CN105675871A - 试剂盒，其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种试剂盒、其制备方法和应用。其中一种大肠杆菌O157:H7检测试剂盒包括试纸条和纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体（简称“金标抗体”），该试纸条包括样本垫以及表面分布有彼此不重合的检测线和质控线的检测垫等，该金标抗体包含单分散的纳米金球和标记在纳米金球上的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，其中纳米金球具有与试纸条读取仪光源波长耦合的等离子光学波长。本发明基于传统免疫层析技术，通过优化纳米金粒子的光学性能和单分散度，实现光学理论上能与试纸条读取仪光源波长达到最佳耦合效果，提高试纸条的检测性能。采用本发明的技术方案，可以大幅提高大肠杆菌O157:H7等物质的检测灵敏度，增加检测范围，实现精确的定量检测，且操作简单。

Description

试剂盒，其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种大肠杆菌O157:H7检测试剂盒、其制备方法和应用，属于微生物检测领域。

技术背景

大肠杆菌O157:H7是目前世界上公认的三大最主要的食源性致病菌之一。自1982年美国科学家发现以来，其危害日益严重。它可以通过污染猪肉、禽肉、牛肉、牛奶、三明治、果汁、蔬菜和饮水等进行传播，也可以通过人与动物，人与人之间接触传播，进而危害人的生体健康。大肠杆菌O157:H7的感染剂量极低，最低10个活菌就可能感染致病。感染患者一般出现腹部绞痛、非出血性腹泻、呕吐、低度发热症状以及溶血性尿毒综合症，甚至导致急性肾衰竭而死亡。因此，快速、高灵敏的检测大肠杆菌O157:H7具有非常重大的理论和现实意义。

相比传统的检测大肠杆菌O157:H7的方法(分离鉴定法、PCR方法和生物传感器方法)，胶体金免疫层析法可以避免传统方法的耗时费力(一般2-7天)，具有便捷、特异敏感、稳定性强、快速(一般15分钟)、不需特殊设备、结果判断直观、可以现场进行检测等特点。但胶体金试纸条的检测灵敏度相对不高(通常高于10⁴CFU/mL)，这个缺陷限制了其在食品和农产品中的普及使用以及定量检测。虽然业界提尝试通过改良试纸条读取仪和最大限度消除试纸条背景干扰信号等方式来提高胶体金试纸条的检测灵敏度，但其效果均不明显。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种新型的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，其通过优化纳米金粒子的光学性能和单分散度，实现光学理论上能与试纸条读取仪光源波长达到最佳的耦合效果，从而大幅提高试纸条的检测性能。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述大肠杆菌O157:H7检测试剂盒的方法。

本发明的再一目的在于提供所述大肠杆菌O157:H7检测试剂盒的用途，例如，利用所述试剂盒实现的大肠杆菌O157:H7检测方法。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

一种大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，包含：

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条，包括：

样本垫，用以向所述试纸条内摄入添加有纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的液态待检测样品，

以及，表面分布有彼此不重合的检测线和和质控线的检测垫，所述检测线包含仅在有大肠杆菌O157:H7存在时能与所述纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及大肠杆菌O157:H7结合的第一抗体，而所述质控线内包含在无大肠杆菌O157:H7存在时就能与所述纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体结合的第二抗体，

所述样本垫与检测垫的边缘部相互接触或重合；

以及，纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，包含单分散的纳米金球和标记在所述纳米金球上的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，其中所述纳米金球具有与试纸条读取仪光源波长耦合的等离子光学波长。

在一可选实施方案之中，所述试纸条包括依次分布于基板上的样本垫、检测垫和吸水垫，其中所述检测垫与吸水垫的边缘部相互接触或重合。

较为优选的，所述单分散的纳米金球的粒子分散度PDI为0.20-0.65，等离子光学波长为520-560cm^-1，粒径为18-60nm。

尤为优选的，所述单分散的纳米金球的粒子分散度PDI为0.20。

进一步的，所述第一抗体包括大肠杆菌O157:H7兔多抗，所述第二抗体包括驴抗鼠二抗。

进一步的，所述检测垫采用硝酸纤维膜。

前述任一种试剂盒的制备方法，包括：

纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备，包括：将HAuCl₄与柠檬酸三钠在水相反应体系中于100-150℃恒温回流，使反应溶液颜色从浅黄→浅紫色→浅红色→酒红色，获得粒子分散度PDI为0.20-0.65的、粒径为18-60nm、等离子光学波长为520-560cm^-1的纳米金球，再将所述纳米金球的分散液与大肠杆菌O157:H7单克隆抗体混合搅拌，并以BSA和PEG2000进行封闭，离心除去未标记的抗体，用复溶液复溶，备用；

