CN107430121A - 受试物质的检测方法及在该方法中使用的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测试样中的受试物质的方法及在该方法中使用的试剂盒。
Description
【技术领域】
本发明涉及检测试样中的受试物质的方法及在该方法中使用的试剂盒。
【背景技术】
作为检测试样中的受试物质的方法，已知数字检测法。数字检测法是指通过一分子一分子检测受试物质而高灵敏度地检测受试物质的方法。
作为数字检测法的一例，已知专利文献1的方法。专利文献1的方法记载了称为数字ELISA，可一分子一分子检测受试物质。由此方法，首先在珠上形成含标记酶及一分子受试物质的免疫复合物。添加酶底物之后，珠被逐个封入微孔或液滴等的隔区化的区域(以下，也简称为“隔区”)。此隔区与别的隔区在空间上隔离，在隔区间不进行化合物的交换。从而，在含形成了免疫复合物的珠的隔区中，酶反应发生，荧光发生。一方面，在含未形成免疫复合物的珠的隔区中，酶反应不发生，荧光不发生。基于检测到荧光的阳性隔区而一分子一分子数字检测受试物质。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：美国专利申请公开第2011/0212848号说明书
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
在数字检测法中，为了检测而如上述一样含一分子受试物质的隔区变得必要。为了从含多个分子受试物质的混合液调制含一分子受试物质的多个隔区，要求用于微孔或液滴形成的装置等，特殊的装置，检测操作变得烦琐。本发明的目的是提供不进行如上所述的隔区化而可进行数字检测的方法。
【解决课题的技术方案】
本发明提供检测试样中的受试物质的方法。此方法包括以下的工序：在载体粒子上形成含能与受试物质结合的第一捕获物质、一分子受试物质、能与受试物质结合的第二捕获物质和催化剂的复合物的工序；使复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于载体粒子的工序；及，通过检测固定了反应产物的载体粒子，检测受试物质的工序。
在所述方法中，由形成工序，每一个载体粒子捕获一分子受试物质；在固定工序中，反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子；形成工序包括将试样和含多个载体粒子的试剂混合的工序。在检测工序中，各载体粒子未被隔区化。
另外，本发明提供区别检测试样中的第一受试物质和与第一受试物质不同的种类的第二受试物质的方法。此方法包括以下的工序：在载体粒子上形成含能与第一受试物质结合的第一捕获物质、一分子第一受试物质、能与第一受试物质结合的第二捕获物质和催化剂的第一复合物，在载体粒子上形成含能与第二受试物质结合的第三捕获物质、一分子第二受试物质、能与上述第二受试物质结合的第四捕获物质和催化剂的第二复合物的工序；使复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于载体粒子的工序；及，通过检测固定了反应产物的载体粒子，区别检测第一受试物质及第二受试物质的工序。
将在所述方法中，形成工序包括上述试样和含多个上述载体粒子的试剂混合的工序；由形成工序，每一个载体粒子捕获一分子第一受试物质及第二受试物质之任一者；在固定工序中，反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子；由催化反应，固定第一受试物质的载体粒子和固定了第二受试物质的载体粒子发生能互相区别的信号；在检测工序中，各载体粒子未被隔区化；在检测工序中，基于能互相区别的信号而区别检测第一受试物质及第二受试物质。
再者，本发明提供在上述的受试物质的检测方法中使用的试剂盒。此试剂盒含多个载体粒子、第一捕获物质、第二捕获物质、催化剂和底物。
【发明效果】
由本发明提供无需隔区化的数字检测法。由此，不要求用于隔区化的特殊的装置或烦琐的检测操作而可简便地检测受试物质。
【附图说明】
【图1】是对本实施方式的方法进行说明的模式图。(A)示固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记了HRP的第二捕获抗体的混合工序。(B)示载体粒子上的复合物形成。(C)示荧光酪胺被自由基化的催化反应。(D)示荧光酪胺向载体粒子的固定化。
【图2】是对使用检测用粒子(荧光粒子)时的本实施方式的方法进行说明的模式图。(A)示固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记HRP的第二捕获抗体的混合工序。(B)示载体粒子上的复合物形成。(C)示酪胺被自由基化的催化反应。(D)示向酪胺的载体粒子固定化和荧光粒子的添加。(E)示荧光粒子向固定了酪胺的载体粒子的固定化。
【图3】是对使用含支持体和多个底物分子的底物(多底物体)时的本实施方式的方法进行说明的模式图。(A)示固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记HRP的第二捕获抗体的混合工序。(B)示载体粒子上的复合物形成。(C)示多底物体中的酪胺被自由基化的催化反应。(D)示多底物体向载体粒子的固定化。(E)示向固定于载体粒子的多底物体再结合多底物体的状态。
【图4】是显示实施例2的结果的坐标图。
【图5】是在实施例3中摄像的显微镜图像。
【图6】是在实施例3中摄像的显微镜图像(HBs抗原浓度0.25IU/mL)的扩大图。
【图7】是显示实施例4的结果的坐标图。
【图8】是显示比较例1的结果的坐标图。
【图9A】是显示空白磁性粒子的荧光强度分布的坐标图。
【图9B】是显示使HRP聚合物(400聚体)结合的磁性粒子的荧光强度分布的坐标图。
【图9C】是显示在空白磁性粒子及结合了各种聚合度的HRP聚合物的磁性粒子中的阳性珠的平均荧光强度的坐标图。
【图9D】是显示阳性粒子的比例和HRP聚合物的聚合度的关系的坐标图。
【图10】是在实施例6中摄像的显微镜图像(HBs抗原浓度0、0.00025、0.0025及0.025IU/mL)。
【图11】是显示阳性粒子的比例和HBs抗原浓度的关系的坐标图。
【图12A】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图12B】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图12C】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图12D】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图12E】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图13】是显示阳性粒子的比例和载体粒子的浓度的关系的坐标图。
【图14】是显示固定荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图(HBs抗原浓度0、及0.025IU/mL)。
【图15】是显示阳性粒子的比例和HBs抗原浓度的关系的坐标图。
【图16A】是显示固定平均粒径160nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。
【图16B】是显示固定平均粒径200nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。
【图16C】是显示固定平均粒径300nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。
【图16D】是显示固定平均粒径400nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。
