CN112175620A - COVID-19 IgG/IgM检测试剂盒、检测卡、稀土纳米探针及制备方法 - Google Patents

COVID-19 IgG/IgM检测试剂盒、检测卡、稀土纳米探针及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了COVID‑19 IgG/IgM检测试剂盒、检测卡、稀土纳米探针及制备方法其中，稀土纳米探针为核壳结构镨掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为40nm～60nm，其组成为：NaGdxLu1‑y‑xF4:yPr@NaYF4，其中，NaGdxLu1‑xF4为基质，掺杂离子为Pr3+；冒号“:”表示为镨掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，y的范围为1％～10％；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaGdxLu1‑y‑xF4:yPr表面。本发明的纳米探针为稀土氟化物纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将探针与新冠重组抗原连接，标记产物稳定，具有灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可对早期新冠疑似患者进行筛查检测，能够快速特异地帮助临床确诊。

Description

COVID-19 IgG/IgM检测试剂盒、检测卡、稀土纳米探针及制备 方法
技术领域
本发明涉及COVID-19 IgG/IgM检测试剂盒及其微球及制备与检测方法。
背景技术
新型冠状病毒基于目前的流行病学调查，潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。感染者以发热、乏力、干咳为主要表现。鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。
新型冠状病毒也称严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒-2，已明确为β属冠状病毒，是感染人类冠状病毒家族中第7个成员，与2003年的SARS冠状病毒一样，由RNA核酸和蛋白等组成，RNA很容易降解，蛋白衣壳将RNA包裹在其中，加上一层由脂质和糖蛋白组成的包膜外衣，从而使其RNA得到保护，病毒RNA编码四种主要结构蛋白，包括刺突糖蛋白(S，SpikeProtein)、小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein)和膜糖蛋白(M，Membrane Protein)，及核衣壳(N)蛋白，其中S蛋白对于病毒识别与入侵有着关键的作用。病毒通过S-蛋白与人ACE2互作的分子机制，来感染人的呼吸道上皮细胞，病毒进入人体后，主要通过激活免疫系统，通过细胞因子、炎症因子等导致肺损伤。并且利用宿主细胞进行复制增殖。因此可以通过采集人的特定部位细胞样本，检测其中是否含有病毒RNA核酸，来确认机体是否受到感染。
核酸检测是目前新型冠状病毒感染确诊的“金标准”，然而病毒核酸检测存在检测时间和周期长、环境要求高、技术力量要求高、硬件设备要求高、价格昂贵等一系列问题，只能在省/市级疾控中心和较大规模的三甲医院开展，不利于肺炎患者的快速诊断和筛查，不利于疫情的防控。
血清学诊断应用中以样本中的IgM测定和IgG测定为常见。新型冠状病毒IgM/IgG抗体检测试剂，主要检测的免疫球蛋白为新型冠状病毒特异性IgG和IgM。在新型冠状病毒感染的初次体液免疫应答中(原发性感染)，特异性IgM抗体首先出现，但存在时间较短，通常为数周到数月。新型冠状病毒特异性IgM抗体阳性常提示早期感染，可用于感染急性期的辅助判断。新型冠状病毒IgG抗体，在免疫接种后、原发性感染及再次感染时都可检出，且较长时间存在。
在感染过程中特异性抗体对抗原亲合力随感染时间的延长而不断升高，检测IgG抗体亲合力，能够较准确地判断感染时间，可作为新型冠状病毒抗体检测的一种补充，高IgG抗体亲合力可辅助排除近期原发性感染。
若能在家庭或者社区，就能便捷、快速、低成本的对新型冠状毒感染患者进行筛查，就能够高效的隔离被感染人群、阻断传播途径，将病毒感染的防控端口前移，能够推进新型冠状病毒感染的有效和及时防控。抗体检测对临床实验室的操作要求相对于核酸检测要低，可以快速、大量检测，且可以在基层实验室完成，可采用IgM和IgG同时检测，两个结果相互补充印证，提高整体准确性并有助于判断病程进展。稀土纳米免疫荧光法是将新型冠状病毒重组抗原共价结合于稀土纳米探针表面活性基团上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断结果，快速便捷可准确定量同时具有高灵敏度、标记物稳定等优点，对早期疑似患者进行筛查检测，能够快速特异地帮助临床确诊。
因此开发一种具有灵敏度高、快速测定血液中COVID-19 IgM/IgG、检测准确度高的试剂盒及方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的问题，提供一种灵敏度高、快速的COVID-19IgM/IgG检测试剂盒及检测卡及其稀土纳米探针制备与检测方法。
实现本发明目的的技术方案分成六个方面：
本发明的第一个技术方案是：稀土纳米探针，为核壳结构镨掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，其组成为：
NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4，其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为Pr3+；冒号“:”表示为镨掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，y的范围为1％～10％；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaGdxLu1-y-xF4:yPr表面。
