WO2021078950A1

WO2021078950A1 - Verfahren, vorrichtung und markersubstanz-kit zur multiparametrischen röntgenfluoreszenz-bildgebung

Info

Publication number: WO2021078950A1
Application number: PCT/EP2020/079909
Authority: WO
Inventors: Florian Grüner
Original assignee: Universität Hamburg
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2020-10-23
Publication date: 2021-04-29
Also published as: US20220370645A1; JP2022553761A; KR20220091515A; DE102019128842A1; CN114667447A; EP4049011A1

Abstract

Ein Verfahren zur multiparametrischen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung mit maximierter Detektions-Sensitivität und minimierter Strahlendosis an einer biologischen/lebenden Probe (10), die eine erste Markersubstanz enthält, umfasst die Schritte Bestrahlung der Probe (10) mit Röntgenstrahlung (1), wobei Röntgenfluoreszenz (2) der ersten Markersubstanz angeregt wird, räumlich aufgelöste Detektion der Röntgenfluoreszenz (2) der ersten Markersubstanz, und Ermittlung einer Verteilung der ersten Markersubstanz in der Probe (10) aus der Röntgenfluoreszenz (2) der ersten (10) Markersubstanz, wobei die Probe (10) mindestens eine weitere Markersubstanz enthält, die durch die Röntgenstrahlung (1) zu Röntgenfluoreszenz (2) angeregt wird, wobei Fluoreszenzlinien (3) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz verschieden sind, mindestens eine der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit Wirksubstanzmolekülen und/oder Liganden-Molekülen gekoppelt ist, die für eine spezifische Wechselwirkung mit der Probe (10) vorgesehen sind, oder in Zellen enthalten sind, um diese nachverfolgen zu können, die Detektion eine spektral aufgelöste Detektion der Röntgenfluoreszenz (2) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz umfasst, und aus der detektierten Röntgenfluoreszenz (2) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz zusätzlich mindestens eine Verteilung der mindestens einen weiteren Markersubstanz in der Probe (10) ermittelt wird. Es werden auch eine Bildgebungsvorrichtung (100) zur multiparametrischen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung und ein optimiertes Auswahlverfahren für ein Markersubstanz-Kit zur Einführung von Markersubstanzen in eine Probe (10) beschrieben.

Description

Verfahren, Vorrichtung und Markersubstanz-Kit zur multiparametrischen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur multiparametrischen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an einer Probe, bei dem Markersubstanz-Verteilungen in der Probe erfasst werden. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Bildgebungsvorrichtung, die zur Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an einer zu untersuchenden Probe eingerichtet ist, und ein Markersubstanz-Kit, das zur Einführung in eine Probe für eine Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an der Probe eingerichtet ist. Anwendungen der Erfindung sind bei der Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an Proben, insbesondere biologischen Proben oder nicht-biologischen Proben, gegeben.

In der vorliegenden Beschreibung wird auf den folgenden Stand der Technik Bezug genommen, der den technischen Hintergrund der Erfindung darstellt:

[1] DE 102017003517;

[2] US 2012/0307962 Al;

[3] US 2016/0252471 Al;

[4] T. Pellegrino et al. in "Nano Lett." Bd. 4, Nr. 4, 2004, S. 703-707;

[5] H. D. Fiedler et al. in "Anal Chem." 2013, 85(21):10142-8; und

[6] R. Zhang et al. in "Am. J. Nucl. Med. Mol. Imaging" 2018, 8(3):169-188;

[7] F. Grüner et al. in "Sei. Rep." Bd. 8, 2018, S. 16561;

[8] K. Khrennikov et al. in "Phys. Rev. Lett." Bd. 114, S. 195003 (2015);

[9] M. Hossain et al. in "Applied Physics Letters" Bd. 97, 2010, S. 263704-1-263704-3;

[10] D. P. Cormode et al. in "Contrast Media & Molecular Imaging" 2014, No. 9, S. 37- 52; und

[11] Y. Li et al.in "Contrast Media & Molecular Imaging" Bd. 2018, 2018, Article ID 8174820, S. 1-7 (mit Supplementary material).

In der Pharmakologie besteht ein Interesse, die örtliche und/oder zeitliche Verteilung von physio logisch wirksamen Substanzen (hier auch als Wirksubstanzen oder Wirksubstanzmoleküle oder pharmakologisch wirksame Substanzen bezeichnet), insbesondere Biomarkern, Antikörpern, Anti körperfragmenten, biologischen Zellen und/oder Medikamenten (Medikament-Moleküle), im Körper eines Patienten oder eines Versuchstieres zu messen (Messung der Pharmakokinetik). Die Messung der Pharmakokinetik hat insbesondere das Ziel, zeitabhängig die lokale Konzentration von applizierten Wirksubstanzen im Körper zu erfassen, da die Wirksamkeit der Wirksubstanzen direkt davon abhängt, in welcher Konzentration (und in welchem Zeitraum) diese am therapeuti schen Wirkort, z. B. durch die Kopplung an Rezeptoren auf Zelloberflächen, gebunden werden. Herkömmliche Verfahren der Pharmakokinetik haben eine beschränkte Aussagekraft. Wenn z. B. nach einer Medikamentengabe Blutproben genommen werden, um die Konzentration des Medi kaments im Blut zu messen, wird keine örtliche Verteilung des Medikaments im Körper erfasst und insbesondere keine Information darüber erhalten, ob, wann und mit welcher Konzentration das Medikament den gewünschten Wirkort erreicht hat. Wenn mehrere Wirksubstanzen appli ziert werden, was hier allgemein als Multimedikation bezeichnet wird, können diese nur bei An wendung aufwendiger Verfahrensschritte getrennt erfasst werden.

Eine weitere wichtige Anwendung wäre die Messung der Verteilung verschiedener Immunzell- Typen, etwa um die Wirksamkeit von Medikamenten für die Behandlung von Morbus Crohn und/oder Colitis Ulcerosa sowie weiterer Immunsystem-vermittelter entzündlicher Erkrankungen zu erfassen. Da hierbei meist mehrere verschiedene Immunzell-Typen relevant sind, stellt sich jedoch die bisher ungelöste Herausforderung, die Dynamik der verschiedenen Immunzell-Typen im Körper getrennt voneinander, aber gleichzeitig und am selben Ort zu messen.

Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein allgemein bekanntes Verfahren, mit dem die Ver teilung z. B. eines Medikaments im Körper erfasst werden kann. PET basiert darauf, dass ein radi oaktives Tracer-Molekül an das Medikament-Molekül gebunden wird. Das Tracer-Molekül emit tiert im untersuchten Körper ein Positron, welches mit einem Elektron annihiliert, wodurch zwei Röntgenphotonen mit einer charakteristischen Energie von 511 keV erzeugt werden. Diese zwei Röntgenphotonen werden nachgewiesen, wobei durch eine Vielzahl von Koinzidenz-Messungen der Emissionsort und damit der Ort des Medikaments bestimmt werden kann. PET hat jedoch eine Reihe von Nachteilen, die sich aus der Strahlenbelastung des Körpers, der komplexen Geräte technik und einer beschränkten Aussagekraft bei Multimedikation ergeben.

PET liefert bei Multimedikation eingeschränkte Informationen, da mit einer Messung nur eine einzige Medikamenten-Verteilung erfasst werden kann (keine gleichzeitige Pharmakokinetik von mehreren Wirksubstanzen). Selbst wenn mehrere Medikamente gleichzeitig appliziert werden, können diese nicht getrennt gemessen werden. Da bei allen Annihilationsvorgängen ausschließ lich Photonen mit der Energie von 511 keV erzeugt werden, könnten selbst verschiedene Tracer- Moleküle jeweils in Verbindung mit verschiedenen Medikament-Molekülen nicht unterschieden und damit keine Medikament-spezifischen Emissionsorte erfasst werden. PET bietet zwar die Möglichkeit, sequentiell zu messen, indem erst ein erstes Medikament injiziert und detektiert und anschließend ein zweites Medikament injiziert und detektiert wird. Dies ist jedoch unpraktisch, da bei PET wegen des schnellen Zerfalls der Tracer-Moleküle das diagnostische Zeitfenster sehr ein geschränkt ist. Eine Anwendung von PET bei Multimedikation ist damit in der Praxis ausgeschlos sen.

Ein weiteres allgemein bekanntes, funktionelles Bildgebungsverfahren ist die Einzelphotonen- Emissionscomputertomographie (SPECT), die jedoch auch nicht zur Erfassung von Wirkstoffvertei lungen bei Multimedikation verwendet werden kann. Bei SPECT könnten zwar verschiedene Tra cer-Moleküle benutzt werden, die aufgrund unterschiedlicher Emissionsenergien unterscheidbar wären. Die Tracer-Moleküle können jedoch nur sehr aufwändig (via Radiochemie) an Biomoleküle gebunden werden. Des Weiteren haben verfügbare Tracer-Moleküle für SPECT sehr unterschiedli che Emissionsenergien und Halbwertszeiten, so dass sie nur schwer gemeinsam detektiert werden können: die Effizienz von Detektoren hängt sehr stark von der Energie der eintreffenden Photo nen ab und je nach Halbwertszeit nimmt die Anzahl der jeweils emittierten Photonen unter schiedlich stark ab. Schließlich bieten verfügbare Tracer-Moleküle nur beschränkte diagnostische Zeitfenster, welche zur Untersuchung von zeitlichen Wirksubstanz-Verteilungen meist zu kurz wären. Eine SPECT-basierte Lösung wäre deutlich aufwändiger, da die Bindung von SPECT-Tracer- Molekülen an die Medikamenten-Moleküle schwierig ist, insbesondere bei unterschiedlichen Tra cer-Molekülen, die gleichzeitig zum Einsatz kommen sollen. Eine für die quantitative Auswertung unverzichtbare Bestimmung der Aktivität direkt vor der Injektion würde in diesem Fall ebenfalls schwierig sein.

Selbst eine Kombination von PET mit SPECT könnte die Beschränkungen von PET nicht beheben, da beide Verfahren zwar bei gleichzeitiger Verwendung von zwei verschiedenen Tracer-Molekülen auch zwei verschiedene Medikamente verfolgen könnten, dies aber nur über deren durch die jeweiligen Halbwertszeiten stark eingeschränkten diagnostischen Zeitfenster. Des Weiteren sind bisher keine Kombinationsgeräte bekannt, die sowohl PET als auch SPECT gleichzeitig erlauben, da beide Methoden unterschiedlich arbeiten.

Röntgenfluoreszenz-Bildgebung (RFB) ist ein weiteres Verfahren zur Erfassung der Verteilung ei nes Medikaments im Körper (siehe z. B. [1] bis [3], [9], [11]). Die diagnostische Röntgenfluores zenz-Bildgebung beruht darauf, eine Markersubstanz, umfassend z. B. eine Vielzahl von Nanopar- tikeln, in einen zu untersuchenden Körper zu applizieren und mittels induzierter Fluoreszenz im Röntgen-Wellenlängenbereich ortsaufgelöst zu detektieren. Wenn an die Nanopartikel Liganden gebunden sind (funktionalisierte Nanopartikel) und die Liganden mit einer Wirksubstanz, wie z. B. Antikörper oder Antikörperfragmente, biologische Zelle, Biomarker oder Medikamente, verbun den sind oder diese selbst umfassen, wird durch die ortsaufgelöste Messung der Röntgenfluores zenz eine Information über die Verteilung der Wirksubstanz im Körper erhalten. In RFB-Studien werden meistens Gold-Nanopartikel verwendet, da diese einfach zu synthetisieren sind und ihre Funktionalisierung auf einer gut untersuchten Kopplungschemie basiert. Weitere Nanopartikel sind in [4], [5], [9], [10] (in Zusammenhang mit Computertomographie) und [11] beschrieben. Aus [6] ist bekannt, mittels RFB mehrere verschiedene, bereits vor der Messung in einem Organismus vorhandene toxische Metalle aufgrund ihrer jeweiligen Röntgenfluoreszenz im Organismus nach zuweisen.

Aus Studien mit RFB oder invasiven Methoden ist jedoch bekannt, dass sich selbst nicht- funktionalisierte Nanopartikel in verschiedenen Organen biologischer Organismen mit unter schiedlichen Konzentrationen ansammeln. Des Weiteren haben Nanopartikel ein stark asymmet risches Massenverhältnis im Vergleich zu typischen Medikament-Molekülen, so dass der Trans port des Medikaments im Körper durch den der Nanopartikel dominiert werden könnte. Diese Eigenschaften von Nanopartikeln beschränken die Aussagekraft des herkömmlichen RFB- Verfahrens: Wenn unter Verwendung von RFB die Konzentration von Gold-Nanopartikel in einem bestimmten Organ gemessen wird, wobei die Gold-Nanopartikel mit einem Medikament funktio- nalisiert sind, kann allein aufgrund des gemessenen Konzentrationswertes nicht darauf geschlos sen werden, dass dieser von dem Medikament bestimmt wurde. Es könnte sein, dass auch ohne das gebundene Medikament die Gold-Nanopartikel dieselbe Konzentration erreicht hätten.

In [7] wird daher vorgeschlagen, für Vergleichszwecke in einem ersten Organismus Nanopartikel mit Ligand und in einem zweiten, separaten Organismus (hier Mäuse) Nanopartikel ohne Ligand zu messen. Dieses Verfahren führt jedoch zu einem hohen Bedarf an Versuchstieren, und es ver nachlässigt die individuellen Unterschiede zwischen einzelnen Organismen. Des Weiteren ist es in der Medizin an Patienten nicht praktikabel. Daher wäre es von Interesse, die Vergleichsmessung gleichzeitig in einem einzigen Organismus durchzuführen. Diese Vergleichsmessung würde des Weiteren die Erfassung des unspezifischen, physiologischen Untergrunds in der Zielregion erlau ben. Befinden sich dort z. B. Blutgefäße und darin ungebundene Nanopartikel, kann dieses "Flin- tergrundbild" von einem RFB-Bild subtrahiert werden. Das Differenzbild zeigt dann nur die spezi fisch gebundenen Nanopartikel. Diese mit herkömmlichen Techniken nicht realisierbare Ver gleichsmessung würde des Weiteren die Erfassung des unspezifischen, physiologischen Unter- grunds in der Zielregion erlauben. Befinden sich dort z. B. Blutgefäße und darin ungebundene Nanopartikel, kann dieses "Hintergrundbild" von einem RFB-Bild subtrahiert werden. Das Diffe renzbild zeigt dann nur die spezifisch gebundenen Nanopartikel.

