CN100494988C

CN100494988C - 层析试条扫描检测方法及其扫描检测仪

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Publication number: CN100494988C
Application number: CNB2007100375534A
Authority: CN
Inventors: 吴冯波; 吴俊清; 许海峰; 刘永章; 胡永刚; 罗记平
Original assignee: SHANGHAI XINBO BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Suzhou Sym Bio Lifescience Co Ltd
Current assignee: Vanadis Diagnostics AB
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2027-02-14
Also published as: CN101034062A

Abstract

本发明涉及一种层析试条的检测方法及其检测装置，主要解决现有生物样品分离分析方法存在的检测灵敏度低、测量范围窄的技术问题。一种层析试条扫描检测方法，包括以下步骤：以长寿命荧光物质为标记，扫描检测仪产生的激发光逐点扫描做固定间距进给运动的层析试条的测试区，测试区内有含有生物物质的样本；在每个测试点，层析试条扫描检测仪以平行或接近平行于测试区条带的线状激发光激发，通过时间分辨荧光检测的方式检测层析试条测试点的荧光强度；将层析试条的测试区域扫描完成后，得到的测试数值为一密集的测试点的序列测试值，根据测试值序列绘制其拟合曲线；计算测试值曲线波峰的面积确定荧光信号的强度。检测仪由光学系统、层析试条驱动系统、信号检测和控制系统构成，本发明特别适用于生物样品的分离分析。

Description

层析试条扫描检测方法及其扫描检测仪

技术领域：本发明涉及一种层析试条的检测方法及其检测装置，特别涉及一种应用时间分辨荧光检测原理的层析试条扫描检测方法及其扫描检测仪，用于提高信号检测的准确性。

背景技术：层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同，在两相中的分配(含量对比)不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力较弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可检测出层析后各组份的浓度或质量，从而可以作定性及定量分析。层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。

由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，层析法已成为生物化学及分子生物学常用的分析手段；作为一种独具特点的层析检测方法，免疫层析法或核酸杂交层析法对待测物的分离与检测依赖于抗体-抗原间或寡核苷酸之间特异的结合反应，目前已广泛应用于多种不同类型待测物的检测，如毒品、过敏原、残留农药、肿瘤标志物、心脏标志物和微生物病原体核酸的检测。

免疫层析法或核酸杂交层析法是一种可实现快速检测的层析分析方式，往往以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使溶液在层析条上泳动，样品中的待测物与层析材料上针对待测物的反应物质(如抗体、抗原或寡核苷酸探针)发生特异的结合反应，形成的复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过肉眼观察或仪器检测对样本中的待测物进行定性或定量检测。

胶体金、硒或呈色乳胶微粒是层析分析的常用标记物质，此类标记物多用于定性层析检测。然而，临床检测往往需要准确测定样本中的待测物浓度，如：用于心肌梗塞诊断的CTn-I(心肌肌钙蛋白I)、用于心脏功能评估的BNP(B型钠尿肽)，等。福州大学杜民、杨富文等分析了影响金标记免疫层析定量的各种因素(如生化噪声、光噪声、电噪声等)，利用光电检测系统将纳米金免疫层析试条的色谱信号转换为光谱信号，实现了金标记免疫层析的定量检测[杜民，杨富文；基于光电检测与信息处理技术的纳米金免疫层析试条定量测试的研究，福州大学博士学位论文，2005/05]，但由于该方法检测的是纳米金产生的色谱信号，不但分析灵敏度较低，而且测量范围一般小于二个数量级，而临床上有意义的待测物浓度范围往往在二个数量级以上，因此，对于高浓度样本，使用该定量分析体系需要稀释样本，这不仅会增加操作步骤，还可能引入实验误差。

检测灵敏度低、测量范围窄是以纳米金等物质为标记的定量/半定量层析分析难以避免的弊端。以荧光物质(如荧光纳米微粒)为标记，通过检测荧光信号尤其是稀土离子螯合物的长寿命荧光信号，将大大改善层析分析的灵敏度和测量范围，建立综合性能更优越的快速、定量Point of Care(现场测试)检测体系。

以稀土离子螯合物长寿命荧光为检测信号，建立快速、定量Point of Care检测体系，要求准确测定测试区的荧光信号。一般情况下，固定在层析膜上的捕获探针(抗体、抗原或寡核苷酸)往往呈条带状，且其宽度仅为1-4mm；由于扩散现象，条带中心与边沿的捕获探针浓度存在差异，因此，采用荧光定位检测方式，要求检测设备的激发光精确地定位在层析膜捕获探针条带上的某一特定位置，否则便难以得到能表征待测物浓度的荧光信号。这对检测设备的定位系统和层析试条的制作工艺都提出了极高的要求，是研制定量层析分析方法的一个主要障碍。