进一步的，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在365nm的激发光源作用下发射出波长范围在450-700nm的荧光。
所述核壳结构镨掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠的粒径为40nm～60nm。
本发明的第二个技术方案是制备稀土纳米探针的方法，包括以下步骤：
步骤一：合成镨掺杂氟化钆镥：在容器中，加入油酸、1-十八烯、钆的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、镨的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、镥的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaGdxLu1-y-xF4:yPr纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaGdxLu1-y-xF4:yPr纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4稀土纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
本发明的第三个技术方案是COVID-19 IgM/IgG检测卡，包括：
底衬；作为所述COVID-19 IgM/IgG检测卡的基底；
包被膜；设置于所述底衬上表面的中部；
结合垫：搭接设置于所述包被膜的上表面的一端；
样品垫；搭接设置于所述结合垫的上表面的一端；
吸水纸；搭接设置于所述包被膜的上表面的另一端；
其中，所述结合垫喷涂有微球线，所述微球线为由权利要求2所述的稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原；所述包被膜上依次设置有检测线M线、G线和质控线，所述检测线M线靠近所述结合垫；所述检测线包被有抗人IgM抗体和抗人IgG抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
进一步的，所述结合垫上喷涂的稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
更近一步的，所述检测线中抗人IgM抗体和抗人IgG抗体包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
本发明的第四个技术方案是COVID-19 IgM/IgG检测卡的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据本发明的第二个技术方案提供的制备方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记COVID-19重组抗原：对步骤一的活化稀土纳米探针按照50～200μg/200μl加入COVID-19重组抗原，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用COVID-19重组抗原和羊抗鼠IgG抗体作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备结合垫：用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上用稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原喷涂一条线，烘干；
步骤五：制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
步骤六：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述COVID-19 IgM/IgG检测卡。
进一步的，所述步骤三中，用微球稀释液将稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球稀释液为含0.5％BSA、10％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
本发明的第五个技术方案是COVID-19 IgM/IgG检测试剂盒，包括：
COVID-19 IgM/IgG检测卡；采用上述的COVID-19 IgM/IgG检测卡；
含有定标曲线的ID卡；由COVID-19 IgM/IgG检测卡测定不同抗体滴度的校准品，以校准品抗体滴度倒数为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
本发明的第六个技术方案COVID-19 IgM/IgG检测试剂盒定量检测COVID-19IgM/IgG的方法，包括以下步骤：
步骤一：以血清/血浆/全血样本作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将血液样本加入到COVID-19 IgM/IgG检测卡加样孔中；
步骤四：将COVID-19 IgM/IgG检测卡插入干式荧光免疫分析仪的检测槽；
步骤五：干式荧光免疫分析仪进行分析，10min读取/打印检测结果，其中IgM>0.8，IgG>0.7提示新型冠状病毒感染的可能。
本发明的原理在于：本试剂采用荧光免疫层析原理，检测人血清、血浆和全血中的新型冠状病毒IgM和IgG抗体。含新型冠状病毒IgG抗体和/或新型冠状病毒IgM抗体的血液样本稀释液层析至结合垫，与稀土纳米荧光微球标记的新型冠状病毒重组抗原结合形成反应复合物，反应复合物在层析作用下沿着NC膜前移，移至检测线处，分别被检测线包被的抗人IgM和/或IgG抗体捕获，形成最终反应复合物。用光源(365nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上稀土纳米探针发出荧光(610nm)，在此荧光范围内生物体自发荧光较弱。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1～10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
