CN107064510A - 一种利用icp‑ms和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法 - Google Patents

一种利用icp‑ms和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107064510A
CN107064510A CN201710272711.8A CN201710272711A CN107064510A CN 107064510 A CN107064510 A CN 107064510A CN 201710272711 A CN201710272711 A CN 201710272711A CN 107064510 A CN107064510 A CN 107064510A
Authority
CN
China
Prior art keywords
icp
whole blood
particle
nano
circulating tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710272711.8A
Other languages
English (en)
Inventor
胡斌
杨彬
何蔓
陈贝贝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University WHU filed Critical Wuhan University WHU
Priority to CN201710272711.8A priority Critical patent/CN107064510A/zh
Publication of CN107064510A publication Critical patent/CN107064510A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G01N27/626—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode using heat to ionise a gas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
    • G01N2446/90—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids characterised by small molecule linker used to couple immunoreagents to magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用ICP‑MS和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞（CTC）的方法。本发明通过抗体包被的Cs掺杂多核磁性纳米粒子，捕获全血样本中的循环肿瘤细胞进行磁分离，然后加入量子点修饰的抗体进行荧光标记，以量子点作为ICP‑MS以及荧光成像的共同标签，可以用荧光显微镜对CTC进行成像，也可以将其经硝酸分散后直接引入ICP‑MS检测，通过ICP‑MS检测抗体上标记的量子点中的元素实现CTC的定量计数。本发明不仅具有高选择性、高灵敏度、耐基质干扰等优点，磁性纳米粒子中掺杂的Cs可以作为内标元素，采用内标法定量以消除因分析过程中磁性纳米粒子的损失对实验结果测定造成的误差，进一步提高了方法的可靠性。本发明适用于人全血样品分析，在临床上有良好的应用前景。

Description

一种利用ICP-MS和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法
技术领域
本发明属于生物分析方法领域，具体涉及一种利用ICP-MS和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞(CTC)的方法。
背景技术
据我国国家癌症中心发布的数据显示，在2015年我国新发癌症病例429.2万，癌症死亡281.4万。肝癌的发病率位于肺癌、胃癌和食管癌之后位列第四，而肝癌的死亡率仅次于肺癌和胃癌。同时肝癌也是目前世界最多发的癌症之一，尚未有有效的治愈手段，尤其是到了肝癌晚期阶段。大多数癌症引起的死亡是由于最初的癌细胞发生转移导致的。与其他许多疾病相似，早期诊断对于癌症的有效治疗至关重要。发展切实可行的肝癌早期诊断方案目前仍然是一项重大的挑战。
电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)是一种元素特异性的检测器，因其具有灵敏度高、线性范围宽、多元素多同位素同时检测、抗基体干扰能力强等诸多优点，被广泛应用于环境、食品以及生物样品中痕量元素及其形态分析。近年来，随着元素标记策略不断发展，ICP-MS技术的应用已拓展到生物定量分析和质谱细胞计数等领域。常用的元素标签通常有内源性元素、金属离子螯合物、含金属元素的聚合物以及含金属元素的纳米粒子等。但ICP-MS作为破坏性检测器也有一定的局限性，它能给出含量但却无法给出可视化的图像。而生物图像中往往包含着丰富的信息，对于避免出现假阴性或假阳性的结果有重要意义。同样，用于光学成像的生物探针往往因为复杂的生物基质自发荧光而无法给出实际生物样品中的定量结果。