发明内容：本发明的目的是提供一种扫描检测方法及其扫描检测仪以精确地检测层析试条上测试区的荧光信号，无需对层析试条测试区作准确定位，可消除本底荧光的影响，从而获得更好的定量检测结果。

本发明的技术方案为：一种层析试条扫描检测方法，包括以下步骤：

a、以长寿命荧光物质为标记，扫描检测仪产生的激发光逐点扫描做固定间距进给运动的层析试条的测试区，测试区内有含有生物物质的样本；

b、在每个测试点，层析试条扫描检测仪以平行或接近平行于测试区条带的线状激发光激发，通过时间分辨荧光检测的方式检测层析试条测试点的荧光强度；

c、将层析试条的测试区域扫描完成后，得到的测试数值为一密集的测试点的序列测试值，根据测试值序列绘制其拟合曲线；计算测试值曲线波峰的面积确定荧光信号的强度。

所述的长寿命荧光物质指稀土离子螯合物或包含有稀土离子螯合物的高分子荧光纳米微粒。所述的样本包括全血、血清或血浆、尿液或其他体液，或经稀释的上述样品。所述的样本中生物物质指可通过层析方式检测的大分子蛋白质、小分子半抗原、核酸或寡核苷酸。

一种扫描检测仪，由光学系统、层析试条驱动系统、信号检测和控制系统构成，光学系统、层析试条驱动系统分别连接信号检测和控制系统，并由信号检测和控制系统中单片机MCU控制，光学系统包括氙灯光源、紫外透镜组、紫外滤光片、分束器、透镜组、滤光片、光电倍增管、紫外透镜和紫外光电管，分束器设置系统中部，在分束器右方由内向外设有紫外透镜组和氙灯光源，在紫外透镜组的透镜间设置有紫外滤光片，在分束器的左方由内向外设有紫外透镜和紫外光电管，在分束器上方由内向外设有透镜组和光电倍增管，在透镜组的透镜间设置有滤光片。层析试条驱动系统包括功率放大器、高精度步进电机、X位移和光电开关，四个元器件依次串接，功率放大器和光电开关还连接单片机MCU，MCU分别连接RAM、EPROM、键盘、LCD、PRINTER及电源，通电后光源产生的激发光扫描样品，通过依次串接光电倍增管PMT、前置放大器、信号放大及甄别器、A/D转换电路将检测到信号输入单片机MCU，不扫描样品的激发光信号则通过串接的光电二极管PT、信号放大及甄别器输入单片机MCU。

本发明的有益效果是：

1)基于时间分辨荧光检测原理，可降低本底干扰荧光对测试的影响；

2)可避免激发位置偏差对检测结果的影响，大大降低层析试条研制/生产对材料和组装工艺的要求，为实现准确的定量层析分析提供了前提；

3)层析试条上未固定捕获探针的空白部分在扫描检测过程中被多次激发、检测，其平均荧光强度更真实地反映了层析试条的本底荧光信号；扣除该本底荧光信号后，各测试区条带的荧光强度能更准确地表征待测物质的浓度；

4)该方法涉及的层析试条扫描检测仪可自动调节激发光强度，保证每次检测时激发光强度的一致性，而无需任何校正措施。

附图说明：

图1是验证荧光扫描检测方式准确性的AFP(甲肽蛋白)层析试条结构示意图，其结构与常规金标层析试条相似，主要区别在于使用的标记物是¹²⁵I和荧光纳米微粒双重标记的抗AFP单克隆抗体；层析试条由吸收垫、包被有抗AFP单克隆抗体(捕获探针)的NC(硝酸纤维素)膜、标记物垫、样品垫组成，按序组装后固定于检测卡外壳中。

图中：1—吸收垫，2—测试区，3—NC膜，4—标记物垫，5—样品垫。

图2为本发明扫描检测仪的光学系统原理图。

图中：1—氙灯光源，2—紫外透镜组，3—紫外滤光片，4—分束器，5—测试样品，6—透镜组，7—滤光片，8—光电倍增管，9—紫外透镜，10—紫外光电管。

图3为本发明扫描检测仪的结构框图。

图4为层析试条的典型扫描检测曲线图。X轴为测试点序列，各测试点间距为0.1mm，Y轴为测试荧光值，A、B、C、D、E、F曲线分别对应实施实例中AFP中A-F六个浓度标准品的测试曲线。