Ein weiterer Nachteil der herkömmlichen RFB ist, dass bei Multimedikation nicht mehrere ver schiedene Medikamente oder Biomarker gleichzeitig verfolgt werden können. Dies gilt auch für die gleichzeitige Bildgebung der Dynamik von verschiedenen Immunzell-Typen. Derartige Mes sungen wären jedoch bei einer Reihe von medizinischen Untersuchungen von Bedeutung, wie z.

B. für die Sichtbarmachung von Entzündungsprozessen im Körper oder für die Tumordiagnostik mit mehreren verschiedenen Antikörpern. Beispielsweise sollen bei Entzündungsprozessen ver schiedene Immunzell-Typen erfasst werden, die zu unterschiedlichen Zeiten am Entzündungsort ankommen und damit den Verlauf der Entzündung beeinflussen. So besteht bei der Krankheit Morbus Crohn ein Interesse, gleichzeitig vier verschiedene Immunzell-Typen zu verfolgen. Ver schiedene Zelltypen sind jedoch mit der herkömmlichen RFB nicht unterscheidbar. Die Messung der Pharmakokinetik bei Multimedikation wäre auch von Interesse, um die Wechselwirkung von Medikamenten zu untersuchen oder die Wirkung von Medikamenten zu vergleichen. So ist allge mein bekannt, dass neue Medikamente oft erst nach der Markteinführung scheitern, weil Patien ten mehrere Medikamente gleichzeitig einnehmen müssen, die sich gegenseitig Bindungsstellen im Körper blockieren. Dieses Ziel ist bisher nicht erreichbar, da herkömmliche Techniken nicht erlauben, dass alle gleichzeitig zu messenden Immunzell-Typen mit einer gleichen Sensitivität bestimmt werden können.

Eine weitere wichtige Fragestellung bei der herkömmlichen RFB ist das Problem, dass bekanntlich die Kinetik der Nanopartikel von deren Größe abhängt. Ein praktikables und effektives Verfahren, die Kinetik von mehreren Nanopartikel-Typen unterschiedlicher Größe gemeinsam und mit glei cher Sensitivität zu verfolgen und direkt miteinander zu vergleichen, ist bisher nicht verfügbar.

Für die Messung der Pharmakokinetik bei Multimedikation könnte auch bei RFB eine sequentielle Messung vorgenommen werden, was aber unannehmbar lange Messzeiten erfordern würde. Verschiedene Medikamente könnten nur aufeinanderfolgend untersucht werden, nachdem je weils ein untersuchtes Medikament abgebaut und ausgeschieden ist. Die Messung einer multipa rametrischen Pharmakokinetik unter praktischen Routinebedingungen ist mit der herkömmlichen RFB somit nicht möglich. In [9] wird eine Multiplex-Biomarker-Detektion mittels Röntgenfluoreszenz von verschiedenen Nanopartikeltypen beschrieben. Die Autoren von [9] haben festgestellt, dass die verschiedenen Nanopartikeltypen anhand ihrer verschiedenen spektralen Fluoreszenzeigenschaften unterschie den werden können und dass eine ortsaufgelöste Messung von verschiedenen Nanopartikeltypen an verschiedenen Orten möglich ist. Die Technik gemäß [9] wurde anhand eines Modellsystems untersucht, bei dem die Nanopartikel mit hohen Anregungsintensitäten der anregenden Röntgen strahlung auf einem dünnen Aluminiumsubstrat bestrahlt werden. Die hohen Anregungsintensitä ten erlauben es, ausreichend hohe Fluoreszenzintensitäten der Röntgenfluoreszenz zu erzeugen und diese damit sensitiv detektieren zu können. Die Verwendung des Aluminiumsubstrats ermög licht, dass störende Streustrahlung (Untergrundstrahlung) aufgrund von Mehrfachstreuungen weitgehend vermieden wird.

Die Technik gemäß [9] ist jedoch in der biomedizinischen Bildgebung nicht anwendbar, da bei dieser aus Gründen des Strahlenschutzes erheblich geringere Intensitäten der anregenden Rönt genstrahlung erforderlich sind und im biologischen Gewebe eine erheblich stärkere Streustrah lung erzeugt wird, da die Objekte (etwa eine Maus) deutlich mehr Gewebe darstellen, in denen vermehrt (Vielfach-)Streuung auftritt. Zur Vermeidung dieser Probleme wird in [9] vorgeschlagen, zur Anregung monochromatische Röntgenstrahlung zu verwenden, was sich aber in der Praxis als nicht ausreichend zur Erzielung einer ausreichenden Sensitivität der Röntgenfluoreszenz- Detektion erweist, insbesondere für Objekte, die deutlich größer als das in [9] verwendete Sub strat sind, da aufgrund ihres größeren Volumens die Streustrahlung einen so großen Untergrund im detektierten Spektrum hervorruft, dass schwache RFB-Signale bei minimaler Strahlendosis nicht mehr detektierbar sind. Auch in [2] wird keine gezielte Auswahl des Marker-Kits beschrie ben.

In [2] wird ein Verfahren zur Computertomographie-RFB beschrieben, bei dem die RFB grundsätz lich mit einer Zusammensetzung aus mehreren verschiedenen Nanopartikel-Typen erfolgen kann. Dabei werden jedoch die spektral verschiedenen Emissionen der verschiedenen Nanopartikel- Typen bei der Auswertung der detektierten Röntgenfluoreszenz nicht für eine Bildgebung an le benden Organismen verwendet.

Eine Bibliothek von Nanopartikeln für die Röntgen-Fluoreszenz Tomographie wird in [11] be schrieben. Die Autoren von [11] haben im Supplementary Material von [11] gezeigt, dass bei Na nopartikeln aus verschiedenen Elementen jeweils über mehrere Größenordnungen variierende Intensitäten der Streustrahlung auftreten, so dass die verschiedenen Nanopartikeln nicht mit glei- chen Sensitivitäten detektiert werden können. Diesem Problem bei der RFB an biologischen Pro ben durch eine Anpassung der Konzentration der Nanopartikel zu begegnen, indem die Konzent ration von Nanopartikel mit einem hohen Untergrund z. B. um einen Faktor 1000 erhöht wird, sind enge physiologische Grenzen gesetzt. Als Auswahlkriterium für die Kombination von Nano- partikeln wird daher in [11] vorgeschlagen, dass die K-Kanten der emittierenden Elemente der Nanopartikel möglichst nahe der (mittleren) Energie der Röntgenquelle sind. Genau das aber er laubt keine Minimierung des Untergrunds. In [11] ist der Untergrund im Signal-Bereich der unter suchten Marker-Elemente also sowohl stark unterschiedlich als auch insgesamt nicht minimiert. Eine hoch-sensitive RFB ist damit nicht möglich.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an einer Probe bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Bildgebungsvorrichtung zur Röntgen fluoreszenz-Bildgebung für die Untersuchung einer Probe bereitzustellen, wobei mit der Bildge bungsvorrichtung Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Markersubstanz-Kit bereitzustellen, das zur Einführung in eine Probe für eine Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an der Probe eingerichtet ist. Die Erfindung soll insbesondere eine hoch-sensitive RFB mit einer erhöhten Aussagekraft bereitstellen, die Mes sung einer räumlichen und/oder zeitlichen Verteilung einer oder mehrerer Wirksubstanzen in einem Körper eines untersuchten Organismus ermöglichen, und/oder neue Anwendungen der RFB, insbesondere unter praktischen Anwendungsbedingungen, bereitstellen. Dabei ist z. B. eine In-vivo-Bildgebung mit einer Erfassung von einer oder mehreren Wirksubstanzen, insbesondere Biomarkern, Antikörpern, Antikörperfragmenten, biologischen Zellen, wie z. B. Immun-Zellen, und/oder Medikamenten, von besonderem Interesse. Die RFB soll insbesondere eine Untersu chung bei Multimedikation mit verringerter Verfahrenskomplexität ermöglichen und/oder Be schränkungen auf kurze diagnostische Zeitfenster vermeiden.

Diese Aufgaben werden jeweils durch ein Verfahren zur Röntgenfluoreszenz-Bildgebung, eine Röntgenfluoreszenz-Bildgebungsvorrichtung und ein Markersubstanz-Kit gelöst, welche die Merkmale der unabhängigen Ansprüche aufweisen. Bevorzugte Ausführungsformen und Anwen dungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur multiparametrischen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung einer Probe gelöst, wobei die folgenden Schritte vorgesehen sind. Die zu untersuchende Probe wird mit Röntgenstrahlung, vor- zugsweise mit monochromatischer oder wenigstens schmalbandiger Röntgenstrahlung, bestrahlt, wobei Röntgenfluoreszenz einer ersten Markersubstanz angeregt wird. Die Probe ist allgemein ein formhaltiger Gegenstand, vorzugsweise ein Körper (oder ein Teil des Körpers) eines biologischen Organismus, besonders bevorzugt ein Körper (oder ein Teil des Körpers) eines humanen oder tierischen Probanden. Alternativ können andere, nicht-natürliche Objekte, wie z. B. synthetische biologische Objekte oder künstliche Organe, wie z. B. Implantate oder Hautmodelle, oder techni sche Objekte, untersucht werden. Es erfolgt eine räumlich aufgelöste Detektion der Röntgenfluo reszenz der ersten Markersubstanz, insbesondere durch Abscannen der Probe. Aus der detektier- ten Röntgenfluoreszenz der ersten Markersubstanz ist eine Verteilung der ersten Markersubstanz in der Probe ermittelbar.

Gemäß der Erfindung enthält die Probe zusätzlich zu der ersten Markersubstanz mindestens eine weitere Markersubstanz, die durch die Röntgenstrahlung zu Röntgenfluoreszenz angeregt wird. Die Anregung der Röntgenfluoreszenz erfolgt vorzugsweise gleichzeitig, wenn sich die mindestens eine weitere Markersubstanz im selben bestrahlten Bereich (Strahlvolumen an einer Position der Bestrahlung, Scan-Position) befindet wie die erste Markersubstanz. Die Markersubstanzen sind molekulare oder partikuläre Stoffe, die jeweils mindestens ein Röntgenfluoreszenz-Element als reines Element oder in einer chemischen Verbindung enthalten. Die Markersubstanzen sind kör perfremde Substanzen, die gezielt vor dem RFB-Verfahren der Probe zugeführt worden sind und nach dem RFB-Verfahren nach einer substanzspezifischen Verweildauer die Probe wieder verlas sen, z. B. durch Transportprozesse ausgeschieden werden. Mit mindestens einer der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz sind Wirksubstanzmoleküle und/oder Liganden- Moleküle gekoppelt, die eine spezifische biologische und/oder chemische Wechselwirkung mit der Probe aufweisen und z. B. durch Transportprozesse, wie Stoffwechsel oder Bluttransport, in bestimmte Abschnitten der Probe transportiert werden und/oder in diesen ankoppeln. Wenn gemäß einer bevorzugten Variante die Wirksubstanzen biologische Zellen umfassen, z.B. für die Immunzelltherapie, und insbesondere bei einer Anwendung, bei der die Zellen mit dem erfin dungsgemäßen Verfahren nachverfolgt werden sollen, sind die angekoppelten Markersubstanzen vorzugsweise in den Zellen enthalten oder an deren Oberfläche gebunden. Die erste und jede weitere Markersubstanz zeichnen sich durch jeweils verschiedene Röntgenfluoreszenz aus. In einem gemessenen Spektrum sind die Fluoreszenzlinien der Röntgenfluoreszenz-Elemente der ersten und jeder weiteren Markersubstanz jeweils verschieden, und sie haben insbesondere Ma- xima bei verschiedenen Energien und/oder verschiedene spektrale Breiten. Die Detektion umfasst gemäß der Erfindung eine spektral und räumlich aufgelöste Erfassung der Röntgenfluoreszenz (Röntgenfluoreszenzemissionen) der ersten und jeder weiteren Markersubstanz, vorzugsweise in einem einzigen Messvorgang, z. B. durch Abscannen mit einem Röntgenstrahl. Aus der detektier- ten Röntgenfluoreszenz der ersten und jeder weiteren Markersubstanz wird zusätzlich zu der Verteilung der ersten Markersubstanz mindestens eine Verteilung der mindestens einen weiteren Markersubstanz in der Probe ermittelt.

Im Ergebnis liefert dieses multiparametrische Verfahren mehrere, spezifische Verteilungen der ersten und jeder weiteren Markersubstanz in der Probe. Die ermittelten Verteilungen stellen typi scherweise keine diagnostische Information an sich dar. Es kann sich an das erfindungsgemäße Verfahren gesondert eine medizinische Diagnose an der Probe anschließen, wobei die ermittelten Verteilungen verwendet werden.