【图16E】是显示固定平均粒径500nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。
【图17A】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图17B】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图17C】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图17D】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图17E】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
【图18】是显示实施例12的结果的坐标图。
【图19A】是显示IL-6浓度和相对于平均粒径2.8μm的集团中所含的粒子数的阳性粒子的比例(％)的相关的坐标图。
【图19B】是显示HBs抗原浓度和相对于平均粒径4.5μm的集团中所含的粒子数的阳性粒子数的比例(％)的相关的坐标图。
【图20】是显示外泌体浓度和阳性粒子的比例(％)的相关的坐标图。
【实施方式】
应用于本实施方式的方法的试样不特别限定。例如，例示血液、淋巴液等的生物体试样、尿、便等的排泄物、河川水、海水、土壤等的环境样品等。
由于本实施方式的检测优选在溶液中进行，当试样不是液状时，通过进行适宜预处理，优选设为液状。其中，“液状”的试样不限于溶质完全地溶解于溶剂的溶液，也包括细胞等的微细的固体物悬浮的悬浮液、溶胶等。预处理的方法根据受试物质的种类适宜选择公知的方法。例如，试样是从生物体摘出的固体组织时，可进行在含表面活性剂的预处理液中对固体组织进行均化，用离心分离等将破碎物分离－除去的等的预处理。此时，可将离心分离后的上清应用于之后的工序。
也可对于液状的试样进行预处理。通过由公知的方法提取特定的成分、纯化，可除去混杂物，可以更高的精度进行受试物质的检测。例如，可对血液进行预处理而作为血清或血浆的状态，将其在后述的检测中使用。
受试物质的种类只要存在对于受试物质的后述的捕获物质，或者，可制造这样的捕获物质，就不特别限定。后述的捕获物质是抗体时只要是有抗原性的物质，就任何物质均能成为检测对象。例如，可举出抗体、蛋白质、核酸、生理活性物质、囊泡、细菌、病毒、多肽、半抗原、治疗药剂、治疗药剂的代谢物等，不特别限定。抗体也可成为抗原。其中，多肽不仅是氨基酸残基数多的蛋白质，也包括一般称为肽的氨基酸残基数少的多肽。在多糖类中，也包括在细胞或蛋白质的表面存在的糖链、及作为细菌的外膜成分的脂多糖。作为生理活性物质，例如，可举出细胞生长因子、分化诱导因子、细胞粘接因子、酶、细胞因子、激素、糖链、脂质等，不特别限定。囊泡只要是由膜构成的小胞，就不特别限定。囊泡也可在内部含液相。作为囊泡，例如，可举出外泌体、微囊泡、凋亡小体等的细胞外小胞或，脂质体等的人工的囊泡等。
[复合物的形成]
在本实施方式中，在试样中的受试物质的检测时，在载体粒子上形成了含一分子受试物质的复合物。此复合物含固定于载体粒子上的第一捕获物质、被第一捕获物质捕获的受试物质、捕获受试物质的第二捕获物质及催化剂。由此复合物形成，一分子受试物质固定于载体粒子上。以下，捕获受试物质的载体粒子也称为“阳性粒子”，不捕获受试物质的载体粒子也称为“阴性粒子”。
在本说明书中，“固定”是指物质被直接或间接捕获到载体粒子。包括物质以任何结合实施方式直接被载体粒子捕获，及经固定于载体粒子上的别的物质间接固定。例如，使亲和素或链霉亲和素(以下，也称为“亲和素类”)结合于载体粒子，使经生物素标记的抗体与载体粒子结合时，此生物素标记抗体变得间接固定于载体粒子。再者，与此生物素标记抗体结合的抗原也变得间接固定于载体粒子。亲和素类和生物素的结合之外，也考虑经本领域公知的接头固定物质。
第一捕获物质及第二捕获物质、以及后述的第三捕获物质及第四捕获物质(以下，将这些综合也称为“捕获物质”)只要是与受试物质特异性地结合的物质，就不特别限定。捕获物质和受试物质的结合根据受试物质的种类考虑各种各样的实施方式。例如，考虑利用抗原抗体反应的结合、利用核酸的互补链形成的结合、受体和配体的结合等。从而，捕获物质可根据抗体、抗原、寡核苷酸探针、受体、与受体结合的配体、适体等受试物质的种类适宜选择。捕获物质及受试物质是核酸时，优选捕获物质是单链的核酸。
第一捕获物质和第二捕获物质优选在受试物质的不同的位置结合。这是因为，如果在相同的位置结合，则第一捕获物质的结合和第二捕获物质的结合竞争结合，有无法结合第一捕获物质和第二捕获物质的两方的可能性。例如，捕获物质是抗体，受试物质是抗原时，优选结合了第一捕获物质的受试物质的表位与结合了第二捕获物质的受试物质的表位不同。捕获物质和受试物质是核酸时，优选结合了第一捕获物质的受试物质的碱基序列与结合了第二捕获物质的受试物质的碱基序列不同。第一捕获物质和第二捕获物质可为同种物质，也可为不同种物质。作为同种物质的例，可举出捕获物质均为抗体的情况。作为别种物质的例，可举出第一捕获物质是适体，第二捕获物质是抗体的情况。再者，其中述的第一捕获物质和第二捕获物质的关系也同样地适用于后述的第三捕获物质及第四捕获物质。
在本说明书中，“抗体”含单克隆抗体、多克隆抗体、Fab或F(ab')2等抗体的片段。作为捕获物质的“核酸”不仅是DNA或RNA，也包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、桥核酸(BNA)等的人工核酸。或者，也可在这些中含多种核酸。
催化剂的种类不限定，考虑后述的底物的种类而选择。优选催化剂是酶。作为酶，例示过氧化物酶、碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖苷酶、多酚氧化酶等。作为过氧化物酶，适宜地使用辣根过氧化物酶(HRP)。作为葡萄糖苷酶，适宜地使用β葡萄糖苷酶。
催化剂可为单体，也可为多个分子聚合成的聚合物。使用单体及聚合物的任何的催化剂根据作为后述的标记使用的物质，特别是，根据由该物质发生的信号的强度决定即可。催化剂只要是聚合物，就变得在1个复合物中含多个催化剂。由于可用1个复合物生成更多的反应产物，从载体粒子发生的信号被扩增。聚合物中所含的单体数(以下，也称为“聚合度”)不特别限定。例如，可使用聚合物的聚合度是2以上并且数百以下，优选为50以上并且400以下的催化剂。
催化剂可为预先与第二捕获物质结合，也可为在第二捕获物质和受试物质的混合时，与第二捕获物质结合。例如，将第二捕获物质用生物素修饰，使亲和素类结合于催化剂，则在第二捕获物质和受试物质的混合时催化剂与第二捕获物质结合。
在本实施方式中，优选使用粒径的小的载体粒子。其理由如下。在本实施方式的方法中，由后述的催化剂和底物的反应，反应产物固定于载体粒子。其中，载体粒子的粒径大时，相对于载体粒子的表面积，结合了反应产物的区域的面积的比例变小。如果这样，由观察粒子的方向或后述的来自标记的信号的大小等有将阳性粒子误认为阴性粒子的可能性。一方面，在载体粒子的粒径小时，由于粒子的表面积变小，反应产物的结合的区域的面积的比例变高。从而，可降低将阳性粒子误认为阴性粒子的可能性。
在本实施方式中，优选使用平均粒径100μm以下的载体粒子。更优选为，平均粒径是90μm以下，80μm以下，70μm以下，60μm以下，50μm以下或40μm以下。特别优选为，平均粒径是30μm以下，25μm以下，20μm以下，15μm以下，10μm以下，5μm以下，4μm以下或3μm以下。从后述的检测方法的检测界限或实验操作的容易性的观点来看，优选平均粒径100nm以上，更优选200nm以上。载体粒子的平均粒径是由利用激光衍射－散射法的粒度分布测定装置测定的体积基准的中位径。作为这样的粒度分布测定装置，可举出日机装株式会社制“微轨道MT3000II”等。在本说明书中，“粒径”是指直径。