图5为层析试条检测AFP中A-F六个浓度的标准品，以扫描检测获得的荧光信号与放射性强度的相关性示意图；由扫描检测获得的荧光信号对放射性强度作图，以origin-6.0软件评估荧光信号对放射性强度之间的相关性，相关性以相关系数r表示。

具体实施方式：

下述实例描述了本发明的一个特殊例子，用以说明本发明的应用效果，该实例不代表本发明的所有可能性，本发明不局限于该实例所涉及的待测物质类型、所用材料或其它条件参数，因为任何具备本领域相关经验的人都可以使用类似本发明的方法研制和生产层析检测试条，这些修改并不脱离本发明所涵盖的范围。

1.时间分辨荧光检测原理

时间分辨荧光检测大多采用稀土离子螯合物为荧光生成物质。根据自旋对称性匹配的要求，有机分子吸收光能后，电子跃迁发生在自旋相同的电子振动能级之间；另外，电子跃迁还要满足轨道对称性匹配的要求。分子吸收光能后电子被激发到与激发光光能相应的单重激发态，高能级的单重激发态寿命很短(10-10～10-6s)，一般很快地以非辐射方式迁移到低能级单重激发态，然后以辐射方式降至基态并发出一个荧光光子。由于分子势能面的交叉，也可引发电子在单重激发态与三重激发态之间的跃迁(系统间能量传递)；当此分子作为配体与某一稀土离子络合，而且稀土离子的振动激发态能级低于配体激发三重态能级时，能量便可通过一分子内能量传递过程传递给稀土离子，使稀土离子激发并发出稀土离子的特征荧光。

基于上述机理，稀土离子螯合物被激发后产生的荧光有很长的寿命(如：100-5000μs)，因此可使用时间分辨方式，待短寿命的杂质荧光(一般小于100ns)消退后，特异地收集稀土离子螯合物的长寿命荧光。除了在荧光寿命上的特点外，稀土离子螯合物荧光还具有很宽的Stoke’s位移，通过波长分辨可使其进一步区别于背景荧光；稀土离子螯合物狭窄的荧光发射峰使其荧光检测具有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性；因此，以稀土离子螯合物为标记物的时间分辨荧光检测为生物分析提供了一高灵敏的测试方法。

2.实施方式

1)层析试条扫描检测仪主要由光学系统、层析试剂条驱动系统、信号检测与控制系统组成，分述如下：

A.光学系统

如图2所示：光学系统包括氙灯光源1、紫外透镜组2、紫外滤光片3、分束器4、透镜组6、滤光片7、光电倍增管8、紫外透镜9和紫外光电管10，分束器4设置系统中部，在分束器4右方由内向外设有紫外透镜组2和氙灯光源1，在紫外透镜组2的透镜间设置有紫外滤光片3，在分束器4的左方由内向外设有紫外透镜9和紫外光电管10，在分束器4上方由内向外设有透镜组6和光电倍增管8，在透镜组的透镜间设置有滤光片7。工作过程为采用能量强、脉宽窄的氙灯为光源，经滤光后获得紫外光，分束器4将紫外光分为两束：一束经紫外透镜组2聚焦到测试样品5层析试条上，作为荧光激发光。另一束经紫外透镜组2聚焦到光电管中，作为处理荧光数据的参考信号。被检测物质在紫外光激发下产生荧光，向上部发射的荧光经分束器4、透镜组6和滤光片7聚焦到光电倍增管8的靶面上，光电倍增管8将光信号转变成电信号。

B.层析试剂条驱动系统

层析试条在高精度步进电机驱动下，做一维运动，使层析试条作固定间距的进给运动，并进行逐点荧光扫描测定。

扫描检测时，固定进给间距应足够小，以保证扫描所获测试值拟合曲线波峰无明显变形和信息缺失。

C.信号检测与控制系统

系统原理图如图3所示，其工作过程是：由电源点亮脉冲氙灯，作为激发光源；层析试条的某一位置在一个脉冲激发过后，产生的荧光通过滤光片进入光电倍增管，将光变成电信号，经滤波、放大后变成一个时间函数信号；紫外光电管接收参考信号，以对激发光强和激发时间予以反馈控制；以触发信号为起始时间T₀，根据层析试条上稀土离子螯合物荧光的寿命，选择合适延滞时间T_τ和时间窗T_τ-T₂。待T₀-T_τ的干扰信号消失，信号采集器收集T_τ-T₂时间内的信号，再通过500-1000次的重复累积积分，信号信噪比得以极大的提高。以Eu³⁺螯合物荧光检测为例，测定条件为：延滞时间：100-400μs；时间窗，200-400μs；单循环时间，500-1000μs。