Vorzugsweise weisen die erste und die mindestens eine weitere Markersubstanz gleiche oder derart ähnliche Fluoreszenz-Wahrscheinlichkeiten, Abschwächungen der Röntgenfluoreszenz in der Probe und Untergrundrauschen-Niveaus in der Probe auf, dass die Detektion der Röntgen fluoreszenz bei gleicher Konzentration der Markersubstanzen vergleichbare statistische Signifi kanz-Niveaus ergibt. Des Weiteren liegt vorzugsweise die Einstrahl-Photonenenergie der anre genden Röntgenstrahlung oberhalb der Absorptions-Kanten aller Markersubstanzen. Der Begriff "Konzentration" bezieht sich auf die Masse einer Markersubstanz pro (Strahl-)Fläche in der Probe, d.h. auf die "Massenbelegung". Die "Fluoreszenz-Wahrscheinlichkeit" bezeichnet den Wirkungs querschnitt der einzelnen Atome der Markersubstanz. Die Anzahl der von einer Markersubstanz erzeugten Fluoreszenz-Photonen, welche nach Transmission der Fluoreszenz durch die Probe das detektierbare Signal liefert, wird durch das Produkt aus der Massenbelegung und dem Wirkungs querschnitt für Fluoreszenz der jeweiligen Markersubstanz bestimmt. Wenn die Wirkungsquer schnitte zweier Markersubstanzen und auch die Transmissionen gleich oder ähnlich und die Mas senbelegungen gleich oder ähnlich sind, so liefert dies vorteilhafterweise gleiche oder ähnliche detektierbare Signale der Markersubstanzen.

Vorzugsweise umfassen die Markersubstanzen Nanopartikel. Besonders bevorzugt weisen die Nanopartikel für die Probe ununterscheidbare, vorzugsweise identisch äußere Oberflächen auf, die sich lediglich durch eine gezielte Funktionalisierung unterscheiden können, und deren Inneres aus verschiedenen Elementen besteht, wo jedes seinen charakteristischen "Fluoreszenz- Fingerabdruck" hat. Diese Nanopartikel können wie bei einer herkömmlichen Nanopartikel- basierten RFB von außen in die Probe eingebracht worden sein. Vorteilhaft für die multiparametrische RFB ist insbesondere die gezielte Wahl der Röntgenfluores- zenz-Elemente der Markersubstanzen. Diese Wahl erfüllt vorzugsweise folgende Kriterien:

(a) die Einstrahl-Photonenenergie liegt oberhalb aller Absorptions-Kanten,

(b) die Röntgenfluoreszenz-Elemente weisen eine ähnliche Fluoreszenz-Wahrscheinlichkeit auf,

(c) die Abschwächung der jeweiligen Fluoreszenz-Linien der Röntgenfluoreszenz-Elemente sollte ebenfalls ähnlich sein,

(d) die Fluoreszenz-Linien der Röntgenfluoreszenz-Elemente sollten ähnliche Untergrundrau schen-Niveaus aufgrund von Streuung (Einzel- und/oder Mehrfachstreuung) in der Probe haben, so dass zusammen mit (b) und (c) die jeweiligen statistischen Signifikanzen der detektierten Fluo reszenzlinien der Elemente ähnliche Niveaus haben, wenn die Massenbelegungen (Konzentratio nen) der Elemente im Röntgenstrahlvolumen gleich sind.

Als Maß für das Niveau der statistischen Signifikanz, d. h. insbesondere für die Sensitivität der Röntgenfluoreszenzdetektion, kann z. B. das Verhältnis aus der Anzahl der registrierten Fluores zenzphotonen zur Wurzel der Anzahl von Untergrundphotonen oder eine dieses Verhältnis quan titativ repräsentierende Größe herangezogen werden. Die Wurzel der Anzahl von Untergrundpho tonen ist wiederum ein Maß für das statistische Untergrundrauschen. Durch mathematische Fit funktionen des gemessenen Röntgenspektrums im Bereich der Fluoreszenzlinien kann unter Ver wendung verfügbarer numerischer Verfahren sowohl die Anzahl der Fluoreszenzphotonen als auch die des Untergrunds bestimmt werden.

Die Kriterien (b) bis (d) sind eine besonders wichtige Feststellung der Erfinder und von besonde rem Vorteil für die Realisierung von Ausführungsformen der Erfindung: wählt man etwa zwei Röntgenfluoreszenz-Elemente, die so weit im Periodensystem auseinander liegen, dass ihre Fluo reszenz-Wahrscheinlichkeiten (d. h. Wirkungsquerschnitte), Abschwächungen in der Probe und Untergrundrauschen-Niveaus übermäßig unterschiedlich sind, würden beide mit stark unter schiedlichen Sensitivitäten detektiert werden, selbst wenn die Massenbelegung beider Elemente im Röntgenstrahlvolumen identisch wären. Dies könnte dazu führen, dass nur eine der beiden Markersubstanz-Sorten effektiv nachweisbar wäre, so dass keine multiparametrische RFB erreicht werden würde.

Die Wirkungsquerschnitte der Atome der Markersubstanzen sind aus Standardmessungen und veröffentlichten Tabellen bekannt, und die Abschwächungen der Röntgenfluoreszenz in der Probe können durch Referenzmessungen und/oder Simulationen ermittelt werden. Der Untergrund wird sowohl durch Streuung der eingestrahlten Photonen in der Probe als auch durch Detektoreffekte gebildet. Das Untergrund-Verhalten von Röntgenfluoreszenz-Elementen kann durch numerische Simulationen oder Messungen bestimmt werden (siehe z. B. [7]), um damit die Wahl der Röntgen- fluoreszenz-Elemente nach den Kriterien (b) bis (d) optimal zu treffen.

Die Zuführung der Markersubstanzen in die Probe wird nicht als Teil der Erfindung betrachtet, soweit die Zuführung einen invasiven Eingriff in biologisches Material, wie z. B. eine Injektion, erfordert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die statistischen Signifikanz- Niveaus der Markersubstanzen maximiert, indem die Einstrahl-Photonenenergie der Röntgen strahlung mit einem Abstand oberhalb der höchsten Absorptions-Kante der Markersubstanzen in der Probe derart gewählt wird, dass die Untergrundrauschen-Niveaus der Markersubstanzen mi nimal und gleich oder annähernd gleich und gleichzeitig die Wirkungsquerschnitte und Transmis sionen der Röntgenfluoreszenz durch die Probe maximal und gleich oder annähernd gleich sind. Die genannten Größen sind vorzugsweise annähernd gleich, wenn Differenzen der Untergrund rauschen-Niveaus bzw. der Wirkungsquerschnitte und Transmissionen einen vernachlässigbar geringen Einfluss auf die Detektion der Röntgenfluoreszenz haben.

Vorzugsweise erfolgt die Wahl der Einstrahl-Photonenenergie der Röntgenstrahlung und die Aus wahl der Markersubstanzen durch eine Optimierung, wobei die Einstrahl-Photonenenergie im Vergleich zur höchsten Absorptions-Kante der Markersubstanzen in der Probe möglichst groß gewählt wird, damit Eingangs-Photonen möglichst viel gestreut werden müssen und entspre chende Energieverluste erleiden, bis sie in den Energiebereich der Röntgenfluoreszenz-Linien fallen (Minimierung des Untergrundrauschens durch notwendige Vielfachstreuung, die umso un wahrscheinlich wird, je mehr Streuungen für den Gesamtenergieverlust von der Einstrahlenergie hinunter zum Fluoreszenz-Energiebereich notwendig sind). Gleichzeitig wird die Einstrahl- Photonenenergie nicht so hoch zu wählen sein, dass die Wirkungsquerschnitte zu stark reduziert sind.

Mit der Erfindung wird erstmalig eine für die praktische Anwendung geeignete multiparametri sche Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an einer Probe bereitgestellt. In [9] werden zwar, wie oben beschrieben, bereits zwei verschiedene Nanopartikel verwendet, jedoch nur in-vitro auf einem sehr dünnen Substrat. Die vorliegende Erfindung hingegen erlaubt durch die Auswahl der Markersubstanzen, die in [9] nicht beschrieben ist, die zuverlässige RFB an realen Objekten, wie z. B. Objekten mindestens der Größe einer Maus. Auch in [2] oder [11] wird die erfindungsgemäße Auswahl der Markersubstanzen nicht beschrieben, so dass z. B. die in [11] genannten RFB- Markerelemente stark unterschiedliche Bildgebungs-Sensitivitäten hätten und eine effektive mul tiparametrische RFB ausgeschlossen ist.

Die Erfindung erlaubt auch, anders als bei den oben erwähnten, in [7] beschriebenen Verfahren, Vergleichsmessungen an einer einzelnen Probe, da die gleichzeitige Vergleichsmessung die glei che Bildgebungs-Sensitivität hat wie die eigentliche Messung, so dass eindeutige Ergebnisse erhal ten werden.

Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch eine Bildgebungsvorrichtung gelöst, die zur multiparametrischen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung zur Untersuchung einer Probe eingerichtet ist und eine Röntgenstrahlungsquelleneinrichtung, eine Detektoreinrichtung und Auswertungseinrichtung aufweist. Die Röntgenstrahlungsquellen einrichtung ist zur Bestrahlung der Probe mit Röntgenstrahlung konfiguriert, wobei Röntgenfluo reszenz einer ersten Markersubstanz und mindestens einer weiteren Markersubstanz in der Probe angeregt wird. Die Detektoreinrichtung, umfassend mindestens einen spektral auflösenden Rönt gendetektor, vorzugsweise eine Vielzahl von spektral auflösenden Röntgendetektoren, ist zur spektral aufgelösten Detektion der Röntgenfluoreszenz der ersten und der mindestens einen wei teren Markersubstanz in der Probe eingerichtet, wobei die Röntgenfluoreszenz der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz jeweils verschiedene Fluoreszenzlinien hat. Die Aus wertungseinrichtung ist zur Ermittlung von Verteilungen der ersten Markersubstanz und der min destens einen weiteren Markersubstanz in der Probe aus den detektierten Röntgenfluoreszen zemissionen eingerichtet. Vorzugsweise ist die Bildgebungsvorrichtung zur Durchführung des Ver fahrens gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder einer seiner Ausfüh rungsformen konfiguriert.

Gemäß einem dritten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Markersubstanz-Kit gelöst, das zur Einführung in eine Probe für eine multiparametrische Röntgen fluoreszenz-Bildgebung an der Probe eingerichtet ist und mindestens zwei Markersubstanzen enthält, die bei Bestrahlung mit Röntgenstrahlung Röntgenfluoreszenz emittieren, wobei Fluores zenzlinien der Markersubstanzen jeweils verschieden sind. Das Markersubstanz-Kit ist vorzugs weise zur Verwendung bei dem Verfahren gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder einer seiner Ausführungsformen, insbesondere zur Applikation in die Probe, vor gesehen. Das Markersubstanz-Kit kann in flüssiger oder fester Form bereitgestellt werden. Die Zusammensetzung des Markersubstanz-Kits (Substanzen, Konzentrationen, Partikelgrößen) und eine bevorzugte Photonenenergie der eingestrahlten Röntgenstrahlung kann durch Test- oder Referenzmessungen und/oder numerische Simulationen ermittelt werden.

Die räumlich aufgelöste Detektion der Röntgenfluoreszenz der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz in der Probe umfasst eine Detektion der Röntgenfluoreszenz der Markersubstanzen ausschließlich in mindestens einem räumlich begrenzten Bereich in der Probe, z. B. im Bereich mindestens eines Organs und/oder mindestens eines anderen Teils im Organis mus und/oder eine ortsaufgelöste Detektion der Röntgenfluoreszenz der Markersubstanzen über die gesamte Probe.

Die Verteilungen der ersten Markersubstanz und der mindestens einen weiteren Markersubstanz umfassen jeweils eine Zuordnung von Quantitätswerten, wie z. B. Konzentrationen (oder Massen belegungen), absolute Stoffmengen und/oder relative Häufigkeiten verschiedener Markersub stanzen der Markersubstanzen zu dem mindestens einen räumlich begrenzten Bereich und/oder zu Ortskoordinaten im Körper. Die Verteilungen der mindestens zwei Markersubstanzen ergeben sich aus deren Transport in der Probe, z. B. mittels Diffusion und/oder Trägerflüssigkeiten, wie Blut, und aus deren biologisch/chemischer Wechselwirkung mit der Probe. Die Quantitätswerte können unmittelbar aus den Amplituden der Röntgenfluoreszenzemissionen der Markersubstan zen ermittelt werden, da die Amplituden ein Maß für die Zahl der detektierten Röntgenfluores- zenz-Elemente sind. Die detektierten Amplituden der Röntgenfluoreszenzemissionen sind des Weiteren von der an sich bekannten Transmission der emittierten Fluoreszenz-Photonen in der Probe abhängig. Es können räumliche und/oder zeitliche Verteilungen der Markersubstanzen ermittelt werden.

Die räumlichen Verteilungen der Markersubstanzen in der Probe umfassen jeweils die Zuordnung der Quantitätswerte der Markersubstanzen zu dem mindestens einen räumlich begrenzten Be reich und/oder zu den Ortskoordinaten im Körper zu einem bestimmten Zeitpunkt.

Die zeitlichen Verteilungen der Markersubstanzen in der Probe umfassen jeweils eine Zeitabhän gigkeit der Zuordnung der Quantitätswerte der Markersubstanzen zu dem mindestens einen räumlich begrenzten Bereich und/oder zu den Ortskoordinaten im Körper.

Eine Verteilung umfasst somit z. B. mittlere Konzentrationswerte (und/oder deren Zeitfunktion) in bestimmten Organen und/oder ein Mapping von Massenwerten auf bestimmte Ortskoordinaten, wie z. B. eine bestimmte Scan-Linie oder eine bestimmte Scan-Fläche oder ein bestimmtes Scan-

Volumen.

Mit der Erfindung wird die RFB vorteilhafterweise dahingehend erweitert, dass gleichzeitig und mit gleicher Sensitivität bei minimaler Strahlendosis die spezifischen Verteilungen von mehreren verschiedenen Markersubstanzen, wie z. B. molekulare Markerelemente oder Nanopartikel, die jeweils verschiedene Wirksubstanzmoleküle (Wirksubstanzen), wie z. B. Medikamente oder Anti körper tragen, oder ganze biologische Zellen, in denen sie enthalten sind, oder die frei von Wirksubstanzmolekülen sind, in-vivo gemessen werden können. Dies war mit der herkömmlichen RFB oder PET prinzipiell ausgeschlossen. Die vorzugsweise gleichzeitige Erfassung der Verteilun gen von mehreren verschiedenen Markersubstanzen ("multi-parametrische Röntgenfluoreszenz- Bildgebung") liefern im Vergleich zum herkömmlichen RFB-Verfahren mit einer einzigen Markersubstanz zusätzliche Informationen über die untersuchte Probe, wie z. B. Pharmakokinetik- Informationen und/oder diagnostisch auswertbare Informationen. Damit werden als neue An wendungen der RFB z. B. die Messung der multi-parametrischen Pharmakokinetik und die multi parametrische Tumordiagnostik ermöglicht. Erstmals kann mit der Erfindung z. B. der Einfluss von Nanopartikeln, die als Markersubstanz verwendet werden können, auf die Kinetik bestimmt wer den, da gleichzeitig mindestens eine Kontrollgruppe umfassend nicht-funktionalisiere Nanoparti kel, mitgemessen wird.

