CN111334282B - Pth稀土检测试剂盒及检测卡及其微球及制备与检测方法 - Google Patents

Pth稀土检测试剂盒及检测卡及其微球及制备与检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PTH稀土检测试剂盒及检测卡及其微球及制备与检测方法。其中，稀土纳米荧光微球为核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为40nm～60nm，其组成为：NaGdxLu1‑y‑xF4:yNd@NaYF4，其中，NaGdxLu1‑xF4为基质，掺杂离子为Nd3+；冒号“:”表示为钕掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，y的范围为1％～10％；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaGdxLu1‑y‑xF4:yNd表面。本发明的荧光微球为稀土氟化物近红外二区发光纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于术中快速判断。

Description

PTH稀土检测试剂盒及检测卡及其微球及制备与检测方法
技术领域
本发明涉及PTH检测试剂盒及检测卡及其微球及制备与检测方法。
背景技术
甲状腺癌是全球范围内发病率上升最快的实体恶性肿瘤。目前，手术是甲状腺癌的首选治疗方式，甲状旁腺损伤是主要的手术损伤。甲状旁腺损伤导致的术后甲状旁腺功能低下仍然是困扰甲状腺外科医师的难题。
通常甲状旁腺不易与脂肪滴、淋巴结、异位甲状腺及异位胸腺相区别。甲状旁腺分泌甲状旁腺激素（parathyroid hormone related peptide，简称PTH），且PTH仅在甲状旁腺内被特异性表达，其他组织均不能表达PTH，因此通过术中对待检组织液进行PTH检测，可提高医生在临床中快速识别甲状旁腺的效能与效率。
现有技术中测定PTH的检测方法主要是电化学发光法和免疫荧光法，电化学发光法灵敏度高，检测结果准确，但是需要特定的大型仪器，样本大多数为血液样本，且测试时间长不利于术中快速判断。
免疫荧光法是将PTH抗体共价结合于荧光微球表面活性基团上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断结果，快速便捷可准确定量同时具有高灵敏度、标记物稳定等优点，在医学免疫检测领域广泛应用。然而在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，而常用的荧光标记物光谱范围大多在可见光区（400~750nm），使用可见区的荧光标记物会产生较强的背景荧光，干扰检测信号，降低检测的灵敏度。
因此开发一种具有检测范围宽、灵敏度高、快速测定组织洗脱液中PTH、检测准确度高且适合术中使用的试剂盒及方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的问题，提供一种检测范围宽、灵敏度高、快速的PTH检测试剂盒及检测卡及其微球及制备与检测方法。
实现本发明目的的技术方案分成六个方面：
本发明的第一个技术方案是：稀土纳米荧光微球，为核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为40nm~60nm，其组成为：
NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4，其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为Nd3+；冒号“:”表示为钕掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20%～90%，y的范围为1%~10%；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaGdxLu1-y-xF4:yNd表面。
进一步的，所述稀土纳米荧光微球在基态下稳定，在800~1000 nm的激发光源作用下发射出波长范围在1000~1100 nm的荧光。
本发明的第二个技术方案是制备稀土纳米荧光微球的方法，包括以下步骤：
步骤一：合成钕掺杂氟化钆镥：在容器中，加入油酸、1-十八烯、钆的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、钕的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、镥的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备稀土纳米荧光微球：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3~4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4稀土纳米荧光微球；
步骤三：活化稀土纳米荧光微球：对步骤二的稀土纳米荧光微球进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10~100mM，pH为5.0~7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0~7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米荧光微球。
本发明的第三个技术方案是PTH检测卡，包括：
底衬；作为所述PTH检测卡的基底；
包被膜；设置于所述底衬上表面的中部；
样品垫；搭接设置于所述包被膜的上表面的一端；
吸水纸；搭接设置于所述包被膜的上表面的另一端；
其中，所述样品垫靠近包被膜的一端喷涂有微球线，所述微球线为由前述的稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体；所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线靠近所述样品垫；所述检测线包被有PTH单克隆抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
