CN115575623A - 胶体金及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胶体金及其制备方法和应用，制备方法包括如下步骤：加热胶体金晶核溶液至沸腾后进入第一阶段煮沸，加入还原剂溶液a，制备混合物A；加热所述混合物A至沸腾后进入第二阶段煮沸，加入氯金酸溶液b，制备混合物B；加热所述混合物B至沸腾后进入第三阶段煮沸，第三阶段煮沸至所得混合物C颜色稳定，制备胶体金；所述还原剂溶液a中所含的还原剂a为柠檬酸钠；第一阶段煮沸的时间为2min‑5min。采用该制备工艺制备胶体金，无需例如滴加等繁琐操作，过程简单，快速，并且所得胶体金的金颗粒粒径、分散度均一，在免疫检测中标记耦合物性能更优。同时，该制备工艺也无需匹配特殊仪器，在常规器材条件下就能够操作。

Description

胶体金及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于胶体金免疫检测技术领域，特别涉及一种胶体金及其制备方法和应用。

背景技术

胶体金是一种在溶液中具有稳定分散性质的胶体溶液，其主要组分是具有一定形态和尺寸且表面带负电荷的纳米金颗粒，这些金颗粒对蛋白质具有很强的吸附性，可以将蛋白质牢固地结合在金颗粒表面，且这种吸附连接，无论是在液态还是固态，都能长久稳定的保持蛋白质固有的生物活性，故，胶体金常被用作免疫检测试剂的显色指示剂。

纳米金颗粒的形成主要经过“成核和连续生长”两个阶段，以柠檬酸钠还原法制备胶体金为例：

第一阶段（成核）：氯金酸（HAuCl₄）经过柠檬酸钠还原作用，溶液中很快出现金原子，其浓度很快升高直至过饱和，随着发生凝集即形成晶核；

第二阶段（连续生长）：晶核一旦形成，溶液中的其它金原子就不断结合到金核上，直至溶液中所有金原子消失，形成粒径尺寸和形态稳定的金颗粒。

胶体金颗粒的形态和尺寸会影响纳米离子的性质，颗粒形貌不同、尺寸的差异以及电解质和表面吸附情况等不同，均会导致离子表面等离子共振（SPR）吸收峰位置发生改变。根据Mie理论，球形金属纳米离子只有一个SPR峰，可通过分析紫外-可见光吸收谱（UV-vis）的峰值强度、半波峰宽和吸收峰位置来判定胶体金性质，最大吸收波长取决于粒子大小，半波峰的宽窄取决于离子尺寸的分布，半波峰越窄，表明离子尺寸分布越窄，粒径均一。吸光值越高、峰形尖窄是单分散性纳米胶体金的象征。

粒径均一、且形态稳定的性质优良胶体金，是维持连接标记蛋白质性能稳定的关键，形状不规则或者粒径不均一，会导致胶体金-蛋白结合物不稳定，相应的在免疫检测试剂应用中，胶体金标记结合物容易解离和沉淀，进而产生层析不完全，显示本底过高或出现假阳性的结果。

目前，胶体金的制备例如CN105067807 B中记载的一种免疫检测用纳米胶体金的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

S1采用传统方法制备小粒径的纳米金颗粒作为晶种：加热氯金酸溶液至沸腾，快速加入还原剂，继续沸腾一段时间后，停止搅拌加热，冷却至室温；

S2晶种的生长：将小粒径的晶种液稀释到一定浓度后置于三口烧瓶中，在室温下，通过两个加料管分别慢速滴加氯金酸溶液和另一种还原剂抗坏血酸溶液，滴加完毕后加热沸腾反应产物并维持沸腾一段时间，然后撤去人员冷却至室温得到粒径增大的纳米金；

重复S2可依次得到从小到大各种粒径的大粒径的纳米金；

所述S2中，在金纳米离子生长过程中，所述晶种液、氯金酸和还原剂的质量分数比为（8-10）:(4-2):1。

然而，目前的胶体金的制备方法存在的问题包括制备过程繁琐、耗时长且标记效果欠佳等问题。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本申请实施例的目的之一包括提供一种胶体金的制备方法，采用该制备方法制备胶体金，步骤简单，耗时短，且免疫检测中标记效果好。

在本申请的第一方面，提供一种胶体金的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

加热胶体金晶核溶液至沸腾后进入第一阶段煮沸，加入还原剂溶液a，制备混合物A；

加热所述混合物A至沸腾后进入第二阶段煮沸，加入氯金酸溶液b，制备混合物B；

加热所述混合物B至沸腾后进入第三阶段煮沸，第三阶段煮沸至所得混合物C颜色稳定，制备胶体金；

所述还原剂溶液a中所含的还原剂a为柠檬酸钠；

第一阶段煮沸的时间为2min-5min。

在本申请的一些实施方式中，所述还原剂溶液a中所述柠檬酸钠的浓度为1wt%-10wt%，所述氯金酸溶液b中氯金酸的浓度为1wt%-10wt%，所述还原剂溶液a和所述氯金酸溶液b的体积比为1：（1-2）。

在本申请的一些实施方式中，第二阶段煮沸的时间为2min-5min。

在本申请的一些实施方式中，第三阶段煮沸的时间为10min-30min。

在本申请的一些实施方式中，所述胶体金晶核溶液具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述胶体金晶核溶液中胶体金晶核的平均粒径为15nm-20nm；和，

（2）所述胶体金晶核溶液的制备步骤包括：

加热氯金酸溶液b’至沸腾，继续煮沸，加入还原剂溶液a’，制备混合物D；

加热所述混合物D至沸腾，继续煮沸，直至所得混合物E颜色稳定，制备胶体金晶核溶液。

在本申请的一些实施方式中，所述胶体金晶核溶液的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述氯金酸溶液b’和所述还原剂溶液a’的体积比为1：（2-3），所述氯金酸溶液b’中氯金酸的浓度为1wt%-10wt%，所述还原剂溶液a’中还原剂a’的浓度为1wt%-10wt%；

（2）所述氯金酸溶液b’沸腾后继续煮沸的时间为2min-5min；和，

（3）所述混合物D沸腾后继续煮沸的时间为10min-30min。

在本申请的一些实施方式中，所述还原剂a’为柠檬酸钠。

在本申请的一些实施方式中，所述胶体金中颗粒的平均粒径为40nm-60nm，分散指数为0.1-0.3。

在本申请的第二方面，提供第一方面所述的制备方法制备的胶体金。

在本申请的第三方面，提供一种免疫层析试纸条，所述试纸条包含第二方面中所述的胶体金。

在本申请的一些实施方式中，所述试纸条为新型冠状病毒抗原、甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的抗原联检试纸条。

在本申请的一些实施方式中，所述抗原联检试纸条包括底板以及设于所述底板上的样本垫，

沿所述底板的延伸方向，所述样本垫的一侧设有第一检测功能区，对侧设有第二检测功能区；

所述第一检测功能区包括依次连接的第一标记耦合物垫、第一分析膜和第一吸水垫，所述第一标记耦合物垫与所述样本垫连接，所述第一分析膜上设有第一检测线和第一质控线；

所述第二检测功能区包括依次连接的第二标记耦合物垫、第二分析膜和第二吸水垫，所述第二标记耦合物垫与所述样本垫连接，所述第二分析膜上设有第二检测线和第二质控线；

所述第一检测功能区和所述第二检测功能区中的一个用于检测新型冠状病毒抗原，另一个用于检测所述甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原。

在本申请的一些实施方式中，所述第一检测功能区用于检测所述新型冠状病毒抗原，

所述第一标记耦合物垫包被有所述胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1和所述胶体金标记的合成多肽a，

所述第一检测线上包被另一抗新型冠状病毒抗体2，所述第一质控线上包被抗所述合成多肽a抗体。

在本申请的一些实施方式中，所述第一检测功能区具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述抗所述合成多肽a抗体为鼠抗；和，

（2）所述第一检测线和第一质控线之间的间距为3mm-5mm。

在本申请的一些实施方式中，所述第二检测功能区用于检测所述甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原，

所述第二标记耦合物垫包被有所述胶体金标记的抗甲型流感病毒抗体1、所述胶体金标记的抗乙型流感病毒抗体1和所述胶体金标记的合成多肽b，

所述第二检测线的数量大于等于2，其中一条第二检测线上包被另一抗甲型流感病毒抗体2，另一条第二检测线上包被另一抗乙型流感病毒抗体2，所述第二质控线上包被抗所述合成多肽b抗体。

在本申请的一些实施方式中，所述第二检测功能区具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述抗所述合成多肽b抗体为鼠抗；和，

（2）所述第二检测线之间以及所述第二检测线和所述第二质控线之间的间距为3mm-5mm。

在本申请的一些实施方式中，所述第一检测功能区和所述第二检测功能区域呈轴对称。

在本申请的一些实施方式中，所述抗原联检试纸条具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述底板为PVC板；

