，部分于4℃备用。
其中，所述增强液(成分：冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、Triton X-100、TOPO、β-NTA、纯化水)。较佳地，增强液是以β-二酮体为主的增强液。
其中，所述方法以稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物，并用增强-解离系统扩大荧光信号。
其中，所述方法的检测灵敏度为0.006ug/ml。
其中，所述方法的含量检测范围为10-5000ng/ml。
其中，所述方法的批内CV平均值为7.3％；批间CV为9.08％；平均回收率为115.07％；标准曲线线性回归相关系数为0.9981。
本发明还提供了一种试剂盒，利用本发明中建立的时间分辨荧光免疫分析方法，进行相关样品中柴胡皂苷a含量测定。试剂盒包括：酶标包被板，标准品，抗柴胡皂苷a单克隆抗体，铕标记复合物，洗涤液，稀释液，增强液。本发明试剂盒中，所述标准品的浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml，2000ng/ml、5000ng/ml，加样量25ul/孔；测定前，以稀释液将抗柴胡皂苷a单克隆抗体4000倍和铕标记复合物800倍稀释，按先后顺序加入100ul/孔；增强液的加液量为200ul/孔。
本发明区别于现有技术的改进包括：用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，并用增强-解离系统扩大荧光信号，利用单克隆抗体技术制造出抗柴胡皂苷a单克隆抗体，使用免疫荧光分析方法应用于中药成分的含量测定。本发明中采用现有技术来制备抗柴胡皂苷a单克隆抗体以及制备柴胡皂苷a与人血清白蛋白复合物。
区别于现有技术，本发明分析法包括了解离增强步骤和荧光检测环节。
本发明分析法中包括的解离增强步骤：现有技术中的解离增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕(Eu)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。但由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此，在本发明方法中采用解离-增强步骤，通过加入一种增强剂，使Eu从复合物上解离下来，解离下来的自由Eu同增强剂中的另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。
本发明分析方法中包括的荧光检测环节：普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。而本发明中的荧光检测环节，镧系元素的荧光光谱有较大的Stokes位移，最大可达290nm，激发光谱和发射光谱间不会相互重叠，加上其发射的光谱信号峰很窄，荧光寿命长，铕的荧光寿命可达730us，检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高本发明方法的检测精密度。TRFIA的测量仪器是时间分辨荧光计，由三大部分组成：光源：脉冲光源：氙灯(每秒闪烁1000次)；小型N2激光器；输出脉冲波长：337nm荧光信号获取系统。
本发明方法中，以三价铕离子为示踪物，标记结合SSa-HSA复合物，结合抗柴胡皂苷a单克隆抗体后，经过解离-增强步骤，测定荧光值。TRFIA法用稀土元素离子Eu3+作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。至目前为止，尚未见有文献报道利用时间分辨荧光免疫分析方法来测定柴胡皂苷a含量的先例。
本发明具有较高的灵敏度和较宽的检测范围：图1表示使用单克隆抗体的柴胡皂苷a含量测定的TRFIA标准曲线，本发明方法测定柴胡皂苷a含量的灵敏度为0.006ug/ml，在确保线性良好又有较好的检测结果的情况下，确定本方法的含量检测范围为10-5000ng/ml.现有文献高效液相色谱法的柴胡皂苷a的检测下限为较低的8ug左右。本发明方法的灵敏度是高效液相色谱法的近2000倍。显然本方法更为敏感，且检测范围更宽。
本发明具有同样的准确性：Shu-hang ZHU等为了比较高效液相色谱法和酶联免疫吸附法得到的结果之间的相关性，已对柴胡皂苷a药材的提取方法进行探讨、研究与改善。其研究证明在提取过程中轻度碱处理后，两检测系统的柴胡皂苷a皂苷的浓度相关性r＝0.999。本发明方法研究者结合了《中国药典》同样采用含5％氨水甲醇溶液进行提取，建立时间分辨荧光免疫分析法测定各个柴胡样品的柴胡皂苷a的含量。图2表示，同样提取方法下，比较ELISA法和TRFIA法的含量测定结果的相关性，r2＝0.9901。表明，本发明建立的TRFIA分析法与HPLC法、ELISA法有同样的准确性。