胶体金试纸条的制备，包括：将样本垫、检测垫、吸水垫依次粘贴在基板上，并将第一抗体和第二抗体分别施加至检测垫上，形成检测线和和质控线。

一种大肠杆菌O157:H7检测系统，包含前述任一种试剂盒以及试纸条读取仪光源。

一种大肠杆菌O157:H7检测方法，包括：

提供前述任一种试剂盒；

将所述纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体加入液态的待检测样品并充分混合，再取混合物滴加至所述试纸条的样本垫上，待混合物在试纸条上充分扩散后，则：

观察试纸条颜色变化，而定性分析待检测样品中是否存在大肠杆菌O157:H7；

或者，以试纸条读取仪读取，记录T、C值和T/C值，并与标准曲线对照，定量检测待检测样品中大肠杆菌O157:H7的含量。

进一步的，该方法对于大肠杆菌O157:H7的检测限为10²CFU/mL。

前述标准曲线可通过业界悉知的方式获得，即制备一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7的标准样品，依照前述的检测方法，分别获得和记录T、C值和T/C值，再依据所获检测结果和相应标准样品的浓度，探知检测结果与样品浓度存在确定的数学关系，从而建立标准曲线。

其中，T、C值分别为试纸条读取仪测得的检测线(T线)和和质控线(C线)的检测值，例如吸光度值等。

本发明的再一重要目的还在于提供一种试剂盒，包括：

试纸条，包括：

样本垫，用以向所述试纸条内摄入含有纳米金标记物的液体样品，

表面分布有彼此不重合的检测线和和质控线的检测垫，所述检测线包含仅在有目标物质存在时能与所述纳米金标记物及目标物质结合的识别物质，而所述质控线内包含在无目标物质存在时就能与所述纳米金标记物结合的参考物质，

所述样本垫与检测垫的边缘部相互接触或重合；

以及，纳米金标记物质，包含单分散的纳米金球以及结合在所述纳米金球上的、能与目标物质特异性结合的标记物，其中所述纳米金球具有与试纸条读取仪光源波长耦合的等离子光学波长。

进一步的，其中目标物质与所述纳米金标记物、识别物质系呈夹心结合的方式，特别是，目标物质被结合于纳米金标记物和识别物质之间。

该试剂盒对于某些生物、化学物质的检测均是适用的，特别适于对具备双抗体夹心结合性能的蛋白质等目标物质的检测。

本发明还提供了基于所述试剂盒的检测方法和检测系统。

其中，该检测方法包括：将所述纳米金标记物加入液态的待检测样品并充分混合，再取混合物滴加至所述试纸条的样本垫上，待混合物在试纸条上充分扩散后，则：

观察试纸条颜色变化，而定性分析待检测样品中是否存在目标物质；

或者，以试纸条读取仪读取，记录T、C值和T/C值，并与标准曲线对照，定量检测待检测样品中目标物质的含量。

其中，该检测系统包含前述任一种试剂盒以及试纸条读取仪光源。

与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：

(1)通过优化纳米金颗粒(亦称“纳米金球”、“金纳米球”、“金纳米粒子”、“纳米金粒子”等)的大小，调控其光学波长在525-560nm之间，进而使其中纳米金颗粒的波长与试纸条读取仪光源波长达到最佳的耦合效果，并使检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度最高(比传统胶体金试纸条检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度提高至少2个数量级)，检测范围宽(10²～10⁷CFU/mL，优选在10²～10⁵CFU/mL)；

(2)通过优化纳米金颗粒的单分散性，使试纸条对于大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度相应提高；

(3)通过使用单分散性好的纳米金粒子，不仅具有散射光强，可提高试纸条的灵敏度，还可大幅减少非特异性反应，降低假阳性，有效增强试纸条的检测稳定性达成双重增强检测灵敏度的效果；