（2）所述第一分析膜或/和所述第二分析膜为硝酸纤维素膜；

（3）所述第一标记耦合物垫或/和所述第二标记耦合物垫各自独立地选自玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜；

（4）所述样本垫为经过封闭处理的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜；

（5）所述第一吸水垫或/和所述第二吸水垫为滤纸；和，

（6）所述抗原联检试纸条的宽度为2.5mm-4mm。

在本申请的第四方面，提供一种免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括试纸盒，所述试纸盒包括盒体以及安装在所述盒体中的第三方面中所述的免疫层析试纸条，

所述盒体上设有加样孔、第一检测窗口和第二检测窗口，

所述加样孔与所述免疫层析试纸条上的所述样本垫对应，用于向所述样本垫滴加检测样本；

所述第一检测窗口与所述免疫层析试纸条上的所述第一分析膜对应，用于观察所述第一检测功能区的检测结果，

所述第二检测窗口与所述免疫层析试纸条上的所述第二分析膜对应，用于观察所述第二检测功能区的检测结果。

在本申请的一些实施方式中，所述试剂盒还包括样本提取液和取样拭子中的一种或者多种。

在本申请的一些实施方式中，所述样本提取液包含10mM-20mM PBS缓冲液、0.1wt%-2wt% PVP40、100mM-200mM NaCl和0.1wt%-1wt% NP40，pH值为7.2-7.6。

在本申请的第五方面，提供第四方面中所述的免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括采用第二方面中所述的胶体金制备免疫层析试纸条的步骤。

在本申请的一些实施方式中，所述制备方法包括：将所述底板、所述样本垫、所述第一吸水垫、所述第二吸水垫、所述第一标记耦合物垫、所述第二标记耦合物垫、所述第一分析膜和所述第二分析膜组装在所述底板上，制备所述免疫层析试纸条。

在本申请的一些实施方式中，所述样本垫的制备步骤包括：

将含封闭剂a的样本垫处理液涂在所述的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜上，干燥，制备样本垫。

在本申请的一些实施方式中，所述样本垫的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述样本垫处理液包含0.01M-0.05M Tris-HCl缓冲液、100mM -200mM NaCl、0.1wt%-1wt%Tween-20以及0.05mg/mL-1.0mg/mL所述封闭剂a，pH值为8-9；

（2）所述封闭剂a为BSA；和，

（3）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃，时间为12h-24h。

在本申请的一些实施方式中，所述制备方法具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述第一分析膜的制备步骤包括：

分别制备包含所述抗新型冠状病毒抗体2的第一检测线包被液和包含抗所述合成多肽a抗体的第一质控线包被液；

分别用所述第一检测线包被液和所述第一质控线包被液在硝酸纤维素膜上划线，干燥，相应形成第一检测线和第一质控线，制备第一分析膜；

和，

（2）所述第二分析膜的制备步骤包括：

分别制备包含所述抗甲型流感病毒抗体2的第二检测线包被液a、包含所述抗乙型流感病毒抗体2的第二检测线包被液b和包含所述抗合成多肽b抗体的第二质控线包被液；

分别用所述第二检测线包被液a、所述第二检测线包被液b和所述第二质控线包被液在硝酸纤维素膜上划线，干燥，相应形成两条第二检测线和第二质控线，制备第二分析膜。

在本申请的一些实施方式中，所述制备方法具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述的第一检测线包被液、第一质控线包被液、第二检测线包被液a、第二检测线包被液b和第二质控线包被液各自独立地包含10mM-20mM PBS缓冲液、1wt%-10wt%海藻糖和1wt%-10wt%甲醇，pH值为7.2-7.6；

（2）所述的抗新型冠状病毒抗体2、所述抗甲型流感病毒抗体2、所述抗乙型流感病毒抗体2、抗所述合成多肽a抗体和抗所述合成多肽b抗体的浓度各地独立地为0.1mg/mL-3.0mg/mL；

（3）所述的第一检测线包被液、第一质控线包被液、第二检测线包被液a、第二检测线包被液b和第二质控线包被液的划线用量各自独立地为0.06μl/mm-0.2μl/mm；和，

（4）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃，时间为12h-48h。

在本申请的一些实施方式中，将所述第一标记耦合物垫和所述第二标记耦合物垫记作标记耦合物垫，将所述的抗新型冠状病毒抗体1、抗甲型流感病毒抗体1、抗乙型流感病毒抗体1、合成多肽a和合成多肽b记作待标记蛋白，相应地，将所述的胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1、抗甲型流感病毒抗体1、抗乙型流感病毒抗体1、合成多肽a和合成多肽b记作胶体金标记蛋白，

所述标记耦合物垫的制备步骤包括：制备包含胶体金标记蛋白的标记溶液，将所述标记溶液涂在所述的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜上，干燥，制备标记耦合物垫；

其中，所述胶体金标记蛋白的制备步骤包括：

调节所述胶体金的pH值至所述待标记蛋白的等电点或者接近所述待标记蛋白的等电点，加入所述待标记蛋白，进行耦合反应；

向耦合反应的产物中加入封闭剂b，进行封闭反应；

对封闭反应的产物进行离心，收集沉淀，制备胶体金标记蛋白。

在本申请的一些实施方式中，所述标记耦合物垫的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述标记溶液中的所述胶体金标记蛋白的浓度为5μg/mL-20μg/mL；

（2）所述标记溶液的用量为0.045mL/cm²-0.052mL/cm²；

（3）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃，时间为12h-24h；

（4）耦合反应的条件包括：温度为20℃-30℃，时间为15min-20min，所述待标记蛋白的初始反应浓度为5μg/mL-20μg/mL；

（5）封闭反应的条件包括：温度为20℃-30℃，时间为15min-20min，所述封闭剂b的初始浓度为0.1wt%-1wt%；

（6）离心的条件包括：温度为4℃-10℃，时间为20min-40min，速度为5000rpm-12000rpm；

（7）调节所述胶体金的pH值采用碳酸钾浓度为0.1M -0.2M的碳酸钾溶液；和，

（8）所述封闭剂b为BSA。

相对于传统技术，本申请的有益效果包括：

本申请在获得胶体金晶核的基础上，对其进行煮沸，煮沸后直接向其中加入所需的还原剂，再煮沸后加入所需的氯金酸，继续煮沸直至颜色稳定，从而形成特定的胶体金制备工艺。采用该制备工艺制备胶体金，无需例如滴加等繁琐操作，过程简单，快速，并且所得胶体金具有较好的金颗粒粒径和分散度，在免疫检测中标记耦合性能更优。同时，该制备工艺也无需匹配特殊仪器，在常规简单器材（例如烧瓶和磁力加热搅拌器）条件下就能够操作。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为两步还原法制备胶体金的粒径和分散度测试实例图；

图2为传统一步还原法制备胶体金的粒径和分散度测试实例图；

图3为免疫层析检测试纸条的结构示意图；

图4为免疫层析检测试纸盒平面图。

具体实施方式

下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本发明中，%(w/w)与wt%均表示重量百分比，%(v/v)指体积百分比，%(w/v)指质量体积百分数。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

平均粒径（Zaverage Size），是动态光散射技术中得到的最重要的参数。

多分散系数（PDI），是多分散性或多扩散系数的分布宽度参数。

本申请的第一方面

本申请提供一种胶体金的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

加热胶体金晶核溶液至沸腾后进入第一阶段煮沸，加入还原剂溶液a，制备混合物A；

加热所述混合物A至沸腾后进入第二阶段煮沸，加入氯金酸溶液b，制备混合物B；

加热所述混合物B至沸腾后进入第三阶段煮沸，第三阶段煮沸至所得混合物C颜色稳定，制备胶体金；

所述还原剂溶液a中所含的还原剂a为柠檬酸钠；

第一阶段煮沸的时间为2min-5min。

本申请提供的制备方法中，第一阶段煮沸的时间例如为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5min。

可选地，所述还原剂溶液a中所述柠檬酸钠的浓度为1wt%-10wt%，所述氯金酸溶液b中氯金酸的浓度为1wt%-10wt%，所述还原剂溶液a和所述氯金酸溶液b的体积比为1：（1-2）。例如：所述还原剂溶液a中柠檬酸钠的浓度为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10wt%，所述氯金酸溶液b中氯金酸的浓度为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10wt%，所述还原剂溶液a和所述氯金酸溶液b的体积比为1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2。

可选地，第二阶段煮沸的时间为2min-5min，例如为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5min。

可选地，第三阶段煮沸的时间为10min-30min，例如为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30min。

可选地，所述胶体金晶核溶液具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述胶体金晶核溶液中胶体金晶核的平均粒径为15nm-20nm；和，