载体粒子的材质不特别限定。可使用金属制粒子、树脂制粒子、氧化硅粒子等。作为金属制粒子的具体例，例示金、银、铜、铁、铝、镍、锰、钛、这些的氧化物等。另外，也可为这些的合金。作为树脂制粒子的具体例，例示聚苯乙烯粒子、乳胶粒子等。载体粒子也可为带磁性的粒子(以下，也称为“磁性粒子”)。
载体粒子的表面优选用封闭剂处理。由用封闭剂的处理，试样或试剂中所含的物质非特异性地吸附到载体粒子表面上被抑制。作为封闭剂，可使用白蛋白、酪蛋白、脱脂乳等公知的物质。
载体粒子的形状不特别限定。如果利用作为如上所述的有小的粒径的粒子的制造方法在本领域一般使用的方法，则成为接近球体的形状，没必要是正球体。也可为接近直方体、立方体、三棱锥的形状。
复合物可通过将含受试物质的试样、含多个载体粒子的试剂(以下，也称为“载体粒子试剂”)、第一捕获物质、第二捕获物质和催化剂混合而形成。混合的顺序不特别限定。
载体粒子试剂优选为液状试剂。可在水或缓冲液等的水性溶剂中，使载体粒子分散或悬浮。溶剂的成分只要是基本上不抑制复合物形成或催化反应的成分，就不特别限定。
酶反应时的载体粒子浓度(载体粒子个数/酶反应液的体积)优选为5×104个/mL以上并且不足5×109个/mL，更优选为5×104个/mL以上并且1×109个/mL以下，特别优选为1×105个/mL以上并且1×108个/mL以下。其中，载体粒子浓度与载体粒子间的平均距离相关。例如，作为底物使用后述的酪胺时，自由基化酪胺的扩散距离被推定为数十nm。从而，酶反应时的载体粒子间的平均距离也可设为自由基化酪胺的扩散距离的100倍以上、优选为1000倍以上、更优选为10000倍以上的距离。即，载体粒子间的平均距离是3μm以上、优选为30μm以上、更优选为300μm以上。理论上、载体粒子间的平均距离是3μm以上时，自由基化酪胺不到达至不与其自由基化酪胺的生成相关的载体粒子。
对于载体粒子的浓度和载体粒子间的距离的关系，基于以下的表1而进行说明。在数字检测法中，通常，使用5×104个以上并且1×107个以下的载体粒子。另外，在数字检测法中的反应液的量通常是1μL以上并且1000μL以下。从载体粒子的数及反应液的量算出载体粒子均一地分散时的载体粒子间的距离，例如，则成为如表1所示。如表1所示，载体粒子间的距离成为3μm以上的载体粒子浓度的最大值被推定为1×109个/mL。
【表1】
在本实施方式中，由于将相对于受试物质的分子数过量的载体粒子混合，理论上成为每一个载体粒子捕获一分子受试物质。受试物质向载体粒子的捕获被认为根据泊松分布而发生。基于其，添加到反应系中的载体粒子的个数优选为预计的受试物质的分子数的10倍以上，更优选100倍以上。一方面，载体粒子数过多，则检测需要时间。从此观点来看，载体粒子数可设为受试物质的分子数的108倍以下。
[催化剂和底物的反应]
在载体粒子上形成复合物之后，使底物反应于复合物中的催化剂。此反应优选在含固定了复合物的载体粒子和底物的溶液中执行。由此，可使此复合物中的催化剂和底物的反应在载体粒子分散于溶液中的状态下进行。通过使载体粒子分散，保持载体粒子间的距离。从而，反应产物固定于未固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子、即未固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子。即，在本实施方式的方法中，在将反应产物固定于载体粒子的工序中，各载体粒子未被隔区化。由此，不进行隔区化而数字检测一分子受试物质变得可能。在反应产物是自由基化酪胺时，通过使载体粒子分散，优选载体粒子间的距离保持至少3μm。如上所述，3μm的距离是自由基化酪胺的飞散距离的约100倍，是充分地分离的距离。从而，载体粒子间的距离只要是3μm以上，就自由基化酪胺变得基本上仅固定于固定有生成其的催化剂(HRP)的载体粒子。
载体粒子是在溶液中沉淀的粒子时，使催化剂和底物反应期间，优选使溶液中的载体粒子分散。使载体粒子分散的手段不特别限定，例如，可举出搅拌、振荡、颠倒混合等。
底物优选有标记的(以下，有标记的底物也称为“标记底物”)。此时，由催化反应生成有标记的反应产物。使用无标记的底物时，也可在催化反应之后，向反应产物附加标记。例如，首先使有亲和素类的底物和催化剂反应，使有亲和素类的反应产物生成。接下来，使有生物素的标记物质结合于此有亲和素类的反应产物。代替有亲和素类的底物而使用有生物素的底物，代替有生物素的标记而使用有亲和素类的标记也同样。这样，也可在反应产物的生成后，向反应产物固定标记。
底物的种类根据催化剂的种类。作为催化剂使用HRP时，作为底物可使用酪胺。酪胺是指有氨基的p-苯酚衍生物，在过氧化氢的存在下由HRP的催化剂作用自由基化。其中，自由基是指有不成对电子的化合物。由于自由基反应性高，与处于近傍的其他物质立即反应而成为稳定的状态。由HRP生成的自由基化酪胺与近傍的芳香族化合物非特异性地结合。此芳香族化合物是例如载体粒子固定的封闭剂、第一捕获物质、受试物质、第二捕获物质及催化剂中所含的酪氨酸残基或色氨酸残基。如上所述，由于自由基化酪胺的自由基寿命短，变得基本上仅固定于固定有生成该自由基化酪胺的HRP的载体粒子，不与其他载体粒子结合。由此，在捕获了受试物质的载体粒子上固定了多个酪胺。在催化反应之前向酪胺附加标记，或在催化反应后，通过使标记结合于固定于载体粒子的酪胺，可向此载体粒子固定多数的标记。一方面，在未捕获受试物质时，由于HRP也不被捕获，基本上不生成自由基化酪胺，标记的固定化也不发生。再者，作为催化剂使用HRP，作为底物使用酪胺时，作为催化反应的产物生成自由基化酪胺。此自由基化酪胺与近傍的芳香族化合物结合，失不成对电子成为酪胺。其中，“反应产物”不仅是在催化反应后生成的自由基化酪胺，也包括在催化反应及与芳香族化合物结合后失不成对电子的酪胺。
作为催化剂使用ALP时，作为底物可使用Fast red等的色原体。Fast red与ALP反应而磷酸基脱离，则变得可与萘酚结合，呈红褐色。另外，也发生荧光。此时，萘酚直接或间接固定于载体粒子。由此，磷酸基脱离的Fast red经萘酚固定于载体粒子。
作为催化剂使用β葡萄糖苷酶或多酚氧化酶时，作为底物可使用橄榄苦苷。橄榄苦苷由酶反应而裂环烯醚萜糖苷部分变成戊二醛样结构。反应产物在化合物内有多个醛基。醛基与伯胺有强的反应性。此反应如Konno et al.,Proceedings of National Academyof Science,96,9154-64(1999)所述。通过反应产物的醛基与固定于载体粒子的氨基酸残基的伯胺结合，反应产物固定于载体粒子。通过使有伯胺的标记结合于未在与载体粒子的结合中使用的醛，可向载体粒子固定标记。
标记只要是发生能检测的信号的物质，就不特别限定。能检测的信号优选为光学的信号。例如，可以从反应液发生的光的强度或波长的变化作为信号。具体而言，例示荧光、显色、发光等，在本领域中常使用的信号。作为发生信号的物质的例，例示荧光物质、发光物质、显色物质等。
作为标记使用荧光物质时，从荧光强度的观点来看，荧光物质优选含芳香族π共轭系聚合物结构。其中，芳香族π共轭系聚合物结构是指由以芳香环作为主链的π共轭系构成的聚合物结构。对于这样的聚合物结构在美国专利第8158444号说明书及美国专利第8575303号说明书中记载。在含芳香族π共轭系聚合物结构的荧光物质中，由激发光激发该聚合物结构部分，则由Forster(或者荧光)共振能量转移(FRET)而激发能从该聚合物结构向荧光物质移动。由此，该荧光物质被间接激发而发生荧光。此时发生的荧光的强度已知比单独直接激发该荧光物质时更扩大。即，芳香族π共轭系聚合物结构发挥用于集合激发光的分子天线的作用。
荧光物质不特别限定，从在分子生物学、免疫学等的技术领域使用的公知的荧光染料选择即可。作为荧光染料，例如，可举出荧光素、若丹明、德克萨斯红、四甲基若丹明、羧基若丹明、藻红蛋白、6-FAM(商标)、Cy(注册商标)3、Cy(注册商标)5、Alexa Fluor(注册商标)的系列等。