本发明有益效果包括：(1)零背景、高特异性：利用斓系元素极长的荧光衰退时间这一特点，激发后以固定时间检测荧光，在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减消失，从而通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。利用斓系元素发射光与激发光波长间巨大的Strokes位移这一荧光重要特征。(2)灵敏度高：解离一增强使荧光性大大提高近百万倍，此步骤加入一种增强剂，使Eu从复合物上解离下来，自由Eu同增强剂中的另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。(3)高稳定性、高精确度：低分子量原子标记，不影响被标记物的空间立体结构，保证其稳定性。且衰变寿命较长、受环境影响小。标记粒子的鳌合物稳定性强，产生的荧光强度高，又使其灵敏度高、重复性更好、线性范围更宽。时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定稳定可达一年以上。例如在具体实施中，本发明方法的灵敏度为0.004ug/ml，设定其检测范围为5～400ng/ml，批内CV平均值为7.98％，批间CV为7.76％。平均回收率为107.7％，相关系数为0.992。
本发明分析法(TRFIA法)与HPLC法比较，其取样量少，前处理简单，并可在同一块板上同时测定40多个样品。样品的提取时用少量甲醇，测定过程不需有机溶剂，毒性小，对人体的健康和环境影响小，节省人力、物力。本发明分析法与ELISA法相比，用稀土元素离子Eu3+作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。传统的柴胡皂苷a的含量检测方法包括薄层扫描色谱法、高效液相色谱法等。高效液相色谱法要求的样品预处理繁琐，精度要求高，进行大样本测量分析时耗时长，需要使用大量有毒、昂贵的有机试剂。相对于传统的测定方法，本发明方法利用单克隆抗体技术和荧光免疫分析技术，简化样品前处理操作，减少有机试剂的使用，降低对环境和人体健康的的危害；大大提高测定方法的灵敏度；同时可进行多个样本的测定。
本发明提供了柴胡皂苷a单克隆抗体的制备及使用该单抗建立起的用于柴胡皂苷a检测的间接竞争TRFIA方法。相对于传统的测定方法，本发明TRFIA利用单克隆抗体技术和荧光免疫分析技术，简化样品前处理操作，减少有机试剂的使用，降低对环境和人体健康的的危害；大大提高测定方法的灵敏度；同时可进行多个样本的测定。TRFIA多用于临床生化指标和病原微生物的检测，目前，尚未见其在中药成分含量测定上的应用。本发明中，用三价稀土离子及其鳌合物作为示踪物代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质标记蛋白质、多肽，激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞；当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应，靶细胞和效应细胞的杀伤反应，核酸探针杂交反应等发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物的荧光强度根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。相较于酶联免疫吸附法的酶标记物不稳定性，荧光衰变周期短。本发明分析法(TRFIA法)用稀土元素离子Eu3+作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。本发明方法的灵敏度高，检测范围宽，稳定性好，无毒性，尤其利于大样本的检测时快速、高效，极为良好的广泛应用价值。此外，我国有丰富稀土元素资源，本发明方法具有稳定性好的同时又合理利用了稀土元素资源。至今尚未见有文献报道本发明方法用于中药材成分测定领域。在中药材成分测定领域的应用中，本发明方法可成为一种行之有效的新方法。
附图说明
图1表示本发明分析法测定柴胡皂苷a的标准曲线。
图2表示本发明分析法和ELISA法测定柴胡中柴胡皂苷a含量的相关性。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实验仪器和试剂：96孔酶标反应板(丹麦Nunc)；半自动VICTORTM1420荧光检测仪(PerkinElmer产品)；柴胡皂苷a(SSa)标准品(中国药品生物制品检定所)；人血清白蛋白(HSA)(美国Sigma公司)；兔抗鼠IgG(Rockland公司)；铕离子标记HAS-SSa复合物；小鼠抗SSa单克隆抗体(自制)；增强液，洗涤液由南方医科大学抗体技术研究中心提供；柴胡药材样品来自各药店；其它试剂：蒸馏水，甲醇等为国产分析纯。