（2）所述胶体金晶核溶液的制备步骤包括：

加热氯金酸溶液b’至沸腾，继续煮沸，加入还原剂溶液a’，制备混合物D；

加热所述混合物D至沸腾，继续煮沸，直至所得混合物E颜色稳定，制备胶体金晶核溶液。

所述胶体金晶核溶液中胶体金晶核的平均粒径例如为15、16、17、18、19、20nm。

可选地，所述胶体金晶核溶液的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述氯金酸溶液b’和所述还原剂溶液a’的体积比为1：（2-3），所述氯金酸溶液b’中氯金酸的浓度为1wt%-10wt%，所述还原剂溶液a’中还原剂a’的浓度为1wt%-10wt%；

（2）所述氯金酸溶液b’沸腾后继续煮沸的时间为2min-5min；和，

（3）所述混合物D沸腾后继续煮沸的时间为10min-30min。

例如：所述还原剂溶液a’中柠檬酸钠的浓度为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10wt%，所述氯金酸溶液b’中氯金酸的浓度为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10wt%，所述还原剂溶液a和所述氯金酸溶液b’的体积比为1：2、1：2.1、1：2.2、1：2.3、1：2.4、1：2.5、1：2.6、1：2.7、1：2.8、1：2.9、1：3。

例如：所述氯金酸溶液b’沸腾后继续煮沸的时间为2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5min。

例如：所述混合物D沸腾后继续煮沸的时间为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30min。

可选地，所述还原剂a’为柠檬酸钠。

本申请提供的制备方法制备的所述胶体金中颗粒，其平均粒径为40nm-60nm（例如为40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60nm），分散指数为0.1-0.3（例如为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3）。

本申请的第二方面

本申请提供第一方面所述的制备方法制备的胶体金。本申请所得胶体金具有较好的金颗粒粒径和分散度，在免疫检测中标记耦合性能更优。

本申请的第三方面

本申请提供一种免疫层析试纸条，所述试纸条包含第二方面中所述的胶体金。

可选地，所述试纸条为新型冠状病毒抗原、甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的抗原联检试纸条。

可选地，所述抗原联检试纸条包括底板以及设于所述底板上的样本垫，

沿所述底板的延伸方向，所述样本垫的一侧设有第一检测功能区，对侧设有第二检测功能区；

所述第一检测功能区包括依次连接的第一标记耦合物垫、第一分析膜和第一吸水垫，所述第一标记耦合物垫与所述样本垫连接，所述第一分析膜上设有第一检测线和第一质控线；

所述第二检测功能区包括依次连接的第二标记耦合物垫、第二分析膜和第二吸水垫，所述第二标记耦合物垫与所述样本垫连接，所述第二分析膜上设有第二检测线和第二质控线；

所述第一检测功能区和所述第二检测功能区中的一个用于检测新型冠状病毒抗原，另一个用于检测所述甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原。

胶体金免疫层析技术是建立在胶体金标记技术和免疫层析技术基础之上，以硝酸纤维素膜等固相膜为载体进行抗原抗体免疫分析的一种即时检验（POCT）技术。该技术一般只需试纸条装置，或者只需读数仪等简单仪器设备配合即可完成检测。

胶体金免疫层析试纸条是胶体金免疫层析技术的最主要组成部分，其底层一般是附着在PVC底板上，依次搭连吸水垫、硝酸纤维素膜、胶体金标记结合垫和样品垫。硝酸纤维素膜上面包被有抗原或抗体等检测蛋白，连接纤维素膜的是固相化的胶体金标记结合垫（通常是玻璃纤维），这种胶体金标记结合垫吸附了针对不同检测样品的特异性抗体或抗原的胶体金颗粒。样品垫通常附着在胶体金标记结合垫上。加样时，随着吸水垫的牵引力，样品垫上的液体样品通过毛细管作用涌动层析经过胶体金标记结合垫，此时样品中的待测靶蛋白，与胶体金标记结合垫上的胶体金标记抗体或胶体金标记抗原结合形成免疫复合物，该免疫复合物会与膜上包被的相应蛋白捕获，形成一条清晰可见的红色条带，即为检测线（T线）。为了指示检测过程是否正常及样品是否充足，检测条通常还包含一条质控线（C线）。

胶体金免疫层析技术作为一种快速检测技术，其功能广泛，通过改变抗体/抗体或包被条带的化学配方，即可对多个领域的多种样品分析为进行检测。该技术具有操作简便、快速灵敏、不需仪器设备（或只需一个简单读数仪）、保质期长、能够同时检测大量样品等优点，并且该技术产品容易在各种人群中推广使用，甚至没有经验的人也可使用。

胶体金免疫层析技术作为一种成熟的快速检测技术，因其特有的技术优势（检测速度快、操作简便、费用低廉等）目前仍被广泛应用于临床医学检验、农业中的食品安全和细菌诊断检测、环境重金属残留检测等诸多领域，随着胶体金免疫层析技术上的改进和新型免疫层析技术的发展，其发展空间势必更加广阔。

基于传统胶体金技术之上的新型免疫层析技术，主要有胶体金-核酸适配体免疫层析技术和胶体金纳米颗粒等离子共振技术。

胶体金-核酸适配体检测技术主要包含：胶体金标记核酸适配体（一类经过人工筛选的具有特异性亲和力和识别功能的单链核酸分子或核苷酸片段）的结合垫和固化有核酸适配体探针的硝酸纤维素膜，可检测多种核酸分子；此项技术因具备①可体外筛选②靶分子范围广③分子量低没有免疫原性和毒性④可化学合成、改造和标记等优点，在疾病诊断、癌症治疗、药物发现等生物学领域已开始使用并具有更广阔的应用前景。

胶体金纳米颗粒等离子共振技术主要基于在可见光谱中，30-120nm胶体金作为等离子体共振，可进行有效的光散射，有色光源在散射光的视野中很容易被单独观察到，用光学检测仪器观察这个粒径范围内的单个等离子共振胶体金颗粒，可显著改善免疫层析检测试纸条的检测限。胶体金纳米颗粒等离子共振检测技术与传统的胶体金免疫层析检测技术相比，具有无需对样品进行标记、实时监测、灵敏度高等突出优点，在临床、药物研制、食品安全检测等领域具有广阔应用前景。

基于新型标记材料的免疫层析技术，目前主要包含有：纳米磁性颗粒免疫检测技术、碳纳米管免疫层析技术、免疫胶乳技术、荧光免疫层析技术。

纳米磁珠颗粒免疫检测技术（IMB）：是以纳米磁性颗粒标记物取代胶体金、胶乳、荧光等标记物的一种新型定量免疫层析技术。纳米磁珠粒是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，基本上有载体微球和免疫配基结合而成，磁珠的核心是载体微球，免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上，形成纳米磁性颗粒，由于载体微球的制备材料和方法不同，具有不同的性质，从而可以结合不同的免疫配基，如抗原、抗体、凝集素、DNA和RNA等。因仪器可直接对磁珠的磁信号进行检测，从而实现定量检测。

碳纳米管免疫层析技术：碳纳米管（CNTs）又称为巴基管，是碳晶体家族中除石墨、金刚石、碳60外的又一种碳结构。CNTs作为生物分子标志物与胶体金类似，其具有的黑色特性可用于肉眼观测的定性或半定量检测中。随着材料技术的发展，各种不同形状和尺寸、无毒的炭黑很容易获得，且都可与蛋白质等生物分子结合，但目前CNTs的制备方法均难以除去其混杂的无定形碳、石墨碳碎片等杂志，从而严重限制了CNTs的研究和应用，目前此项技术的研发还处在早期阶段。

免疫胶乳技术：是以抗原抗体反应为基础，将抗原或抗议等免疫活性物质交联与胶乳（Iatex）上并进行免疫分析的一种快速检测技术。免疫胶乳技术的胶乳致敏方法主要是物理吸附法、化学交联法、生物素-亲和素桥联法、多肽桥联法、重碳乳胶化学连接法等。随着各种精密仪器如分光光度计、浊度计、颗粒计数仪以及其它免疫学技术的发展，免疫乳胶技术也得到了快速发展，由以前的定性检测向半定量和定量检测技术发展。

荧光免疫层析技术：荧光，是指一种光致发光的冷发光现象。利用荧光染料与倍研究对象（蛋白、多肽等）吸附或共价结合后，其荧光特性会发生改变，通过这些改变对有关研究对象的性能进行研究的技术是荧光技术。荧光免疫层析技术是将荧光技术和传统免疫层析技术相结合后，通过对荧光复合物的荧光可视信号进行检测的一种新型定性或者定量的新型检测技术。

目前的免疫层析试纸条/试剂盒例如：

CN112904001A记载了一种新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，包含检测试条，所述检测试条包括顺次搭连的样品垫、结合垫、检测垫以及吸收垫，所述检测垫设有相互平行的检测线和质控线，所述检测线包含相互分离设置的第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线上包被有新冠病毒抗体，所述第二检测线是哪个包被有甲型流感病毒抗体，所述第三检测线上包被有乙型流感病毒抗体。