Beispielsweise wird es erstmalig möglich, in-vivo zu bestimmen, ob an einem bestimmten Ort in der Probe ein Medikament in ausreichender Konzentration vorliegt und ob am selben Ort ein da mit wechselwirkendes (z. B. hemmendes) anderes Medikament ebenfalls mit signifikanter Kon zentration vorliegt.

Eine weitere Anwendung ist die gleichzeitige Messung der Pharmakokinetik von Medikamenten, z. B. von einem neuen Medikament und einem bereits zugelassenen Medikament oder einem Alternativ-Medikament oder Generika.

Erfindungsgemäß kann nicht nur die Wirksamkeit von Medikamenten untersucht werden, son dern auch deren Wechselwirkung bei Multimedikation, wenn also gleichzeitig mehrere Medika mente verabreicht wurden. Die Verteilung verschiedener Medikamente kann durch Bindung an verschiedene Markersubstanzen und Erfassung von deren Verteilungen ermittelt werden. Damit kann genau erfasst werden, wo in der Probe verschiedene Medikamente mit bestimmter Kon- zentration wechselwirken und so möglicherweise ihre jeweilige Wirkung gegenseitig stören. Für die Medikamentenentwicklung stellt dies einen wesentlichen Vorteil dar.

Ein Verfahren zur Anwendung bei der multi-parametrischen Tumordiagnostik würde z. B. so aus geführt, dass verschiedene Markersubstanzen jeweils mit verschiedenen Antikörpern gekoppelt werden, um den Sub-Typ eines untersuchten Tumors zu erkennen. Dies ist für eine anschließende Therapie von großem Vorteil, da die optimale Therapie vom Sub-Typ des Tumors abhängt. Insbe sondere in solchen Fällen, in denen keine Biopsie möglich ist (z. B. ein Tumor im Atemzentrum des Gehirns), wäre es ein entscheidender Vorteil für die anschließende Therapie, wenn der Sub-Typ bekannt ist.

Ein wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin, RFB mit verschiedenen Markersubstanzen anzuwenden, die hier als erste und weitere Markersubstanzen bezeichnet werden. Die verschie denen Markersubstanzen unterscheiden sich inhärent, z. B. in ihrem Inneren, durch jeweils ver schiedene fluoreszierende Elemente (Röntgenfluoreszenz-Elemente), welche die verschiedenen Fluoreszenzlinien ergeben. Die verschiedenen Markersubstanzen können als weiteres wichtiges Merkmal im nicht-funktionalisierten Zustand, d. h. ohne gekoppelte Wirksubstanzen, in Bezug auf ihre Wechselwirkung mit der Probe gleich sein, so dass sie also biologisch, chemisch, physiolo gisch und/oder physikalisch auf die Probe gleichwirkend, d. h. für die Probe identisch sind. Im nicht-funktionalisierten Zustand sind die Markersubstanzen somit von ihrer Umgebung her, insbe sondere biologisch und/oder chemisch, nicht unterscheidbar.

Des Weiteren sind die Fluoreszenzlinien der Markersubstanzen so verschieden, dass ein Detektor mit endlicher spektraler Auflösung (Energieauflösung) die jeweiligen Röntgenfluoreszenz- Elemente in dem gemessenen Röntgenspektrum der Röntgenfluoreszenzemissionen der Markersubstanzen unterscheiden kann. Die Röntgenfluoreszenz-Elemente der Markersubstanzen werden vorzugsweise so gewählt, dass die K- und L-alpha/beta-Linien dieser Elemente einen der artigen spektralen Abstand haben, dass die Detektoreinrichtung diese Linien in dem gemessenen Röntgenspektrum unterscheiden kann. Darüber hinaus haben die Röntgenfluoreszenz-Elemente der Markersubstanzen vorzugsweise eine gleiche oder zueinander angenäherte Fluoreszenz- Wahrscheinlichkeit (Wirkungsquerschnitt) und Transmission durch die Probe sowie vergleichbare minimale Untergrund-Rauschen-Niveaus.

Für die unten beispielhaft genannten, bevorzugt verwendeten Elemente sind diese Merkmale erfüllt, wobei typischerweise K-alpha-Linien von zwei im Periodensystem benachbarten Elemen- ten sich überlagern, zwei weitere aber nicht und somit getrennt im Spektrum erscheinen. Da alle vier Linien ähnliche Energien haben und daher in der Probe ähnlich absorbiert werden, können alle vier Linien mit gleicher oder vergleichbarer Genauigkeit gemessen werden.

Die spektral aufgelöste Detektion der Röntgenfluoreszenz liefert ein Röntgenspektrum mit einer additiven Überlagerung der Fluoreszenzlinien der Markersubstanzen. Die einzelnen quantitativen Beiträge der Fluoreszenzlinien können aus dem Röntgenspektrum durch eine numerische Entfal tung und/oder durch Vergleich mit vorgegebenen Referenzmessungen ermittelt werden. Aus den quantitativen Beiträgen der Fluoreszenzlinien ergeben sich die gesuchten Quantitätswerte der Markersubstanzen (z. B. Konzentrationen, absolute Stoffmengen und/oder relative Fläufigkeiten verschiedener Markersubstanzen). Selbst wenn in dem Röntgenstrahlvolumen alle Typen von Markersubstanzen vorhanden sind, kann deren relative Häufigkeit aus dem Röntgenspektrum ermittelt werden, weil die Röntgenfluoreszenz-Linien aller Röntgenfluoreszenz-Elemente klar voneinander im Spektrum unterscheidbar sind.

In der Praxis kann die Optimierung für eine konkret betrachtete Probe durch numerische Simula tionen des Untergrundrauschens und/oder Testmessungen bei verschiedenen Einstrahl- Photonenenergien der Röntgenstrahlung erfolgen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Röntgenfluores zenzemissionen der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit einem ge meinsamen Anregungsstrahl (oder Abfragestrahl) der Röntgenstrahlung angeregt und gleichzeitig detektiert. Vorteilhafterweise werden damit die Strahlungsbelastung der Probe und die Verfah rensdauer minimiert.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Röntgenfluoreszenzemis sionen der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit jeweils verschiedenen Anregungsstrahlen der Röntgenstrahlung, die verschiedene Energien (Einstrahl-Photonen energien) aufweisen, gleichzeitig oder sequenziell angeregt und detektiert. Für diese Ausfüh rungsform ist die Röntgenstrahlungsquelleneinrichtung für die Erzeugung von mehreren Anre gungsstrahlen der Röntgenstrahlung ausgelegt, indem z. B. mehrere, auf die Probe gerichtete Quellen mit verschiedenen Energien gleichzeitig oder sequentiell (z. B. unmittelbar aufeinander folgend) betrieben werden. Es können sich Vorteile durch die Anpassung der Energie der Anre gungsstrahlen jeweils an die Absorption der Röntgenfluoreszenz-Elemente der Markersubstanzen ergeben. Die gleichzeitige Anregung und Detektion hat Vorteile in Bezug auf die Minimierung der Verfahrensdauer. Die sequentielle Anregung und Detektion bedeutet, dass die verschiedenen Markersubstanzen schrittweise, vorzugsweise unmittelbar aufeinanderfolgend, angeregt werden und die zugehörige Fluoreszenz detektiert wird. Bei dieser Variante ergeben sich Vorteile für die unmittelbare Erfassung der Markersubstanzen aus deren aufeinander folgend aufgenommenen Röntgenspektren.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass verschiedene Typen von Markersubstanzen verfügbar sind, die Nanopartikel (oder: Targetpartikel) und Markermoleküle umfassen. Die erste und jede weitere Markersubstanz umfasst jeweils eine Vielzahl von Nanopartikeln und/oder eine Vielzahl von Markermolekülen. Nanopartikel sind Partikel mit einer typischen Dimension im Be reich von 2 nm bis 100 nm oder mehr, deren Oberflächen für eine Ankopplung von Liganden und/oder Wirksubstanzmolekülen geeignet oder gezielt präpariert sind. Markermoleküle sind einzelne Moleküle oder Molekülaggregate, die das Röntgenfluoreszenz-Element enthalten und die für eine Ankopplung von Wirksubstanzmolekülen geeignet sind. Es können alle Teile einer Markersubstanz mit einem bestimmten Röntgenfluoreszenz-Element ausschließlich aus Nanopar tikeln oder ausschließlich aus Markermolekülen bestehen, oder eine Markersubstanz kann Nano partikeln und Markermolekülen umfassen, die beide das gleiche oder unterschiedliche Röntgen- fluoreszenz-Elemente enthalten.

Markersubstanzen in Gestalt von Nanopartikeln haben besondere Vorteile für die Bindung von Wirksubstanzen. Auf der Oberfläche der Nanopartikel sind Liganden gebunden, mit denen Wirksubstanzmoleküle koppelbar sind oder die selbst als Wirksubstanz verwendet werden. Die Wirksubstanzmoleküle befinden sich auf der Oberfläche der Nanopartikel. Optional können Wirksubstanzmoleküle auch im Innern der Partikel angeordnet sein. Vorteilhafterweise bilden die Nanopartikel in diesem Fall Wirkstoffträger wie bei herkömmlichen Drug-Carrier-Techniken. Es können somit Nanopartikel verwendet werden, bei denen zur Bereitstellung verschiedener Markersubstanzen auf den Oberflächen unterschiedliche Ligandenmoleküle gebunden sind (so dass man untersuchen kann, welche Liganden wo im Körper andocken) und gleichzeitig im Inne ren gleiche oder andere Wirksubstanzmoleküle angeordnet sind. Bei den meisten Anwendungen bilden jedoch Ligandenmoleküle auf der Partikeloberfläche zugleich die Wirksubstanz.

Markersubstanzen aus verschiedenen Nanopartikeln umfassen zum Beispiel eine erste Vielzahl von Nanopartikeln (oder: Gruppe oder Sorte von Nanopartikeln), die nicht funktionalisiert sind, und mindestens eine weitere Vielzahl von Nanopartikeln, an denen jeweils mindestens ein vorbe stimmtes, zu untersuchendes Medikament gebunden ist. Eine multiparametrische RFB mit diesen Markersubstanzen ergibt mit einer Messung gleichzeitig oder sequentiell die lokale Konzentration der nicht-funktionalisierten Nanopartikel und die der funktionalisierten Nanopartikel, wobei der Unterschied in den Konzentrationen dem Medikament zugeordnet werden kann, mit dem die funktionalisierten Nanopartikel gekoppelt sind, da sich vorzugsweise die beiden Sorten von Nano- partikeln für die Probe nur durch das Wirksubstanz- bzw. Liganden-Molekül unterscheiden. In einer weiteren Variante kann eine dritte Sorte von Nanopartikel mit einem zweiten Medikament funktionalisiert sein. Mit dieser multiparametrischen RFB-Variante können eine Grundverteilung der nicht-funktionalisierten Nanopartikel von den gemessenen Konzentrationen der funktionali sierten Nanopartikel abgezogen und dabei sogar die beiden verschiedenen Medikamente unter schieden werden. Die entsprechenden Verfahren sind auch mit Markersubstanzen realisierbar, die anstelle der Nanopartikel Markermoleküle umfassen.

Nanopartikel sind Partikel, die ausschließlich aus einem Röntgenfluoreszenz-Element (ggf. in einer chemischen Verbindung) oder aus einer Zusammensetzung aus einem Röntgenfluoreszenz- Element (ggf. in einer chemischen Verbindung) und mindestens einem weiteren Element beste hen. So kann gemäß einer Variante der Erfindung jede Sorte von Nanopartikeln ausschließlich eines von mehreren Röntgenfluoreszenz-Elementen, optional in Zusammensetzung mit einem nicht-fluoreszierenden Element, enthalten. Gemäß einer alternativen Variante der Erfindung kann die erste Markersubstanz einen ersten Typ von Nanopartikeln, die überwiegend ein erstes Rönt- genfluoreszenz-Element enthalten, und die mindestens eine weitere Markersubstanz jeweils min destens einen weiteren Typ von Nanopartikeln umfassen, die jeweils überwiegend mindestens ein weiteres Röntgenfluoreszenz-Element enthalten. Somit können Nanopartikel jeweils mindestens zwei Röntgenfluoreszenz-Elemente enthalten, von denen ein Röntgenfluoreszenz-Element be stimmend für die jeweils zu detektierende Fluoreszenzlinie ist. Dies kann Vorteile für die Gestal tung der Nanopartikel haben, z. B. bei dem unten genannten Kern-Schale Aufbau.

