CN108469445A - 用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于x射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒及制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒及制备,属于生物医学领域。本发明利用AFP一抗修饰的磁珠作为癌症抗原的捕捉探针,利用AFP二抗修饰的可被X射线激发发光的镧系稀土纳米粒子作为荧光标记,加入不同浓度相同体积的AFP标准液,经过洗涤和磁性分离后,在X射线激发下,检测不同浓度AFP存在下体系的荧光强度,得到荧光强度—AFP浓度标准工作曲线;将待测样在X射线诱导下的荧光强度代入标准工作曲线,即可得到待测样中的AFP浓度。利用X射线作为激发光源检测血清中的癌症标志物可有效避免自体荧光的干扰,提高灵敏度,操作过程简便,灵敏度高,结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测领域,具体涉及一种用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒及其制备。
背景技术
免疫分析作为生物分析的重要方法依赖于抗原抗体的特异性结合。免疫分析广泛的应用于临床诊断、环境分析、食品安全以及生物医药研究。免疫分析作为体外诊断中最为重要的一项技术,占领了25%的市场份额。发展至今,有多种技术被应用于免疫分析,比如:电化学技术、表面增强拉曼技术、荧光技术、电化学发光技术以及表面等离子共振技术。在众多技术中,荧光免疫分析技术得到广泛的关注。荧光免疫分析技术应用于定量检测生物样品中的多种靶标,比如:药物、核酸、蛋白以及重金属。荧光免疫分析技术之所以得到广泛的应用得益于其特有的灵敏度、特异性以及高通量。然而,在紫外光照射下,生物样品的自体荧光干扰限制了荧光免疫分析的灵敏度。
为了解决自体荧光的干扰,研究人员做了大量的工作。
一、时间分辨荧光技术,利用镧系稀土离子的螯合物作为荧光标记,镧系稀土离子与传统染料相比有更长的荧光寿命,通过设定时间阈值收集荧光信号,可有效的降低复杂样品的自体荧光所带来的干扰。
二、上转换荧光技术,利用可被近红外光激发的上转换荧光纳米粒子作为荧光标记,由于近红外光无法激发生物样品发光,因此利用近红外光作为激发光源可有效避免自体荧光的干扰。
三、长余辉发光技术,利用长余辉纳米粒子作为荧光标记,可有效避免由激发光引起生物样品的自体荧光干扰,提高免疫分析的灵敏度。
尽管针对荧光免疫分析发展了许多技术,有效消除自体荧光干扰的技术仍然有限。因此,发展新型荧光免疫分析技术仍迫在眉睫。
X射线广泛的应用于临床和生物医学成像系统,比如说CT(电子计算机断层扫描)。除了紫外-可见光和近红外光,X射线也可激发不同纳米材料发光,比如:金纳米团簇、有机-金属框架纳米材料、聚合物量子点以及镧系稀土离子掺杂纳米粒子。其中,镧系稀土纳米粒子由于其具有较高的原子序数,合适的电子能态,可有效的吸收X射线,在紫外、可见以及近红外区有发光。近年来,由于闪烁体材料的快速发展,X射线激发的荧光成像成为一种新的分子影像技术。X射线激发的发光成像可有效避免生物组织的自体荧光,增加成像的穿透深度以及灵敏度,使其成为临床检测成像的重要途径。但X射线在免疫分析中的应用还未见报道。
本发明中,合成可被X射线激发的镧系稀土纳米粒子,对其进行抗体的修饰,将该粒子作为荧光免疫分析中的荧光标记。当AFP一抗修饰的磁珠捕获抗原后,标记上AFP二抗修饰的镧系稀土纳米粒子,用自主搭建的荧光仪进行荧光检测,以实现在血清样品中,无背景的检测癌症抗原的含量,具有高灵敏度,高准确性。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒及其制备。传统的荧光免疫分析的灵敏度受限于生物样品中存在的自体荧光,由于X射线不可激发生物样品发光,本发明利用X射线作为激发光源检测血清中的癌症标志物可有效避免自体荧光的干扰,提高灵敏度。本发明利用X射线作为激发光源检测血清中的癌症标志物,操作过程简便,灵敏度高,结果准确。
为实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:
一种用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子NaGdF4:Tb@NaYF4的合成;
2)标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子的制备:对镧系荧光纳米粒子进行表面改性后,偶联AFP二抗,制得标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子;
3)标准曲线的构建:向均匀的修饰有AFP一抗的免疫磁珠体系中分别加入不同浓度相同体积的AFP标准液,经过洗涤和磁性分离后,往体系中加入标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子,标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子通过抗原-抗体反应标记在AFP上,形成AFP捕获抗体/AFP抗原/AFP检测抗体的三明治结构,经过洗涤和磁性分离后,在X射线激发下,检测不同浓度AFP存在下体系的荧光强度,将荧光强度与AFP浓度一一对应,得到荧光强度—AFP浓度标准工作曲线;将待测样在X射线诱导下的荧光强度代入标准曲线方程:y=13.63x+87.57,y代表荧光强度,x代表AFP浓度,即可得到待测样中的AFP浓度。