CN216209195U记载了一种新冠与流感病毒抗原联合检测试剂盒，包括检测试纸，所述检测试纸包括顺次搭连在一起的样本垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体、抗甲型流感病毒抗体和抗乙型流感病毒抗体；用于标记所述抗新型冠状病毒抗体、所述抗甲型流感病毒抗体和所述抗乙型流感病毒抗体的述胶体金的粒径为90nm-130nm。

CN112557655A记载了一种新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒抗原三合一检测试剂盒，包括盒体以及设置在所述盒体中的两条免疫层析试纸条、样本提取液，所述盒体包括底卡和盖板，所述底卡上设有双卡槽，所述盖板通过双卡槽卡接在底卡上，所述盖板上设有两个加样孔和两个观察窗，两个所述加样孔呈左右设置在盖板下端，两个所述观察窗呈左右设置且分别位于两个加样孔上方，左边的所述观察窗对应区域有“C”、“T”字样标识，“C”靠近观察窗上端，“T”靠近观察窗下端，右边的所述观察窗对应区域有“C”、“A”“B”字样标识，“C”靠近观察窗上端，“B”靠近观察窗下端，“A”位于两者之间；两条所述免疫层析试纸条一种用于检测新型冠状病毒抗原，另一种用于检测甲型、乙型流感抗原，两条所述免疫层析试纸条都包括PVC底板以及依次设置在所述PVC底板上的样品垫、标记垫、反应垫和吸水垫，所述标记垫和吸水垫分别叠压在反应垫的两端，并在反应垫的表面形成检测区，所述样品垫叠压在标记垫上；两条所述免疫层析试纸条均位于底卡和盖板之间，其中一条所述免疫层析试纸条的反应垫与左边的观察窗对应且反应垫设置有一条检测线区T线和一条控制线区C线，所述检测线区T线和制线区C线分别与“C”、“T”字样标识对应，另一条所述免疫层析试纸条的反应垫与右边的观察窗对应且反应垫上设置有控制线区C线、检测线区B线和检测线区A线，所述控制线区C线、检测线区B线和检测线区A线分别与“C”、“A”“B”字样标识对应。

CN112198312 A记载了一种新型冠状病毒抗原与流感病毒抗原联合检测试纸条，包括底板，所述底板上依次粘贴有样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜表面靠近金标垫的一端上依次包被有抗新型冠状病毒抗体、抗甲型流感病毒抗体和抗乙型流感病毒抗体，所述硝酸纤维素表面靠近吸水纸端包被有兔抗鼠IgG抗体，所述金标垫上喷点有胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体、抗甲型流感病毒抗体和抗乙型流感病毒抗体。

现行胶体金免疫层析检测技术，实现新冠和甲乙型流感病毒抗原三项联合检测的方法主要有两种：一种是并行两根检测条的联卡模式，如CN112557655 A和CN112904001 A，另外一种是三个项目集中在一根检测条的单卡模式，如专利CN112198312 A和CN216209195U，两种检测模式均可实现新冠和甲乙型流感病毒抗原三项联合检测，但两种模式各存在以下缺陷和不足：1）针对联卡模式，一次采样需要分别进行2次滴加样本，操作不便，另外需要组装两根试纸条，试剂成本较高，生产组装效率和产能也低。2）针对单卡模式，虽然避免了联卡的2次加样缺陷，操作便捷，但多个项目制备在一根检测条上，NC膜制备时不同检测项目混液风险较大，另外，不同项目间也容易因样本干扰而造成交叉反应，影响特异性，试剂灵敏度也在一定程度上受到影响。因此，现行新冠和甲乙型流感病毒抗原胶体金免疫层析检测技术有待进一步改进和提高。

而本申请的检测试剂盒，将新冠和甲乙型流感病毒三个项目制备在一根试纸条上，试剂成本降低，生产组装效率较高，另外一次采集后只需1次加样即可实现新冠和甲乙型流感病毒抗原三项联检，且新冠和流感项目分开检测能够降低因样本干扰所造成的不同项目间交叉反应性，保证试剂特异性，降低假阳性，同时增强了试剂的灵敏度，降低漏检概率。

可选地，所述第一检测功能区用于检测所述新型冠状病毒抗原，

所述第一标记耦合物垫包被有所述胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1和所述胶体金标记的合成多肽a，

所述第一检测线上包被另一抗新型冠状病毒抗体2，所述第一质控线上包被抗所述合成多肽a抗体。

可选地，所述第一检测功能区具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述抗所述合成多肽a抗体为鼠抗；和，

（2）所述第一检测线和第一质控线之间的间距为3mm-5mm（例如为3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5mm）。

可选地，所述第二检测功能区用于检测所述甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原，

所述第二标记耦合物垫包被有所述胶体金标记的抗甲型流感病毒抗体1、所述胶体金标记的抗乙型流感病毒抗体1和所述胶体金标记的合成多肽b，

所述第二检测线的数量大于等于2，其中一条第二检测线上包被另一抗甲型流感病毒抗体2，另一条第二检测线上包被另一抗乙型流感病毒抗体2，所述第二质控线上包被抗所述合成多肽b抗体。

可选地，所述第二检测功能区具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述抗所述合成多肽b抗体为鼠抗；和，

（2）所述第二检测线之间以及所述第二检测线和所述第二质控线之间的间距为3mm-5mm。

可选地，所述第一检测功能区和所述第二检测功能区域呈轴对称。

可选地，所述抗原联检试纸条具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述底板为PVC板；

（2）所述第一分析膜或/和所述第二分析膜为硝酸纤维素膜；

（3）所述第一标记耦合物垫或/和所述第二标记耦合物垫各自独立地选自玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜；

（4）所述样本垫为经过封闭处理的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜；

（5）所述第一吸水垫或/和所述第二吸水垫为滤纸；和，

（6）所述抗原联检试纸条的宽度为2.5mm-4mm（例如为2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4mm）。

本申请的第四方面

本申请提供一种免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括试纸盒，所述试纸盒包括盒体以及安装在所述盒体中的第三方面中所述的免疫层析试纸条，

所述盒体上设有加样孔、第一检测窗口和第二检测窗口，

所述加样孔与所述免疫层析试纸条上的所述样本垫对应，用于向所述样本垫滴加检测样本；

所述第一检测窗口与所述免疫层析试纸条上的所述第一分析膜对应，用于观察所述第一检测功能区的检测结果，

所述第二检测窗口与所述免疫层析试纸条上的所述第二分析膜对应，用于观察所述第二检测功能区的检测结果。

可选地，所述试剂盒还包括样本提取液和取样拭子中的一种或者多种。

可选地，所述样本提取液包含10mM-20mM PBS缓冲液、0.1wt%-2wt% PVP40、100mM-200mM NaCl和0.1wt%-1wt% NP40，pH值为7.2-7.6。

可选地，所述取样拭子，例如为鼻拭子、鼻咽拭子。

本申请的第五方面

本申请提供第四方面中所述的免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括采用第二方面中所述的胶体金制备免疫层析试纸条的步骤。

可选地，所述制备方法包括：将所述底板、所述样本垫、所述第一吸水垫、所述第二吸水垫、所述第一标记耦合物垫、所述第二标记耦合物垫、所述第一分析膜和所述第二分析膜组装在所述底板上，制备所述免疫层析试纸条。

可选地，所述样本垫的制备步骤包括：

将含封闭剂a的样本垫处理液涂在所述的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜上，干燥，制备样本垫。

可选地，所述样本垫的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述样本垫处理液包含0.01M-0.05M（例如为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 M）Tris-HCl缓冲液、100mM -200mM（例如为100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM） NaCl、0.1wt%-1wt%（例如为0.1wt%、0.2wt%、0.3wt%、0.4wt%、0.5wt%、0.6wt%、0.7wt%、0.8wt%、0.9wt%、1wt%）Tween-20以及0.05mg/mL-1.0mg/mL（例如为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mg/mL）所述封闭剂a，pH值为8-9（例如为8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9）；

（2）所述封闭剂a为BSA；和，

（3）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃（例如为45、46、47、48、49、50℃），时间为12h-24h（例如为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24h）。

可选地，所述制备方法具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述第一分析膜的制备步骤包括：

分别制备包含所述抗新型冠状病毒抗体2的第一检测线包被液和包含抗所述合成多肽a抗体的第一质控线包被液；

分别用所述第一检测线包被液和所述第一质控线包被液在硝酸纤维素膜上划线，干燥，相应形成第一检测线和第一质控线，制备第一分析膜；

和，

（2）所述第二分析膜的制备步骤包括：

分别制备包含所述抗甲型流感病毒抗体2的第二检测线包被液a、包含所述抗乙型流感病毒抗体2的第二检测线包被液b和包含所述抗合成多肽b抗体的第二质控线包被液；

分别用所述第二检测线包被液a、所述第二检测线包被液b和所述第二质控线包被液在硝酸纤维素膜上划线，干燥，相应形成两条第二检测线和第二质控线，制备第二分析膜。

可选地，所述制备方法具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述的第一检测线包被液、第一质控线包被液、第二检测线包被液a、第二检测线包被液b和第二质控线包被液各自独立地包含10mM-20mM（例如为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mM）PBS缓冲液、1wt%-10wt%（例如为1wt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、6wt%、7wt%、8wt%、9wt%、10wt%）海藻糖和1wt%-10wt%（例如为1wt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、6wt%、7wt%、8wt%、9wt%、10wt%）甲醇，pH值为7.2-7.6（例如为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6）；