优选为，含芳香族π共轭系聚合物结构的荧光物质用下述的式(I)表示。
【化1】
(式中，
R1各自独立地是-(CH2)x(OCH2CH2)y、-(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3、-(CH2CH2O)y(CH2)x、ω-铵烷基盐、ω-铵烷氧基盐、ω-磺酸酯烷基盐或ω-磺酸酯烷氧基盐，
R2各自独立地是氢原子、卤素原子、羟基、烷氧基、氰基、-(CH2)x(OCH2CH2)y、-(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3、-(CH2CH2O)y(CH2)x、ω-铵烷基盐、ω-铵烷氧基盐、ω-磺酸酯烷基盐或ω-磺酸酯烷氧基盐，
R3是-(CH2)a-或-(CH2CH2O)b(CH2)c-，
L1是荧光物质，
m及n相同或不同，是1以上10000以下的整数、优选为1以上5000以下的整数、更优选为1以上1000以下的整数，
x各自独立地是0以上20以下的整数、优选为0以上10以下的整数，
y各自独立地是1以上50以下的整数、优选为1以上24以下的整数，
a各自独立地是1以上20以下的整数、优选为1以上10以下的整数，
b各自独立地是1以上50以下的整数、优选为1以上24以下的整数，
c各自独立地是0以上20以下的整数、优选为0以上10以下的整数。)
在本说明书中，“烷基”也可是指非取代或在至少1个位置取代，碳原子数1～24的直链状、分枝状或环状的饱和烃基，含多环式化合物。作为烷基的例，可举出非取代或取代的甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、s-丁基、t-丁基、n-戊基、异戊基、新戊基、n-己基、n-庚基、n-辛基、n-癸基、己基辛基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等，以及环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基、及正冰片基等的环烷基。“低级烷基”表示碳原子数1以上6以下，优选为1以上4以下的烷基。作为取代的烷基中的取代基，例如，可举出羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、-SH、卤素、卤烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺、及硫醚。
“烷氧基”示“-O-烷基”基，烷基如上述定义。“低级烷氧基”基是指碳原子数1以上6以下，优选为1以上4以下的烷氧基。
“卤素原子”表示氟、氯、溴或碘。优选为，卤素原子是氟。
有芳香族π共轭系聚合物结构的荧光物质在市售，例如，可得到Brilliant Violet(商标)(Sirigen公司)的系列。就是在其中，特别优选Brilliant Violet(商标)421。
反应产物向载体粒子的结合在催化剂和底物的反应后立即开始。添加到反应系中的过量的底物由催化剂而化为反应产物，蓄积到载体粒子。由此，即使仅固定一分子受试物质，大量的反应产物也固定于载体粒子，检测灵敏度提高。
在本实施方式中，也可作为标记的一种使用检测用粒子。通过将检测用粒子固定于载体粒子，如后所述，也可使载体粒子的光学性质变化。从而，在本实施方式的方法中，也可向形成了复合物的载体粒子进一步固定检测用粒子。优选为，在固定了反应产物的载体粒子上优选经该反应产物固定了检测用粒子。具体而言，也可通过使检测用粒子预先结合的底物和催化剂反应，向载体粒子固定检测用粒子。或者，催化剂和底物的反应后，也可使检测用粒子结合于固定于载体粒子的反应产物。例如，首先使有生物素的底物和催化剂反应，将有生物素的反应产物固定于载体粒子。接下来，使有亲和素类的检测用粒子结合于此有生物素的反应产物。代替有生物素的底物而使用有亲和素类的底物，代替有亲和素类的检测用粒子而使用有生物素的检测用粒子也同样。这样，可向载体粒子固定检测用粒子。在此实施方式中，通过经反应产物而检测固定了检测用粒子的载体粒子，可检测受试物质。
检测用粒子的材质不特别限定，与载体粒子同样地，可使用由金属及其化合物、树脂、氧化硅等制作的粒子。检测用粒子也可含荧光物质、发光物质等的发能检测的信号的物质的粒子。作为这样的检测用粒子，优选含荧光物质的粒子(以下，也称为“荧光粒子”)。荧光粒子自体是在本领域中公知的。例如，一般可得到Estapor(注册商标)FluorescentMicrospheres(Merck公司)的系列等。荧光粒子与荧光染料比，尺寸大，发生的信号(例如荧光的强度)也大。从而，作为检测用粒子使用荧光粒子，则受试物质的检测精度提高。
检测用粒子的平均粒径，优选载体粒子的平均粒径的5％以上，更优选10％以上。例如，载体粒子的平均粒径是1μm之时，检测用粒子的平均粒径优选50nm以上，更优选100nm以上。检测用粒子的粒径越大，有阳性粒子和阴性粒子的区别变得越明确的倾向。但是，检测用粒子的粒径过大，则有检测用粒子变得易从载体粒子脱离的可能性。从而，检测用粒子的平均粒径优选相比载体粒子的平均粒径更小的方。
在本实施方式中，作为底物，也可使用含支持体和多个底物分子的复合物(以下，也称为“多底物体”)。支持体只要是可在能使多个底物分子与催化剂反应的状态下保持的物质即可。底物分子的数不特别限定，可根据支持体的种类、保持的实施方式等适宜决定。
作为多底物体，可使用固定了多个底物分子的支持体。底物分子可为经本领域公知的接头而固定于支持体，也可为经亲和素类和生物素的结合等而固定于支持体。例如，也可使有生物素的多个底物分子和结合多个亲和素类的支持体反应，经生物素和亲和素类的结合而将多个底物分子固定于支持体。代替有生物素的多个底物分子而使用有亲和素类的多个底物分子，代替有亲和素类的支持体而使用多个有生物素的支持体也同样。
在本实施方式中，也可使用发生能检测的信号的支持体。当底物分子无上述的标记时，通过检测来自支持体的信号而可检测阳性粒子。当底物分子有标记时，通过检测来自支持体的来自信号及标记的信号的中至少一方而可检测阳性粒子。发生信号的支持体优选含荧光物质或发光物质。在它们之中，也特别优选含荧光物质的支持体。另外，也可支持体本身是荧光物质。作为发生荧光信号的支持体，例如，一般可得到上述的荧光粒子、荧光蛋白质、Qdot(注册商标)Nanocrystal(invitrogen公司)的系列等。再者，Qdot(注册商标)Nanocrystal是含半导体物质(与硒或碲混合的镉)作为核心的粒径10～20nm的荧光物质。
多底物体的底物分子的种类如上所述根据催化剂的种类。多底物体中所含的底物分子可为1种，也可为2种以上。使用不发生信号的支持体时，底物分子优选有上述的标记。催化剂是HRP时，作为底物分子优选酪胺。有多个酪胺的多底物体如后所述，可提供结合了多个作为反应产物的自由基化酪胺的支架。从而，得到了比使用一分子的底物时更强的信号。
如图1所示，作为底物使用一分子的酪胺时，由与催化剂的反应发生的自由基化酪胺可与载体粒子上的封闭剂、第一捕获物质、第二捕获物质、受试物质及催化剂结合。与此相比，使用有多个酪胺的多底物体时，如图3所示，在此多底物体自体上也可结合自由基化酪胺。例如，多底物体的多个酪胺分子的中至少一分子的酪胺由催化剂而自由基化，则与载体粒子上的复合物或该载体粒子反应而被固定。此时，在载体粒子上的复合物或未固定于该载体粒子的酪胺分子上可结合别的多底物体中的自由基化酪胺。这是因为酪胺本身也是芳香族化合物。即，通过使用多底物体，可增加自由基化酪胺反应的部位。从而，如果使用多底物体，可相比使用一分子的酪胺时，将更多的反应产物固定于载体粒子上。此时，酪胺有标记或者支持体有信号发生物质时，发生更强的信号。
[检测]