步骤1)所述的镧系荧光纳米粒子其尺寸为19.3±1.3nm,晶格间距为0.53 nm,晶相为 (100) 六方晶相。
步骤1)所述的镧系荧光纳米粒子的制备方法为:
1)内核的制备:①将稀土醋酸盐加入到油酸和十八烯中,加热至150℃后冷却至室温;②将甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液加入到步骤①所得混合液中,加热至50℃反应30min;③将温度升高至100℃抽真空;④将温度升高至290℃反应1.5 h后冷却至室温;⑤用乙醇、丙酮混合液多次洗涤后分散在环己烷溶液中;
2)核壳结构的纳米粒子的制备:①将稀土醋酸盐加入到油酸和十八烯中,加热至150℃后冷却至室温;②将步骤1)中制备的内核加入到步骤①制得的混合液中,加热至80℃反应30 min,除去体系中的环己烷;③将甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液加入到步骤②所得混合液中,加热至50℃反应30min;④将温度升高至100℃抽真空;⑤将温度升高至290℃反应1.5 h后,冷却至室温;⑥用乙醇、丙酮混合液多次洗涤后分散在环己烷溶液中。
步骤1)中所述的稀土醋酸盐由Gd(CH3COO)· 4H2O 和Tb(CH3COO) ·4H2O按摩尔比1-x:x混合而成,所述的x为0.01-0.25。
步骤1)中氢氧化钠和氟化铵的比例为1:(1~2),油酸和十八烯的比例为1:(1~10),甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液与步骤①所得混合液的体积比为1:(1~10),稀土醋酸盐的用量为0.1~1 mmol。
步骤2)所述的稀土醋酸盐为Y(CH3COO)·4H2O。
步骤2)氢氧化钠和氟化铵的比例为1:(1~2),油酸和十八烯的比例为1:(1~10),甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液与步骤②所得混合液的体积比为1:(1~10),稀土醋酸盐的用量与纳米粒子的用量为0.1~1 mmol。
步骤2)所述的表面改性为:用乙醇沉淀分散在环己烷中的镧系荧光纳米粒子,去除上清液后,加入0.2~2 M盐酸超声溶解,离心分离,水洗后将镧系荧光纳米粒子分散在水溶液中。
步骤3)中均匀的修饰有AFP一抗的免疫磁珠、标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子在体系中的浓度分别为:50~500 μg/mL。
一种如上所述的制备方法制得的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒。
本发明试剂盒的作用机制为:制备AFP二抗(检测抗体)修饰的镧系荧光纳米粒子作为X射线荧光免疫分析的荧光标记,用AFP一抗(捕捉抗体)修饰的磁珠富集血清中的AFP抗原,标记上镧系稀土纳米粒子后,在X射线的诱导下获得荧光信号,将荧光信号强度代入荧光强度-AFP浓度的标准工作曲线中,即可实现测定血液中的AFP含量。
本发明的显著优点在于:
(1)本发明所制得的镧系荧光纳米粒子具有较强的X射线发光,便于用于无背景免疫荧光分析中;
(2)镧系荧光纳米粒子在复杂的生物环境中具有较好的稳定性和较强的抗干扰能力;
(3)传统的荧光免疫分析的灵敏度受限于生物样品中存在的自体荧光,由于X射线不可激发生物样品发光,本发明利用X射线作为激发光源检测血清中的癌症标志物可有效避免自体荧光的干扰,提高灵敏度;而且本发明利用X射线作为激发光源检测血清中的癌症标志物,操作过程简便,灵敏度高,结果准确。
附图说明
图1 X射线镧系稀土荧光纳米粒子的透射电子显微镜图(TEM);
图2 X射线镧系稀土荧光纳米粒子X射线粉末衍射图(XRD);
图3 镧系稀土纳米粒子的X射线激发发光光谱;
图4 镧系稀土纳米粒子修饰柠檬酸、亲和素、抗体的水合粒径分布图(DLS);
图5 镧系稀土纳米粒子修饰柠檬酸、亲和素、抗体ζ电位图;
图6 X射线荧光免疫分析检测AFP标准溶液的线性曲线。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
实施例1
X射线核壳结构镧系稀土纳米粒子的合成:
步骤一:将0.075 mmol醋酸铽,0.425 mmol 醋酸钆,加入到4mL油酸和16mL十八烯中。在双口圆底烧瓶中搅拌,加热升温至150 ℃;反应45 min,除水。反应冷却至室温后,加入10mL甲醇溶解的1.8 mmol氢氧化钠溶液和1.8 mmol氟化铵溶液。升温至50℃搅拌混合30min。升温至100 ℃。开始抽气20 min后,换气3次。加热至290 ℃,反应1.5 h。得到的稀土纳米粒子用乙醇/环己烷(沉淀/分散)纯化三次后,将产物分散在环己烷中供进一步使用。