2)层析试条扫描检测与定点测试的对比

A)¹²⁵I-抗AFP单克隆抗体致敏有机高分子荧光纳米微粒(EDC法)

搅拌下将5ml表面带-COOH的有机高分子荧光纳米微粒(含Eu³⁺螯合物，Seradyn，Inc.，95nm)对0.1M pH6.2的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)缓冲液透析24小时，取出置于洁净的玻璃小瓶中；加入水溶性EDC(碳二亚胺，Sigma)12mg，搅拌溶解，室温反应10min；加入¹²⁵I标记的抗AFP单克隆抗体1mg(北京原子高科，比放射性强度：1886μBq/μg)，搅拌均匀，4℃反应10min；将混合物上2×50cm sephadex G200柱，以50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.8，含0.9％NaCl)洗涤，收集第一个荧光纳米微粒标记的抗体峰。

B)制备标记物涂膜与抗体包被硝纤膜：

取连接有¹²⁵I-抗AFP单克隆抗体标记的荧光纳米微粒，与稀释液混匀，配制成工作浓度(～20000μBq/mL)；将溶液加入Biodot喷涂机的Airjet喷头储存瓶中；设定压力为16PSI，聚酯膜的移动速度为50mm/s；每条喷2遍；真空干燥箱中于37℃烘干12h，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，4℃保存。

硝纤膜(NC膜)组件的制备：NC膜活化处理，水洗，干燥；将抗AFP单克隆抗体MH2A以0.1M磷酸盐缓冲液稀释至1.5mg/ml；将抗AFP单克隆抗体MH2A喷涂于测试区(T带)，干燥前以2B铅笔标明测试区的确切位置与宽度(约1.5-2.5mm)；完成包被后，置37℃干燥箱24h；用含1％BSA、0.5％酪蛋白、1％表面活性剂的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)封闭处理30min；用洗液抽洗一次；37℃干燥箱干燥备用。

C)组装：参照图1

在湿度小于30％的室温条件下将包被有抗AFP测试区2的NC膜3粘于支撑片基的不干胶上；将含荧光纳米微粒的聚酯膜、玻纤膜、滤纸按要求重叠组装于NC膜上，使聚酯膜即标记物垫4的下端与NC膜3上端重叠2mm，玻纤膜即样品垫5的下端与聚酯膜的荧光纳米微粒吸附区重叠3mm，吸水滤纸即吸收垫1置于NC膜3的另一端，与NC膜重叠3mm，压紧；将组装的层析试条卡入检测卡外壳内。

NC膜、聚酯膜、玻纤膜、滤纸由Milipore、S & S公司提供。

D)AFP标准品的配制与标定

以50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5，含0.9％NaCl，5％BSA，0.05NaN₃)将婴儿脐带血清(含高浓度AFP)稀释成六个不同AFP浓度的标准品(A、B、C、D、E、F)；以Wallac公司AFP TRIFMA(时间分辨免疫荧光分析)试剂盒测定其浓度，六个AFP标准品浓度分别为0、5.5、23.0、70.3、150.8、389.2ng/mL。

E)免疫层析

平放层析条，在六条层析试条样品区分别滴入50μl已知AFP浓度的校准品A、B、C、D、E、F；静置层析15min。

F)二种荧光检测方式的准确性对比

由于示踪AFP抗体同时标记有¹²⁵I和荧光纳米微粒，故层析试条T带抗体所捕获的AFP量可同时以放射性强度和荧光强度表示，且放射性强度与荧光强度的比例应具有一致性；由于放射性强度的检测不受方向性影响、无须激发、仪器性能稳定，检测结果可靠，荧光检测的准确性可通过对比放射性强度与荧光强度的方式进行验证。

荧光扫描检测：将层析试条固定于检测底架上，以扫描方式检测上述六种不同AFP标准品层析试条T带的荧光强度值。荧光扫描检测参数：步进马达驱动速度：0.1mm/S，测试间距0.1mm；延迟400μS，收集400～800μS荧光，单循环时间为1000μs，1000个循环/秒；单一T带获得的多点荧光强度通过计算机处理，以峰值测试点为中心的15个测试点内的峰面积表征T带的荧光强度(Fs)。

