CN114878804A - 一种用于胶体金法新冠病毒抗原检测卡的样本稀释液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于胶体金法新冠病毒抗原检测卡的样本稀释液，包括Tris缓冲液0.1％‑2％，NP40 0.5％‑3％，TritonX‑100 0.1％‑5％，Proclin300 0.05％，磷脂酶0.001％‑2％，胰蛋白酶0.001％‑2％，胶原酶0.001％‑2％，碱性磷酸酶0.001％‑2％，0.02％EDTA，NaCl 0.8％‑2％，酪蛋白0.01％‑5％。本发明在传统的稀释液中加入破坏细胞膜成分的磷脂酶和碱性磷酸酶，两者能够协同作用，显著提高破坏新型冠状病毒最外层膜结构的能力，从而增加新冠病毒核衣壳蛋白的暴露率，大幅增加检测卡的检出率，从而增加灵敏度。

Description

一种用于胶体金法新冠病毒抗原检测卡的样本稀释液
技术领域
本发明涉及抗原检测技术领域，具体涉及一种用于胶体金法新冠病毒抗原检测卡的样本稀释液。
背景技术
新冠病毒抗原检测是通过抗原和抗体结合反应在试纸条上检测，方便快捷，一般15-20分钟即可出结果。目前新冠病毒抗原检测的方法主要有：胶体金法、荧光免疫层析法和乳胶法。其中以胶体金法进行抗原检测的占绝大多数。胶体金法是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金也是免疫电镜技术中较为理想的免疫标记物，主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。胶体金法抗原检测试剂盒里面包含了检测卡、样本稀释液、吸滴管。其检测步骤为采集样本，往检测卡加样孔中滴入样本(如果稀释液，加入样本与稀释液混合物)，水平静置等待15～20分钟，在检测卡观察孔中查看检测线(T)与质控线(C)有无红色条带出现。结果判读首先根据质控线，无红色条带出现，该次检测无效；有红色条带出现，其次根据检测线，无红色条带出现，为阴性，有红色条带出现，为阳性。
胶体金法的新冠抗原检测卡由于其检测方法简单，价格低廉，检测方便快捷，成为人员筛查以及居家自测的首选。胶体金法的新冠抗原检测卡是检测新冠抗原的核衣壳蛋白，它与核酸检测法相比灵敏度较低，这样会给防疫工作带来相应的风险，因此提高其灵敏度成为目前较为紧迫的问题。新冠抗原检测卡的灵敏度主要跟抗体、胶体金颗粒、硝酸纤维素膜、样本稀释液有关。本发明提供一种高灵敏度的样本稀释液，能够提高破坏新型冠状病毒的最外层膜，从而增加核衣壳蛋白的暴露率，增加检测卡的检出率，从而增加灵敏度。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于胶体金法新冠病毒抗原检测卡的样本稀释液。本发明的样本稀释液可以显著提高检测的灵敏度，增加检测卡的检出率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于胶体金法新冠病毒抗原检测卡的样本稀释液，其特征在于，包括以下重量百分比的原料：
Tris缓冲液0.1％-2％，表面活性剂1.5～8％，防腐剂0.05％，裂解剂0.024～8.02％，电解质0.8％-2％，稳定剂0.01％-5％，余量为纯化水；
所述裂解剂含有磷脂酶和碱性磷酸酶。
本发明中，新冠病毒是指冠状病毒SARS-CoV-2。
优选的，所述样本稀释液的pH值为5.0-10.0。
优选的，所述表面活性剂包括乙基苯基聚乙二醇(NP 40)和聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)；所述NP 40的用量占样本稀释液总重量的0.5％-3％；所述TritonX-100的用量占样本稀释液总重量的0.1％-5％。
优选的，所述防腐剂为Proclin300。
优选的，所述裂解剂由磷脂酶，胰蛋白酶，胶原酶，碱性磷酸酶和EDTA组成。