步骤二:将0.5 mmol醋酸钇加入到4 mL油酸和16 mL十八烯中。在双口圆底烧瓶中搅拌,加热升温至150℃;反应45 min,除水。降温至80 ℃,加入步骤一中的产物反应30 min除去环己烷溶剂。反应冷却至室温后,加入10 mL甲醇溶解的1.8 mmol氢氧化钠溶液和1.8mmol氟化铵溶液。升温至50 ℃搅拌混合 30 min。升温至100 ℃。开始抽气20 min后,换气3次。加热至290 ℃,反应1.5 h。得到的核壳结构稀土纳米粒子用乙醇/环己烷(沉淀/分散)纯化三次后,将产物分散在环己烷中供进一步使用。
图1为核壳结构X射线荧光纳米粒子的透射电子显微镜(TEM),图中标尺为50 nm,从图1中可以看出明显的核壳结构,纳米粒子分布均匀、尺寸均一,大小为16-22 nm。
图2所示,该X射线荧光纳米粒子具有良好的结晶性,其衍射峰的位置与NaGdF4的PDF标准卡片(JCPDS:27-0699)一致,为纯的六方相结构,无杂相。
图3为纳米粒子在X射线激发下的荧光发射光谱,可观察到稀土金属铽的特征发射峰489 nm, 546 nm, 584 nm, 612 nm 对应铽的5D4激发态到7Fj (j=6-3)基态的跃迁。
实施例2
X射线荧光探针的构建
步骤一:将合成好的纳米粒子用乙醇沉淀,6000 rpm离心10 min后弃去上清液,加入1mL 2 M的盐酸超声10 min除去纳米粒子表面的油酸配体后,20000 rpm 15 min。得到的产物用二次水清洗三次,并分散在二次水里。
步骤二:将制备好去除表面油酸配体的纳米粒子分散在5 mL 0.2 M的柠檬酸钠,超声1 h,所得修饰柠檬酸钠配体的纳米粒子 20000 rpm 15 min。得到的产物用二次水清洗三次,并分散在二次水里。
步骤三:1 mg柠檬酸钠配体覆盖的纳米粒子分散在1 mL 2-(N-吗啉基)乙磺酸 4-吗啉乙磺酸 (MES) (10 mM, pH=6.0) 溶液中,用1 mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 (EDC) 和1 mM N-羟基丁二酰亚胺 (NHS) 在室温下活化1 h。活化的纳米粒子 10000rpm, 10 min离心下后,用二次水清洗三次,并分散在1 mL 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸) (HEPES) 缓冲液 (10 mM, pH=7.2)。100 μL 亲和素(avidin) (1mg/mL) 加入到纳米粒子中室温下孵育6 h。avidin修饰的纳米粒子离心10000rpm 10 min,用二次水清洗并分散在HEPES缓冲液中。
步骤四:100 μL AFP二抗-生物素 (Biotin) 加入到1 mL (1mg/mL) avidin修饰的纳米粒子中室温反应4 h后,8000 rpm 10 min,得到的二抗修饰的X射线荧光纳米粒子用二次水清洗三次,分散在HEPES中。
图4为纳米粒子表面修饰柠檬酸、亲和素和AFP二抗后水合粒径的分布图,从图中可以看出,带柠檬酸钠配体的纳米粒子在修饰了亲和素后水合粒径由 40.7 nm变化至48.8 nm,在修饰了AFP二抗后,纳米粒子的水合粒径为 58.1 nm,说明亲和素、AFP二抗的成功修饰。
图5为纳米粒子表面修饰柠檬酸、亲和素和AFP二抗后ζ电位图,从图中可以看出,带柠檬酸钠配体的纳米粒子在修饰了亲和素后电位由 -37.6 mV变化至 28.7 mV,在修饰了AFP二抗后,纳米粒子的水合粒径为 5.5 mV,说明亲和素、AFP二抗的成功修饰。
实施例3
标准曲线的建立
将200 μL 2%的牛血清白蛋白 (BSA) 加入到AFP一抗磁珠4 ℃封闭1 h。用磷酸盐缓冲液 (PBS) (10 mM,pH=7.2) 洗涤,磁性分离3次除去未结合的BSA,得到用BSA封闭好的AFP一抗免疫磁珠。加入200 μL用PBS (10 mM, pH=7.2) 配置的AFP梯度标准溶液在37 ℃下反应1 h后,用PBS (10 mM, pH=7.2) 洗涤,磁性分离3次除去未结合AFP抗原。加入200 μLAFP二抗修饰的稀土纳米粒子 37 ℃反应2 h后,用HEPES (10 mM HEPES 包含 0.05% (v/v) TWEEN 20,pH =7.2) 洗涤,磁性分离3次除去未结合纳米粒子。用自主搭建的X射线荧光检测仪,在X射线 (50 kV) 激发下,检测荧光信号,绘制一定范围内的标准曲线。
图6为X射线荧光免疫分析测定AFP标准品的标准曲线,从图中可以看出,X射线激发纳米粒子的荧光强度随着AFP浓度的增加而增强。本实验结果表明该方法在0.75-40 ng/mL内呈良好线性关系 (R=0.997)。
实施例4
血清中AFP的检测
如实施例3中建立标准曲线后,检测血清中AFP浓度的方法与实施例3一致。根据检测所得的X射线发光强度,对照标准曲线得出血清中AFP的浓度。
表1为本发明与酶联免疫法测定血清中AFP浓度的比较。将得到的数据进行相关性比较,两者无显著差异,结果的相关性较高(R=0.995)。说明本发明检测血清中AFP含量与国内外知名厂家生产的AFP试剂盒相比,技术指标相当,但本方法灵敏度更高,稳定性更好,结果更准确。
表1 临床血清样品AFP测试,本发明方法与酶联免疫法的比较
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (10)
1.一种用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子NaGdF4:Tb@NaYF4的合成;