此外，生物基质例如全血中循环肿瘤细胞含量极少且成分复杂，为了获得可接受的检测灵敏度，有必要在用ICP-MS检测前采用合适的样品前处理手段将目标细胞从基质复杂的悬浮液中分离和富集。由于磁性纳米粒子性质稳定，具有较大的比表面积，且在磁场作用下能快速分离，因此磁性纳米粒子很适合用于循环肿瘤细胞的分离。但是磁分离存在固有的缺陷，在清洗步骤中磁性颗粒会有部分损失，这会造成测量误差、信号波动以及灵敏度降低。
发明内容
为了克服现有循环肿瘤细胞检测方法的不足，本发明提供了一种基于磁免疫捕获量子点标记的方法检测循环肿瘤细胞。该方法利用免疫磁珠高效捕捉循环肿瘤细胞，利用量子点实现循环肿瘤细胞的定量检测以及成像，多核磁性纳米粒子中掺杂的Cs可以作为内标元素，提高了方法的抗干扰能力和可靠性。
本发明提供的技术方案具体如下：
一种利用ICP-MS和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
(1)在铯盐溶液中加入硅源，通过碱催化反应得到Cs掺杂纳米二氧化硅；
(2)向O/W反向微乳液中依次加入磁性纳米粒子和Cs掺杂纳米二氧化硅，然后加入浓氨水进行搅拌，再分次加入正硅酸乙酯进行搅拌，最后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷进行搅拌，洗涤后得到氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子，即MMNPs-NH2；
(3)将MMNPs-NH2与anti-EpCAM抗体加入HEPES缓冲液中，然后加入EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行偶联反应，再加入Tris-HCl缓冲液封闭多余的活性位点，得到MMNPs-anti-EpCAM探针磁球；
(4)利用金属量子点标记ASGPR抗原，得到QDs-anti-ASGPR标记探针；
(5)将MMNPs-anti-EpCAM探针磁球在1％牛血清蛋白溶液中封闭处理，然后加入除去红细胞的全血样品，室温孵育，然后磁分离弃去上清液，并用PBS缓冲液清洗磁球；然后加入过滤的脱脂奶粉进行封闭，再加入QDs-anti-ASGPR标记探针进行孵育，然后磁分离弃去上清液；
(6)将步骤(5)的产物用酸液分散，置于ICP-MS中检测，得到Cs与量子点中金属元素的质谱峰强度，比对工作曲线，得到全血样品中循环肿瘤细胞的准确含量；
(7)将步骤(5)的产物用PBS缓冲液重悬，然后将溶液转移到96孔板中，静置待细胞沉降至96孔板底部后，置于荧光显微镜下观察循环肿瘤细胞的数量及形貌。
步骤(1)的操作步骤具体为：将铯盐溶于去离子水中，再加乙醇，超声分散，再加入硅源继续搅拌，即得到Cs掺杂纳米二氧化硅。
所述的铯盐为CsCl，所述的硅源为3-氨丙基三乙氧基硅烷或正硅酸乙酯，离子水和乙醇的体积比为1:7。
步骤(2)中所述的O/W反向微乳液由多库酯钠、水和庚烷组成，其中，水和庚烷的体积比为＝18:1，每900毫升O/W反向微乳液中含有2.2克多库酯钠。
步骤(2)中所述的氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子，其粒径为100-150nm。
步骤(4)中所述的金属量子点为CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、InP、InAs中的一种。
步骤(5)中MMNPs-anti-EpCAM探针磁球在1％牛血清蛋白溶液中封闭处理的时间为1h。
步骤(6)中所述的酸液为浓度为1mol·L-1的硝酸溶液。
所述的MMNPs-anti-EpCAM探针磁球和QDs-anti-ASGPR标记探针均需提前用1％BSA封闭1小时；步骤(5)中用PBS缓冲液清洗磁球是为了排除干扰，保证测定的准确性；步骤(6)所述的工作曲线具体是对人工配制的已知CTC含量的标准样品进行测定，以标准样品中CTC的数量为横坐标，以量子点中金属元素与内标元素的质谱峰强度比值为纵坐标，建立标准样品中CTC的数量与量子点中金属元素与内标元素Cs的质谱峰强度比值之间的标准曲线。
本发明的原理具体如下：
本发明通过抗体包被的Cs掺杂多核磁性纳米粒子，捕获全血样本中的循环肿瘤细胞进行磁分离，然后加入量子点修饰的抗体进行荧光标记，以量子点作为ICP-MS以及荧光成像的共同标签，可以用荧光显微镜对CTC进行成像，也可以将其经硝酸分散后直接引入ICP-MS检测，通过ICP-MS检测抗体上标记的量子点中的元素实现CTC的定量计数。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
1、本发明通过单一量子点标记，提供了一种ICP-MS计数定量与荧光成像相结合检测CTC的手段，可同时获取图像信息和定量结果。
2、本发明基于ICP-MS具有优异的同位素质量数分辨率及绝对定量能力，基于含稳定同位素的纳米粒子标记和ICP-MS检测的生物分析方法具有强的多目标分析物同时分析及精准定量的能力。