进一步的，所述样品垫上喷涂的稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体的含量为50~200µg抗体/200µl荧光微球。
更近一步的，所述检测线中PTH单克隆抗体包被浓度为0.1~2mg/ml、用量为0.5~1.5µl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5~2mg/ml、用量为0.5~1.5µl包被液量/cm膜。
本发明的第四个技术方案是PTH检测卡的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据前述的步骤制备得到活化稀土纳米荧光微球；
步骤二：制备稀土纳米荧光微球标记PTH单克隆抗体：对步骤一的活化稀土纳米荧光微球按照50~200µg/200µl加入PTH单克隆抗体，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备样品垫：在样品垫上用稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体喷涂一条线，烘干；
步骤四：制备包被膜：分别用PTH单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤五：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述PTH检测卡。
进一步的，所述步骤三中，用微球解离液将稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体稀释8~30倍，用量为2~4µl液量/cm样品垫；所述微球解离液为含0.5%BSA、25%蔗糖的20mMTris-Hcl缓冲液。
本发明的第五个技术方案是PTH检测试剂盒，包括：
PTH检测卡；采用上述的PTH检测卡；
含有定标曲线的ID卡；由PTH检测卡测定不同梯度浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
本发明的第六个技术方案PTH检测试剂盒定量检测PTH的方法，包括以下步骤：
步骤一：制备样本：以组织洗脱液作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将组织洗脱液加入到PTH检测卡加样孔中；
步骤四：将PTH检测卡插入干式荧光免疫分析仪的检测槽；
步骤五：干式荧光免疫分析仪进行分析，读取/打印检测结果，其中≥25pg/ml提示该组织为甲状旁腺，＜25pg/ml提示该组织非甲状旁腺。
本发明的原理在于：试剂盒的检测原理是双抗体夹心法，检测人组织洗脱液中PTH的含量。含PTH的组织洗脱液样滴加在样本加样区，通过毛细作用层析至样品垫，与稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体结合，形成微球抗体-抗原复合物，免疫复合物自毛细管作用向上流动与测试区抗PTH抗体反应，经特定波长激发光源激发后在反应区产生荧光信号，信号的强弱与样本中PTH的含量成正比，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线羊抗鼠结合。用光源（808nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线上稀土纳米荧光微球发出荧光（1064nm），在此荧光范围内生物体自发荧光较弱。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1~10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
采用了上述技术方案后，本发明具有积极的效果：（1）本发明的荧光微球为稀土氟化物近红外二区发光纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽（10-1000pg/mL）、灵敏度高（检出限10pg/mL）、准确度高、检测快速简便等特点，可用于术中快速判断。
（2）近红外荧光材料的发射波长范围在650~1000nm，在这个范围内，生物体自发荧光较弱，因此使用近红外发光的材料来标记抗体会使得荧光试纸条背景荧光低，检测信噪比高，提高检测灵敏度的特点。稀土掺杂纳米材料具有稳定的物理化学性质，窄带发射，长寿命等优点，从而排除激发光干扰，可通过时间分辨延迟检测消除本底荧光干扰，在生物标记过程中不容易受环境影响。稀土发光材料尤其是稀土氟化物具有较低的声子能量，且物理化学性能稳定，适合于稀土发光材料的基质材料，它能减少激活离子激发态的无辐射驰豫从而提高激活离子的发光效率。因此采用稀土氟化物近红外二区发光纳米粒子作为标记物，发光寿命长，发射波长为808nm，可降低试纸条背景荧光同时结合时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和准确性，具有检测范围宽（10-1000pg/mL）、灵敏度高（检出限10pg/mL）、准确度高、检测快速简便等特点，可用于术中快速判断。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明的PTH检测卡的结构示意图。
图2为本发明的定标曲线。
图3为采用本发明的试剂盒进行检测与罗氏电化学发光法检测甲状旁腺素结果相关性比较图。
附图中标号为：底衬1、样品垫2、微球线21、包被膜3、检测线31、质控线32、吸水纸4。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
（实施例1）
稀土纳米荧光微球，为核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为40nm~60nm，其组成为：
NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4，其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为Nd3+；冒号“:”表示为钕掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20%～90%，优选为40%；y的范围为1%~10%，优选为5%；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaGdxLu1-y-xF4:yNd表面。