采用了上述技术方案后，本发明具有积极的效果：(1)本发明的纳米探针为稀土氟化物纳米材料，具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将探针与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽(临床样本IgM浓度在本产品IgM最低检出限浓度的750倍时未出现钩状效应；临床样本IgG浓度在本产品IgG最低检出限浓度的1125倍时未出现钩状效应)、灵敏度高(灵敏度参考品IgM和IgG滴度为1:256可检出)、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
(2)稀土掺杂纳米材料具有稳定的物理化学性质，窄带发射，宽Stokes位移，长寿命等优点，从而排除激发光干扰，可通过时间分辨延迟检测消除本底荧光干扰，在生物标记过程中不容易受环境影响。稀土发光材料尤其是稀土氟化物具有较低的声子能量，且物理化学性能稳定，适合于稀土发光材料的基质材料，它能减少激活离子激发态的无辐射驰豫从而提高激活离子的发光效率。因此采用稀土氟化物纳米粒子作为标记物，发光寿命长，激发波长为365nm，发射波长为610nm，Stokes位移大，可避免激发光源的干扰，同时结合时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和准确性，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
(3)本发明利用稀土氟化物作为基质，通过不同稀土离子的掺杂，合成了高性能的镨掺杂氟化镥钠纳米探针，镥的掺杂以及掺杂比例进一步降低基质的声子能，提高能量转化的效率，而镨的掺杂可以利用镨在610nm左右的发光，方便了其检测，故而制备出了光化学性质稳定强、发光寿命长的稀土纳米探针。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明的COVID-19 IgM/IgG检测卡的结构示意图。
图2为NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4稀土纳米探针在365nm激发下的荧光光谱图。
图3为NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4稀土纳米探针透射电镜图，纳米探针粒径在40-60nm。
附图中标号为：
底衬1、样品垫2、结合垫3、微球线31、包被膜4、检测线M 41、检测线G 42、质控线43、吸水纸5。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
(实施例1)
本实施例的稀土纳米探针，为核壳结构镨掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为40nm～60nm，其组成为：
NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4，其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为Pr3+；冒号“:”表示为镨掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，优选为40％；y的范围为1％～10％，优选为5％；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaGdxLu1-y-xF4:yPr表面。
进一步的，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在365nm的激发光源作用下发射出波长范围在450～700nm的荧光。NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4稀土纳米探针在365nm激发下的荧光光谱图，如图2所示。NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4稀土纳米探针透射电镜图，如图3所示。
制备本实施例的稀土纳米探针的方法，包括以下步骤：
步骤一：合成镨掺杂氟化钆镥：在容器中，加入体积比为3～6：7～14的油酸和1-十八烯，再按摩尔比例，加入x份钆的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，y份镨的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，1-x-y份的镥的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～70％，y的范围为0～30％；在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至100～120℃，反应20～30分钟，再升温至150～160℃，反应10～15分钟，得到透明溶液；自然冷却至40～50℃，释放真空，加入摩尔浓度比为1～2：1.6～3.4的NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～300℃，反应1～2小时，离心处理，随后用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中，得到NaGdxLu1-y-xF4:yPr纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入体积比为3～6：7～14油酸和1-十八烯，加入醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，以及与油酸体积比为3～6：2～4的NaGdxLu1-y-xF4:yPr纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