3、免疫磁珠的引入使得本发明可以应用于复杂实际样品的分析，在生物医学研究和临床应用等领域对早期诊断、高通量检测和精准定量等方面发挥积极的作用。
4、本发明在免疫磁珠掺杂内标元素可以消除因分析过程中免疫磁珠的损失对实验结果测定造成的误差，进一步提高了方法的稳定性和可靠性。
附图说明
图1为本发明氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子的制备过程示意图。
图2为实施例1所制备的氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子的透射电镜图。
图3为目标细胞和非目标细胞的ICP-MS分析结果图。
图4为目标细胞和非目标细胞的荧光成像图；其中，图4(A)、图4(C)、图4(E)为目标细胞的荧光成像图，图4(B)、图4(D)、图4(F)为非目标细胞的荧光成像图。
图5为实施例5得到的CTC模型细胞数量与标记量子点和内标元素的质谱峰强度比值之间的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明，并不能限制本发明的范围。以下实施例中所使用的细胞样本先用商品化氯化铵型红细胞裂解液处理去除红细胞。
实施例l：氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子、MMNPs-anti-EpCAM探针磁球以及QDs-anti-ASGPR标记探针的制备
氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子的制备过程示意图如图1所示，具体步骤如下：
(1)采用共沉淀法制备磁性纳米粒子Fe3O4：首先称取1.35g FeCl3·6H2O、0.5gFeCl2·4H2O，加入25mL去离子水中；待固体完全溶解后，在氩气氛围中机械搅拌并于80℃加热回流；当溶液颜色变为深橘红色时，调大氩气流速，快速加入12.5mL浓氨水，此时，溶液颜色由橘红色变为黑色；继续加热搅拌20min，然后冷却至室温，得到磁性纳米粒子Fe3O4，采用磁分离方法分别用去离子水和乙醇洗涤磁球三次，产物保存于6mL去离子水中待用。
(2)采用碱催化法制备Cs掺杂纳米二氧化硅：将5.0mg CsCl溶于1mL去离子水中，再加7mL乙醇，超声分散5min，再加入35μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)搅拌24h，得到Cs掺杂纳米二氧化硅。
(3)反向微乳液法合成氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子：将2.2g多库酯钠和860μL水加入48mL庚烷中搅拌10min；然后加入300μL磁性纳米粒子Fe3O4分散液搅拌30min，再缓慢加入300μL Cs掺杂纳米二氧化硅水分散液，搅拌10min后加入224μL浓氨水，继续搅拌15min后加入430μL TEOS，继续搅拌24h后加入100μLTEOS，继续搅拌20min后加入100μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌24h，所得固体产物用丙酮、乙醇、去离子水洗涤数次，得到氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子，即MMNPs-NH2，保存于5mL去离子水中待用。
(4)将MMNPs-NH2与anti-EpCAM抗体加入HEPES缓冲液中，然后加入EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，再加入Tris-HCl缓冲液进行偶联反应，得到MMNPs-anti-EpCAM探针磁球。
(5)利用量子点(CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、InP或InAs)标记ASGPR抗原，得到QDs-anti-ASGPR标记探针。
实施例2：氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子的表征
采用透射电子显微镜(TEM)观察实施例1制备的MMNPs-NH2，其TEM照片如图2所示。从图2可以看出，MMNPs-NH2分散性较好，粒径较为均一，在100-150nm左右，可以明显观察到一个磁球内包含多个Fe3O4核。
实施例3：目标细胞和非目标细胞的ICP-MS分析
本实施例以硒化镉(CdSe)量子点作为标记量子点，选取表达ASGPR抗原(肝特异性跨膜糖蛋白)的HepG2细胞为目标对象，选取了不表达ASGPR的人舌鳞癌细胞Cal 27细胞和人宫颈癌细胞HeLa细胞作为阴性对照细胞。A组含HepG2细胞，B组含1×104个HeLa细胞，C组含1×104个Cal-27细胞，D组含1×104个HepG2细胞，E组含1×104个HepG2细胞和1×105个HeLa细胞，F组含1×104个HepG2细胞和1×105个Cal-27细胞。