（2）所述的抗新型冠状病毒抗体2、所述抗甲型流感病毒抗体2、所述抗乙型流感病毒抗体2、抗所述合成多肽a抗体和抗所述合成多肽b抗体的浓度各地独立地为0.1mg/mL-3.0mg/mL；

（3）所述的第一检测线包被液、第一质控线包被液、第二检测线包被液a、第二检测线包被液b和第二质控线包被液的划线用量各自独立地为0.06μl/mm-0.2μl/mm（例如为0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2μl/mm）；和，

（4）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃（例如为45、46、47、48、49、50℃），时间为12h-48h（例如为12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48h）。

可选地，将所述第一标记耦合物垫和所述第二标记耦合物垫记作标记耦合物垫，将所述的抗新型冠状病毒抗体1、抗甲型流感病毒抗体1、抗乙型流感病毒抗体1、合成多肽a和合成多肽b记作待标记蛋白，相应地，将所述的胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1、抗甲型流感病毒抗体1、抗乙型流感病毒抗体1、合成多肽a和合成多肽b记作胶体金标记蛋白，

所述标记耦合物垫的制备步骤包括：制备包含胶体金标记蛋白的标记溶液，将所述标记溶液涂在所述的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜上，干燥，制备标记耦合物垫；

其中，所述胶体金标记蛋白的制备步骤包括：

调节所述胶体金的pH值至所述待标记蛋白的等电点或者接近所述待标记蛋白的等电点，加入所述待标记蛋白，进行耦合反应；

向耦合反应的产物中加入封闭剂b，进行封闭反应；

对封闭反应的产物进行离心，收集沉淀，制备胶体金标记蛋白。

可选地，所述标记耦合物垫的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述标记溶液中的所述胶体金标记蛋白的浓度为5μg/mL-20μg/mL（例如为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/mL）；

（2）所述标记溶液的用量为0.045mL/cm²-0.052mL/cm²（例如为0.045、0.046、0.047、0.048、0.049、0.050、0.051、0.052mL/cm²）；

（3）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃（例如为45、46、47、48、49、50℃），时间为12h-24h（例如为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24h）；

（4）耦合反应的条件包括：温度为20℃-30℃（例如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃），时间为15min-20min（例如为15、16、17、18、19、20min），所述待标记蛋白的初始反应浓度为5μg/mL-20μg/mL（例如为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/mL）；

（5）封闭反应的条件包括：温度为20℃-30℃（例如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃），时间为15min-20min（例如为15、16、17、18、19、20min），所述封闭剂b的初始浓度为0.1wt%-1wt%（例如为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1wt%）；

（6）离心的条件包括：温度为4℃-10℃（例如为4、5、6、7、8、9、10℃），时间为20min-40min（例如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40min），速度为5000rpm-12000rpm（例如为5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000rpm）；

（7）调节所述胶体金的pH值采用碳酸钾浓度为0.1M -0.2M（例如为0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2）的碳酸钾溶液；和，

（8）所述封闭剂b为BSA。

可选地，所述封闭剂b以其溶液的方式加入，例如加入BSA浓度为20wt%的BSA溶液。

具体实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1

一、基础溶液配置

（1）氯金酸溶液配置：用超纯水溶解氯金酸，配置成1wt%氯金酸浓度的氯金酸溶液，2-8℃储存备用，有效期3个月；

（2）还原剂溶液配置：用超纯水溶解柠檬酸钠，配置成1wt%柠檬酸钠浓度的柠檬酸钠溶液，2-8℃储存备用，有效期3个月；

玻璃器皿清洗：烧制胶体金前，需氢氧化钠强碱溶液浸泡至少2小时后用超纯水清洗干净备用。

二、制备胶体金

（1）对照组胶体金烧制：

传统柠檬酸钠一步还原法制备胶体金。

取1L超纯水加热至沸腾，设定所需温度及转速（250℃，不引起剧烈旋涡的转速），待稳定后一次性迅速加入40mL 1wt%氯金酸溶液，待重新煮沸2min后，一次性迅速加入50mL1wt%柠檬酸钠溶液，待沸腾后继续加热煮沸10-30min，观察颜色变化，颜色由紫黑色变成紫色再变成紫红色，待颜色稳定性后停止加热，维持搅拌并冷却至室温。

（2）实验组胶体金烧制：

第一步还原：传统柠檬酸钠一步还原法制备1/万15-20nm胶体金作为晶核。

取1L超纯水加热至沸腾，设定所需温度及转速（250℃，不引起剧烈旋涡的转速），待稳定后一次性迅速加入10mL 1wt%氯金酸溶液，待重新煮沸2min后，一次性迅速加入30mL1wt%柠檬酸钠溶液，待沸腾后继续加热煮沸10min，观察颜色变化，颜色由紫黑色变成紫红色再变成橙红色，待颜色稳定后停止加热，维持搅拌并冷却至室温，即可得到平均粒径为15-20nm小颗粒胶体金。

第二步还原：晶核继续成长制备2/万-9/万、平均粒径为50nm胶体金。

设定所需温度及转速（250℃，不引起剧烈旋涡的转速），加入煮沸上述冷却的小颗粒胶体金溶液，待沸腾2min后，一次性迅速加入82mL 1wt%柠檬酸钠，待重新煮沸2min后，一次性迅速加入95mL 1wt%氯金酸溶液，待沸腾继续煮沸10min，观察颜色变化，颜色由紫黑色变成紫色再变成紫红色，待颜色稳定后停止加热，维持搅拌并冷却至室温，即可得到9/万平均粒径为50nm胶体金。

就本申请的胶体金制备而言，发明人发现：

（1）晶核生长的过程中，不能先向胶体金晶核溶液中添加氯金酸溶液再加入还原剂溶液，因为这样的添加顺序会导致金颗粒粒径不均一。做出如下解释：氯金酸用A表示、还原剂用B表示、金原子用C表示、晶核用D表示，粒径增大胶体金用E表示、晶核生长的过程是：A+B=C，C至饱和聚集成D，D+C=E，如果先加入A再加入B，最初因还原剂量的不足导致生成的C数量有限，而溶液中原有的晶核D会优先结合C形成粒径偏大的E，但随着B不断添加，C的浓度逐渐增大至饱和，从而聚集形成新的晶核D，晶核D结合溶液中剩余的C而形成新的粒径增大的胶体金E，这样因晶核形成速率不一导致制备的胶体金粒径不均一；反之，如果先添加B再加入A，晶核D处在大量的饱和C中，最终声称粒径均一的增大胶体金E。

（2）晶核生长的过程中，不能向胶体金晶核溶液中同时添加氯金酸溶液和还原剂溶液，原因1是生产不易操作，原因2是二者同时加入容易导致反应物浓度不易快速分散均一，在持续高温反应条件下，晶核形成反应速率不一，从而导致制备的胶体金粒径不均一。

（3）晶核生长的过程中，加入还原剂后煮沸时间超出限定时间，溶液损失严重，反应物浓度发生改变，影响金颗粒大小和性状；加入氯金酸后10-30min胶体即可形成，再延长煮沸时间，金颗粒粒径也不再发生改变，且延长煮沸时间，液体损失严重。

（4）晶核生长的过程中，还原剂必须采用柠檬酸钠。其他的还原剂，例如：白磷还原剂，易燃易爆、实验室一般不采用；抗坏血酸还原剂：见光易分解，现配现用，生产不易推广；硼氢化钠还原剂：还原性强，反应快，导致胶体金生长速率和胶体核形成速率不平衡，粒径分布不均匀；鞣酸还原剂：微毒性，对水稍有危害；另外鞣酸在常温下即可还原氯金酸，鞣酸制备的胶体金长期储存不稳定。

三、测试

用粒度及Zeta电位分析仪分别测试对照组和实验组胶体金的粒径和分散指数，比较二者差异。

测试数据如下：

实验组和对照组胶体金粒径和分散度的测试数据：

详见图1和图2，实验组（图1）比对照组（图2）制备的胶体金粒径大，且分散指数PDI较小，半峰宽也较小，表明实验组胶体金粒径大且均一。结果显示，图2有微量（1.2%）超大粒径金颗粒存在。