～290℃，反应1～2小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；所述醋酸钇、NaOH、氟化铵物质的量之比为0.2～0.4：0.5～1：0.8～1.6；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4稀土纳米纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行1～2min的超声波处理和离心处理(12000～14000rpm高速)，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，超声波处理2～3min；加入20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后12000～14000rpm高速离心5～15min，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
(实施例2)
如图1所示，本实施例的COVID-19 IgM/IgG检测卡，包括：
底衬1；作为所述COVID-19 IgM/IgG检测卡的基底；
包被膜4；设置于所述底衬1上表面的中部；
结合垫3：搭接设置于所述包被膜4的上表面的一端
样品垫2；搭接设置于所述结合垫3的上表面的一端；
吸水纸4；搭接设置于所述包被膜3的上表面的另一端；
其中，所述结合垫3喷涂有微球线31，所述微球线31为实施例1提供的稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原；所述包被膜4上依次设置有检测线M 41、检测线G 42和质控线43，所述检测线41靠近所述结合垫3，检测线M 41、检测线G 42和质控线43相互平行，间隔距离为3～5mm；所述检测线M 41包被有抗人IgM抗体，检测线G 42包被有抗人IgG抗体、质控线43包被有羊抗鼠IgG抗体。
进一步的，所述结合垫3上喷涂的稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
更近一步的，所述检测线M 41中抗人IgM包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，检测线G 42中抗人IgG包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜所述质控线32中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
制作完成后，将其固定在与检测卡尺寸匹配的塑料底卡上，检测卡表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫2和包被膜3的部分分别预留加样孔和观察窗。
制备本实施例的COVID-19 IgM/IgG检测卡的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据实施例1提供的方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记COVID-19重组抗原：对步骤一的活化稀土纳米探针超声波处理1～2min后按照50～200μg/200μl加入COVID-19重组抗原，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后12000～14000rpm高速离心5～15min，用含1％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用抗人IgM、抗人IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体作为检测线M、检测线G和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用包被缓冲液将抗人IgM、抗人IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔3～7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
步骤四：制备结合垫：用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上将稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原用微球稀释液稀释8～30倍均匀喷涂一条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述微球稀释液为含0.5％BSA、10％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
步骤五：制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
步骤六：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述COVID-19 IgM/IgG检测卡。
(实施例3)
本实施例的COVID-19 IgM/IgG检测试剂盒，包括：
COVID-19 IgM/IgG检测卡：采用实施例2所提供的COVID-19 IgM/IgG检测卡；
含有定标曲线的ID卡：由COVID-19 IgM/IgG检测卡测定不同抗体滴度的校准品，以校准品滴度倒数为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应抗体滴度。
本实施例的COVID-19 IgM/IgG检测试剂盒定量检测COVID-19的方法，包括以下步骤：
步骤一：以血清/血浆/全血样本作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：使用合适量程的移液器吸取10μl待测血清/血浆/15μl全血样本加入加样孔，再加入两滴稀释液(约80μl)加入到检测卡加样孔中，吸取及加样时注意不要产生明显气泡。