在本说明书中，“检测”含定性的检测、定量的检测及半定量的检测。“半定量的检测”是指如称为“阴性”、“弱阳性”、“阳性”、“强阳性”等，阶段性地表示试样中的受试物质的含量(或者浓度)。
如上所述，标记与载体粒子结合，则载体粒子的光学性质发生变化。光学性质是指例如，载体粒子所发的光的波长。在本实施方式中，由于作为标记，使用荧光物质、发光物质等，光学性质成为特定的波长的荧光、发光等。在检测工序中，通过检测载体粒子的光学信息，检测到受试物质。作为光学信息，可使用载体粒子所发的特定的波长的光的强度。例如，利用后述的流式细胞仪的检测的情况可以检测到的光的信号的峰值、积分值等作为光的强度使用。在本实施方式中，由于作为标记，使用荧光物质、发光物质等，光学信息成为荧光强度、发光强度等。
检测用粒子与载体粒子结合之时，载体粒子的光学性质也发生变化。例如，光学性质是在向载体粒子照射光之时发生的光的散射。由于通过检测用粒子固定于载体粒子而整体的尺寸及表面积变大，通过向载体粒子的光照射而发生的散射光发生变化。此时，光学信息是散射光强度。检测用粒子是含荧光物质、发光物质等的粒子时，光学性质也可为特定的波长的荧光、发光等。此时，光学信息是荧光强度、发光强度等。这样，通过检测固定了检测用粒子的载体粒子的光学信息，检测到受试物质。
载体粒子的检测方法只要是可逐个检测载体粒子的方法，就不特别限定。例如，可使用显微镜、流式细胞仪、像传感器等检测。
像传感器是指具备将入射光变换为电信号的半导体元件，不使用透镜等的光学系统的检测系统。作为像传感器，例示CMOS像传感器或CCD像传感器等。
流式细胞仪是指可对载体粒子等的微细的粒子进行计数的装置。流式细胞仪具备有细管的流动池和检测部。向流动池导入含载体粒子的悬浮液，将通过流动池中的每种载体粒子由检测部检测。检测部含例如向通过流动池的载体粒子照射光的光源和检测通过光照射到载体粒子而发生的荧光或散射光等的光学信息的光接收元件。在进一步的实施方式中，检测部对通过流动池的每种载体粒子的照片进行摄影。有摄像的功能的流式细胞仪称为成像流式细胞仪。由成像流式细胞仪对荧光像进行摄像时，检测部具备向载体粒子照射激发光的光源。
在使用显微镜或像传感器时，可对视野进行摄像，使用摄像的数据而检测每种载体粒子。摄像时的载体粒子可为静止，也可为流动。
使用流式细胞仪时可向流动池导入载体粒子，检测从通过流动池的每种载体粒子发生的荧光或散射光等的光学信息。另外，也可检测在每种载体粒子通过流动池时发生的电阻等的电信息。使用成像流式细胞仪时，可对通过流动池的每种载体粒子进行摄像，使用摄像的数据而检测每种载体粒子。
在检测中，也可对信号、即各载体粒子的光学信息进行测定，将该测定值与预先设定的指定的阈值比较。比较的结果，优选以测定值在指定的阈值以上的载体粒子作为阳性粒子检测。根据载体粒子的材质而还考虑到载体粒子本身有背景信号的情况等。例如，由于在检测荧光时有载体粒子本身有自身荧光的情况，进行上述的比较工序是适宜的。
上述的指定的阈值只要是可高精度区分阳性粒子和阴性粒子的值，就不特别限定。例如，可对多个阳性粒子的信号和多个阴性粒子的信号进行测定，设定为可最高精度区分阳性粒子和阴性粒子的值。为了抑制假阴性，也可以多个阳性粒子的信号的最小值作为指定的阈值。为了抑制假阳性，也可以多个阴性粒子的信号的最大值作为指定的阈值。
作为标记使用荧光物质时，可使用荧光显微镜。可由荧光显微镜对视野进行摄像，对摄像的数据进行解析而对从每种载体粒子发生的荧光强度进行测定，以荧光强度在指定的阈值以上的载体粒子作为阳性粒子检测。使用流式细胞仪时，首先使载体粒子流过广泛使用的流式细胞仪。作为标记使用荧光物质时，可从流式细胞仪的光源向每种载体粒子照射激发光，用光接收元件接收荧光信号，基于荧光信号的强度(例如，峰值)检测载体粒子。
可由上述的检测方法对阳性粒子的个数进行计数。理论上，由于在一个阳性粒子上固定了仅一分子受试物质，阳性粒子的个数与受试物质的分子数实质上相同。
再者，也可不是阳性粒子的个数的计数，而算出发生阳性粒子的信号的面积的总和。作为信号检测荧光时，“阳性粒子的面积”也可为阳性粒子的荧光发生的部分的面积。此时，阳性粒子的面积的总和可算出发某一定的强度以上的荧光的部分的面积的总和。“面积”可为粒子的表面积，也可为对粒子进行摄像而取得的二维图像上的面积。为了阳性粒子的面积的总和与受试物质的分子数相关，可基于所述总和而进行受试物质的定量。另外，在受试物质的定量中，也可使用阴性粒子的面积的总和和阳性粒子的面积的总和的比率，或全粒子的面积的总和和阳性粒子的面积的总和的比率等。“阴性粒子的面积”及“全粒子的面积”可为粒子的表面积，也可为对粒子进行摄像而取得的二维图像上的面积。检测发光时也同样。
在检测时，可为将添加到试样的载体粒子的全部供于检测，也可为将添加到试样的载体粒子的一部分供于检测。例如，由流式细胞仪检测时，考虑向流动池导入供于反应的载体粒子之中的一部分，供于检测。由显微镜或像传感器检测时，考虑基于一部分的视野的摄像数据而进行检测。
优选对供于检测的载体粒子(以下，也称为“全载体粒子”)的个数进行计数的。例如，使用流式细胞仪，则可基于荧光、电阻、散射光等的信息而简便地计数。另外，使用显微镜或像传感器时，可在对视野进行摄像上，由图像处理对全载体粒子进行计数。如后所述，对阴性粒子的个数进行计数时，也可将阴性粒子数和阳性粒子数相加而算出全载体粒子数。
再者，也可算出阴性粒子的个数。例如，可通过从用上述的方法计数的全载体粒子数减去阳性粒子数而算出。另外，使用流式细胞仪时，可以信号不足指定的阈值的载体粒子作为阴性粒子进行计数。另外，使用显微镜时，可在摄像上，由图像解析对阴性粒子数进行计数。
受试物质的浓度基于阳性粒子的个数而算出。例如，可以阳性粒子的个数作为试样中所含的受试物质的分子数，算出浓度等。另外，全载体粒子中所占的阳性粒子的比例、可举出使用阳性粒子和阴性粒子的比的值等算出的。适宜地，使用含已知浓度的受试物质的标准试样而实施本实施方式的检测方法，制成校正曲线，基于此校正曲线而定量受试物质。
将添加到试样的载体粒子的一部分供于检测时，可考虑在添加到试样中的载体粒子之中将何程度供于检测而算出受试物质的分子数。例如，可使用使全载体粒子所占的阳性粒子的比例乘以添加到试样中的载体粒子数而得到的值而算出受试物质的分子数。
在本实施方式的方法中，不进行载体粒子的隔区化。如上所述，隔区化是指作为对载体粒子进行空间隔离而在各隔区间不进行化合物的交换的状态。作为进行隔区化的以往的数字检测法的例，可举出在孔中一个一个收容载体粒子，将各孔用疏水性溶剂密封的方法(参照例如，美国专利申请公开第2013/345088号说明书)。另外，作为别的例，可举出在油相中制作多个液滴，向每个液滴一个一个封入载体粒子的方法(参照例如，美国专利第8236574号说明书)。由这些方法在各隔区中构建了含一个载体粒子和一分子受试物质的反应系统，含受试物质的隔区的溶剂变得发生信号。对发生信号的隔区的个数进行计数，基于计数结果而定量受试物质。在这些以往的方法中，由于成为从溶剂发生信号，如果不使载体粒子隔区化，数字检测是不可能的。在本实施方式的方法中，有标记的反应产物基本上仅固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，仅固定受试物质的载体粒子光学性质发生变化。从溶剂基本上检测不到信号。从而，不进行隔区化而可进行数字检测。由本实施方式的方法，不需要用于隔区化的特殊的装置或器具，可使检测操作简便化。再者，在本实施方式中，检测工序也可在含多个载体粒子的溶液中执行。此时，各载体粒子在溶液中未被隔区化。
其中，对于作为捕获物质使用抗体(以下，也称为“捕获抗体”)、作为催化剂使用HRP、作为标记底物使用标记荧光物质的酪胺(以下，也称为“荧光酪胺”)，作为受试物质检测抗原时的本实施方式的方法，使用图1的模式图进行说明。在图1中，载体粒子用黑色圆点表示；抗体用Y字型表示；抗原用空白的三角形表示；HRP用黑菱形表示；底物用白色圆点表示；荧光物质用星形表示；自由基用星号(＊)表示。