(4)通过优化免疫层析反应，免去了将胶体金喷在结合垫上的步骤，免疫学反应结果更加稳定，定量检测时变异系数减小，非特异性降低。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案之中使用免疫层析试纸条(胶体金试纸条)检测阴性样本的示意图；

图2是本发明一典型实施方案之中使用免疫层析试纸条检测阳性样本的示意图。

具体实施方式

本发明主要是通过优化纳米金粒子的光学性能和分散度，实现光学理论上能与试纸条读取仪光源达到最佳的波长共轭效果，提高胶体金试纸条对大肠杆菌O157:H7的检测性能。

进一步的讲，本发明是根据胶体金试纸条的检测原理，纳米金粒子标记的抗体1与大肠杆菌O157:H7结合后，再分别与检测线和控制线上抗体2和抗体3相结合的结果，通过判断检测线上纳米金粒子聚集的颜色变化(肉眼辨认)或检测线上的光强变化(试纸条读取仪的光学信号)来定性或定量检测大肠杆菌O157:H7。检测线上纳米金的颜色或光学信号变化的核心来源纳米金粒子的光学性质，因此，精确调控纳米金粒子的光学性质以及调控纳米金光学信号与试纸条读取仪光源信号的共轭效果，可以最大限度地提高胶体金试纸条的检测灵敏度。

例如，在本发明的一典型实施案例中，本发明可通过如下技术方案实现：

(1)制备具有不同等离子光学性能的纳米金球：将合适浓度的，例如2.5×10^-4MHAuCl₄水溶液与合适浓度的，例如0.1％(W/W)柠檬酸三钠溶液在100-150℃恒温回流，使纳米金粒子均匀生长，液颜色从浅黄→浅紫色→红色→酒红色，得到粒子分散度优良的纳米金球(静态光散射测试的粒子分散度PDI为0.20)。调整金离子溶液与柠檬酸钠的比例，得到不同大小(18-60nm)具有不同等离子光学波长(520-560cm^-1)的纳米金球。

(2)制备具有不同单分散度的纳米金球：取合适浓度的，例如，例如100mL2.5×10^-4MHAuCl₄溶液煮沸，加入合适浓度的，例如1mL1％柠檬酸三钠溶液，溶液颜色从浅黄→蓝色→深蓝→红色,当溶液的颜色完全变为透明的红色时，停止加热，冷却至室温，得到单分散度PDI为0.65的纳米金颗粒。然后与步骤(1)具有相同光学波长单分散度PDI为0.20的纳米金混合，调整不同比例混合，可以得到粒子单分散度PDI在0.20-0.65之间的不同纳米金球。

(3)纳米金的标记：取一定量的，例如3mL纳米金溶液，调节pH，加入一定量的，例如0.3mL大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，搅拌1h，加入1.5mL2％BSA封闭0.5h，加入1.5mL5％PEG20000封闭0.5h，9000r/min离心30min，去上清，以一定量的，例如0.3mL复溶液复溶，并将获得的金标抗体于4℃存放备用。

(4)制作免疫层析试纸条：将大肠杆菌O157:H7兔多抗和驴抗鼠二抗喷到检测垫(可选用硝酸纤维膜)上分别作为检测线和质控线，浓度均为1.0～2.0mg/mL，37℃真空干燥过夜，将样本垫、检测垫、吸水纸、滤纸依次粘贴在基板(例如PVC底板)上，贴好后将其切成合适尺寸的，例如4mm宽的试纸条，装入卡中。将制备好的试纸条置于锡箔袋中，加入干燥剂后密封并置于干燥缸保存备用。

(5)利用双抗夹心法对样品进行目测和使用仪器测定结果：取一定量的，例如4μL制备好的金标抗体颗粒滴加到ELISA孔板中，将一定量的，例如100μL稀释好的不同浓度梯度的菌液加入有金标抗体的ELISA孔板中，取出金-抗体-菌复合物滴加到试纸条的样品孔中，10min后用肉眼观察试纸条颜色变化，并用试纸条读取仪读取，记录T、C值和T/C的值。