步骤四：将检测卡插入检测槽，按“检测”键，检测仪将自动对检测卡进行扫描(请严格控制加样后到检测的时间10min)。读取/打印检测结果，其中IgM>0.8，IgG>0.7提示新型冠状病毒感染的可能。
(实施例4)
本实施例进行具体的实例试验并进行测定。
与实施例2的COVID-19 IgM/IgG检测卡结构一致，结合垫上微球线上使用特定的激发光(365nm)/发射光(610nm)波长的核壳结构镨掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠颗粒(NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4)(直径约60nm)标记COVID-19重组抗原(100μg抗体/200μl纳米探针)，检测线包被抗人IgM和抗人IgG(0.5mg/ml)，质控线包被浓度为1mg/ml的羊抗鼠IgG抗体(其中COVID-19重组抗原采购自北京义翘神州科技股份有限公司，抗人IgM和抗人IgG来自于菲鹏生物股份有限公司，羊抗鼠IgG抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线用量为4μl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为1μl包被液量/cm膜。
在本实施例中，COVID-19 IgM/IgG检测试剂盒的制备包括以下步骤：
(1)镨掺杂氟化钆镥合成：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入4.5mL油酸和12.5mL 1-十八烯，再按摩尔比例，加入1.6mmol醋酸钆，1.6mmol醋酸镥和0.02mmol醋酸镨，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入1mmol NaOH和1.6mmol氟化铵甲醇混合溶液，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至300℃，反应1.5小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中。
(2)核壳结构镨掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠纳米探针的制备：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入3mL油酸和7mL1-十八烯，加入0.4mmol醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入1mmol NaOH和1.6mmol氟化铵甲醇混合溶液，4mL NaGdxLu1-y-xF4:yPr纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至290℃，反应1小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4稀土纳米荧光探针。NaGdxLu1-y-xF4:yPr纳米探针中x摩尔百分数优选为40％，y优选为5％。所述材料尺寸约为60nm，且形貌均一，发光性能好。纳米探针激发波长为365nm，发射波长为610nm。
(3)稀土纳米探针的活化：
超声波处理稀土纳米探针2min后，取200μl纳米探针以14000rpm高速离心15min后，沉淀物用100mM，pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入50μl的100mg/ml碳二亚胺，混匀5min，再加入100μl的100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀15min后14000rpm高速离心15min，沉淀用pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml。
(4)稀土纳米探针标记COVID-19重组抗原的制备：
在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照100μg/200μl加入COVID-19重组抗原，混匀2小时，用含0.5％BSA的50mM、pH8.0 Tris-HCl封闭液封闭1小时后14000rpm高速离心15min，用含1％(w/w)Nacl、0.5％(w/w)BSA、0.1％(w/w)Tween-20的50mM、pH8.0的Tris-HCl保存液中缓冲液洗涤两次并超声处理重悬至200μl于4℃避光保存。
(5)包被膜的制备：
分别用包被缓冲液(含2.5％(w/w)蔗糖的20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液)将抗人IgM、抗人IgG调整浓度到0.5mg/ml，羊抗鼠IgG抗体调整浓度到1mg/ml，用量为1μl包被液量/cm膜，分别作为检测线M、检测线G和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线M、检测G和检测线间隔4mm，在湿度<30％，温度45℃烘箱中烘干过夜，封袋，备用；
(6)结合垫的制备：
用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上将稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原用微球稀释液(含0.5％(w/w)BSA、10％(w/w)蔗糖的2mM硼酸缓冲液)稀释20倍均匀喷涂一条线，用量为4μl液量/cm样品垫。置于烘箱中，37℃烘干过夜。
(7)制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
(8)检测卡组装：