Gemäß weiteren vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung kann der erste Typ von Nano partikeln einen ersten Typ von Wirksubstanzmolekülen tragen, die eine chemische und/oder phy sikalische Wechselwirkung mit der Probe aufweisen, während jeder weitere Typ von Nanoparti keln jeweils einen anderen Typ von Wirksubstanzmolekülen, die eine vom ersten Typ abweichen de chemische und/oder physikalische Wechselwirkung mit der Probe aufweisen kann, oder keine Wirksubstanzmoleküle trägt. Besonders bevorzugt trägt jeder Typ von Nanopartikeln ausschließ lich einen spezifischen Typ von Wirksubstanzmolekülen. Vorteilhafterweise wird damit die Aussa gekraft der RFB erhöht. Vorteilhafterweise bieten die Nanopartikel damit eine große Flexibilität bei der Anpassung an eine konkrete RFB-Untersuchungsaufgabe. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann mindestens ein Typ von Nanopartikeln einen Kern-Schale-Aufbau mit einem Partikelkern und einer Partikeldeckschicht aufweisen (Hybrid-Nanopartikel). Vorteilhafterweise erlaubt der Kern-Schale-Aufbau eine Tren nung von zwei Funktionen der Nanopartikel erstens in Bezug auf die Röntgenfluoreszenzemission und zweitens in Bezug auf die Wechselwirkung mit der Umgebung. So kann der Partikelkern aus dem Röntgenfluoreszenz-Element mit der gewünschten Fluoreszenzlinie des jeweiligen Typs von Nanopartikeln hergestellt sein, während die Partikeldeckschicht aus einem anderen Material als der Kern hergestellt ist und eine Oberfläche zur Kopplung von Liganden und/oder Wirksubstanz molekülen und zur Bereitstellung einer vorbestimmten biologischen und/oder chemischen Wech selwirkung mit der Probe bildet. Die Partikeldeckschicht kann aus einem fluoreszierenden oder einem nicht-fluoreszierenden Element hergestellt sein.

Gemäß bevorzugten Varianten der Erfindung ist die Partikeldeckschicht aus einem Metall, insbe sondere Gold, oder einem nicht-metallischen Material, insbesondere einem Polymer oder einem Liposomen-Material oder ein Mizellen-Material, gebildet. Da die Kopplungschemie von Wirksub stanzen mit Nanopartikeln bisher besonders mit Metall-Nanopartikeln, insbesondere Gold- Nanopartikeln, untersucht wurde, haben Nanopartikel mit dem Kern-Schale-Aufbau vorzugsweise im Partikelkern ein Röntgenfluoreszenzelement mit vergleichbar großer Kernladungszahl wie Gold (so dass die Röntgenfluoreszenz in einem vergleichbar hohen Energiebereich ist, um diese Photo nen mit hoher Empfindlichkeit außerhalb der Probe zu messen), und der Partikelkern ist vorzugs weise von einer Metall-Schicht, insbesondere Gold-Schicht, für die Kopplung der Wirksubstanzen (Liganden) bedeckt. Die Dicke der Partikeldeckschicht beträgt vorzugsweise z. B. 1/4 des Partikel durchmessers oder weniger. Daher ist der Volumenanteil des Goldes im Vergleich zu dem ande ren Röntgenfluoreszenz-Element vernachlässigbar, so dass das RFB-Signal so aussieht, als gäbe es nur das Röntgenfluoreszenz-Element des Partikelkerns. Eine alternative Möglichkeit besteht darin, Nanopartikel aus den verschiedenen Röntgenfluoreszenz-Elementen herzustellen und für die Par tikeldeckschicht statt Metall ein Polymer zu benutzen, wie z. B. in [5] beschrieben ist. An diese Polymer-Partikeldeckschichten können dann die entsprechenden Liganden gebunden werden, also z. B. Medikamente oder Antikörper. Auch die Polymerschicht-Nanopartikel können mit ge eigneten inneren Röntgenfluoreszenz-Elementen kombiniert werden, um je nach konkreten An wendungsbedingungen (z. B. Größe und Menge eines untersuchten Medikaments) eine multipa rametrische RFB zu realisieren, bei der alle verwendeten Nanopartikel eine ähnliche Sensitivität (Verhältnis aus Signalstärke zum statistischen Rauschen des jeweiligen Untergrunds) aufweisen. Besonders bevorzugt haben alle Nanopartikel der verschiedenen Markersubstanzen den Kern- Schale-Aufbau, wobei die Partikelkerne der verschiedenen Markersubstanzen aus verschiedenen Röntgenfluoreszenz-Elementen aufgebaut sind und die Partikeldeckschichten aller Markersub stanzen aus dem gleichen Element aufgebaut sind, an dem mindestens eines von Wirksubstanz molekülen und Liganden-Molekülen gebunden werden können. Optional können die Partikel ei ner Markersubstanz von mehreren Markersubstanzen vollständig aus dem Element gebildet sein, aus dem die Partikeldeckschichten der übrigen Markersubstanzen gebildet sind.

Gemäß einer bevorzugten Gestaltung sind die Nanopartikel außen ununterscheidbar, während sie im Inneren verschiedene Elemente aufweisen, wobei sie vorzugsweise die gleiche Größe haben. Vorzugsweise haben Nanopartikel mit dem Kern-Schale-Aufbau außen die Partikeldeckschichten, die aus einem identischen Material gebildet sind und vorzugsweise identisch sind. Somit können sie von der Probe, insbesondere vom Körper eines untersuchten biologischen Organismus, nicht unterschieden werden, es sei denn, sie sind unterschiedlich funktionalisiert. Im Inneren weisen diese Nanopartikel verschiedene Elementen, deren Röntgenfluoreszenz-Energien unterschiedlich sind. So kann man in einem gemessenen RFB-Spektrum die verschiedenen Nanopartikel-Typen voneinander unterscheiden und gleichzeitig ihre jeweilige Konzentration bestimmen, während sie von der Probe, abgesehen von der Funktionalisierung, ununterscheidbar sind.

Gemäß besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Nanopartikel jeweils als Röntgenfluoreszenz-Elemente, insbesondere im Partikelkern, Iridium oder Platin oder Gold oder Bismut. Vorteilhafterweise sind diese Elemente aufgrund ihrer ähnlichen, aber unter scheidbaren Röntgenfluoreszenz-Energien mit vergleichbarer Empfindlichkeit detektierbar. Damit können sogar bis zu vier unterschiedliche Medikamente, (Immun-)Zelltypen und/oder sub-typ- spezifische Antikörper z. B. im Körper eines biologischen Organismus gleichzeitig verfolgt werden. Gemäß alternativen Varianten können die Nanopartikel jeweils verschiedene Röntgen- Kontrastmittelmoleküle enthalten. Vorteilhafterweise sind Röntgen-Kontrastmittelmoleküle, wie z. B. lod oder Barium oder Gadolinium, in der Praxis vielfältig verfügbar und in Bezug auf ihr Ab sorptionsverhalten gut untersucht lod und Barium sind insbesondere für die Bildgebung an Klein tieren bevorzugt. Von Vorteil für die Bildgebung an Kleintieren sind auch Nanopartikel aus Silber, Palladium, Indium, Cadmium oder lod.

Wenn gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verschiedene Nanoparti kel, d. h. die verschiedenen Markersubstanzen mit verschiedenen Röntgenfluoreszenz-Elementen, jeweils eine andere Nanopartikelgröße aufweist, wird ein weiterer Freiheitsgrad bei der multipa- rametrischen RFB bereitgestellt. Vorteilhafterweise können damit die Aussagekraft der RFB noch erhöht werden und/oder das Verhalten von Nanopartikeln in der Probe untersucht werden. So ist aus der Praxis bekannt, dass Nanopartikel unterschiedlicher Größe eine unterschiedliche Kinetik haben können. Beispielsweise könnten mittels Röntgenfluoreszenz Verteilungen von Nanoparti keln mit bis zu vier verschiedenen Größen erfasst werden. Typische Größen werden dabei in den Durchmesser-Intervallen 2 nm bis 5 nm, 6 nm bis 10 nm, 11 nm bis 20 nm und 21 nm bis 50 nm gewählt. Bevorzugt haben die Nanopartikel mit verschiedenen Größen gleiche Oberflächenarten, so dass nur die Größe und je nach Größe das entsprechende Röntgenfluoreszenz-Element variiert werden.

Alternativ oder zusätzlich können sich die Nanopartikel verschiedener Markersubstanzen in Bezug auf die Zufuhr in die Probe unterscheiden. Beispielsweise kann mit der multiparametrischen RFB die Wirkung unterschiedlicher Verabreichungswege, z. B. orale und intravenöse Zufuhr der Nano partikel, auf die Verteilung der Markersubstanzen in der Probe untersucht werden.

Markersubstanzen in Gestalt von Markermolekülen haben besondere Vorteile für den Transport in der Probe. Markermoleküle haben eine erheblich geringere Größe als Nanopartikel, so dass ihr Transport in der Probe eher dem molekularen Stofftransport in Proben, insbesondere in biologi schen Organismen, ähnelt. Vorzugsweise umfasst die erste Markersubstanz einen ersten Typ von Markermolekülen, die ein erstes Röntgenfluoreszenz-Element enthalten, und jede weitere Markersubstanz jeweils einen weiteren Typ von Markermolekülen, die jeweils mindestens ein weiteres Röntgenfluoreszenz-Element enthalten.

Wenn gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung die erste Markersub stanz Nanopartikel umfasst, die ein erstes Röntgenfluoreszenz-Element enthalten, und die min destens eine weitere Markersubstanz Markermoleküle umfasst, die jeweils mindestens ein weite res Röntgenfluoreszenz-Element enthalten, werden Vorteile für neue Anwendungen der RFB ge wonnen. Beispielsweise können mehrere, z. B. vier, Markersubstanzen mit verschiedenen Nano partikeln mit einer oder mehreren weiteren Markersubstanzen aus Markermolekülen in Form von Kontrastmittelmolekülen kombiniert werden.

Man kann z. B. drei verschiedene Typen von Immunzellen mit drei verschiedenen Nanopartikeln koppeln und zusätzlich ein Medikament untersuchen, an das ein fluoreszierendes Markermolekül gebunden ist. Die Markierung der verschiedenen Immunzell-Typen jeweils mit verschiedenen Nanopartikel erfolgt z. B. durch vorige Entnahme der Zellen mit anschließendem Beladen mit den Nanopartikeln und Einbringen in die Probe, oder durch Verwendung von Nanopartikel, die so funktionalisiert sind, dass sie jeweils ln-vivo nur an bestimmte, unterschiedliche Immunzell-Typen binden. Die Nanopartikel für die Immunzellen sollten für die Zellen und die Probe nicht unter scheidbar sein, während das Medikament sich von den Immunzellen unterscheidet. Mit anderen Worten, in diesem Fall muss das Medikament nicht zwingend auch an ein Nanopartikel gebunden sein. Diese Anwendung kann besondere Vorteile bei der Untersuchung von immunbasierten Er krankungen, wie z. B. Morbus Crohn haben. Es könnten die Verteilungen verschiedener Immun- zell-Typen und gleichzeitig die Verteilung des Medikamentes gemessen werden, um damit in-vivo die Wirksamkeit des Medikamentes zu untersuchen. Die Wirkung kann dabei darin bestehen, dass das Medikament die Häufigkeiten der Immunzell-Typen im Entzündungsgebiet verändert, wobei z. B. die Entzündung abschwächenden Immunzelltypen dann häufiger Vorkommen.

Eine weitere vorteilhafte Anwendung der Erfindung, bei der sowohl Nanopartikel als auch Markermoleküle jeweils als verschiedene Markersubstanzen verwendet werden, sind die so ge nannten Drug Carriers. Es können z. B. zwei verschiedene Markersubstanzen jeweils mit verschie denen Nanopartikel verwendet werden, von denen eine Gruppe von Nanopartikeln nicht- funktionalisiert ist und die andere Gruppe von Nanopartikeln mit einem vorbestimmten Liganden funktionalisiert ist, der an eine Zielstruktur in der Probe andocken soll. Beide Nanopartikel können dabei als Drug Carrier dienen, d.h. im Inneren das eigentliche Medikament haben, an das nun Molekül-basierte Marker gebunden sind. Mit der multiparametrischen RFB kann festgestellt wer den, wo und ggf. wann die Nanopartikel als Drug Carrier ihre Fracht abgeben. Eine verfrühte Ab gabe wäre z. B. feststellbar wenn die Medikament-Verteilung nicht der Verteilung der Nanoparti kel entspricht. Der Vergleich der Verteilungen der nicht-funktionalisierten Nanopartikel mit de nen, die die Liganden tragen, kann zeigen, wie spezifisch die Liganden ihren Zielort finden. Sind beide Verteilungen identisch, würde festgestellt werden, dass der Drug Carrier eher zufällig und nicht zielgerichtet am Zielort ankommt, was mit den Liganden eigentlich erzielt werden soll.

Vorzugsweise sind die Markermoleküle an Wirksubstanzmoleküle gebunden, wobei die Marker moleküle jeweils eines von dem ersten und mindestens einen weiteren Röntgenfluoreszenz- Element enthalten. Besonders bevorzugt umfassen die Röntgenfluoreszenz-Elemente mittel schwere Elemente von Zirkonium bis Cerium, für die das Untergrundrauschen-Niveau stark redu ziert werden kann, oder schwere Elemente wie Iridium, Platin, Gold und Bismuth. Diese beiden Gruppen von Elementen haben Vorteile aufgrund ihrer ähnlichen und bereits gut untersuchten Fluoreszenzeigenschaften und können leicht an Medikamenten-, bzw. Liganden-Moleküle gekop pelt werden. Gemäß der Erfindung können räumliche und/oder zeitliche Verteilungen der Markersubstanzen ermittelt werden. Von besonderem Vorteil ist dabei eine bevorzugte Ausführungsform der Erfin dung, bei der sowohl räumlich als auch zeitlich aufgelöst gemessen und eine Zeitfunktion der räumlichen Verteilungen der ersten Markersubstanz und der mindestens einen weiteren Markersubstanz in der Probe ermittelt wird. Diese Ausführungsform hat eine besonders hohe Aussagekraft über den Transport der Markersubstanzen in der Probe von der Zuführung in die Probe bis zur Bindung innerhalb der Probe.