(6)检测结果的判定：大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体包被在硝酸纤维膜上形成检测线，驴抗鼠二抗包被在硝酸纤维膜上作为质控线。当待测样品中不含大肠杆菌O157:H7时，金标抗体将不与检测线上的抗体作用，只与质控线上的抗体结合，可通过肉眼(检测线不显色，质控线显色)和试纸条读取仪(检测线无信号，质控线有信号)，判断其为阴性(见图1)。若样品中含有一定浓度的大肠杆菌O157:H7时，大肠杆菌O157:H7先与金标抗体结合，形成大肠杆菌O157:H7-抗体-纳米金复合物，由于免疫学反应原理形成抗体—抗原(大肠杆菌O157:H7)—纳米金抗体复合物而富集在检测线上，多余的纳米金-抗体标记物继续移动到质控线位置，可通过肉眼(检测线显色，质控线显色)和试纸条读取仪(检测线无信号，质控线有信号)，判断其为阳性(见图2)。如果质控线处没有颜色或者没有明显信号，说明试纸条有质量问题，测试无效。

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：使用单分散度好的纳米金对牛奶中大肠杆菌O157:H7的检测

1.制备纳米金：取100mL2.5×10^-4mol/mLHAuCl₄溶液加热至100-150℃，加入10mL1％柠檬酸三钠溶液，溶液颜色从浅黄→浅紫色→浅红色→酒红色,当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时,继续回流10min后停止加热，冷却至室温，4℃保存，得到分散度PDI为0.20的纳米金颗粒，紫外光谱吸收波长为526nm。

2.纳米金的标记：取3mL上述纳米金溶液，调节pH，加入0.3mL大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，搅拌1h，加入1.5mL2％BSA封闭0.5h，加入1.5mL5％PEG20000封闭0.5h,9000r/min离心30min，去上清，0.3mL复溶液复溶，4℃备用。

3.取25mL灭过菌的牛奶加入到225mL培养基中，接种一定浓度的大肠杆菌O157:H7，温度在36℃±1℃，时间为8～18h，震荡培养。

4.制作大肠杆菌O157:H7免疫层析试纸条：将大肠杆菌O157:H7兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，浓度均为1.0～2.0mg/mL，喷量均为1.0～2.5μL/cm，37℃真空干燥过夜，将样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装入卡中。将制备好的试纸条置于锡箔袋中并加入干燥剂密封，置于干燥缸保存备用。

5.利用双抗夹心法对样品进行目测和使用仪器测定结果：将2中制备的金标记抗体加入ELISA板中，将培养大肠杆菌O157:H7的牛奶100μL滴加到孵育纳米金抗体的酶标板中，将复合物加入试纸条加样孔中，10min后用肉眼判读并用试纸条读取仪读取，记录T、C值和T/C的值，以不同菌的浓度为横坐标，分别以T线吸光度、T/C值为纵坐标绘制标准曲线。

6.参考所做的标准曲线图，对普通牛奶样品中的检验结果进行确证。定量检验菌浓度的范围在10²～10⁵CFU/mL。

实施例2：使用单分散度好的对牛肉中大肠杆菌O157:H7的检测

1.制备纳米金：取100mL2.5×10^-4mol/mLHAuCl₄溶液加热至100-150℃，加入10mL1％柠檬酸三钠溶液，溶液颜色从浅黄→浅紫色→浅红色→酒红色,当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时,继续回流10min后停止加热，冷却至室温，4℃保存，得到分散度PDI为0.20的纳米金颗粒，紫外光谱吸收波长为526nm。

2.纳米金的标记：取3mL纳米金溶液，调节pH，加入0.3mL大肠杆菌O157:H7单克隆抗体0.3mL，搅拌1h，加入1.5mL2％BSA封闭0.5h，加入1.5mL5％PEG20000封闭0.5h,9000r/min离心30min，去上清，0.3mL复溶液复溶，4℃备用。

3.取25mL灭过菌的牛肉糜加入到225mL培养基中，接种一定浓度的大肠杆菌O157:H7，温度在36℃±1℃，时间为8～18h震荡培养。

4.制作大肠杆菌O157:H7免疫层析试纸条：将大肠杆菌O157:H7兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，浓度均为1.0～2.0mg/mL，喷两均为1～2.5μL/cm，37℃真空干燥过夜，将样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装入卡中。将制备好的试纸条置于锡箔袋中并加入干燥剂密封，置于干燥缸保存备用。