在底衬(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(尺寸为22*300mm，玻璃纤维棉材质)、结合垫(尺寸为10*300mm，玻璃纤维棉材质)、被膜(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的试纸条。
本发明COVID-19 IgM/IgG检测卡在使用时由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳设有两个开孔，分别为加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫2，塑料下壳上设置有固定检测试纸条的卡口，结果观察窗对应于检测线M 41、检测线G 42和质控线43，该COVID-19 IgM/IgG检测卡可以从该塑料外壳中取出。
COVID-19 IgM/IgG检测试剂盒中，每盒均含有标准曲线的ID卡(同批次标准曲线相同)，通过稀土纳米荧光试纸条测定不同抗体滴度的校准品，以校准品抗体滴度倒数为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入ID卡并生成二维码，通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。
下面详细介绍标准曲线的绘制
取滴度为1：256的IgM校准品用阴性临床样本分别稀释32，64，256，320倍，每个浓度重复测量三次，取T/C值均值与校准品浓度建立标准曲线。
取滴度为1：256的IgG校准品用阴性临床样本分别稀释成滴度为32，64，256，366倍，每个浓度重复测量三次，取T/C值均值与校准品浓度建立标准曲线。
实验结果及分析见表1和表2：
表1 IgM标准曲线
Figure BDA0002711386670000111
表2 IgG标准曲线
Figure BDA0002711386670000112
Figure BDA0002711386670000121
以抗体滴度倒数和样本信号T/C平均值绘制标准曲线，曲线数据见表1和表2，通过该标线对样品中所含COVID-1抗体滴度进行定量测定。
下面对COVID-19 IgM/IgG检测卡进行性能测试：
1.阴性符合率：检测阴性企业参考品(N1-N24)，24份均为阴性。
其中阴性参考品包含：阴性血浆(N1)，含类风湿因子的阴性血浆(N2)；冠状病毒(HKU1)IgM阳性血浆(N3)，冠状病毒(HKU1)IgG阳性血浆(N4)、冠状病毒(OC43)IgM阳性血浆(N5)、冠状病毒(OC43)IgG阳性血浆(N6)、冠状病毒(NL63)IgM阳性血浆(N7)，冠状病毒(NL63)IgG阳性血浆(N8)，冠状病毒(229E)IgM阳性血浆(N9)，冠状病毒(229E)IgG阳性血浆(N10)，甲型流感病毒IgM阳性血浆(N11)，甲型流感病毒IgG阳性血浆(N12)，乙型流感病毒IgM阳性血浆(N13)，乙型流感病毒IgG阳性血浆(N14)，肠道病毒IgM阳性血浆(N15)，肠道病毒IgG阳性血浆(N16)，呼吸道合胞病毒IgM阳性血浆(N17)，呼吸道合胞病毒IgG阳性血浆(N18)，腺病毒IgM阳性血浆(N19)，腺病毒IgG阳性血浆(N20)，肺炎支原体IgM阳性血浆(N21)，肺炎支原体IgG阳性血浆(N22)，肺炎衣原体IgM阳性血浆(N23)，肺炎衣原体IgG阳性血浆(N24)。
2.阳性符合率：检测阳性企业参考品(P1-P15)，P1-P5均为IgM阳性和IgG阳性，P6-P10均为IgM阳性和IgG阴性，P11-P15均为IgM阴性和IgG阳性。
其中阳性参考品包含P1～P5：IgM阳性和IgG阳性；P6～P10：IgM阳性和IgG阴性；P11～P15：IgM阴性和IgG阳性。
3.最低检出限：检测企业灵敏度参考品S1～S12，S1、S2、S3均为IgM阳性和IgG阳性，S5、S6、S7均为IgM阳性和IgG阴性，S9、S10、S11均为IgM阴性和IgG阳性，S4、S8、S12均为阴性。
企业灵敏度参考品S1～S12，S1、S2、S3、S4为IgM阳性和IgG阳性混合样本稀释S32倍、64倍、256倍、512倍；S5、S6、S7、S8为IgM阳性和IgG阴性混合样本稀释S32倍、64倍、256倍、512倍；S9、S10、S11为IgM阴性和IgG阳性混合样本稀释S32倍、64倍、256倍、512倍。
4.重复性：用同一批次试剂盒，分别检测企业重复性参考品C1～C6，每个样本平行检测5次，C1检测结果均为IgM阳性、IgG阳性，C2检测结果均为IgM阳性、IgG阳性，C3检测结果均为IgM阳性、IgG阴性，C4检测结果均为IgM阳性、IgG阴性，C5检测结果均为IgM阴性、IgG阳性，C6检测结果均为IgM阴性、IgG阳性。
企业重复性参考品(C1-C6)，C1为IgM阳性、IgG阳性，C2为IgM阳性、IgG阳性，C3为IgM阳性、IgG阴性，C4为IgM阳性、IgG阴性，C5为IgM阴性、IgG阳性，C6为IgM阴性、IgG阳性。
6.钩状效应：临床样本IgM浓度在本产品IgM最低检出限浓度的750倍时未出现钩状效应；临床样本IgG浓度在本产品IgG最低检出限浓度的1125倍时未出现钩状效应。
为了验证产品性能，还进行了临床样本检测：
本次临床试验样本为544例受试者血清样本，试验结果归总如下：
1、确诊的阳性样本233例中考核试剂检测结果：(IgM+IgG)阳性为214例，IgM阳性样本197例，IgG阳性样本208例；其中早期确诊阳性56例，(IgM+IgG)阳性为39，IgM阳性样本36例，IgG阳性样本34例，中期确诊阳性55例，(IgM+IgG)阳性为54，IgM阳性样本49例，IgG阳性样本54例，后期确诊阳性122例，(IgM+IgG)阳性为121，IgM阳性样本112例，IgG阳性样本120例，确诊的阴性样本311例中考核试剂检测结果：(IgM+IgG)阴性为307例，IgM阴性样本309例，IgG阴性样本308例。
2、544例临床血清样本的检查结果显示：
Figure BDA0002711386670000131