将固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记HRP的第二捕获抗体混合(图1(A))，则在载体粒子上形成了含抗原一分子和捕获抗体的复合物(图1(B))。接下来，将荧光酪胺混合。过量添加的荧光酪胺由HRP接连自由基化(图1(C))。自由基化荧光酪胺固定于含所述HRP的复合物、及固定有所述复合物的载体粒子。由此，向载体粒子固定了多个荧光物质(图1(D)的阳性粒子)。此时，由于自由基仅与近傍的物质反应，荧光酪胺不固定于未捕获复合物的载体粒子(图1(D)的阴性粒子)。其后，使载体粒子流过流式细胞仪，逐个测定载体粒子的荧光强度。对阳性粒子的个数进行计数，对受试物质进行定量。
使用有生物素的酪胺(以下，也称为“生物素化酪胺”)和有亲和素的荧光物质时，可根据例如以下的工序，实施本实施方式的方法。首先，将固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记HRP的第二捕获抗体混合，则在载体粒子上形成了含抗原一分子和捕获抗体的复合物。接下来，将生物素化酪胺混合。过量添加的生物素化酪胺由HRP接连自由基化。自由基化的生物素化酪胺固定于含所述HRP的复合物、及固定有所述复合物的载体粒子。通过使固定了生物素化酪胺的载体粒子和有亲和素的荧光物质接触，向载体粒子固定了多个荧光物质。由于自由基仅与近傍的物质反应，生物素化酪胺不固定于未捕获复合物的载体。从而，有亲和素的荧光物质也未被固定。其后，使载体粒子流过流式细胞仪，逐个测定载体粒子的荧光强度。对阳性粒子的个数进行计数，对受试物质进行定量。
作为进一步的实施方式，对于作为捕获物质使用抗体、作为催化剂使用HRP、作为底物使用生物素化酪胺、作为检测用粒子使用有亲和素的荧光粒子，作为受试物质检测抗原的的情况，使用图2的模式图进行说明。在图2中，载体粒子用黑色圆点表示；抗体用Y字型表示；抗原用空白的三角形表示；HRP用黑菱形表示；底物用白色圆点表示；荧光粒子用灰色圆点表示；自由基用星号(＊)表示。
将固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记HRP的第二捕获抗体混合(图2(A))，则在载体粒子上形成了含抗原一分子和捕获抗体的复合物(图2(B))。接下来，将生物素化酪胺混合。过量添加的生物素化酪胺由HRP接连自由基化(图2(C))。自由基化的生物素化酪胺固定于所述含HRP的复合物、及固定有所述复合物的载体粒子。由此，向载体粒子固定了多个生物素化酪胺(图2(D)之右的载体粒子)。此时，由于自由基仅与近傍的物质反应，生物素化酪胺不固定于未捕获复合物的载体粒子(图2(D)之左的载体粒子)。其中，添加有亲和素的荧光粒子(图2(D))，则经生物素和亲和素的结合，向固定了生物素化酪胺的载体粒子还固定了荧光粒子(图2(E)的阳性粒子)。其后，使载体粒子流过流式细胞仪，逐个测定载体粒子的荧光强度。对阳性粒子的个数进行计数，对受试物质进行定量。
在上述的实施方式中，也可使生物素化酪胺和有亲和素的荧光粒子预先结合，取得结合了荧光粒子的酪胺，使其与固定了复合物的载体粒子接触。或者，也可向固定复合物的载体粒子实质上同时添加生物素化酪胺和有亲和素的荧光粒子。
作为进一步的实施方式，对于作为捕获物质使用抗体、作为催化剂使用HRP、作为底物使用使多个酪胺分子结合于有荧光物质的支持体的多底物体，作为受试物质检测抗原的情况，使用图3的模式图进行说明。在图3中，载体粒子用黑色圆点表示；抗体用Y字型表示；抗原用空白的三角形表示；HRP用黑菱形表示；底物分子用白色圆点表示；支持体用空白的四角形表示；自由基用星号(＊)表示。
将固定第一捕获抗体的多个载体粒子、抗含原的试样和标记HRP的第二捕获抗体混合(图3(A))，则在载体粒子上形成了含抗原一分子和捕获抗体的复合物(图3(B))。接下来，将含多个酪胺的多底物体混合。过量添加的多底物体中的酪胺由HRP接连自由基化(图3(C))。再者，在图中，多底物体中的一分子的酪胺被自由基化，但也可二分子以上的酪胺被自由基化。多底物体经自由基化的酪胺而固定于所述含HRP的复合物、及固定有所述复合物的载体粒子。由此，向载体粒子固定了多个多底物体(图3(D)之右的载体粒子)。此时，由于自由基仅与近傍的物质反应，多底物体不固定于未捕获复合物的载体粒子(图3(D)之左的载体粒子)。其中，在固定于上述的复合物或载体粒子的多底物体上存在不贡献于固定的酪胺分子。由于酪胺自体也是芳香族化合物，在不贡献于固定的酪胺分子上可结合别的多底物体中所含的自由基化酪胺。如上所述，多底物体的酪胺由HRP接连自由基化。所以，含自由基化酪胺的别的多底物体进一步固定于固定于载体粒子的多底物体的酪胺分子。这样，多底物体可以首先固定的别的多底物体的酪胺分子作为支架接连结合(图3(E)的阳性粒子)。此时，由于自由基化酪胺仅与近傍的物质反应，多底物体不固定于未捕获复合物的载体粒子(图3(E)的阴性粒子)。其后，使载体粒子流过流式细胞仪，逐个测定载体粒子的荧光强度。对阳性粒子的个数进行计数，对受试物质进行定量。
也可在各工序之间进行未反应的游离成分的除去。一般而言，此操作由于对固定于固相的分子(B)和未固定到固相的游离状态的分子(F)进行分离，称为B/F分离。例如，在载体粒子上形成复合物之后，在与标记底物混合之前以除去未反应的第二捕获物质的目的，可进行B/F分离。再者，在标记底物和催化剂的反应后，在载体粒子的检测前，可以除去未反应的标记底物的目的进行B/F分离。B/F分离可由本技术领域常使用的方法进行。例如，对载体粒子进行离心分离，可通过除去含未反应的游离成分的上清而进行B/F分离。当载体粒子带磁性时，通过由磁铁集合载体粒子(以下，也称为“集磁”)，除去液体成分可进行B/F分离。
由本实施方式的方法，则还能检测2种以上的受试物质。这一般称为多重检测。在检测工序中，为了互相区别检测至少2种受试物质，作为第一捕获物质及/或第二捕获物质，使用与至少2种受试物质的各自能特异性地结合的捕获物质。作为一例，对于检测第一受试物质和与此第一受试物质不同的种类的第二受试物质的2种受试物质的情况进行说明。此时，可使用固定捕获第一受试物质的第一捕获物质的载体粒子(以下，称为“载体粒子A”)，和固定了捕获第二受试物质的第三捕获物质的载体粒子(以下，称为“载体粒子B”)。使捕获第一受试物质的第二捕获物质结合于被载体粒子A捕获的第一受试物质，在载体粒子A上形成第一复合物。使捕获第二受试物质的第四捕获物质结合于被载体粒子B捕获的第二受试物质，在载体粒子B上形成第二复合物。为了互相区别检测2种受试物质，在检测工序中，优选捕获一分子第一受试物质的载体粒子(以下，称为“阳性粒子A”)，和捕获一分子第二受试物质的载体粒子(以下，称为“阳性粒子B”)发生能互相区别的信号。互相区别检测阳性粒子A和阳性粒子B时，也可以阳性粒子A和阳性粒子B发生能互相区别的信号的方式使用不同的种类的催化剂及/或底物。另外，也可使用不同的种类的标记。由此，上述的能互相区别的信号可从催化剂和底物的反应产物发生。具体而言，在复合物的形成工序中，可使用有第一催化剂的第二捕获物质和有与第一催化剂不同的第二催化剂的第四捕获物质。进而，在固定工序中，作为底物，使用对应于第一催化剂的第一底物和对应于第二催化剂的第二底物。其中，作为不同的种类的标记，也可使用可发生能互相区别的波长的荧光的荧光染料。例如，也可为第一底物有第一荧光染料，第二底物有以能与第一荧光染料区别的程度发生不同的波长的荧光的第二荧光染料。由此，向捕获一分子第一受试物质的载体粒子A固定了第一荧光染料，向捕获一分子第二受试物质的载体粒子B固定了第二荧光染料。进而，在检测工序中，作为能互相区别的信号，可检测来自固定于载体粒子的第一荧光染料及第二荧光染料的荧光。可由荧光波长的差异互相区别检测捕获一分子第一受试物质的载体粒子A和捕获一分子第二受试物质的载体粒子B。本实施方式的方法也可还包括基于上述的能互相区别的信号而判断是否检测任何的受试物质的工序。