进一步的，所述稀土纳米荧光微球在基态下稳定，在800~1000 nm的激发光源作用下发射出波长范围在1000~1100 nm的荧光。
（实施例2）
制备稀土纳米荧光微球的方法，包括以下步骤：
步骤一：合成钕掺杂氟化钆镥：在容器中，加入体积比为3~6：7~14 的油酸和1-十八烯，再按摩尔比例，加入x份钆的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，y份钕的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，1-x-y份的镥的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20%～70%， y的范围为0~30%；在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至100~120oC，反应20~30分钟，再升温至150~160 oC，反应10~15分钟，得到透明溶液；自然冷却至40~50oC，释放真空，加入摩尔浓度比为1~2 ：1.6~3.4的NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，反应20~30 min；升温至90~100oC，抽气换气3~4次，通入氮气，升温至280~300oC，反应1~2小时，离心处理，随后用环己烷乙醇混合液洗涤3~4次，分散于环己烷中，得到NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备稀土纳米荧光微球：在容器中，加入体积比为3~6 ：7~14油酸和1-十八烯，加入醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120oC，反应20分钟，再升温至160oC，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50oC，释放真空，加入NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，以及与油酸体积比为3~6：2~4的 NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应20~30 min；升温至90~100oC，抽气换气3~4次，通入氮气，升温至280~290oC，反应1~2小时， rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3~4次，分散于环己烷中；所述醋酸钇、NaOH、氟化铵物质的量之比为0.2~0.4：0.5~1 ：0.8~1.6；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4稀土纳米荧光微球；
步骤三：活化稀土纳米荧光微球：对步骤二的稀土纳米荧光微球进行1~2min的超声波处理和离心处理（12000~14000rpm高速），对沉淀物用10~100mM，pH为5.0~7.0的MES溶液洗涤，超声波处理2~3min；加入20~100mg/ml碳二亚胺，混匀5~10min，再加入20~100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10~20min后12000~14000rpm高速离心5~15min，对沉淀物用pH为5.0~7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米荧光微球。
（实施例3）
如图1所示，PTH检测卡，包括：
底衬1；作为所述PTH检测卡的基底；
包被膜3；设置于所述底衬1上表面的中部；
样品垫2；搭接设置于所述包被膜3的上表面的一端；
吸水纸4；搭接设置于所述包被膜3的上表面的另一端；
其中，所述样品垫2靠近包被膜3的一端喷涂有微球线21，所述微球线21为实施例1的稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体；所述包被膜3上依次设置有检测线31和质控线32，所述检测线31靠近所述样品垫2，检测线31和质控线32相互平行，间隔距离为3~5mm；所述检测线31包被有PTH单克隆抗体，质控线32包被有羊抗鼠IgG抗体。
进一步的，所述样品垫2上喷涂的稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体的含量为50~200µg抗体/200µl荧光微球。
更近一步的，所述检测线31中PTH单克隆抗体包被浓度为0.1~2mg/ml、用量为0.5~1.5µl包被液量/cm膜，所述质控线32中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5~2mg/ml、用量为0.5~1.5µl包被液量/cm膜。
制作完成后，将其固定在与检测卡尺寸匹配的塑料底卡上，检测卡表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫2和包被膜3的部分分别预留加样孔和观察窗。
（实施例4）
PTH检测卡的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据实施例2的步骤制备得到活化稀土纳米荧光微球；
步骤二：制备稀土纳米荧光微球标记PTH单克隆抗体：对步骤一的活化稀土纳米荧光微球超声波处理1~2min后按照50~200µg/200µl加入PTH单克隆抗体，混匀1~3小时，用含0.5%BSA的10~50mM、pH7.5~8.5 Tris-HCl封闭液封闭0.5~1小时后12000~14000rpm高速离心5~15min，用含1% NaCl、0.5%BSA、0.1% Tween-20的10~50mM、pH7.5~8.5 Tris-HCl保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备样品垫：用样品垫处理液在远离包被膜的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2~4µl液量/cm样品垫，在样品垫靠近包被膜一侧将稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体用微球解离液稀释8~30倍均匀喷涂一条线，用量为2~4µl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述样品垫处理液为含0.5%NaCl、0.5%S17、0.1%BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl；所述微球解离液为含0.5%BSA、25%蔗糖的20mM Tris-Hcl缓冲液；