优选的，所述磷脂酶的用量占样本稀释液总重量的0.001％-2％；所述胰蛋白酶的用量占样本稀释液总重量的0.001％-2％；所述胶原酶的用量占样本稀释液总重量的0.001％-2％；所述碱性磷酸酶的用量占样本稀释液总重量的0.001％-2％，所述EDTA的用量占样本稀释液总重量的0.02％。
优选的，所述电解质为NaCl。
优选的，所述稳定剂为酪蛋白。
本发明的第二方面，提供样本稀释液在制备高灵敏度胶体金法新冠病毒抗原检测卡中的应用。
本发明的第三方面，提供样本稀释液的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：先取纯化水的80～90wt％，向其中加入Tris缓冲液、表面活性剂、防腐剂和电解质，搅拌至完全溶解；再加入稳定剂和裂解剂，调节pH为5～10，加入剩余纯化水，搅拌至完全溶解，得到样本稀释液。
本发明的有益效果：
本发明在传统的稀释液中加入破坏细胞膜成分的磷脂酶和碱性磷酸酶，两者能够协同作用，显著提高破坏新型冠状病毒最外层膜结构的能力，从而增加新冠病毒核衣壳蛋白的暴露率，大幅增加检测卡的检出率，从而增加灵敏度。
附图说明
图1：病毒灭活培养液在稀释100倍后的检测结果，图中样本1～4依次为对比例1、对比例2、对比例3和实施例的样本稀释液稀释后的检测结果；
图2：病毒灭活培养液在稀释1000倍后的检测结果，图中样本1～4依次为对比例1、对比例2、对比例3和实施例的样本稀释液稀释后的检测结果；
图3：病毒灭活培养液在稀释1万倍后的检测结果，图中样本1～4依次为对比例1、对比例2、对比例3和实施例的样本稀释液稀释后的检测结果。
图4：病毒灭活培养液在稀释10万倍后的检测结果，图中样本1～4依次为对比例1、对比例2、对比例3和实施例的样本稀释液稀释后的检测结果。
图5：病毒灭活培养液在稀释23万倍后的检测结果，图中样本1～4依次为对比例1、对比例2、对比例3和实施例的样本稀释液稀释后的检测结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，胶体金法的新冠抗原检测卡是检测新冠抗原的核衣壳蛋白，它与核酸检测法相比灵敏度较低，这样会给防疫工作带来相应的风险，因此提高其灵敏度成为目前较为紧迫的问题。新冠抗原检测卡的灵敏度主要跟抗体、胶体金颗粒、硝酸纤维素膜、样本稀释液有关。
基于此，本发明的目的是提供一种用于胶体金法新冠病毒抗原检测卡的样本稀释液，能够提高破坏新型冠状病毒的最外层膜，从而增加核衣壳蛋白的暴露率，增加检测卡的检出率，从而增加灵敏度。本发明通过研究发现，向传统样本稀释液中加入破坏细胞膜成分的磷脂酶和碱性磷酸酶，两者能够协同作用，可显著提高破坏新型冠状病毒最外层膜结构的能力，从而增加新冠病毒的核衣壳蛋白的暴露率。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例
加入纯化水(ρ＝1.0g/mL)80g。在电子天平上准确称取Tris 121.14mg，NaCl977.5mg，NP 40 600mg，Proclin300 50mg，TritonX-100 1.0g，搅拌溶解均匀，加入酪蛋白120mg，磷脂酶100mg，胰蛋白酶100mg，胶原酶100mg，碱性磷酸酶100mg，EDTA20mg，调节pH值为8.0±0.1，加入剩余纯化水(ρ＝1.0g/mL)至溶液总重为100.0g，搅拌至完全溶解，得到样本稀释液，记为S-P+ALP。
对比例1
与实施例的区别在于：不加入磷脂酶和碱性磷酸酶，得到样本稀释液，记为S-0。
对比例2
与实施例的区别在于：不加入磷脂酶，得到样本稀释液，记为S-P。
对比例3
与实施例的区别在于：不加入碱性磷酸酶，得到样本稀释液，记为S-ALP。
试验例
将紫外灭活新冠病毒(SARS-CoV-2)培养液(购自ZeptoMetrix)分别用实施例和对比例1～3制备的样本稀释液稀释至10倍、100倍、1000倍、1万倍、10万倍和23万倍，上样至同一批胶体金法病毒检测试剂盒(均为20200601批次制备，生产厂家为：山东博科诊断科技有限公司)进行检测，15～20min内观察检测结果，每组试验重复10次，所得结果见表2和图1～5。表1为不同稀释倍数下病毒培养液稀释后的浓度。