作为不同的种类的标记，使用在照射相同的激发光之时，也可为可发生以能互相区别的程度不同的强度的荧光的荧光染料。此时，由于各荧光染料可由荧光强度的差异区别彼此，各荧光染料也可发生相同或同程度的波长的荧光。在上述的例中，也可为第一底物有第一荧光染料，第二底物有发生以能与第一荧光染料区别的程度不同的强度的荧光的第二荧光染料。作为能互相区别的信号，可检测来自固定于载体粒子的第一荧光染料及第二荧光染料的荧光。可由荧光强度的差异互相区别检测捕获一分子第一受试物质的载体粒子A和捕获一分子第二受试物质的载体粒子B。
在本实施方式中，也可使用互相不同的平均粒径的载体粒子而检测至少2种受试物质。平均粒径优选以可由光学信息区别各平均粒径的载体粒子的组的程度不同。具体而言，可使用平均粒径互相100nm以上、优选为200nm以上、更优选为500nm以上不同的多种载体粒子。载体粒子的种类的数优选与受试物质的种类的数相同。例如，检测第一受试物质及第二受试物质时，可使用有500nm的平均粒径的第一载体粒子和有1μm的平均粒径的第二载体粒子。其中，优选在第一载体粒子上固定了捕获第一受试物质的第一捕获物质，在第二载体粒子上固定了捕获第二受试物质的第三捕获物质的。第一载体粒子和第二载体粒子由基于载体粒子的平均粒径的信号能互相区别。例如，向第一载体粒子和第二载体粒子的各自照射光之时，由平均粒径的差异，从第一载体粒子及第二载体粒子发生互相不同的强度的散射光。从而，可基于散射光强度而互相区别检测第一载体粒子和第二载体粒子。进而，在区别的第一载体粒子的组及第二载体粒子的组的各自中，通过检测固定了反应产物的载体粒子而可区别阴性粒子和阳性粒子。
另外，也可使用互相不同的材质的载体粒子而检测至少2种受试物质。例如，检测第一受试物质及第一受试物质的2种时，可使用有磁性的第一载体粒子和无磁性的第二载体粒子。此时，优选在第一载体粒子上固定了捕获第一受试物质的第一捕获物质，在第二载体粒子上固定了捕获第二受试物质的第三捕获物质。在检测前，通过使用磁铁而分离第一载体粒子和第二载体粒子，可互相区别检测第一载体粒子和第二载体粒子。进而，在分离的第一载体粒子的组及第二载体粒子的组的各自中，通过检测固定了反应产物的载体粒子而可区别阴性粒子和阳性粒子。
即使受试物质是3种以上，也可由与上述同样的原理互相区别检测各自的受试物质。
载体粒子、第一捕获物质、第二捕获物质、催化剂及标记底物，为了实施本实施方式的方法，可作为试剂盒提供。载体粒子、第一捕获物质、第二捕获物质、催化剂及标记底物优选各自收容到不同的容器中。催化剂和标记底物不得不收容到不同的容器中，但除此之外，也可收容到1个容器中。如上所述，也可使催化剂和第二捕获物质预先结合。也可使载体粒子和第一捕获物质预先结合。底物也可含支持体和多个酪胺分子的标记底物。标记可为酪胺分子具有，也可为支持体具有。
提供的试剂优选均为液状试剂。作为溶剂，可使用水或在当技术领域中广泛使用的缓冲液。例如，可使用如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、三乙基胺缓冲液、MES缓冲液一样的缓冲剂。
在本实施方式中，也可将收容上述的各种试剂的容器捆包到箱里而提供于使用者。在此箱中，也可为同装试剂盒的附带文书。在此附带文书中，例如，优选记载了试剂盒的构成、受试物质的检测流程等的。本实施方式的试剂盒的一例示于图12A。在图12A中，10示试剂盒，11示收容载体粒子的第1容器，12示收容第一捕获物质的第2容器，13示收容第二捕获物质的第3容器，14示收容催化剂的第4容器，15示收容标记底物的第5容器，16示附带文书，17示捆包箱。
进一步的实施方式的试剂盒的一例示于图12B。在图12B中，20示试剂盒，21示收容载体粒子、第一捕获物质及第二捕获物质的第1容器，22示收容催化剂的第2容器，23示收容标记底物的第3容器，24示附带文书，25示捆包箱。
进一步的实施方式的试剂盒的一例示于图12C。在图12C中，30示试剂盒，31示收容载体粒子的第1容器，32示收容第一捕获物质的第2容器，33示收容使催化剂预先结合的第二捕获物质的第3容器，34示收容标记底物的第4容器，35示附带文书，36示捆包箱。
进一步的实施方式的试剂盒的一例示于图12D。在图12D中，40示试剂盒，41示收容使第一捕获物质预先结合的载体粒子的第1容器，42示收容第二捕获物质的第2容器，43示收容催化剂的第3容器，44示收容标记底物的第4容器，45示附带文书，46示捆包箱。
进一步的实施方式的试剂盒的一例示于图12E。在图12E中，50示试剂盒，51示收容使第一捕获物质预先结合的载体粒子的第1容器，52示收容使催化剂预先结合的第二捕获物质的第2容器，53示收容标记底物的第3容器，54示附带文书，55示捆包箱。
本实施方式的试剂盒除了载体粒子、第一捕获物质、第二捕获物质、催化剂及底物之外，也可含检测用粒子。此实施方式的试剂盒的一例示于图17A。在图17A中，60示试剂盒，61示收容载体粒子的第1容器，62示收容第一捕获物质的第2容器，63示收容第二捕获物质的第3容器，64示收容催化剂的第4容器，65示收容底物的第5容器，66示收容检测用粒子的第6容器，67示附带文书，68示捆包箱。
进一步的实施方式的试剂盒的一例示于图17B。在图17B中，70示试剂盒，71示收容载体粒子、第一捕获物质及第二捕获物质的第1容器，72示收容催化剂的第2容器，73示收容底物的第3容器，74示收容检测用粒子的第4容器，75示附带文书，76示捆包箱。
进一步的实施方式的试剂盒的一例示于图17C。在图17C中，80示试剂盒，81示收容载体粒子的第1容器，82示收容第一捕获物质的第2容器，83示收容使催化剂预先结合的第二捕获物质的第3容器，84示收容底物的第4容器，85示收容检测用粒子的第5容器，86示附带文书，87示捆包箱。
进一步的实施方式的试剂盒的一例示于图17D。在图17D中，90示试剂盒，91示收容使第一捕获物质预先结合的载体粒子的第1容器，92示收容第二捕获物质的第2容器，93示收容催化剂的第3容器，94示收容底物的第4容器，95示收容检测用粒子的第5容器，96示附带文书，97示捆包箱。
进一步的实施方式的试剂盒的一例示于图17E。在图17E中，100示试剂盒，101示收容使第一捕获物质预先结合的载体粒子的第1容器，102示收容使催化剂预先结合的第二捕获物质的第2容器，103示收容底物的第3容器，104示收容检测用粒子的第4容器，105示附带文书，106示捆包箱。
本实施方式的试剂盒也可作为用于实施上述的多重检测的试剂盒提供。例如，用于检测第一受试物质及第二受试物质的试剂盒也可含载体粒子、第一捕获物质、第二捕获物质、第三捕获物质、第四捕获物质、催化剂及标记底物。如上所述，催化剂及标记底物也可为可发生能互相区别的信号的组合。例如，试剂盒也可含第一催化剂和对应于其的第一标记底物、及第二催化剂和对应于其的第二标记底物。第一标记底物及第二标记底物也可作为标记，有可发生能互相区别的波长或强度的荧光的荧光染料。各试剂也可各自收容到不同的容器中。也可使第一催化剂和第二捕获物质预先结合，使第二催化剂和第四捕获物质预先结合。试剂盒也可含第一载体粒子和与第一载体粒子有以能区别的程度不同的平均粒径的第二载体粒子。另外，试剂盒也可含有磁性的第一载体粒子和无磁性的第二载体粒子。也可使第一载体粒子和第一捕获物质预先结合，使第二载体粒子和第三捕获物质预先结合。在使用时使捕获物质与载体粒子结合时，第一载体粒子和第二载体粒子优选收容到不同的容器中的。
本发明包括上述的试剂盒用于检测受试物质的用途。对于受试物质的检测是如上所述。另外，本发明包括上述的各种试剂用于制造试剂盒的用途。对于各种试剂及试剂盒是如上所述。
【实施例】
以下，由实施例对于本实施方式进行说明。在实施例中言及的粒径是全部上述的平均粒径。
(实施例1)利用流式细胞仪的载体粒子的检测
(1)磁性粒子的调制