步骤四：制备包被膜：分别用PTH单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
分别用包被缓冲液将PTH单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体调整浓度到0.5~2mg/ml，用量为0.5~1.5µl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔3~7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
步骤五：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述PTH检测卡。
（实施例5）
PTH检测试剂盒，包括：
PTH检测卡；采用上述的PTH检测卡；
含有定标曲线的ID卡；由PTH检测卡测定不同梯度浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。
（实施例6）
PTH检测试剂盒定量检测PTH的方法，包括以下步骤：
步骤一：制备样本：以组织洗脱液作为检测样本；样本采集：针取法制备组织洗脱液，用预充了1ml生理盐水的注射器，留少量刺入疑似组织内，注射后吸取少量组织洗脱液混匀，重复针吸2-3次，即得组织洗脱液作为检测样本；
步骤二：将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用；开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：使用合适量程的移液器吸取80μl组织洗脱液，加入到PTH检测卡加样孔中，吸取及加样时注意不要产生明显气泡；
步骤四：将PTH检测卡插入干式荧光免疫分析仪的检测槽；需严格控制加样后到检测的时间15min；
步骤五：干式荧光免疫分析仪进行分析，读取/打印检测结果，其中≥25pg/ml提示该组织为甲状旁腺，＜25pg/ml提示该组织非甲状旁腺。
（实施例7）
下面进行具体的实例试验并进行测定。
与实施例3的PTH检测卡结构一致，样品垫1上微球线上使用特定的激发光（808nm）/发射光（1064nm）波长的核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠颗粒（NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4）（直径约60nm）标记PTH单克隆抗体（100µg抗体/200µl荧光微球），检测线包被PTH单克隆抗体（1mg/ml），质控线包被浓度为1mg/ml的羊抗鼠IgG抗体（其中PTH单克隆抗体和单克隆抗体采购自Meridian，羊抗鼠IgG抗体来自长沙博优生物科技有限公司）。微球线用量为4µl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为1µl包被液量/cm膜。
在本实施例中，PTH检测试剂盒的制备包括以下步骤：
（1）钕掺杂氟化钆镥合成：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入4.5 mL油酸和12.5 mL 1-十八烯，再按摩尔比例，加入1.6 mmol 醋酸钆，1.6 mmol 醋酸镥和0.02 mmol 醋酸钕，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120oC，反应20分钟，再升温至160oC，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50oC，释放真空，加入1 mmol NaOH和1.6 mmol氟化铵甲醇混合溶液，反应30 min；升温至100oC，抽气换气3次，通入氮气，升温至300oC，反应1.5小时，6000 rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中。
（2）核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠纳米微球的制备：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入3 mL油酸和7 mL1-十八烯，加入0.4 mmol醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120oC，反应20分钟，再升温至160oC，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50oC，释放真空，加入1 mmol NaOH和1.6 mmol氟化铵甲醇混合溶液，4 mL NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应30 min；升温至100oC，抽气换气3次，通入氮气，升温至290oC，反应1小时，6000 rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4稀土纳米荧光探针。NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针中x摩尔百分数优选为40%，y优选为5%。所述材料尺寸约为60 nm，且形貌均一，发光性能好。纳米探针激发波长为808 nm，发射波长为1064 nm。
（3）稀土纳米荧光微球的活化：
超声波处理荧光微球2min后，取200µl荧光微球以14000rpm高速离心15min后，沉淀物用100mM，pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入50µl的100mg/ml碳二亚胺，混匀5min，再加入100µl的100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀15min后14000rpm高速离心15min，沉淀用pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml。