本发明提出的测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，是以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品或标准品中的柴胡皂苷a竞争结合一定量的抗柴胡皂苷a的单抗；用稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物，采用以β-二酮体为主的增强液作为发光增强系统，利用间接竞争TRFIA法测定柴胡药材中柴胡皂苷a的含量。
本发明测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，方法建立的基本步骤：
(1)以4ug/ml兔抗鼠IgG100ul/孔包被96孔酶标板，4℃反应过夜；
(2)常温振荡1h，洗涤液清洗3次后，280ul/孔封闭液常温封闭1h，清洗4次，拍干；
(3)取柴胡皂苷a标准对照品，配制成溶剂为10％甲醇水的标准品，每孔加入25ul标准品，浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml，2000ng/ml、5000ng/ml、，每个浓度3孔。再加入以稀释缓冲液1∶4000倍稀释的抗柴胡皂苷a皂苷单克隆抗体溶液和1∶800倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，于常温下振荡反应1h；
其中，稀释缓冲液成分包括：Tris-base、DTPA、NaCl、Tween-20、BSA、ProClin300、Bovine gamma globulin、PHloxine B。抗柴胡皂苷a皂苷单克隆抗体溶液是以稀释液稀释后的抗柴胡皂苷a单克隆抗体溶液。标记抗原复合物是以3价铕离子标记的已合成的柴胡皂苷a和人血清白蛋白复合物。
(4)反应结束后，清洗6次，拍干，加入增强液(成分：冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、TritonX-100、TOPO、β-NTA、纯化水)200ul，振荡5min后，用荧光免疫分析仪Victor1420测定其荧光信号。
(5)根据荧光值，建立标准曲线。
以柴胡皂苷a的标准品建立TRFIA的标准曲线，见图1。
在上述步骤(2)中，在每孔加入25ul待测样品，其他步骤及条件相同，则测得待测样品的荧光值。
SSa-HSA复合物的制备：
在1ml10mg/mlNaIO4溶液中，加入0.5ml溶解SSa3.2mg的甲醇溶液，室温避光搅拌反应1h。将反应混合物加至0.5ml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)中，用1mol/L的Na2CO3溶液调节至pH9左右，搅拌12h，对水透析5次。
铕标记抗原结合物的制备：
将合成的SSa-HSA复合物用标记缓冲液来纯化、浓缩，再比例加入Eu-DTTA(抗原∶Eu-DTTA＝2∶1)，充分混匀后放入室温孵育16-20小时后，缓慢加入纯化柱内，然后换成洗脱缓冲液对样品进行洗脱，待蛋白检测仪显示出现蛋白峰时，开始收集样品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1％。分装，部分于-20℃保存，部分于4℃备用。
对于间接竞争法标记免疫分析，log-logit数学模型的计算方法相对简单，且大多数情况下可以得到较好相关性，因此是评价这类试剂盒的首选数学模型。方程式：logit Y＝A+B*log X，式中：logit Y＝B/B0/(1-B/B0)，同时，曲线最高浓度点和最低浓度点之间，使曲线在规定的剂量范围内有足够的落差，即结合率(B/B0％)为25％(或20％)所对应的剂量浓度点应小于曲线最高剂量点，结合率为75％或(80％)所对应的剂量浓度点应大于曲线最低剂量点。本发明分析方法中，以柴胡皂苷a的标准品建立TRFIA的标准曲线利用间接竞争法测定样品中的柴胡皂苷a的荧光值，经log-logit函数处理得标准曲线见图1。间接竞争法测定柴胡皂苷a的荧光值，经log-logit函数处理得标准曲线见图1。logitY＝ln[Y/(1-Y)]，Y＝B/B0，B0为零浓度点的的荧光值。在测量范围5-400ng/ml间相关系数R2＝0.992，实验结果表明标准曲线量很高。
实施例1测定市售柴胡药材中SSa含量。
样品前处理：将采买的柴胡药材粉碎，过四号筛，精密称取20mg，加入含5％浓氨试液的甲醇溶液0，5ml，超声处理10分钟，10000r/min离心5min，取上清液，重复5次，合并上清液待溶剂挥干，用甲醇将提取物溶解转移至5ml容量瓶定容，取其1ml加水定容至10ml，供试品溶液即得，备用。
实验方法：测定时，取出包被好的酶反应板，每孔加入25ul标准品/样本，复孔加样。再加入以稀释缓冲液1∶4000稀释的抗柴胡皂苷单克隆抗体溶液和1∶800稀释的标记抗原复合物于常温下振荡反应1h；反应结束后，清洗6次，加入增强液200ul，振荡5min后，用Victor1420测定其荧光信号，取得样品浓度。实验结果见表3。
表3TRFIA法测定柴胡样品中的柴胡皂苷a的含量
Figure BDA0000486932270000071