注：胶体金法的新冠抗原检测卡是检测新冠抗原的核衣壳蛋白，通过坏新型冠状病毒的最外层膜，使核衣壳蛋白的暴露，从而进行新冠抗原检测。核衣壳蛋白的暴露率和暴露速度，影响最终检测的灵敏度。
表1
稀释比例 浓度(TCID<sub>50</sub>/mL)
原始溶液(即灭活新冠病毒培养液) 1.15×10<sup>7</sup>
1：10 1.15×10<sup>6</sup>
1：100 1.15×10<sup>5</sup>
1：1000 1.15×10<sup>4</sup>
1：10000 1.15×10<sup>3</sup>
1：100000 1.15×10<sup>2</sup>
1：230000 50
表2
Figure BDA0003655977900000041
Figure BDA0003655977900000051
由表2和图1～5可以看出，实施例1的样本稀释液将新冠病毒培养液稀释10万倍后，仍能检出新冠病毒，而对比例1的样本稀释液只能稀释1000倍，对比例2和对比例3的样本稀释液只能稀释1万倍。图1～5依次为稀释100倍～23万倍后，15min时的检测结果，图4可以看出，样本1～样本3(对比例1～对比例3)在稀释10万倍后，已无法检出病毒。由此可见，本申请的病毒稀释液可通过碱性磷酸酶和磷脂酶协同作用，显著提高检测的灵敏度。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于胶体金法新冠病毒抗原检测卡的样本稀释液，其特征在于，包括以下重量百分比的原料：
Tris缓冲液0.1％-2％，表面活性剂1.5～8％，防腐剂0.05％，裂解剂0.024～8.02％，电解质0.8％-2％，稳定剂0.01％-5％，余量为纯化水；
所述裂解剂含有磷脂酶和碱性磷酸酶。
2.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述样本稀释液的pH值为5.0-10.0。
3.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述表面活性剂包括乙基苯基聚乙二醇和聚乙二醇辛基苯基醚；所述乙基苯基聚乙二醇的用量占样本稀释液总重量的0.5％-3％；所述聚乙二醇辛基苯基醚的用量占样本稀释液总重量的0.1％-5％。
4.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述防腐剂为Proclin300。
5.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述裂解剂由磷脂酶，胰蛋白酶，胶原酶，碱性磷酸酶和EDTA组成。
6.根据权利要求5所述的样本稀释液，其特征在于，所述磷脂酶的用量占样本稀释液总重量的0.001％-2％；所述胰蛋白酶的用量占样本稀释液总重量的0.001％-2％；所述胶原酶的用量占样本稀释液总重量的0.001％-2％；所述碱性磷酸酶的用量占样本稀释液总重量的0.001％-2％，所述EDTA的用量占样本稀释液总重量的0.02％。
7.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述电解质为NaCl。
8.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述稳定剂为酪蛋白。
9.权利要求1～8所述的样本稀释液在制备高灵敏度胶体金法新冠病毒抗原检测卡中的应用。
10.权利要求1～8所述的样本稀释液的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：先取纯化水的80～90wt％，向其中加入Tris缓冲液、表面活性剂、防腐剂和电解质，搅拌至完全溶解；再加入稳定剂和裂解剂，调节pH为5～10，加入剩余纯化水，搅拌至完全溶解，得到样本稀释液。
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