可见，本发明的试剂盒利用稀土纳米荧光免疫层析技术的灵敏性，结合干式免疫荧光分析仪，实现了高灵敏度、可准确定量、简便快捷的定量检测COVID-19 IgM/IgG抗体。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.稀土纳米探针，其特征在于：为核壳结构镨掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，其组成为：
NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4，其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为Pr3+；冒号“:”表示为镨掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，y的范围为1％～10％；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaGdxLu1-y-xF4:yPr表面。
2.根据权利要求1所述的稀土纳米探针，其特征在于：所述稀土纳米探针在基态下稳定，在365nm的激发光源作用下发射出波长范围在450-700nm的荧光。
3.制备活化的权利要求1或2所述的稀土纳米探针的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：合成镨掺杂氟化钆镥：在容器中，加入油酸、1-十八烯、钆的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、镨的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、镨的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaGdxLu1-y-xF4:yPr纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaGdxLu1-y-xF4:yPr纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yPr@NaYF4稀土纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
4.COVID-19 IgG/IgM检测卡，其特征在于包括：
底衬；作为所述COVID-19 IgM/IgG检测卡的基底；
包被膜；设置于所述底衬上表面的中部；
结合垫：搭接设置于所述包被膜的上表面的一端；
样品垫；搭接设置于所述结合垫的上表面的一端；
吸水纸；搭接设置于所述包被膜的上表面的另一端；
其中，所述结合垫喷涂有微球线，所述微球线为由权利要求2所述的稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原；所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫；所述检测线包被有抗人IgM和IgG抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
5.根据权利要求4所述的COVID-19 IgG/IgM检测卡，其特征在于：所述结合垫上喷涂的稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
6.根据权利要求5所述的COVID-19 IgG/IgM检测卡，其特征在于：所述检测线中抗人IgM和IgG抗体包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
7.制备权利要求6所述的COVID-19 IgG/IgM检测卡的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：根据权利要求3所述的制备方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记COVID-19重组抗原：对步骤一的活化稀土纳米探针按照50～200μg/200μl加入COVID-19重组抗原，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用抗人IgM、IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体作为检测线M、G线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备结合垫：用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上用稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原喷涂一条线，烘干；
步骤五：制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
步骤六：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述COVID-19 IgM/IgG检测卡。
8.根据权利要求7所述的COVID-19 IgG/IgM检测卡的制备方法，其特征在于：
所述步骤三中，用微球稀释液将稀土纳米探针标记的COVID-19重组抗原稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球稀释液为含0.5％BSA、10％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
9.COVID-19 IgG/IgM检测试剂盒，其特征在于包括：
COVID-19 IgM/IgG检测卡；所述COVID-19 IgG/IgM检测卡的结构如权利要求6所述；
含有定标曲线的ID卡；由权利要求6所述的COVID-19IgG/IgM检测卡测定不同抗体滴度的校准品，以校准品抗体滴度倒数为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
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