Gemäß einem weiteren, bevorzugt realisierten Merkmal werden die Einstrahl-Photonenenergie der Röntgenstrahlung zur Anregung der Markersubstanzen und Röntgenfluoreszenzeigenschaften der Markersubstanzen so gewählt, dass die Einstrahl-Photonenenergie der Röntgenstrahlung oberhalb der Absorptions-Kanten der Röntgenfluoreszenz-Elemente aller Markersubstanzen liegt und die Röntgenfluoreszenz-Elemente aller Markersubstanzen gleiche oder derart ähnliche Fluo reszenz-Wahrscheinlichkeiten, Abschwächungen der Röntgenfluoreszenz in der Probe und Signal- Untergrundrauschen-Niveaus in der Probe aufweisen, dass die Detektion der Röntgenfluoreszenz bei gleicher Konzentration vergleichbare Signalstärken ergibt. Vorteilhafterweise können mit die sem Merkmal vereinfacht relative Häufigkeiten verschiedener Markersubstanzen direkt aus den detektierten Röntgenspektren ermittelt werden. Es kann beispielsweise eine von mehreren Markersubstanzen eine erheblich geringere Konzentration haben als die anderen Markersubstan zen, weil z. B. die Liganden an diesen Nanopartikeln nur schlecht an Zielstrukturen in der Probe ankoppeln. Dieses Verhalten lässt sich bei Detektion der Röntgenfluoreszenz mit vergleichbarer Sensitivität direkt aus den detektierten Röntgenspektren beobachten. Wenn alle Markersubstan zen eine gleiche oder ähnliche Massenbelegung haben, werden ihre Signale vergleichbare Intensi täten haben.

Gemäß einer bevorzugten Anwendung der Erfindung ist die untersuchte Probe ein menschlicher oder tierischer Proband oder ein Körperteil von diesem. Dem Probanden wurden die Markersub stanzen vorab zugeführt, z. B. durch orale oder anderweitige Verabreichung oder Injektion. Die erste und die mindestens eine weitere Markersubstanz können jeweils auf verschiedenen Wegen in die Probe eingeführt werden. Ein Vorbereitungsschritt mit einer Zufuhr einer Markersubstanz durch Injektion in den Körper des Probanden ist nicht Teil der Erfindung.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Anwendung der Erfindung umfassen die Wirksubstanzen biologische Zellen, wobei die mindestens eine der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit den biologischen Zellen gekoppelt ist und die Ermittlung der Verteilung der ersten Markersubstanz und der mindestens einen weiteren Markersubstanz eine Erfassung eines Transports der biologischen Zellen durch die Probe umfasst. Vorteilhafterweise kann damit bei spielsweise der Transport von verschiedenen Immunzellen durch die Probe ermittelt werden.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beige fügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

Figur 1: eine schematische Illustration einer Bildgebungsvorrichtung zur Röntgenfluoreszenz- Bildgebung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;

Figur 2: ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur Röntgenfluoreszenz-Bildgebung gemäß Ausfüh rungsformen der Erfindung;

Figur 3: Beispiele von Markersubstanzen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Rönt genfluoreszenz-Bildgebung verwendbar sind;

Figur 4: eine schematische Illustration eines Markersubstanz-Kits gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;

Figur 5: ein gemessenes Röntgenspektrum zur Illustration von Röntgenfluoreszenzemissionen von zwei verschiedenen Röntgenfluoreszenz-Elementen in biologischen Zellen;

Figur 6: ein gemessenes Röntgenspektrum zur Illustration von Röntgenfluoreszenzemissionen von vier verschiedenen Röntgenfluoreszenz-Elementen in einer Probe; und

Figur 7: simulierte Röntgenspektren zur Illustration von Röntgenfluoreszenzemissionen von Röntgenfluoreszenz-Elementen in einer Probe für zwei unterschiedliche Einstrahl- Energien.

Merkmale bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden unter beispiel haftem Bezug auf die RFB an einem menschlichen Probanden mit bestimmten Röntgenfluores- zenz-Elementen beschrieben. Es wird betont, dass die Umsetzung der Erfindung in der Praxis nicht auf die genannten Beispiele beschränkt, sondern entsprechend mit anderen Proben, wie z. B. Teilbereichen eines menschlichen Probanden, synthetischen biologischen Objekten, tierischen Probanden oder deren Teilbereichen, möglich ist. Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden insbesondere unter Bezug auf wichtige Merkmale der Konfiguration der Markersub stanzen, die Durchführung der RFB und den Aufbau der Bildgebungsvorrichtung beschrieben. Weitere Merkmale der Bildgebungsvorrichtung können z. B. realisiert sein, wie in [1] beschrieben ist. [1] wird hinsichtlich des Aufbaus und der Funktion der Bildgebungsvorrichtung durch Bezug nahme in die vorliegende Offenbarung einbezogen. Einzelheiten der Funktionalisierung von Na- nopartikeln, der Kopplung von Nanopartikeln mit Wirksubstanzen, der Auswahl von Liganden, der Kopplung von Markermolekülen mit Wirksubstanzen, der spektral und räumlich aufgelösten De tektion von Röntgenfluoreszenz und der Analyse von überlagerten, aus mehreren Fluoreszenzli nien zusammengesetzten Spektren werden nicht beschrieben, soweit diese aus dem Stand der Technik an sich bekannt sind. Die Konzentrationen der Markersubstanzen können gewählt wer den, wie an sich von der herkömmlichen RFB bekannt ist.

Figur 1 illustriert schematisch Merkmale von Ausführungsformen einer Bildgebungsvorrichtung 100 zur Röntgenfluoreszenz-Bildgebung für die Untersuchung einer Probe 10, wie z. B. eines menschlichen Probanden, die auf einem Probenträger 101, wie z. B. einer Liege, angeordnet ist. Figur 2 zeigt schematisch die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der Bildgebungsvorrichtung 100, umfassend die Zufuhr der Markersubstanzen (Sl), die Bestrahlung der Probe mit Röntgenstrahlung (S2), die Detektion der Röntgenfluoreszenz (S3) und die Ermitt lung von Markersubstanz-Verteilungen aus der detektierten Röntgenfluoreszenz (S4).

Zusätzlich ist in Figur 2 ein Schritt SO illustriert, der die Auswahl der Markersubstanzen und der Einstrahl-Photonenenergie umfasst. Es ist ausreichend, wenn Schritt SO für eine betrachtete Pro be oder Gruppe von Proben mit gleichen Streueigenschaften, wie z. B. für Kleintiere einer be stimmten Tierart und Größe, einmalig und von der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfah rens getrennt ausgeführt wird. Alternativ kann Schritt SO als Teil jeder Ausführung des erfindungs gemäßen Verfahrens vorgesehen sein.

Die Auswahl erfolgt z. B. mit den folgenden Überlegungen anhand der in Figur 7 beispielhaft ge zeigten Fluoreszenzspektren. Im Einzelnen zeigt Figur 7 zwei simulierte Spektren nach Anregung mit monochromatischen Röntgenstrahlen im direkten Vergleich, erstens für eine Einstrahlenergie von z. B. 85 keV und zweitens für eine Einstrahlenergie von z. B. 53 keV. Im ersten Fall könnten z.B. Gold-Nanopartikel angeregt werden (K-Kante bei ca. 81 keV), die aber Fluoreszenzlinien im Bereich des starken Peaks um ca. 65 keV haben, wobei dieser Peak von nur einfach-gestreuten Photonen herrührt. Im Gegensatz dazu zeigt das 53-keV-Spektrum ein ausgeprägtes Untergrund- Minimum bei solchen Fluoreszenzlinien von mittelschweren Elementen, die im Bereich zwischen etwa 15 und 28 keV liegen, da hierfür eingestrahlte Photonen meist 5-mal oder öfter streuen müssen. Das 85-keV-Spektrum zeigt zwar im selben Energiebereich ebenfalls ein Minimum, je doch ist dieses höher und die hohe Einstrahlenergie würde kleinere Ausbeuten für die Fluoreszenz von mittelschweren Elementen bedeuten.

Für ein Marker-Kit mittelschwerer Elemente ist also die niedrigere Einstrahlenergie effizienter, für schwere Elemente von Gold ist die höhere Energie bevorzugt. Mit einer Variation der Detektorpo sition relativ zur Strahlrichtung (hier 150°) kann das Minimum im Untergrundbereich noch etwas ausgeweitet werden, der entscheidende Parameter zur Flöhe des Minimums aber ist die Einstrah lenergie.

In einem konkreten Beispiel der RFB an Mäusen können für eine erste Markersubstanz als Rönt genfluoreszenzelement lod und als Einstrahl-Photonenenergie 53 keV gewählt werden (siehe Fi gur 7). Die Einstrahl-Photonenenergie 53 keV liegt deutlich oberhalb der lod-Kante von 33 keV. Eingangs-Photonen, die nach Vielfach-Streuungen in den Energiebereich der Röntgenfluoreszenz von lod fallen (ca. 29 keV), müssten also mehrere aufeinanderfolgende Compton-Streuungen, insbesondere ca. 5 Compton-Streuungen, ausführen. Mit jeder weiteren Compton-Streuung nach der vorhergehenden Streuung verringert sich die Gesamt-Wahrscheinlichkeit, so dass der Unter grund minimiert ist. Zugleich besitzt lod bei der Anregung mit 53 keV eine ausreichend hohe Fluo reszenzwahrscheinlichkeit. Als weitere Markersubstanz ist bei diesem Beispiel ein im PSE zu lod nahe benachbartes Element, wie z. B. Indium, vorgesehen, das mit der gleichen Einstrahl- Photonenenergie von 53 keV angeregt wird.

Die Auswahl der Markersubstanzen und der Einstrahl-Photonenenergie erfolgt z. B. durch Simula tion des Streuverhaltens der Probe und/oder Tests, gemäß der oben genannten Optimierung der art, dass die Einstrahl-Photonenenergie der Röntgenstrahlung einen Abstand von einer höchsten Absorptions-Kante aller Markersubstanzen in der Probe aufweist, bei dem gleichzeitig die Unter grundrauschen-Niveaus der Markersubstanzen minimal und die Wirkungsquerschnitte ähnlich sind.

In einem weiteren Beispiel der RFB an größeren Proben würden z. B. Gold und ein zu Gold im PSE nahe benachbartes Element, wie z. B. Platin, als Röntgenfluoreszenzelement und eine Einstrahl- Photonenenergie der Röntgenstrahlung von z. B. 85 keV verwendet werden. Schritt S1 umfasst z. B. eine orale Zufuhr und/oder eine Injektion der Markersubstanzen und kann, soweit ein Eingriff in einen biologischen Körper vorgesehen ist, nicht als Teil der Erfindung be trachtet werden.

Die Bildgebungsvorrichtung 100 umfasst eine Röntgenstrahlungsquelleneinrichtung 110, die für die Bestrahlung der Probe 10 mit Röntgenstrahlung 1 (Schritt S2) konfiguriert ist und z. B. eine Photonenenergie von 50 keV oder 100 keV emittiert. Die Röntgenstrahlungsquelleneinrichtung 110 ist vorzugsweise eine kompakte laser-basierte Thomson-Quelle (Röntgenstrahlungsquelle, die Röntgenstrahlung basierend auf der Thomson-Streuung von Laserlicht an relativistischen Elektro nen) erzeugt, wie sie z. B. in [8] beschrieben wird, kann aber auch eine Synchrotronquelle oder allgemein eine Röntgenquelle, z. B. Röntgenröhre umfassen, die Röntgenstrahlung mit ausrei chend geringer Divergenz und hoher Intensität insbesondere im Energiebereich oberhalb der K- Kante der Röntgenfluoreszenz-Elemente der Markersubstanzen erzeugt und möglichst mono chromatisch sein sollte, damit die oben beschriebene Optimierung der Einstrahlenergie verbes sert wird.

Die Röntgenstrahlung 1 kann in Gestalt eines parallelen Strahlenbündels mit einem Durchmesser erzeugt werden, der den gesamten zu untersuchenden Querschnitt der Probe 10 abdeckt. In die sem Fall werden alle Bereiche der Probe gleichzeitig bestrahlt und die in diesen vorhandenen Markersubstanzen zu Röntgenfluoreszenz 2 angeregt. Alternativ kann die Röntgenstrahlung 1 als Nadelstrahl, insbesondere mit einem geringeren Durchmesser als der Querschnitt der Probe quer zur Strahlrichtung, erzeugt und relativ zur Probe 10 mit einer Röntgenoptik (nicht gezeigt) bewegt (gescannt) werden. In diesem Fall werden die Bereiche der Probe aufeinanderfolgend bestrahlt ("abgescannt") und die in diesen vorhandenen Markersubstanzen zu Röntgenfluoreszenz 2 ange regt. Da die Scanbewegung eines Nadelstrahls über die Probe 10 innerhalb einer Scandauer erfol gen kann, die im Vergleich zu typischen Transportzeiten von Markersubstanzen in der Probe 10 vernachlässigbar ist, wird auch beim Scannen der Röntgenstrahlung 1 effektiv eine Momentauf nahme der Röntgenfluoreszenz 2 erfasst.

Die Bildgebungsvorrichtung 100 umfasst des Weiteren eine Detektoreinrichtung 120, die zur spektral und räumlich aufgelösten Detektion der Röntgenfluoreszenz 2 von Markersubstanzen in der Probe 10 angeordnet ist (Schritt S3). Die Detektoreinrichtung 120 umfasst eine Vielzahl von Detektorelementen (nicht gezeigt), die jeweils ein Röntgenspektrum der Röntgenfluoreszenz 2 erfassen. Durch Kollimatoren der einzelnen Detektorelemente oder an Gruppen von Detektorel ementen kann der entsprechende Raumwinkelbereich eingeschränkt werden, der einen vorbe- stimmten geometrischen Abschnitt in der Probe 10 abdeckt. Die Detektoreinrichtung 120 ist z. B. so aufgebaut, wie in [1] beschrieben ist. Zwischen der Detektoreinrichtung und der Probe kann ein Kollimator angeordnet sein, der wie in [7] beschrieben Streustrahlung reduzieren kann.