5.利用双抗夹心法对样品进行目测和使用仪器测定结果：将分散度好的纳米金标记抗体加入ELISA板中，将培养大肠杆菌O157:H7的牛肉糜100μL滴加到有纳米金抗体的酶标板中，将复合物加入试纸条加样孔中，10min用肉眼判读并用试纸条读取仪读取，记录T、C值和T/C的值，以不同菌的浓度为横坐标，分别以T线吸光度、T/C值为纵坐标绘制标准曲线。

6.参考所做的标准曲线图，对牛肉糜样品中的检验结果进行确证。定量检验菌浓度的范围在10²～10⁵CFU/mL。

利用本发明的方法，可大幅提高大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度，增加检测限范围，实现高灵敏度的定量检测，且操作简单，检测结果准确。

应当指出，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其特征在于包括：

试纸条，包括：

样本垫，用以向所述试纸条内摄入含有纳米金标记物的液体样品，

表面分布有彼此不重合的检测线和和质控线的检测垫，所述检测线包含仅在有目标物质存在时能与所述纳米金标记物及目标物质结合的识别物质，而所述质控线内包含在无目标物质存在时就能与所述纳米金标记物结合的参考物质，

所述样本垫与检测垫的边缘部相互接触或重合；

以及，纳米金标记物质，包含单分散的纳米金球以及结合在所述纳米金球上的、能与目标物质特异性结合的标记物，其中所述纳米金球具有与试纸条读取仪光源波长耦合的等离子光学波长。

2.一种大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，其特征在于包含：

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条，包括：

样本垫，用以向所述试纸条内摄入添加有纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的液态待检测样品，

以及，表面分布有彼此不重合的检测线和和质控线的检测垫，所述检测线包含仅在有大肠杆菌O157:H7存在时能与所述纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及大肠杆菌O157:H7结合的第一抗体，而所述质控线内包含在无大肠杆菌O157:H7存在时就能与所述纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体结合的第二抗体，

所述样本垫与检测垫的边缘部相互接触或重合；

以及，纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，包含单分散的纳米金球和标记在所述纳米金球上的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，其中所述纳米金球具有与试纸条读取仪光源波长耦合的等离子光学波长。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条包括依次分布于基板上的样本垫、检测垫和吸水垫，其中所述检测垫与吸水垫的边缘部相互接触或重合。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述单分散的纳米金球的粒子分散度PDI为0.20-0.65，优选为0.20，等离子光学波长为520-560cm^-1，粒径为18-60nm。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述第一抗体包括大肠杆菌O157:H7兔多抗，所述第二抗体包括驴抗鼠二抗。

6.根据权利要求2所述的大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条，其特征在于所述检测垫采用硝酸纤维膜。

7.权利要求2-6中任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括：

纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备，包括：将HAuCl₄与柠檬酸三钠在水相反应体系中于100-150℃恒温回流，使反应溶液颜色从浅黄→浅紫色→浅红色→酒红色，获得粒子分散度PDI为0.20-0.65的、粒径为18-60nm、等离子光学波长为520-560cm^-1的纳米金球，再将所述纳米金球的分散液与大肠杆菌O157:H7单克隆抗体混合搅拌，并以BSA和PEG2000进行封闭，离心除去未标记的抗体，用复溶液复溶，备用；

胶体金试纸条的制备，包括：将样本垫、检测垫、吸水垫依次粘贴在基板上，并将第一抗体和第二抗体分别施加至检测垫上，形成检测线和和质控线。

8.一种大肠杆菌O157:H7检测方法，其特征在于包括：

提供权利要求2-6中任一项所述的试剂盒；

将所述纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体加入液态的待检测样品并充分混合，再取混合物滴加至所述试纸条的样本垫上，待混合物在试纸条上充分扩散后，则：

观察试纸条颜色变化，而定性分析待检测样品中是否存在大肠杆菌O157:H7；

或者，以试纸条读取仪读取，记录T、C值和T/C值，并与标准曲线对照，定量检测待检测样品中大肠杆菌O157:H7的含量。

9.根据权利要求8所述大肠杆菌O157:H7检测方法，其特征在于该方法对于大肠杆菌O157:H7的检测限为10²CFU/mL。

10.一种检测系统，其特征在于包含权利要求1-6中任一项所述的试剂盒以及试纸条读取仪光源。