取2μL制备好的MMNPs-anti-EpCAM探针磁球，用200μL牛血清蛋白溶液(1％BSA)封闭0.5h，以便减小探针的非特异性吸附；然后加入待测细胞置于90rpm摇床室温孵育1h，之后磁分离弃去上清液并用1×PBS缓冲液清洗磁球，加入5％过滤的脱脂奶粉置于90rpm摇床室温孵育0.5h以封闭磁球表面的非特异性吸附位点；封闭完成后，加入0.25μL的QDs-anti-ASGPR标记探针置于90rpm摇床室温孵育40min；磁分离后弃去上清液，用1×PBS缓冲液清洗磁球3次，洗去未反应以及非特异性吸附的标记探针。清洗结束后，加入100μL 1mol·L-1的HNO3溶液分散磁球，最后将磁球引入ICP-MS检测114Cd和133Cs信号。
以114Cd和133Cs的质谱峰强度比值为纵坐标作图，结果如图3所示，Cal 27细胞和人HeLa细胞得到的信号值与方法的空白值相近，HepG2细胞得到的信号值明显高于其他两种细胞，因此本发明能特异性识别检测HepG2细胞。此外，过量的Cal 27细胞和人HeLa细胞的存在并不会影响本发明对HepG2细胞的检测，说明本方法对HepG2细胞具有良好的选择性。
实施例4：目标细胞和非目标细胞荧光成像
本实施例以硒化镉(CdSe)量子点作为标记量子点，选取表达ASGPR抗原的HepG2细胞为目标对象，选取了不表达ASGPR的人乳腺癌细胞MCF-7细胞作为阴性对照细胞。A组为HepG2细胞，B组为1×104个MCF-7细胞。
取2μL制备好的MMNPs-anti-EpCAM探针，用200μL牛血清蛋白溶液(1％BSA)封闭0.5h，以便减小探针的非特异性吸附。加入细胞置于90rpm摇床室温孵育1h。之后磁分离弃去上清液并用1×PBS缓冲液清洗磁球，加入5％过滤的脱脂奶粉置于90rpm摇床室温孵育0.5h以封闭磁球表面的非特异性吸附位点。封闭完成后，加入0.25μL的QDs-anti-ASGPR标记探针置于90rpm摇床室温孵育40min。磁分离后弃去上清液，用1×PBS缓冲液清洗磁球3次，洗去未反应以及非特异性吸附的标记探针。加入50μL的1×PBS缓冲液重悬细胞，转移到96孔板中。静置10min待细胞沉降至96孔板底部后，置于倒置荧光显微镜下观察细胞成像，采用561nm的光源作为激发光源。
实施例5：加标人血样分析
本实施例以硒化镉(CdSe)量子点作为标记量子点，选取表达ASGPR抗原的HepG2细胞为CTC模型细胞，将其加入健康人血样中作为加标人血样用于分析。
(1)标准曲线的建立
取2μL制备好的MMNPs-anti-EpCAM探针，用200μL牛血清蛋白溶液(1％BSA)封闭0.5h，以便减小探针的非特异性吸附；加入待测细胞置于90rpm摇床室温孵育1h，之后磁分离弃去上清液并用1×PBS缓冲液清洗磁球，加入5％过滤的脱脂奶粉置于90rpm摇床室温孵育0.5h以封闭磁球表面的非特异性吸附位点；封闭完成后，加入0.25μL的QDs-anti-ASGPR标记探针置于90rpm摇床室温孵育40min，磁分离后弃去上清液，用1×PBS缓冲液清洗磁球3次，洗去未反应以及非特异性吸附的标记探针；清洗结束后，加入100μL 1mol·L-1的HNO3分散磁球，最后将其引入ICP-MS检测114Cd和133Cs信号。
选取200、500、1000、2000、5000、10000、20000、30000个HepG2细胞建立标准曲线。以HepG2细胞数量为横坐标，以114Cd和133Cs的质谱峰强度比值为纵坐标建立标准曲线，结果如图5所示。
(2)加标人血样中CTC的检测
向人全血中分别加入500、1000、2000、5000、10000个HepG2细胞，采用与(1)建立标准曲线相同的方法检测人血样中114Cd和133Cs信号。将114Cd和133Cs的质谱峰强度比值对照(1)中所建立的标准曲线，计算出人全血中CTC的含量，结果如表1所示。加标回收率在86％-104％之间，加标回收率良好，表明本发明具有良好的抗干扰能力，可以用于实际人血样中CTC的定量检测。
表1人全血样品加标回收结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用ICP-MS和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在铯盐溶液中加入硅源，通过碱催化反应得到Cs掺杂纳米二氧化硅；
(2)向O/W反向微乳液中依次加入磁性纳米粒子和Cs掺杂纳米二氧化硅，然后加入浓氨水进行搅拌，再分次加入正硅酸乙酯进行搅拌，最后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷进行搅拌，洗涤后得到氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子，即MMNPs-NH2；
(3)将MMNPs-NH2与anti-EpCAM抗体加入HEPES缓冲液中，然后加入EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行偶联反应，再加入Tris-HCl缓冲液封闭多余的活性位点，得到MMNPs-anti-EpCAM探针磁球；
(4)利用金属量子点标记ASGPR抗原，得到QDs-anti-ASGPR标记探针；
(5)将MMNPs-anti-EpCAM探针磁球在1％牛血清蛋白溶液中封闭处理，然后加入除去红细胞的全血样品，室温孵育，然后磁分离弃去上清液，并用PBS缓冲液清洗磁球；然后加入过滤的脱脂奶粉进行封闭，再加入QDs-anti-ASGPR标记探针进行孵育，然后磁分离弃去上清液；