2)标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子的制备:对镧系荧光纳米粒子进行表面改性后,偶联AFP二抗,制得标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子;
3)标准曲线的构建:向均匀的修饰有AFP一抗的免疫磁珠体系中分别加入不同浓度相同体积的AFP标准液,经过洗涤和磁性分离后,往体系中加入标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子,标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子通过抗原-抗体反应标记在AFP上,形成AFP捕获抗体/AFP抗原/AFP检测抗体的三明治结构,经过洗涤和磁性分离后,在X射线激发下,检测不同浓度AFP存在下体系的荧光强度,将荧光强度与AFP浓度一一对应,得到荧光强度—AFP浓度标准工作曲线;将待测样在X射线诱导下的荧光强度代入标准曲线方程:y=13.63x+87.57,即可得到待测样中的AFP浓度。
2.根据权利要求1所述的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤1)所述的镧系荧光纳米粒子其尺寸为19.3±1.3nm,晶格间距为0.53 nm,晶相为 (100) 六方晶相。
3.根据权利要求1所述的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤1)所述的镧系荧光纳米粒子的制备方法为:
1)内核的制备:①将稀土醋酸盐加入到油酸和十八烯中,加热至150℃后冷却至室温;②将甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液加入到步骤①所得混合液中,加热至50℃反应30min;③将温度升高至100℃抽真空;④将温度升高至290℃反应1.5 h后冷却至室温;⑤用乙醇、丙酮混合液多次洗涤后分散在环己烷溶液中;
2)核壳结构的纳米粒子的制备:①将稀土醋酸盐加入到油酸和十八烯中,加热至150℃后冷却至室温;②将步骤1)中制备的内核加入到步骤①制得的混合液中,加热至80℃反应30 min,除去体系中的环己烷;③将甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液加入到步骤②所得混合液中,加热至50℃反应30 min;④将温度升高至100℃抽真空;⑤将温度升高至290℃反应1.5 h后,冷却至室温;⑥用乙醇、丙酮混合液多次洗涤后分散在环己烷溶液中。
4.根据权利要求3所述的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤1)中所述的稀土醋酸盐由Gd(CH3COO)·4H2O 和Tb(CH3COO)·4H2O按摩尔比1-x:x混合而成,所述的x为0.01-0.25。
5.根据权利要求3所述的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤1)中氢氧化钠和氟化铵的比例为1:1~2,油酸和十八烯的比例为1:1~10,甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液与步骤①所得混合液的体积比为1~10:1,稀土醋酸盐的用量为0.1~1 mmol。
6.根据权利要求3所述的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤2)所述的稀土醋酸盐为Y(CH3COO)·4H2O。
7.根据权利要求3所述的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤2)中氢氧化钠和氟化铵的比例为1:1~2,油酸和十八烯的比例为1:1~10,甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液与步骤②所得混合液的体积比为1~10:1,稀土醋酸盐的用量为0.1~1 mmol。
8.根据权利要求2所述的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤2)所述的表面改性为:用乙醇沉淀分散在环己烷中的镧系荧光纳米粒子,去除上清液后,加入0.2~2 M盐酸超声溶解,离心分离,水洗后将镧系荧光纳米粒子分散在水溶液中。
9.根据权利要求2所述的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤3)中均匀的修饰有AFP一抗的免疫磁珠、标记AFP二抗的镧系荧光纳米粒子在体系中的浓度分别为:50~500 μg/mL。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的制备方法制得的用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于X射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒。
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