Abweichend von Figur 1 kann die Detektoreinrichtung 120 mit nur einem Detektorelement ausge stattet sein, das relativ zur Probe 10 beweglich und zur spektral aufgelösten Detektion der Rönt genfluoreszenz 2 von Markersubstanzen in der Probe 10 angeordnet ist. Mit dem beweglichen Detektorelement kann die Probe 10 abgetastet (abgescannt) werden, um eine räumliche Vertei lung der Markersubstanzen zu erfassen, wenn ein Kollimator nur bestimmte Bereiche der Probe in dem Raumwinkelbereich des Detektorelements ausschneidet. Gemäß einer weiteren Alternative kann ein einziges Detektorelement relativ zur Probe 10 ortsfest und zur spektral aufgelösten De tektion der Röntgenfluoreszenz 2 von Markersubstanzen in einem bestimmten Abschnitt der Pro be 10 angeordnet sein. Auch in diesem Fall wird die Röntgenfluoreszenz 2 räumlich auf einen de finierten Teil der Probe 10, z. B. ein Organ, beschränkt erfasst, wenn ein Kollimator benutzt wird.

Alternativ können die Markersubstanzen ohne Kollimatoren durch ein Abscannen des Röntgen strahls 1 lokalisiert werden, z. B. wie in [7] beschrieben ist.

Die Probe 10 enthält mindestens zwei Markersubstanzen mit jeweils verschiedenen Röntgenfluo reszenz-Elementen, die mit der Röntgenstrahlung 1 zu Röntgenfluoreszenz 2 angeregt werden.

Die Detektoreinrichtung 120 liefert Ausgangssignale in Gestalt von Röntgenspektren, die jeweils vorbestimmten Abschnitten (geometrischen Positionen) in der Probe 10 zugeordnet sind und die eine Überlagerung der Fluoreszenzlinien 3 der Röntgenfluoreszenz-Elemente beinhalten (siehe schematische Kurvendarstellung eines Spektrums in Figur 1 und Beispielmessung in den Figuren 5 und 6).

Des Weiteren umfasst die Bildgebungsvorrichtung 100 eine Auswertungseinrichtung 130 zur Auf nahme der Ausgangssignale (räumlich aufgelöste Röntgenspektren) der Detektoreinrichtung 120 und zur Ermittlung räumlicher Verteilungen 4 der Markersubstanzen in der Probe 10 aus der de- tektierten Röntgenfluoreszenz 2 (Schritt S4). Die Auswertungseinrichtung 130 umfasst z. B. eine Computereinrichtung, die mit der Detektoreinrichtung 120 gekoppelt ist. Die Auswertungseinrich tung 130 ist zur Ausführung eines Computerprogramms eingerichtet, mit dem aus den Ausgangs signalen der Detektoreinrichtung 120, vorzugsweise unter Berücksichtigung eines vorab ermittel ten Untergrund-Spektrums, die Intensitäten der Fluoreszenzlinien an den geometrischen Positio- nen in der Probe 10 und aus diesen die gesuchten Verteilungen 4 der Markersubstanzen ermittelt werden.

Die Verteilungen 4 der Markersubstanzen (siehe schematische Illustration in Figur 1) werden z. B. als Bild (Karte) oder Tabellenwerte ausgegeben. Bei Erfassung einer zeitlichen Verteilung der Markersubstanzen kann eine Folge bewegter Bilder, z. B. eine Videosequenz, ausgegeben werden, welche die Bewegung der Markersubstanzen in der Probe 10 und/oder die Anreicherung mindes tens einer der Markersubstanzen in einem Abschnitt der Probe 10, wie z. B. einem Organ, reprä sentiert.

Optional kann die Computereinrichtung zusätzlich als Steuereinrichtung der Bildgebungsvorrich- tung 100, insbesondere zur Steuerung und/oder Überwachung, der Röntgenstrahlungsquellenein richtung 110 und/oder der Detektoreinrichtung 120 vorgesehen sein.

Die Probe 10 enthält eine erste und mindestens eine weitere Markersubstanz, die sich in ihren Fluoreszenzlinien 3 unterscheiden und im Folgenden beispielhaft unter Bezug auf Figur 3 be schrieben werden. Die Figuren 3A bis 3C zeigen einen ersten Typ von Markersubstanzen in Gestalt von Nanopartikeln 11, 12, während die Figuren 3D bis 3E einen zweiten Typ von Markersubstan zen in Gestalt von Markermolekülen 14, 15 zeigen. Die Nanopartikeln 11, 12 können eine sphäri sche Form (wie beispielhaft dargestellt) oder eine andere Form, z. B. eine eckige Form mit einer Vielzahl von Seitenflächen und/oder eine Stabform, aufweisen.

Gemäß Figur 3A kann ein Nanopartikel 11 aus einem einzigen Röntgenfluoreszenz-Element herge stellt sein, insbesondere vollständig aus dem Röntgenfluoreszenz-Element, wie z. B. Gold oder Platin bestehen, und einen Durchmesser von z. B. 10 nm aufweisen. Gemäß Figur 3B kann ein Nanopartikel 12 einen Kern-Schale-Aufbau mit einem Partikelkern 13 und einer Partikeldeck schicht 14 aufweisen. Der Partikelkern 13 kann wie der Nanopartikel 11 gemäß Figur 3A aus ei nem einzigen Röntgenfluoreszenz-Element hergestellt sein, insbesondere vollständig aus dem Röntgenfluoreszenz-Element, wie z. B. Platin, bestehen. Die Partikeldeckschicht 14 besteht aus einem anderen Material als der Partikelkern 13, z. B. aus Gold oder einem Polymer (siehe [5]). Die Partikeldeckschicht 14 hat eine Dicke von z. B. 2 nm. Gemäß Figur 3C kann z. B. ein Nanopartikel 12 mit einem Kern-Schale-Aufbau und/oder einer Partikeldeckschicht funktionalisiert, d. h. auf seiner Oberfläche mit Liganden- und/oder Wirksubstanzmolekülen versehen sein. Die Liganden- und/oder Wirksubstanzmoleküle sind in Figur 3C schematisch mit Dreiecken illustriert und können insbesondere ganze biologische Zellen umfassen. Jede Markersubstanz umfasst eine Vielzahl von Nanopartikeln 11, 12, deren Stoffmenge in Ab hängigkeit von der gewünschten Konzentration in der Probe und der gewünschten Sensitivität bei der Messung der Röntgenspektren mit der Detektoreinrichtung 120 gewählt wird. Die Auswahl der Röntgenfluoreszenz-Elemente der Nanopartikel und ggf. die Funktionalisierung der Nanopar- tikel werden unter Berücksichtigung der folgenden Betrachtungen implementiert.

Im Periodensystem der Elemente (PSE) haben nahe beieinanderliegende Elemente physikalische sehr ähnliche Eigenschaften in Bezug auf die Produktionswahrscheinlichkeit und die Abschwä chung von Röntgenfluoreszenz. Die erste Größe hängt bei gegebener Energie der eingestrahlten Röntgenphotonen nur vom Element ab. Entsprechend werden die Röntgenfluoreszenz-Elemente der Nanopartikel so gewählt, dass sie im PSE direkt benachbart sind oder so dicht beieinander liegen, dass die Röntgenfluoreszenz aller Röntgenfluoreszenz-Elemente mit vergleichbarer Sensi tivität gemessen werden kann. Röntgenfluoreszenz-Elemente in verschiedenen Nanopartikeln umfassen z. B. mindestens zwei von Iridium, Platin, Gold und Bismuth, da diese vier schweren Elemente im PSE sehr nahe beieinander liegen (Ir, Pt und Gold sogar direkt benachbart). Damit ist ihr Verhalten sehr ähnlich und alle vier können gleichzeitig für RFB benutzt werden. Eine weitere günstige Variante wären mittelschwere Röntgenfluoreszenz-Elemente von Zirkonium bis Cerium. Ungünstig wäre hingegen, Nanopartikel von zwei verschiedenen Markersubstanzen z. B. so zu realisieren, dass die einen Nanopartikel im Inneren aus Gold und die anderen Nanopartikel aus einer lod-Verbindung bestehen. Beide Elemente Gold und lod sind so weit im PSE voneinander getrennt, dass sie nur dann gleichzeitig Röntgenfluoreszenz abgeben können, wenn die Einstrahl- Energie oberhalb der sog. Gold-Kante liegt: läge die Energie unterhalb dieser Kante, würde keine Gold-Röntgenfluoreszenz angeregt werden. Da aber die lod-Kante weit davon entfernt liegt, nimmt die Wahrscheinlichkeit dafür, dass auch eine lod-Fluoreszenz erzeugt wird, stark ab. Flinzu kommt das Problem des Untergrunds bei der RFB: die (Vielfach-)Compton-Streuung kann zu ei nem starken Untergrund im Röntgenspektrum in der Signal-Region der eigentlichen Fluoreszenz- Linien führen (siehe [1] und [7]) und wäre für Gold deutlich höher als für lod, so dass insgesamt beide Elemente nicht mit ähnlicher Sensitivität messbar sind.

Von Vorteil ist, wenn die Probe, insbesondere der Körper des Probanden, die Gold- und Platin- Nanopartikel nicht voneinander unterscheiden kann, da beide dieselbe Größe, äußere Oberfläche (z. B. eine identische Polymer-Partikeldeckschicht) und gleiche oder sehr ähnliche Massen haben. Wenn nun z. B. nur das Platin-Nanopartikel mit Gold-Partikeldeckschicht auf dieser funktionali- siert ist, das Gold-Nanopartikel aber nicht-funktionalisiert bleibt, und beide in die Probe gegeben werden, können gemessene Unterschiede in den lokalen Konzentrationen auf das Wirken der Liganden zurückgeführt werden, da beide Nanopartikel-Sorten vom Körper ansonsten nicht unter scheidbar sind. Nur wenn die Liganden im Körper gezielte Bindungen eingehen, wird die lokale Konzentration am Bindungsort der Platin-Nanopartikel höher sein als die der nicht-funktio- nalisierten Gold-Nanopartikel, die damit als Referenz-Konzentration dienen. Vorteilhafterweise können diese lokalen Konzentrationsunterschiede mit der erfindungsgemäßen RFB gemessen werden. Hierzu ist von besonderem Vorteil, wenn die Mess-Sensitivitäten beider innerer Röntgen- fluoreszenz-Elemente der Nanopartikel ausreichend hoch und vorzugsweise gleich oder sehr ähn lich (eventuelle Unterschiede hinsichtlich der Auswertung der Detektorausgangssignale vernach lässigbar) sind.

Eine weitere Variante der Verwendung von Nanopartikel ist derart möglich, dass diese im Inneren keine schweren Elemente, sondern leichtere Moleküle mit Röntgenfluoreszenz-Elementen, wie die z. B. beiden unten genannten Kontrastmittel für die Computertomographie (CT) enthalten und als Partikeldeckschicht eine Polymer-Hülle tragen.

Die Figuren 3E und 3D beziehen sich auf Varianten der Erfindung bei denen Wirksubstanzen, wie z. B. Medikamenten-Moleküle, direkt mit Markermolekülen 15, 16, wie z. B. kleineren Komplexe mit Röntgenfluoreszenz-Elementen, wie z. B. einen Trijodbenzolring oder einen Ring aus Barium- Atomen, verbunden sind. Trijodbenzol und Barium sind vorteilhafterweise verfügbare Kontrast mittel der CT, wobei beide Elemente, lod und Barium, nahe beieinander im PSE angeordnet sind. Die multiparametrische RFB mit Markermolekülen verwendet somit Röntgenfluoreszenz-Element- Komplexe mit unterschiedlichen Röntgenfluoreszenz-Elementen, an die z. B. unterschiedliche Medikamenten-Moleküle gebunden sind. Vorzugsweise sind die Markermoleküle auf die Probe chemisch gleich oder sehr ähnlich wirkend, so dass sie die Kinetik der Medikamente in der Probe nicht oder für die Messung nur vernachlässigbar beeinflussen.

Zur die Verwendung von verschiedenen CT-Kontrastmitteln als Markersubstanzen wird ange merkt, dass das herkömmliche CT-Verfahren keine multiparametrische Messung erlauben würde, da der Messunterschied in den unterschiedlichen Absorptionen der Kontrastmittel viel zu gering wäre, als dass dieser gleichzeitig messbar wäre. Ein wichtiger Vorteil der Erfindung im Vergleich zu CT liegt darin, dass die RFB ein spektroskopisches Verfahren ist, wo jedes Element eigene charak teristische Linien hervorruft, und kein reines Absorptionsverfahren. Figur 4 zeigt beispielhaft schematisch ein Markersubstanz-Kit 200 zur Einführung von Markersub stanzen in eine Probe für eine Röntgenfluoreszenz-Bildgebung gemäß der Erfindung. Das Markersubstanz-Kit 200 umfasst einen Behälter 210, wie z. B. einen flexiblen Beutel, der mit einer Markersubstanz-Suspension 220 gefüllt ist. Die Markersubstanz-Suspension 220 umfasst eine physiologische Flüssigkeit, wie z. B. eine physiologische Salzlösung, in der Nanopartikel 11, 12 mit verschiedenen Röntgenfluoreszenz-Elementen angeordnet sind. Die Gestaltung der Nanopartikel 11, 12, das Volumen des Behälters 210 und die Konzentration der Nanopartikel 11, 12 in der Markersubstanz-Suspension 220 werden in Abhängigkeit von der konkreten RFB-Anwendung ge wählt. Zur Anwendung des Markersubstanz-Kits 200 wird der Behälter 210 über eine Leitung und eine Injektionsnadel mit einem Blutgefäß eines Probanden verbunden und die Markersubstanz- Suspension 220 mit den Nanopartikeln 11, 12 in das Blutgefäß geleitet.

Alternativ kann das Markersubstanz-Kit 200 gemäß Figur 4 für eine orale Einnahme vorgesehen sein. Gemäß einer weiteren Alternative kann ein Markersubstanz-Kit in trockener Form, z. B. in Gestalt einer Tablette, umfassend die Nanopartikel 11, 12 und ein physiologisches Bindemittel, vorgesehen sein.