荧光定位检测：手工调节检测底架位置，使激发光定位于层析试条T带的中心位置；关好仓门，激发并记录荧光强度值(F_1/2)；以同样方式，在离边沿1/4条带宽度位置激发并记录荧光强度值(F_1/4)。荧光定位检测参数：单循环时间为1000μs，延迟400μS，1000个循环/秒，收集400～800μS荧光。

¹²⁵I放射性强度的检测：层析试条经荧光扫描检测和荧光定位检测后，以小刀切取层析试条的T带，置于试管底部；以FJ-2008P型γ放免计数仪测定并纪录¹²⁵I的放射性强度(R)，测量时间1min。实验结果如下：

单位注释：CPM——counts per minute(每分钟计数值)

CPS——counts per second，(每秒钟计数值)

CPSS——counts per standard segment，(单位片断计数值)

上述数据及图4、图5表明：以高分子荧光纳米微粒为标记，采用扫描方式检测T带的荧光强度，荧光强度与放射性强度具有高度一致性(相关系数r＝0.998)；而定位检测方式得到的荧光强度却与放射性强度偏离较大。同荧光定位检测相比，荧光扫描检测可避免T带上不同位置荧光分布的差异性和激发光定位的准确性对荧光强度的影响，显著改善荧光信号检测的准确性。基于该结果，扫描检测将为定量免疫层析试条的研制提供一灵敏、准确的荧光检测方式。另外，由于扫描检测无需对T带的位置作严格的定位，荧光扫描检测还将降低定量层析试条的研制和生产对工艺的要求，提高检测的精密性。

Claims

1、一种层析试条扫描检测方法，包括以下步骤：

d、以长寿命荧光物质为标记，扫描检测仪产生的激发光逐点扫描做固定间距进给运动的层析试条的测试区，测试区内有含有生物物质的样本；

e、在每个测试点，层析试条扫描检测仪以平行或接近平行于测试区条带的线状激发光激发，通过时间分辨荧光检测的方式检测层析试条测试点的荧光强度；

f、将层析试条的测试区域扫描完成后，得到的测试数值为一密集的测试点的序列测试值，根据测试值序列绘制其拟合曲线；计算测试值曲线波峰的面积确定荧光信号的强度。

2、根据权利要求1所述的一种层析试条扫描检测方法，其特征是，所述的长寿命荧光物质指稀土离子螯合物或包含有稀土离子螯合物的高分子荧光纳米微粒。

3、根据权利要求1所述的一种层析试条扫描检测方法，其特征是，所述的样本包括全血、血清或血浆、尿液或其他体液，或经稀释的上述样品。

4、根据权利要求1所述的一种层析试条扫描检测方法，其特征是，所述的样本中生物物质指可通过层析方式检测的大分子蛋白质、小分子半抗原、核酸或寡核苷酸中的一种。

5、用于进行权利要求1所述的一种层析试条扫描检测方法的扫描检测仪，其特征是由光学系统、层析试条驱动系统、信号检测和控制系统构成，光学系统、层析试条驱动系统分别连接信号检测和控制系统，并由信号检测和控制系统中单片机MCU控制，层析试条驱动系统包括功率放大器、高精度步进电机、X位移和光电开关，四个元器件依次串接，功率放大器和光电开关还连接单片机MCU，MCU分别连接RAM、EPROM、键盘、LCD、PRINTER及电源，通电后光源产生的激发光扫描样品，通过依次串接光电倍增管PMT、前置放大器、信号放大及甄别器、A/D转换电路将检测到信号输入单片机MCU，不扫描样品的激发光信号则通过串接的光电二极管PT、信号放大及甄别器输入单片机MCU。

6、根据权利要求5所述的扫描检测仪，其特征是光学系统包括氙灯光源、紫外透镜组、紫外滤光片、分束器、透镜组、滤光片、光电倍增管、紫外透镜和紫外光电管，分束器设置系统中部，在分束器右方由内向外设有紫外透镜组和氙灯光源，在紫外透镜组的透镜间设置有紫外滤光片，在分束器的左方由内向外设有紫外透镜和紫外光电管，在分束器上方由内向外设有透镜组和光电倍增管，在透镜组的透镜间设置有滤光片。