(6)将步骤(5)的产物用酸液分散，置于ICP-MS中检测，得到Cs与量子点中金属元素的质谱峰强度，比对工作曲线，得到全血样品中循环肿瘤细胞的准确含量；
(7)将步骤(5)的产物用PBS缓冲液重悬，然后将溶液转移到96孔板中，静置待细胞沉降至96孔板底部后，置于荧光显微镜下观察循环肿瘤细胞的数量及形貌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)的操作步骤具体为：将铯盐溶于去离子水中，再加乙醇，超声分散，再加入硅源继续搅拌，即得到Cs掺杂纳米二氧化硅。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的铯盐为CsCl，所述的硅源为3-氨丙基三乙氧基硅烷或正硅酸乙酯，离子水和乙醇的体积比为1:7。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的O/W反向微乳液由多库酯钠、水和庚烷组成，其中，水和庚烷的体积比为＝18:1，每900毫升O/W反向微乳液中含有2.2克多库酯钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的氨基改性Cs掺杂多核磁性纳米粒子，其粒径为100-150nm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的金属量子点为CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、InP、InAs中的一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中MMNPs-anti-EpCAM探针磁球在1％牛血清蛋白溶液中封闭处理的时间为1h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的酸液为浓度为1mol·L-1的硝酸溶液。
CN201710272711.8A 2017-04-24 2017-04-24 一种利用icp‑ms和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法 Pending CN107064510A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710272711.8A CN107064510A (zh) 2017-04-24 2017-04-24 一种利用icp‑ms和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710272711.8A CN107064510A (zh) 2017-04-24 2017-04-24 一种利用icp‑ms和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107064510A true CN107064510A (zh) 2017-08-18

Family

ID=59605401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710272711.8A Pending CN107064510A (zh) 2017-04-24 2017-04-24 一种利用icp‑ms和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107064510A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108801990A (zh) * 2018-04-19 2018-11-13 华南师范大学 一种基于CsPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器的氧化乐果的检测方法
CN112034160A (zh) * 2019-06-03 2020-12-04 中国科学院福建物质结构研究所 一种基于稀土纳米材料荧光放大的循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用
WO2023231385A1 (zh) * 2022-06-01 2023-12-07 苏州佳谱科技有限公司 液体中痕量重金属元素的富集检测方法和装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNGAA KO ET AL: "Multicore Magnetic Nanoparticles (MMNPs) Doped with Cs and FITC for the Determination of Biomarker in Serum using ICP-MS", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