Figure BDA0000486932270000081
实施例2测定市售中成药中SSa含量。
样品前处理：取市售各中成药样品若干，研碎，常温至恒重，各精密称取1.000g，加入含5％浓氨试液的甲醇溶液0，5ml，超声处理10分钟，转速10000r/min离心5min，取上清液，重复5次，合并上清液待溶剂挥干，用甲醇将提取物溶解转移至5ml容量瓶定容，取其1ml加水定容至10ml，供试品溶液即得，备用。
实验方法：测定时，取出包被好的酶反应板，每孔加入25ul标准品/样本，复孔加样。再加入以稀释缓冲液1∶4000稀释的抗柴胡皂苷单克隆抗体溶液和1∶800稀释的标记抗原复合物于常温下振荡反应1h；反应结束后，清洗6次，加入增强液200ul，振荡5min后，用Victor1420测定其荧光信号，取得样品浓度。实验结果见表4。
表4TRFIA测定含柴胡皂苷a药材的市售中成药中SSa的含量
Figure BDA0000486932270000082
实施例3测定大鼠血液中SSa含量。
实验动物及给药：SD大鼠6只，雌雄各半，体重(200±20)g。实验前禁食12小时，每只大鼠以2.5mg/kg的剂量尾静脉注射SSa。分别在给药后10min，20min，50min，以眼眶静脉丛取血0.4ml，离心并分离血浆。
样品处理方法：精密吸取血浆样品100ul，按血清∶甲醇＝1∶2，加入200ul甲醇，涡旋3min，于10℃12000r/min离心10min，吸取一定量上清液，用蒸馏水和甲醇将溶液中甲醇浓度调至10％，备用待测。
实验方法：测定时，取出包被好的酶反应板，每孔加入25ul标准品/样本，复孔加样。再加入以稀释缓冲液1∶4000稀释的抗柴胡皂苷单克隆抗体溶液和1∶800稀释的标记抗原复合物于常温下振荡反应1h；反应结束后，清洗6次，加入增强液200ul，振荡5min后，用Victor1420测定其荧光信号，取得样品浓度。实验结果见表5。
表5TRFIA测定大鼠血液中SSa的含量(ng/ml)
Figure BDA0000486932270000091
实施例4考察本发明分析方法的灵敏度
测定20个零浓度点的荧光值，以
Figure BDA0000486932270000093
的荧光值在曲线上计算出相应的浓度，即为该方法的分析灵敏度。过程：标准品每个浓度加复孔，然后加入20个孔零浓度的标准品，将测得的20个荧光值的平均值减去标准差所得数据代入标准曲线所得浓度值为4ng/ml，则本方法的测定灵敏度为0.006ug/ml。
经计算，本发明方法测定柴胡皂苷a含量的灵敏度为0.006ug/ml，表明本方法很大程度的降低了柴胡皂苷a含量的检测下限，提高了检测灵敏度，在检测浓度较低样本时，本方法更适用。
实施例5考察本发明分析方法的精密度
分别配制三个浓度(20、200、2000ng/ml)的标准品。按照实施例1中所述步骤测定测定结果，计算变异系数。批间精密度6.33％～7.85％，平均值为7.3％＜10％；批间精密度7.31％～11.4％，平均值为9.08％＜10％。测定结果见表1。一般批间精密度高于批内精密度。显然新方法的两者变异系数均不超出一般范围。
表1TRFIA法测定柴胡皂苷a浓度的精密度
Figure BDA0000486932270000092
实施例6考察本发明分析方法的回收率
回收率试验按照以上所述步骤操作，测定结果的回收率平均值为115.07％＜20％。测定结果见表2。
表2TRFIA法测定柴胡中柴胡皂苷a含量的回收率
实施例7本发明建立的间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)与传统酶联免疫吸附法(ELISA)的比较
Zhu等比较了酶联免疫吸附法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)测定药材中柴胡皂苷a结果之间的相关性。其研究证明在待测药材样品制备过程中经轻度碱处理后，两检测系统所得柴胡皂苷浓度的相关性r＝0.999。本发明发明人按照《中国药典》方法，采用含5％氨水甲醇溶液进行药材待测样品的提取制备，用建立的时间分辨荧光免疫分析法，测定各个柴胡样品的SSa含量；并将本分析方法与传统ELISA方法取得的结果进行比较。结果见表6和图2。结果显示，本发明建立的TRFIA法与HPLC法、ELISA法有同样的准确性。
表6TRFIA和ELISA两种方法测定柴胡皂苷a药材中SSa含量的比较
Figure BDA0000486932270000102
实施例8测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析的试剂盒
以实例1来说明本方法的组成，使用和结果测定：
(1)加标准品：首先，在第一条反应板(12孔)加标准品，浓度分别为0ng/ml(A)、10ng/ml(B)、50ng/ml(C)、250ng/ml(D)、2000ng/ml(E)，5000ng/ml(F)，每个浓度3孔，每个浓度做复孔加样(如AABB--FF)每孔加入25ul；