图1的检测条件描述：温度（℃）：25.0；光强269.2（kcps）：261.7；样品池描述：一次性定量比色皿；持续时间（s）：60；测量位置（mm）：1.05；衰减器：5；

图1的结果描述：平均粒径（d.nm）：49.92；多分散系数：0.140；截距：0.946；质量报告：Good；第1峰对应的粒径（d.nm）为57.61、百分比%为100.0、标准差（d.nm）为18.57；第2峰对应的粒径（d.nm）为0.000、百分比%为0.0、标准差（d.nm）为0.000；第3峰对应的粒径（d.nm）为0.000、百分比%为0.0、标准差（d.nm）为0.000。图2的检测条件描述：温度（℃）：25.0；光强269.2（kcps）：269.2；样品池描述：一次性定量比色皿；持续时间（s）：60；测量位置（mm）：0.85；衰减器：7；

图2的结果描述：平均粒径（d.nm）：36.61；多分散系数：0.221；截距：0.875；质量报告：Good；第1峰对应的粒径（d.nm）为46.39、百分比%为98.8、标准差（d.nm）为25.29；第2峰对应的粒径（d.nm）为0.000、百分比%为1.2、标准差（d.nm）为889.0；第3峰对应的粒径（d.nm）为0.000、百分比%为0.0、标准差（d.nm）为0.000。

实施例2

一、基础溶液配置

（1）0.2M碳酸钾溶液配置：用超纯水溶解碳酸钾，配置成0.2M碳酸钾浓度的碳酸钾溶液；

（2）20wt%BSA溶液配置：用超纯水溶解BSA，配置成20wt%浓度的BSA溶液；

（4）包被稀释液配置：用超纯水配置，其中含10mM PBS、5wt%海藻糖、3wt%的甲醇，包被稀释液的pH为7.4；

（5）样本垫处理液配置：用超纯水配置，其中含0.05M Tris-HCl缓冲液、150mM的NaCl、1wt%的Tween-20，封闭剂使用浓度为0.2mg/mL；

（6）标记耦合物储存液配置：用超纯水配置，其中含0.05MTris-HCl缓冲液、150mM的NaCl、0.05wt%的Tween-20、5wt%蔗糖和0.3wt%Casein（酪蛋白）；

（7）标记耦合物稀释液配置：用超纯水配置，其中含0.05MTris-HCl缓冲液、150mM的NaCl、2wt%的Tween-20、0.1wt%PVP40、5wt%蔗糖、和0.3wt%Casein。

二、检测试纸条制备

（1）对照组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测标记耦合物垫制备：

1）选择对照组烧制的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至7.0-7.1，以10μg/mL浓度加入抗新型冠状病毒（2019-nCoV）标记抗体1，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100（w/v）进行重悬，即获得对照组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测标记耦合物浓缩液；

2）选择对照组烧制的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至6.5-6.8，以10μg/mL浓度加入合成多肽a，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得对照组质控线标记耦合物浓缩液；

3）用标记耦合物稀释液将步骤1）制备的对照组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测标记耦合物浓缩液和步骤2）制备的对照组质控线标记耦合物浓缩液进行分别稀释（前者的稀释比例为1:5，后者的稀释比例为1:20）并混合，然后将所得混合液（胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1的浓度为10μg/mL，胶体金标记的合成多肽a的浓度为10μg/mL）均匀涂布在玻璃纤维上（混合液的用量为27mL，玻璃纤维规格是20cm×30cm），并放置45℃恒温恒湿箱烘干24小时，即获得对照组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测标记耦合物垫。

（2）对照组甲/乙型流感病毒抗原检测标记耦合物垫制备：

1）选择对照组制备的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至7.3-7.4，以10μg/mL浓度加入抗甲型流感病毒标记抗体1，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得对照组甲型流感病毒抗原检测标记耦合物浓缩液；

2）选择对照组制备的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至7.3-7.4，以10μg/mL浓度加入抗乙型流感病毒标记抗体1，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得对照组乙型流感病毒抗原检测标记耦合物浓缩液；

3）选择对照组制备的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至6.5-6.8，以10μg/mL浓度加入合成多肽b，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得对照组质控线标记耦合物浓缩液；

4）用标记耦合物稀释液将步骤1）制备的对照组甲型流感病毒抗原检测标记耦合物浓缩液、步骤2）制备的对照组乙型流感病毒抗原检测标记耦合物浓缩液和步骤3）制备的对照组质控线标记耦合物浓缩液进行分别稀释（稀释比例依次为1:8，1:10和1:20）并混合，然后将所得混合液（胶体金标记的抗甲型流感病毒标记抗体1的浓度为10μg/mL，胶体金标记的抗乙型流感病毒标记抗体1的浓度为10μg/mL，胶体金标记的合成多肽b的浓度为10μg/mL）均匀涂布在玻璃纤维上（混合液的用量为27mL，玻璃纤维规格是20cm×30cm），并放置45℃恒温恒湿箱烘干24小时，即获得对照组甲/乙型流感病毒抗原检测标记耦合物垫。

（3）实验组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测标记耦合物垫制备：

1）选择实验组制备的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至7.1-7.2，以10μg/mL浓度加入抗新型冠状病毒（2019-nCoV）标记抗体1，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得实验组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测标记耦合物浓缩液；

2）选择实验组制备的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至6.5-6.8，以10μg/mL浓度加入合成多肽a，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得实验组质控线标记耦合物浓缩液；

3）用标记耦合物稀释液将步骤1）制备的实验组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测标记耦合物浓缩液和步骤2）制备的实验组质控线标记耦合物浓缩液进行稀释（前者的稀释比例为1:5，后者的稀释比例为1:20，v/v）并混合，然后将所得混合液（胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1的浓度为10μg/mL，胶体金标记的合成多肽a的浓度为10μg/mL）均匀涂布在玻璃纤维上（混合液的用量为27mL，玻璃纤维规格是20cm×30cm），并放置45℃恒温恒湿箱烘干24小时，即获得实验组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测标记耦合物垫。

（4）实验组甲/乙型流感病毒抗原检测标记耦合物垫制备：

1）选择实验组制备的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至7.2-7.3，以10μg/mL浓度加入抗甲型流感病毒标记抗体，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得实验组甲型流感病毒抗原检测标记耦合物浓缩液；

2）选择实验组制备的胶体金管，用0.2M碳酸钾溶液调pH至7.2-7.3，以10μg/mL浓度加入抗乙型流感病毒标记抗体，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液（BSA在封闭反应中的初始反应浓度为0.2wt%），迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得实验组乙型流感病毒抗原检测标记耦合物浓缩液；

3）选择实验组制备的胶体金，用0.2M碳酸钾溶液调pH至6.5-6.8，以10μg/mL浓度加入合成多肽，迅速混匀后室温反应15min，然后加入1/100体积的20wt%BSA溶液，迅速混匀后室温反应20min，然后设置离心机（10℃，转速12000rpm）并离心20min，然后去除上清，用标记耦合物储存液按照1/100进行重悬，即获得实验组质控线标记耦合物浓缩液；

4）用标记耦合物稀释液将实验组甲型流感病毒抗原检测标记耦合物浓缩液、实验组甲型流感病毒抗原检测标记耦合物浓缩液和实验组质控线标记耦合物浓缩液进行稀释（稀释比例依次为1:8，1:10和1:20）并混合，然后将混合液（胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1的浓度为10μg/mL，胶体金标记的合成多肽a的浓度为10μg/mL）均匀涂布在玻璃纤维上（混合液的用量为27mL，玻璃纤维规格是20cm×30cm），并放置45℃恒温恒湿箱烘干24小时，即获得实验组甲/乙型流感病毒抗原检测标记耦合物垫。

（5）新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测包被NC膜制备

用包被稀释液分别稀释抗新型冠状病毒（2019-nCoV）包被抗体（即抗新型冠状病毒抗体2，T线）和鼠抗多肽抗体（即鼠抗合成多肽a抗体，C线），二者终浓度分别为1.5mg/mL和1.0mg/mL，用划膜仪按0.1μl/mm划线喷量和5mm划线间距要求包被，并将包被好的NC膜放入50℃恒温恒湿箱烘干48小时，即获得新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测包被NC膜。

（6）甲/乙型流感病毒抗原检测包被NC膜制备

用包被稀释液分别稀释抗甲型流感病毒包被抗体（即抗甲型流感病毒抗体2，A线）、抗乙型流感病毒包被抗体（即抗乙型流感病毒抗体2，B线）和鼠抗多肽抗体（即鼠抗合成多肽b抗体，C线），三者终浓度分别为1.5mg/mL、1.5mg/mL和1.0mg/mL，用划膜仪按0.1μl/mm划线喷量和4mm划线间距要求包被，并将包被好的NC膜放入50℃恒温恒湿箱烘干48小时，即获得甲/乙型流感病毒抗原检测包被NC膜。