（4）稀土纳米荧光微球标记PTH单克隆抗体的制备：
在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照100µg/200µl加入PTH单克隆抗体，混匀2小时，用含0.5%BSA的50mM、pH8.0 Tris-HCl封闭液封闭1小时后14000rpm高速离心15min，用含1%（w/w） Nacl、0.5%（w/w）BSA、0.1%（w/w） Tween-20的50mM、pH8.0的Tris-HCl保存液中缓冲液洗涤两次并超声处理重悬至200µl于4℃避光保存。
（5）样品垫的制备：
用样品垫处理液（含0.5%NaCl、0.5%S17、0.1%BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl）在靠近样品垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为4µl液量/cm样品垫，在样品垫靠近包被膜一侧将稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体用微球稀释液（含0.5%（w/w）BSA、25%（w/w）蔗糖的20mM Tris-Hcl缓冲液）稀释20倍均匀喷涂一条线，用量为4µl液量/cm样品垫。置于烘箱中，37℃烘干过夜。
（6）包被膜的制备：
分别用包被缓冲液（含2.5%（w/w）蔗糖的20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液）将PTH单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体调整浓度到1mg/ml，用量为1µl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔4mm，在湿度<30%，温度37℃烘箱中晾干10小时，封袋，备用；
（7）检测卡组装：
在底衬（尺寸为80*300mm）上顺次相互搭接地粘贴样品垫（尺寸为30*300mm，玻璃纤维棉材质）、包被膜（尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质）和吸水纸（尺寸为28*300mm）得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的试纸条。
本发明PTH检测卡在使用时由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳设有两个开孔，分别为加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫2，塑料下壳上设置有固定检测试纸条的卡口，结果观察窗对应于检测线31和质控线32，该PTH检测卡可以从该塑料外壳中取出。
PTH检测试剂盒中，每盒均含有标准曲线的ID卡（同批次标准曲线相同），通过稀土纳米荧光试纸条测定不同浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入ID卡并生成二维码，通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。
下面详细介绍标准曲线的绘制
制备好的PTH检测卡加入不同浓度PTH抗原质控品（1100pg/mL、900pg/mL、600pg/mL、300pg/mL、150pg/mL、50pg/mL、5pg/mL共七个浓度，每个浓度设三个重复，均由0.5mg/mlPTH单克隆抗体用0.85%生理盐水稀释得到），加入0.85%生理盐水，层析15min后，通过激发光（808nm）/发射光（1064nm）的时间分辨免疫定量分析仪读取C、T线荧光信号及C/T值，实验结果及分析见表1：
Figure SMS_1
以PTH质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制标准曲线，曲线数据见表1，标准曲线如图2所示。其中R值为0.9989，通过该标线对样品中所含微量PTH浓度进行浓度定量测定。
下面对PTH检测卡进行性能测试：
最低检出限：用零值样本进行重复测定20次，计算20次结果的均值M与标准差SD，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限（M+2SD），结果为4.58 pg/mL，符合灵敏度5pg/mL。
线性范围：取5~1100pg/mL之间七个浓度值，每个浓度重复测量三次，将测定浓度平均值于理论浓度进行线性分析，得到线性方程y = 1.0027x -0.4559，r=0.9996，表明本发明试剂盒在10~1000pg/mL线性范围内相关性很好。
精密度：取三批实施例1中所制近红外稀土纳米荧光定量检测PTH试剂盒，分别检测600、150pg/mL重复性质控品，每批试剂盒用重复性质控品平行检测10次，150pg/mL浓度三批批内CV分别为5.71%、5.86%、9.06%，三批批间CV为7.25%，600pg/mL浓度三批批内CV分别为7.03%、4.73%、6.70%，三批批间CV为6.18%，均在10%以内。
准确度:选择浓度为5pg/mL的质控物为检测样本，分为体积相同3份，在其中2份样本中分别加入900pg/mL和150pg/mL的准确度质控品，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶液，制成基础样本。对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算。计算回收率=（分析样品浓度-基础样品浓度）/加入浓度×100%。回收样本900pg/mL的回收率为98.78%，150pg/mL的回收率为100.90%，平均回收率为98.11%。偏差在10%以内。
为了验证，还进行了临床样本检测：
医院采集100例患者选取颈部不同组织（甲状旁腺组织、肌肉组织、脂肪组织、淋巴结组织、甲状腺组织）取样，制作组织洗脱液，分别检测PTH，用本发明的试剂盒和罗氏电化学发光法检测PTH试剂盒两种方法进行检测比较。本发明试剂盒中，取80µl加入到检测卡加样孔中，层析15min后通过激发光（808nm）/发射光（1064nm）的时间分辨免疫定量分析仪读取浓度，同一样本采用对比系统罗氏电化学发光法检测PTH试剂盒进行浓度检测。两种方法检测结果进行线性分析，如图3所示，其相关性很好r=0.9801，P>0.05，结果符合临床分析要求，适合用于临床检测。