XIAOTING LI ET AL: "Simultaneous detection of MCF-7 and HepG2 cells in blood by ICP-MS with gold nanoparticles and quantum dots as elemental tags", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108801990A (zh) * 2018-04-19 2018-11-13 华南师范大学 一种基于CsPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器的氧化乐果的检测方法
CN112034160A (zh) * 2019-06-03 2020-12-04 中国科学院福建物质结构研究所 一种基于稀土纳米材料荧光放大的循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用
WO2023231385A1 (zh) * 2022-06-01 2023-12-07 苏州佳谱科技有限公司 液体中痕量重金属元素的富集检测方法和装置

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105308458B (zh) 用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统
Tallury et al. Nanobioimaging and sensing of infectious diseases
CN104651315B (zh) 一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法
Ganganboina et al. Hollow magnetic-fluorescent nanoparticles for dual-modality virus detection
CN108469445B (zh) 用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于x射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒及制备
TW200424521A (en) Membrane-based assay devices
CN107430121A (zh) 受试物质的检测方法及在该方法中使用的试剂盒
CN107064510A (zh) 一种利用icp‑ms和荧光成像检测全血中循环肿瘤细胞的方法
CN107233941B (zh) 一种多重近红外荧光增强生物芯片筛选循环肿瘤细胞方法
CN104977277B (zh) 一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡
CN101566626A (zh) 一种抗原检测方法及其应用
CN103842813B (zh) 用于对样品中的稀少目标细胞进行细胞计数检测的方法和组合物
CN104568923A (zh) 电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒
CN105195242A (zh) 一种c反应蛋白定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片
CN108801988A (zh) 基于上转换荧光适配体传感器的双酚a和雌二醇检测试剂盒及应用和检测方法
WO2018082405A1 (zh) 一种多靶分子浓度检测方法
CN110346557B (zh) 一种检测试剂盒
Cui et al. Rapid and efficient isolation and detection of circulating tumor cells based on ZnS: Mn2+ quantum dots and magnetic nanocomposites
Wu et al. Magnetic nanoparticles and magnetic particle spectroscopy-based bioassays: a 15 year recap
CN101441218A (zh) 一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的甲胎蛋白(afp)的检测方法
Cai et al. A miniature chip for protein detection based on magnetic relaxation switches
CN102608090B (zh) 一种基于量子点均相免疫检测病毒的方法
CN108333342A (zh) 一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法
KR101928333B1 (ko) 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
CN111724954A (zh) 一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170818

RJ01 Rejection of invention patent application after publication