（7）样本垫制备：

用样本垫处理液稀释封闭剂，封闭剂终浓度为0.2mg/mL，将稀释好的处理液均匀涂布在玻璃纤维上并放入50℃恒温恒湿箱烘干24小时，即获得新型冠状病毒（2019-nCoV）和甲/乙型流感病毒抗原检测试剂盒的样本垫。

三、检测试纸条组装

（1）对照组试纸条组装：

参照图3所示的试纸条结构进行组装，在PVC底板上按固定位置依次粘贴对照组甲/乙型流感病毒抗原检测包被NC膜、对照组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测包被NC膜、样本垫、对照组甲/乙型流感病毒抗原检测耦合物垫、对照组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测耦合物垫和吸水垫，粘贴合格后切割成3mm宽的试纸条，并封装入试纸盒中。

（2）实验组试纸条组装：

参照图3所示的试纸条结构进行组装，在PVC底板上按固定位置依次粘贴实验组甲/乙型流感病毒抗原检测包被NC膜、实验组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测包被NC膜、样本垫、实验组甲/乙型流感病毒抗原检测耦合物垫、实验组新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测耦合物垫和吸水垫，粘贴合格后切割成3mm宽的试纸条，并封装入试纸盒中。

试纸盒的盒体包括下盖和上盖，且上盖中间位置与所述样本垫正相对处设有加样孔，与所述包被NC膜正相对处开设有2个对称的检测窗口，以分别用于观察两种不同试纸条的检测结果。左侧窗口用于观察甲型流感病毒抗原检测结果（A线）和观察乙型流感病毒检测结果（B线），右侧窗口用于观察新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测结果（T线）。整体上，本实施例组装的新型冠状病毒（2019-nCoV）和甲/乙型流感病毒抗原检测试纸条100，包括底板10以及设于所述底板10上的样本垫20，

沿底板10的延伸方向，所述样本垫20的一侧设有第一检测功能区30，对侧设有第二检测功能区40；

第一检测功能区30包括依次连接的第一标记耦合物垫31、第一分析膜32和第一吸水垫33，第一标记耦合物垫31与所述样本垫20连接，第一分析膜32上设有第一检测线321（图4中“T”）和第一质控线322（图4中“C”）；

第二检测功能区40包括依次连接的第二标记耦合物垫41、第二分析膜42和第二吸水垫43，所述第二标记耦合物垫41与所述样本垫20连接，所述第二分析膜42上设有第二检测线421（图4中“A”）、422（图4中“B”）和第二质控线423（图4中“C”）。

本实施例中，抗新型冠状病毒抗体1、抗甲型流感病毒抗体1、抗乙型流感病毒抗体1、抗新型冠状病毒抗体2、抗甲型流感病毒抗体2、抗乙型流感病毒抗体2购自东莞菲鹏生物，抗合成多肽a抗体和抗合成多肽b抗体为同一抗体，购自武汉三渡生物。

四、测试

使用企业阳性参考品、检出限参考品、交叉样本及干扰样本对对照组试纸盒和实验组试纸盒进行对比检测，对比二者差异。测试数据如下：

（1）实验组试纸盒和对照组试纸盒阳性参考品测试数据：

表1

注：“+”表示有阳性，“-” 表示有阴性

实验组测试新型冠状病毒阳性参考品、乙型流感病毒阳性参考品和甲型流感病毒阳性参考品均能检出，对照组测试新型冠状病毒阳性参考品P8未检出，测试乙型流感病毒阳性参考品P2和P4未检出，同时P1与甲流有交叉反应。

（2）实验组试纸盒和对照组试纸盒检出限参考品测试数据

表2

新型冠状病毒检出限参考品实验组L1、L2、L3均检出，对照组仅检出L1和L2，乙型流感病毒检出限参考品实验组L4、L5均检出，对照组仅检出L4。

其中，新型冠状病毒检出限参考品L1-L4分别为新型冠状病毒强阳样本、中阳样本、弱阳样本、阴性样本，甲型流感病毒检出限参考品L1-L3分别为甲型流感病毒中阳样本、弱阳样本、阴性样本, 乙型流感病毒检出限参考品L4-L6分别为乙型流感病毒中阳样本、弱阳样本、阴性样本。

（3）实验组试纸盒和对照组试试纸盒交叉反应测试数据

依据下表交叉病原体样本的浓度添加阴性样本中，平行测试对照组试纸盒和实验组试纸盒，结果显示：对照组试纸盒存在个别假阳性，而实验组试纸盒均无交叉反应。

表3

（4）实验组试纸盒和对照组试纸盒抗干扰测试数据

按照下表潜在干扰物质浓度分别添加到弱阳性样本中，以未添加的弱阳性样本为对照组，实验组试纸盒和对照组试纸盒平行测试以上样本，均无明显干扰作用。

表4

实施例3

使用本实施例2提供的新型冠状病毒（2019-nCoV）和甲/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法），测试正常人和患者鼻咽拭子和鼻拭子样本，以核酸RT-PCR为参比试剂，评价其临床符合率。其中，所使用的样本提取液包含15mM PBS缓冲液、1wt% PVP40、150mMNaCl和0.5wt% NP40，pH值为7.4。

临床符合率测试结果总结如下：

1）鼻咽拭子

新型冠状病毒抗原：

表5

新型冠状病毒抗原检测灵敏度: 100/115 = 86.96%(95%CI: 79.59%-91.93%)；

新型冠状病毒抗原检测特异性: 456/458 = 99.56% (95%CI: 98.42%-99.88%)。

甲型流感病毒抗原：

表6

甲型流感病毒抗原检测灵敏度: 52/57 = 91.23% (95%CI: 81.06%-96.20%)；

甲型流感病毒抗原检测特异性: 413/415 = 99.52% (95%CI: 98.26%-99.87%)。

乙型流感病毒抗原：

表7

乙型流感病毒抗原检测灵敏度: 49/53 = 92.45% (95%CI: 82.14%-97.03%)；

乙型流感病毒抗原检测特异性: 416/419 = 99.28% (95%CI: 97.92%-99.76%)。

2）鼻拭子

新型冠状病毒抗原：

表8

新型冠状病毒抗原检测灵敏度: 96/115 = 83.48%(95%CI: 75.63%-89.16%)；

新型冠状病毒抗原检测特异性: 457/458 = 99.78% (95%CI: 98.77%-99.96%)。

甲型流感病毒抗原：

表9

甲型流感病毒抗原检测灵敏度: 50/57 = 87.72% (95%CI: 76.75%-93.92%)；

甲型流感病毒抗原检测特异性: 413/415 = 99.52% (95%CI: 98.26%-99.87%)。

乙型流感病毒抗原：

表10

乙型流感病毒抗原检测灵敏度: 47/53 = 88.68% (95%CI: 77.42%-94.71%)；

乙型流感病毒抗原检测特异性: 417/419 = 99.52% (95%CI: 98.28%-99.87%)。

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (29)

1.一种胶体金的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

加热胶体金晶核溶液至沸腾后进入第一阶段煮沸，加入还原剂溶液a，制备混合物A；

加热所述混合物A至沸腾后进入第二阶段煮沸，加入氯金酸溶液b，制备混合物B；

加热所述混合物B至沸腾后进入第三阶段煮沸，第三阶段煮沸至所得混合物C颜色稳定，制备胶体金；

所述还原剂溶液a中所含的还原剂a为柠檬酸钠；

第一阶段煮沸的时间为2min-5min。

2.根据权利要求1所述的胶体金的制备方法，其特征在于，所述还原剂溶液a中所述柠檬酸钠的浓度为1wt%-10wt%，所述氯金酸溶液b中氯金酸的浓度为1wt%-10wt%，所述还原剂溶液a和所述氯金酸溶液b的体积比为1：（1-2）。

3.根据权利要求1所述的胶体金的制备方法，其特征在于，第二阶段煮沸的时间为2min-5min。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的胶体金的制备方法，其特征在于，第三阶段煮沸的时间为10min-30min。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的胶体金的制备方法，其特征在于，所述胶体金晶核溶液具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述胶体金晶核溶液中胶体金晶核的平均粒径为15nm-20nm；和，

（2）所述胶体金晶核溶液的制备步骤包括：

加热氯金酸溶液b’至沸腾，继续煮沸，加入还原剂溶液a’，制备混合物D；

加热所述混合物D至沸腾，继续煮沸，直至所得混合物E颜色稳定，制备胶体金晶核溶液。

6.根据权利要求5所述的胶体金的制备方法，其特征在于，所述胶体金晶核溶液的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述氯金酸溶液b’和所述还原剂溶液a’的体积比为1：（2-3），所述氯金酸溶液b’中氯金酸的浓度为1wt%-10wt%，所述还原剂溶液a’中还原剂a’的浓度为1wt%-10wt%；