不同组织洗脱液检测结果见表2：
Figure SMS_2
根据表中数据表明，PTH在甲状旁腺中含量与其他组织中含量有显著差别，因此在术中进行识别甲状旁腺特异性高。
可见，本发明的试剂盒利用近红外稀土纳米荧光免疫层析技术的灵敏性，结合干式免疫荧光分析仪，实现了高灵敏度、可准确定量、简便快捷的定量检测PTH。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.稀土纳米荧光微球，其特征在于：为核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为40nm～60nm，其组成为：
NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4，其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为Nd3+；冒号“:”表示为钕掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，y的范围为1％～10％；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaGdxLu1-y-xF4:yNd表面；所述稀土纳米荧光微球在基态下稳定，在800～1000nm的激发光源作用下发射出波长范围在1000～1100nm的荧光；
所述稀土纳米荧光微球的制备方法包括以下步骤：
步骤一：合成钕掺杂氟化钆镥：在容器中，加入油酸、1-十八烯、钆的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、钕的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、镥的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaGdxLu1-y- xF4:yNd纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备稀土纳米荧光微球：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4稀土纳米荧光微球；
步骤三：活化稀土纳米荧光微球：对步骤二的稀土纳米荧光微球进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米荧光微球。
2.PTH稀土检测卡，其特征在于包括：
底衬；作为所述PTH稀土检测卡的基底；
包被膜；设置于所述底衬上表面的中部；
样品垫；搭接设置于所述包被膜的上表面的一端；
吸水纸；搭接设置于所述包被膜的上表面的另一端；
其中，所述样品垫靠近包被膜的一端喷涂有微球线，所述微球线为由权利要求1所述的稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体；所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线靠近所述样品垫；所述检测线包被有PTH单克隆抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
3.根据权利要求2所述的PTH稀土检测卡，其特征在于：所述样品垫上喷涂的稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
4.根据权利要求3所述的PTH稀土检测卡，其特征在于：所述检测线中PTH单克隆抗体包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
5.制备权利要求4所述的PTH稀土检测卡的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：根据权利要求1所述的步骤制备得到活化稀土纳米荧光微球；
步骤二：制备稀土纳米荧光微球标记PTH单克隆抗体：对步骤一的活化稀土纳米荧光微球按照50～200μg/200μl加入PTH单克隆抗体，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备样品垫：在样品垫上用稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体喷涂一条线，烘干；
步骤四：制备包被膜：分别用PTH单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤五：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述PTH稀土检测卡。
6.根据权利要求5所述的PTH稀土检测卡的制备方法，其特征在于：
所述步骤三中，用微球解离液将稀土纳米荧光微球标记的PTH单克隆抗体稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球解离液为含0.5％BSA、25％蔗糖的20mMTris-Hcl缓冲液。
7.PTH稀土检测试剂盒，其特征在于包括：
PTH稀土检测卡；所述PTH稀土检测卡的结构如权利要求4所述；
含有定标曲线的ID卡；由权利要求4所述的PTH稀土检测卡测定不同梯度浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
8.根据权利要求7所述的PTH稀土检测试剂盒定量检测PTH的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：制备样本：以组织洗脱液作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将组织洗脱液加入到所述PTH稀土检测卡加样孔中；
步骤四：将所述PTH稀土检测卡插入干式荧光免疫分析仪的检测槽；
步骤五：干式荧光免疫分析仪进行分析，读取/打印检测结果，其中≥25pg/ml提示该组织为甲状旁腺，＜25pg/ml提示该组织非甲状旁腺。
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