Bei Testmessungen der Erfinder wurden biologische Zellen sowohl mit Gold- als auch Platin- Nanopartikeln in vorbestimmten Konzentrationen versehen und in einem Reagenzgefäß (Eppen dorf-Gefäß) mit einem Durchmesser von 6 mm angeordnet. Das Reagenzgefäß wurde dann in ein Stück tierisches Fleisch gesteckt, welches ähnliche Maße hatte wie eine Maus. Die Probe, umfas send das Fleisch mit dem eingeführten Reagenzgefäß wurde mit monochromatischer Röntgen strahlung vom DESY-Synchrotron (DESY Flamburg) bestrahlt. Bei weiteren Testmessungen wurden vier verschiedene fluoreszierende Elementen in einem Reagenzgefäß angeordnet und mit Rönt genstrahlung vom DESY-Synchrotron bestrahlt. Die Testmessungen, die auf die Unterscheidbar keit und quantitative Auswertbarkeit der gemessenen Röntgenfluoreszenz gerichtet waren, erga ben die in den Figuren 5 und 6 gezeigten Ergebnisse. Die entsprechenden Messungen mit räumli cher Auflösung können z. B. auch mit der in [1] beschriebenen Technik realisiert werden.

Gemäß Figur 5 sind die mit hoher Sensitivität gleichzeitig detektierten Gold- und Platin- Fluoreszenzlinien deutlich unterscheidbar. Die Auswertung der überlagerten Fluoreszenzlinien, umfassend eine numerische Entfaltung zur Ermittlung der einzelnen Intensitäten der Fluoreszenz linien ergab unter Berücksichtigung von vorbestimmten Referenz- oder Kalibrierungsdaten die Konzentrationen der Gold- und Platin-Nanopartikel. Figur 6 zeigt ein gemessenes Röntgenspektrum im Fall des Reagenzgefäßes, in dem sich die vier Elemente Iridium, Platin, Gold, Bismuth in vorgegebenen Konzentrationen in Lösung befanden. Man kann deutlich die vier Elemente in dem Spektrum erkennen. Aus allen vorhandenen Fluores zenz-Linien konnten die jeweiligen Konzentrationen bestimmt werden, die mit den verwendeten sehr gut übereinstimmten.

In den Figuren 5 und 6 ist auch jeweils ein Untergrund-Spektrum gezeigt, das gemessen wurde, wenn sich in den Reagenzgefäßen nur Wasser befand. Die Messung des Untergrund-Spektrums veranschaulicht, dass die Kenntnis des Untergrunds für die quantitative Auswertung der einzelnen Fluoreszenzlinien im Spektrum von Bedeutung ist, um auf die Anzahl der entsprechenden Fluores zenz-Photonen schließen zu können. Der Untergrund kann bei jeder Anwendung konkret gemes sen oder durch Referenz- oder Kalibrierungsdaten ermittelt werden. Insbesondere kann der Un tergrund für alle Markerelemente annähend gleich und möglichst für alle gleich minimal gewählt werden.

Der Untergrundverlauf kann auch bei der Wahl der Röntgenfluoreszenz-Elemente berücksichtigt werden. Wenn die Absorption der Fluoreszenz-Photonen eines Elements zu stark ist, so dass sie kaum vom Untergrund im Spektrum an der Stelle der Fluoreszenz-Energie unterschieden werden kann, wäre dieses Element unbrauchbar.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merk male der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination oder Unterkombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur multiparametrischen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an einer Probe (10), die mindestens einen Teil eines Körpers eines biologischen Organismus umfasst und eine erste Markersubstanz und mindestens eine weitere Markersubstanz enthält, wobei mindestens eine der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit Wirksubstanzmolekülen und/oder Liganden-Molekülen gekoppelt ist, die für eine spezifische Wechselwirkung mit der Pro be (10) vorgesehen sind, mit den Schritten:

- Bestrahlung der Probe (10) mit Röntgenstrahlung (1), wobei durch die Röntgenstrahlung (1) Röntgenfluoreszenz (2) der ersten Markersubstanz und der mindestens einen weiteren Markersubstanz angeregt wird und Fluoreszenzlinien (3) der Röntgenfluoreszenz (2) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz verschieden sind,

- räumlich aufgelöste Detektion der Röntgenfluoreszenz (2), umfassend eine spektral aufgelöste Detektion der Röntgenfluoreszenz (2) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersub stanz, und

- Ermittlung einer Verteilung der ersten Markersubstanz in der Probe (10) und zusätzlich mindes tens einer Verteilung der mindestens einen weiteren Markersubstanz aus der detektierten Rönt genfluoreszenz (2), wobei

- die erste und die mindestens eine weitere Markersubstanz gleiche oder derart ähnliche Fluores zenz-Wahrscheinlichkeiten, Abschwächungen der Röntgenfluoreszenz (2) in der Probe (10) und Untergrundrauschen-Niveaus aufgrund von Streuung in der Probe (10) aufweisen, dass die Detek tion der Röntgenfluoreszenz (2) bei gleicher Konzentration der Markersubstanzen vergleichbare statistische Signifikanz-Niveaus ergibt, und

- die Einstrahl-Photonenenergie der Röntgenstrahlung (1) oberhalb der Absorptions-Kanten aller Markersubstanzen liegt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem

- die statistischen Signifikanz-Niveaus der Markersubstanzen maximiert werden, indem die Ein- strahl-Photonenenergie der Röntgenstrahlung (1) mit einem Abstand oberhalb der höchsten Ab sorptions-Kante der Markersubstanzen in der Probe derart gewählt wird, dass die Untergrundrau schen-Niveaus der Markersubstanzen minimal und gleich oder annähernd gleich und gleichzeitig die Fluoreszenz-Wahrscheinlichkeiten und Transmissionen durch die Probe gleich oder annähernd gleich und maximal sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem

- die Röntgenfluoreszenz (2) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit einem gemeinsamen Anregungsstrahl der Röntgenstrahlung (1) angeregt und gleichzeitig detek- tiert wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem

- die Röntgenfluoreszenz (2) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit verschiedenen Anregungsstrahlen der Röntgenstrahlung (1), die verschiedene Energien aufwei sen, angeregt und gleichzeitig oder sequenziell detektiert wird.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die erste und die mindestens eine weitere Markersubstanz jeweils eines von Nanopartikeln (11, 12) und Markermolekülen (15, 16) umfassen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem

- die erste oder die mindestens eine weitere Markersubstanz jeweils Nanopartikel (11, 12) umfas sen, und

- die Nanopartikel (11, 12) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz für die Probe (10) ununterscheidbare Oberflächen aufweisen, wobei die Nanopartikel (11, 12) im Inneren verschiedene Elementen umfassen.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, bei dem

- die erste Markersubstanz einen ersten Typ von Nanopartikeln (11) umfasst, die überwiegend ein erstes Röntgenfluoreszenz-Element enthalten, und

- die mindestens eine weitere Markersubstanz mindestens einen weiteren Typ von Nanopartikeln (12) umfasst, die jeweils überwiegend mindestens ein weiteres Röntgenfluoreszenz-Element ent halten.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem

- jeder Typ von Nanopartikeln (11, 12) ausschließlich eines von dem ersten und dem mindestens einen weiteren Röntgenfluoreszenz-Element enthält.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, bei dem

- der erste Typ von Nanopartikeln (11) einen ersten Typ von Wirksubstanzmolekülen und/oder Liganden-Molekülen trägt, die für eine chemische und/oder physikalische Wechselwirkung mit der Probe (10) vorgesehen sind, und

- der mindestens eine weitere Typ von Nanopartikeln (12) jeweils andere Typen von Wirksub stanzmolekülen und/oder Liganden-Molekülen, die für eine chemische und/oder physikalische Wechselwirkung mit der Probe (10) vorgesehen sind, oder keine Wirksubstanzmoleküle und keine Liganden-Molekülen trägt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem

-jeder Typ von Nanopartikeln (11, 12) ausschließlich einen spezifischen Typ von Wirksubstanzmo lekülen und/oder Liganden-Molekülen trägt.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 10, bei dem

- mindestens einer von dem ersten und dem mindestens einen weiteren Typ von Nanopartikeln (11, 12) einen Kern-Schale-Aufbau mit einem Partikelkern (13) und einer Partikeldeckschicht (14) aufweist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem

- alle Nanopartikel (11, 12) den Kern-Schale-Aufbau aufweisen.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12, bei dem

- die Partikeldeckschicht (14) ein Metall, insbesondere Gold, oder ein nichtmetallisches Material, insbesondere ein Polymer oder ein Liposomen-Material oder ein Mizellen-Material, umfasst.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12, bei dem

- die Partikeldeckschichten (14) aller Nanopartikel (11, 12) aus dem gleichen Material hergestellt sind, an dem von Wirksubstanzmolekülen und/oder Liganden-Molekülen gebunden werden kön nen.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 14, bei dem

- die Nanopartikel (11, 12) jeweils Iridium, Platin, Gold, Bismut, Silber, lod, Palladium, Cadmium oder Indium enthalten.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 15, bei dem

- die Nanopartikel (11, 12) jeweils verschiedene Röntgen-Kontrastmittelmoleküle enthalten.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 16, bei dem

- jeder Typ von Nanopartikeln (11, 12) eine andere Nanopartikelgröße aufweist.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 17, bei dem

- die erste Markersubstanz einen ersten Typ von Markermolekülen (15) umfasst, die ein erstes Röntgenfluoreszenz-Element enthalten, und

- die mindestens eine weitere Markersubstanz mindestens einen weiteren Typ von Markermole külen (16) umfasst, die jeweils mindestens ein weiteres Röntgenfluoreszenz-Element enthalten.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 17, bei dem

- die erste Markersubstanz Nanopartikel (11) umfasst, die ein erstes Röntgenfluoreszenz-Element enthalten, und

- die mindestens eine weitere Markersubstanz Markermoleküle (15) umfasst, die jeweils mindes tens ein weiteres Röntgenfluoreszenz-Element enthalten.

20. Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, bei dem

- die Markermoleküle (15, 16) an Wirksubstanz- und/oder Ligandenmoleküle gebunden sind, wo bei die Markermoleküle (15, 16) jeweils eines von dem ersten und mindestens einen weiteren Röntgenfluoreszenz-Element umfassen.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, bei dem

- die Röntgenfluoreszenz-Elemente Silber, Indium, Palladium, Cadmium, lod oder Barium umfas sen.

22. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- eine Zeitfunktion der räumlichen Verteilungen der ersten Markersubstanz und der mindestens einen weiteren Markersubstanz in der Probe (10) ermittelt wird.

23. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Wirksubstanzen biologische Zellen umfassen und die mindestens eine der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit den biologischen Zellen gekoppelt ist, und - die Ermittlung der Verteilung der ersten Markersubstanz und der mindestens einen weiteren Markersubstanz eine Erfassung eines Transports der biologischen Zellen durch die Probe umfasst.

24. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die erste und die mindestens eine weitere Markersubstanz jeweils auf verschiedenen Wegen in die Probe (10) eingeführt worden sind.

25. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die erste und die mindestens eine weitere Markersubstanz so gebildet sind, dass sie ohne ge koppelte Wirksubstanzmoleküle und/oder Liganden-Moleküle für die Probe gleichwirkend sind.

26. Bildgebungsvorrichtung (100), die zur multiparametrischen Röntgenfluoreszenz- Bildgebung zur Untersuchung einer Probe (10) mit einem Verfahren gemäß einem der vorherge henden Ansprüche eingerichtet ist, wobei die Probe mindestens einen Teil eines Körpers eines biologischen Organismus umfasst und eine erste Markersubstanz und mindestens eine weitere Markersubstanz enthält, wobei mindestens eine der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz mit Wirksubstanzmolekülen und/oder Liganden-Molekülen gekoppelt ist, die für eine spezifische Wechselwirkung mit der Probe (10) vorgesehen sind, umfassend:

- eine Röntgenstrahlungsquelleneinrichtung (110), die zur Bestrahlung der Probe (10) mit Rönt genstrahlung (1) angeordnet ist, wobei Röntgenfluoreszenz (2) der ersten Markersubstanz und der mindestens einen weiteren Markersubstanz angeregt wird und Fluoreszenzlinien (3) der Röntgenfluoreszenz (2) der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz verschie den sind,

- eine Detektoreinrichtung (120), die zur räumlich und spektral aufgelösten Detektion der Rönt genfluoreszenz (2) der ersten Markersubstanz und der mindestens einen weiteren Markersub stanz eingerichtet ist, und

- eine Auswertungseinrichtung (130), die zur Ermittlung einer räumlichen Verteilung der ersten Markersubstanz und zusätzlich einer räumliche Verteilung der mindestens einen weiteren Markersubstanz in der Probe (10) aus der detektierten Röntgenfluoreszenz (2) eingerichtet ist.

27. Markersubstanz-Kit (200), das zur Einführung von Markersubstanzen in eine Probe (10) für eine multiparametrische Röntgenfluoreszenz-Bildgebung an der Probe (10) eingerichtet ist, umfassend

- eine erste Markersubstanz, die bei Bestrahlung mit Röntgenstrahlung (1) Röntgenfluoreszenz (2) emittiert, und - mindestens eine weitere Markersubstanz, die bei Bestrahlung mit Röntgenstrahlung (1) Rönt genfluoreszenz (2) emittiert, wobei

- Fluoreszenzlinien der ersten und der mindestens einen weiteren Markersubstanz verschieden sind, und - die erste und die mindestens eine weitere Markersubstanz gleiche oder derart ähnliche Fluores zenz-Wahrscheinlichkeiten, Abschwächungen der Röntgenfluoreszenz (2) in der Probe (10) und Untergrundrauschen-Niveaus aufgrund von Streuung in der Probe (10) aufweisen, dass die Detek tion der Röntgenfluoreszenz (2) bei gleicher Konzentration der Markersubstanzen vergleichbare statistische Signifikanz-Niveaus ergibt, die durch eine Auswahl der Einstrahlenergie maximierbar sind.