（2）所述氯金酸溶液b’沸腾后继续煮沸的时间为2min-5min；和，

（3）所述混合物D沸腾后继续煮沸的时间为10min-30min。

7.根据权利要求6所述的胶体金的制备方法，其特征在于，所述还原剂a’为柠檬酸钠。

8.根据权利要求1至3、6和7中任一项所述的胶体金的制备方法，其特征在于，所述胶体金中颗粒的平均粒径为40nm-60nm，分散指数为0.1-0.3。

9.权利要求1至8任一项所述的制备方法制备的胶体金。

10.一种免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包含有权利要求9所述的胶体金。

11.根据权利要求10所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条为新型冠状病毒抗原、甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的抗原联检试纸条。

12.根据权利要求11所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗原联检试纸条包括底板以及设于所述底板上的样本垫，

沿所述底板的延伸方向，所述样本垫的一侧设有第一检测功能区，对侧设有第二检测功能区；

所述第一检测功能区包括依次连接的第一标记耦合物垫、第一分析膜和第一吸水垫，所述第一标记耦合物垫与所述样本垫连接，所述第一分析膜上设有第一检测线和第一质控线；

所述第二检测功能区包括依次连接的第二标记耦合物垫、第二分析膜和第二吸水垫，所述第二标记耦合物垫与所述样本垫连接，所述第二分析膜上设有第二检测线和第二质控线；

所述第一检测功能区和所述第二检测功能区中的一个用于检测新型冠状病毒抗原，另一个用于检测所述甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原。

13.根据权利要求12所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述第一检测功能区用于检测所述新型冠状病毒抗原，

所述第一标记耦合物垫包被有所述胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1和所述胶体金标记的合成多肽a，

所述第一检测线上包被另一抗新型冠状病毒抗体2，所述第一质控线上包被抗所述合成多肽a抗体。

14.根据权利要求13所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述第一检测功能区具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述抗所述合成多肽a抗体为鼠抗；和，

（2）所述第一检测线和第一质控线之间的间距为3mm-5mm。

15.根据权利要求12所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述第二检测功能区用于检测所述甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原，

所述第二标记耦合物垫包被有所述胶体金标记的抗甲型流感病毒抗体1、所述胶体金标记的抗乙型流感病毒抗体1和所述胶体金标记的合成多肽b，

所述第二检测线的数量大于等于2，其中一条第二检测线上包被另一抗甲型流感病毒抗体2，另一条第二检测线上包被另一抗乙型流感病毒抗体2，所述第二质控线上包被抗所述合成多肽b抗体。

16.根据权利要求15所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述第二检测功能区具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述抗所述合成多肽b抗体为鼠抗；和，

（2）所述第二检测线之间以及所述第二检测线和所述第二质控线之间的间距为3mm-5mm。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述第一检测功能区和所述第二检测功能区域呈轴对称。

18.根据权利要求12至16中任一项所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗原联检试纸条具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述底板为PVC板；

（2）所述第一分析膜或/和所述第二分析膜为硝酸纤维素膜；

（3）所述第一标记耦合物垫或/和所述第二标记耦合物垫各自独立地选自玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜；

（4）所述样本垫为经过封闭处理的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜；

（5）所述第一吸水垫或/和所述第二吸水垫为滤纸；和，

（6）所述抗原联检试纸条的宽度为2.5mm-4mm。

19.免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试纸盒，所述试纸盒包括盒体以及安装在所述盒体中的权利要求12至18任一项所述的免疫层析试纸条，

所述盒体上设有加样孔、第一检测窗口和第二检测窗口，

所述加样孔与所述免疫层析试纸条上的所述样本垫对应，用于向所述样本垫滴加检测样本；

所述第一检测窗口与所述免疫层析试纸条上的所述第一分析膜对应，用于观察所述第一检测功能区的检测结果，

所述第二检测窗口与所述免疫层析试纸条上的所述第二分析膜对应，用于观察所述第二检测功能区的检测结果。

20.根据权利要求19所述的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本提取液和取样拭子中的一种或者多种。

21.根据权利要求20所述的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述样本提取液包含10mM-20mM PBS缓冲液、0.1wt%-2wt% PVP40、100mM-200mM NaCl和0.1wt%-1wt% NP40，pH值为7.2-7.6。

22.权利要求10至18中任一项所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括采用权利要求9所述的胶体金制备免疫层析试纸条的步骤。

23.根据权利要求22所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述免疫层析试纸条如权利要求13至18中任一项定义，所述制备方法包括：将所述底板、所述样本垫、所述第一吸水垫、所述第二吸水垫、所述第一标记耦合物垫、所述第二标记耦合物垫、所述第一分析膜和所述第二分析膜组装在所述底板上，制备所述免疫层析试纸条。

24.根据权利要求23所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述样本垫的制备步骤包括：

将含封闭剂a的样本垫处理液涂在所述的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜上，干燥，制备样本垫。

25.根据权利要求24所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述样本垫的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述样本垫处理液包含0.01M-0.05M Tris-HCl缓冲液、100mM -200mM NaCl、0.1wt%-1wt%Tween-20以及0.05mg/mL-1.0mg/mL所述封闭剂a，pH值为8-9；

（2）所述封闭剂a为BSA；和，

（3）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃，时间为12h-24h。

26.根据权利要求23所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述第一分析膜的制备步骤包括：

分别制备包含所述抗新型冠状病毒抗体2的第一检测线包被液和包含抗所述合成多肽a抗体的第一质控线包被液；

分别用所述第一检测线包被液和所述第一质控线包被液在硝酸纤维素膜上划线，干燥，相应形成第一检测线和第一质控线，制备第一分析膜；

和，

（2）所述第二分析膜的制备步骤包括：

分别制备包含所述抗甲型流感病毒抗体2的第二检测线包被液a、包含所述抗乙型流感病毒抗体2的第二检测线包被液b和包含所述抗合成多肽b抗体的第二质控线包被液；

分别用所述第二检测线包被液a、所述第二检测线包被液b和所述第二质控线包被液在硝酸纤维素膜上划线，干燥，相应形成两条第二检测线和第二质控线，制备第二分析膜。

27.根据权利要求26所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述的第一检测线包被液、第一质控线包被液、第二检测线包被液a、第二检测线包被液b和第二质控线包被液各自独立地包含10mM-20mM PBS缓冲液、1wt%-10wt%海藻糖和1wt%-10wt%甲醇，pH值为7.2-7.6；

（2）所述的抗新型冠状病毒抗体2、所述抗甲型流感病毒抗体2、所述抗乙型流感病毒抗体2、抗所述合成多肽a抗体和抗所述合成多肽b抗体的浓度各地独立地为0.1mg/mL-3.0mg/mL；

（3）所述的第一检测线包被液、第一质控线包被液、第二检测线包被液a、第二检测线包被液b和第二质控线包被液的划线用量各自独立地为0.06μL/mm-0.2μL/mm；和，

（4）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃，时间为12h-48h。

28.根据权利要求23所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，将所述第一标记耦合物垫和所述第二标记耦合物垫记作标记耦合物垫，将所述的抗新型冠状病毒抗体1、抗甲型流感病毒抗体1、抗乙型流感病毒抗体1、合成多肽a和合成多肽b记作待标记蛋白，相应地，将所述的胶体金标记的抗新型冠状病毒抗体1、抗甲型流感病毒抗体1、抗乙型流感病毒抗体1、合成多肽a和合成多肽b记作胶体金标记蛋白，

所述标记耦合物垫的制备步骤包括：制备包含胶体金标记蛋白的标记溶液，将所述标记溶液涂在所述的玻璃纤维膜或者醋酸纤维膜上，干燥，制备标记耦合物垫；

其中，所述胶体金标记蛋白的制备步骤包括：

调节所述胶体金的pH值至所述待标记蛋白的等电点或者接近所述待标记蛋白的等电点，加入所述待标记蛋白，进行耦合反应；

向耦合反应的产物中加入封闭剂b，进行封闭反应；

对封闭反应的产物进行离心，收集沉淀，制备胶体金标记蛋白。

29.根据权利要求28所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述标记耦合物垫的制备步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：

（1）所述标记溶液中的所述胶体金标记蛋白的浓度为5μg/mL-20μg/mL；

（2）所述标记溶液的用量为0.045mL/cm²-0.052mL/cm²；

（3）干燥的条件包括：烘干，温度为45℃-50℃，时间为12h-24h；

（4）耦合反应的条件包括：温度为20℃-30℃，时间为15min-20min，所述待标记蛋白的初始反应浓度为5μg/mL-20μg/mL；

（5）封闭反应的条件包括：温度为20℃-30℃，时间为15min-20min，所述封闭剂b的初始浓度为0.1wt%-1wt%；

（6）离心的条件包括：温度为4℃-10℃，时间为20min-40min，速度为5000rpm-12000rpm；

（7）调节所述胶体金的pH值采用碳酸钾浓度为0.1M -0.2M的碳酸钾溶液；和，

（8）所述封闭剂b为BSA。

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