(2)加待测样品：将经过前处理的样品，制备成与标准品溶剂同样为10％的甲醇溶液后，把样品溶液以每个样品做复孔加样，25ul/孔加入酶表板反应孔内。(实例1有4个样品，每个样品做了3个平行试验，所以，待测样品使用2条板，剩下的5条可以4℃保存近期使用，若长期不用放-20℃较宜)；(3)在加过标准品/待测样品的反应孔内，分别加入以稀释缓冲液4000倍稀释的抗柴胡皂苷a皂苷单克隆抗体溶液和800倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，于常温下振荡反应1h；
(4)配液：用蒸馏水将洗涤液按稀释倍数做相应稀释后，备用。
(5)洗涤：反应结束后，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔300-350ul洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复6次，拍干，(有自动洗板机者，清洗6次，拍干)。加入增强液200ul，不贴封膜。
(6)振荡5min后，用时间分辨荧光免疫分析仪测定其荧光信号。
(7)根据测定荧光数据，以标准品建立的标准曲线，用三次样条平滑拟合或log-logit拟合方式直接打印测定样品浓度值。
操作注意：1.加样时将标准品/样品加于酶标板孔底部，所有实验操作均应规范、认真，以确保得出准确的实验结果；2.保证增强液不被污染，加液时应悬空加入；保持枪头干净，不接触孔壁，不沾染其他液体或脏污；增强液受到污染，将造成荧光值偏差很大，直接导致检测结果不准确。
按本发明TRFIA法制成的上述试剂盒，与HPLC法比较，其取样量少，前处理简单，并可在同一块板上同时测定40多个样品。样品的提取时用少量甲醇，测定过程不需有机溶剂，毒性小，对人体的健康和环境影响小，节省人力、物力。

Claims (7)

1.一种测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析法，其特征在于，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品中的柴胡皂苷a竞争结合抗柴胡皂苷a的单抗，用稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物，以增强液作为发光增强系统，利用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，测定所述样品中的柴胡皂苷a含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以兔抗鼠IgG包被96孔酶标板，4℃反应过夜；
(2)常温振荡，洗涤液清洗，常温封闭，清洗，拍干；
(3)配制柴胡皂苷a标准品或待测样品，溶剂为20％甲醇水，每孔加入标准品或待测样品，浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml，2000ng/ml、5000ng/ml；再加入以稀释缓冲液1∶4000倍稀释的抗柴胡皂苷a皂苷单克隆抗体溶液和1∶800倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，常温下振荡反应；
(4)清洗，拍干，加入增强液，振荡后，用荧光免疫分析仪Victor1420测定其荧光信号；
(5)测得标准品的荧光值，建立标准曲线；测得待测样品的荧光值即得为样品的柴胡皂苷a含量。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法以稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物，并用增强-解离系统扩大荧光信号。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的检测灵敏度为0.006ug/ml。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的含量检测范围为10-5000ng/ml。
6.一种试剂盒，用于测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于，包括：酶标包被板，标准品，抗柴胡皂苷a单克隆抗体，铕标记复合物，洗涤液，稀释液，增强液。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品的浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml，2000ng/ml、5000ng/ml，加样量25ul/孔；测定前，以稀释液将抗柴胡皂苷a单克隆抗体4000倍和铕标记复合物800倍稀释，按先后顺序加入100ul/孔；增强液的加液量为200ul/孔。
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