作为磁性粒子，准备平均粒径200nm的磁性粒子(FG beads COOH珠、多摩川精机制)、500nm的磁性粒子(SiMAG-COOH、Chemicell GmbH制)、2μm的磁性粒子(micromerM-COOH、micromod Partikeltechnologie GmbH制)及4μm的磁性粒子(micromerM-COOH、micromod Partikeltechnologie GmbH制)。调制200μL将200mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS、岸田化学制)溶液和水溶性碳二亚胺(WSC、同仁化学制)溶液以1:1混合的溶液(NHS/WSC混合溶液)。向NHS/WSC混合溶液添加106～108个各磁性粒子，于室温反应2小时。集磁后，除去上清。向磁性粒子添加500μL磷酸缓冲液(以下，也称为PBS)(pH 6.0)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、磷酸缓冲液的添加及搅拌的操作再进行4次。集磁后，添加800μL的0.1mM生物素结合BSA(Sysmex制)的溶液，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽(ShakingIncubator SI-300C、ASONE制)内反应1小时。将粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，集磁后，除去上清，添加500μL的PBS(pH 7.5)，用涡旋混合器搅拌。这样，取得含固定生物素的磁性粒子的粒子悬浮液。
(2)HRP向磁性粒子的固定
将结合链霉亲和素的HRP(Streptavidin Poly-HRP80Conjugate、StereospecificDetection Technologies制)用PBS(pH 7.4)稀释，各自调制0pg/mL、10pg/mL及100pg/mL的浓度的HRP溶液。向在上述(1)中调制的各粒子悬浮液80μL各自添加HRP溶液20μL。在设定为1600rpm、25℃的恒温槽内反应1小时。将粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，集磁后，除去上清，添加80μL的PBS(pH 7.4)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、PBS添加及搅拌再进行1次。
(3)酶反应
将TSA试剂盒#22with HRP,链霉亲和素和Alexa Fluor 488酪胺(制品编号T20932、Life Technologies制)的30％H2O2用扩增缓冲剂稀释，调制0.005％底物缓冲液。将酪胺-Alexa Fluor 488用底物缓冲液稀释20倍。向在上述(2)中调制的粒子悬浮液添加各20μL的稀释的酪胺-Alexa Fluor 488，使磁性粒子分散。在设定为1000rpm、25℃的振荡恒温槽内进行30分钟酶反应。集磁后，除去上清。向其中添加80μL的PBS(pH 7.4)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、PBS添加及搅拌再进行1次。集磁后，除去上清。向其中添加500μL的PBS(pH 7.4)，用涡旋混合器搅拌。
(4)利用流式细胞仪的检测
使在(3)中取得的粒子悬浮液流过FACS VERSE(Becton Dickinson制)，，对各载体粒子的荧光强度进行测定。其中，以仅测定阴性粒子时的最大荧光强度作为阈值，以有此阈值以上的荧光强度的磁性粒子作为阳性粒子进行计数。另外，以有不足此阈值的荧光强度的磁性粒子(阴性粒子)和阳性粒子的总数作为全粒子进行计数。此全粒子数表示供于检测的磁性粒子的总数。
(5)结果
HRP浓度和阳性粒子数的相关关系示于表2。表2中所示的阳性粒子数的值是向相对于供于检测的全粒子的阳性粒子的比例乘以在上述(1)中添加的磁性粒子数(106～108个)的值。再者，阳性粒子的比例(％)根据[(用流式细胞仪计数的阳性粒子数)/(用流式细胞仪计数的全粒子数)]×100算出。
【表2】
如表2所示，得知即使使用200nm、500nm、2μm及4μm的任何的粒径的载体粒子，一分子检测也是可能的。另外，载体粒子的粒径越变小，可检测越多的阳性粒子。
(实施例2)利用显微镜的载体粒子的检测
(1)固定抗体的磁性粒子的调制
作为磁性粒子，准备平均粒径1μm的磁性粒子(Dynabeads Myone-COOH、LifeTechnologies制)、2μm的磁性粒子(micromerM-COOH、micromod PartikeltechnologieGmbH制)及4μm的磁性粒子(micromerM-COOH、micromod Partikeltechnologie GmbH制)。根据附属的说明书而使用Dynabeads抗体-偶联试剂盒(Life Technologies制)，将与HBs抗原结合的抗体(Sysmex制)(以下，也称为“抗HBs抗体”)固定于1μm的磁性粒子，得到粒子悬浮液。同样地，也向2μm的磁性粒子、4μm的磁性粒子固定抗HBs抗体，得到粒子悬浮液。其中使用的磁性粒子数是各106个。
(2)HBs抗原的捕获
对在上述(1)中调制的粒子悬浮液进行集磁，除去上清。向其中添加80μL的PBS(pH7.4)，使磁性粒子分散。向其中添加20μL的HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C0(0IU/mL)或C1(0.25IU/mL)。在设定为1600rpm、42℃的振荡恒温槽内进行40分钟抗原抗体反应。将粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，集磁后，除去上清。向其中添加80μL的PBS(pH7.4)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、PBS添加及搅拌的操作再进行1次。
(3)第二捕获抗体的结合
集磁后，除去上清。向其中添加100μL的1μg/mL的生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)溶液，使磁性粒子分散。再者，此第二捕获抗体的表位与第一捕获抗体的表位不同。在设定为1600rpm、42℃的振荡恒温槽内进行20分钟抗原抗体反应。将粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，集磁后，除去上清。向其中添加80μL的PBS(pH 7.4)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、PBS添加及搅拌的操作再进行1次。
(4)HRP的结合
集磁后，除去上清。向其中添加100μL的1μg/mL的链霉亲和素Poly-HRP80Conjugate，使磁性粒子分散。在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应10分钟。将粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，集磁后，除去上清。向其中添加80μL的PBS(pH 7.4)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、PBS添加及搅拌的操作再进行1次。
(5)酶反应
最后，除了添加20μL的PBS，用涡旋混合器搅拌之外，与实施例1(3)同样地进行酶反应。
(6)利用显微镜的检测
采集10μL的粒子悬浮液，滴到沉查用检镜载玻片(松浪硝子工业制)。为了检测作为荧光物质的Alexa Fluor 488而使用设置适合的波长的激发滤光器及荧光滤光器的荧光显微镜(BZX710、KEYENCE制)，使用40×物镜而对明视野像及荧光像进行摄像。荧光像取得时的曝光时间设为1/5秒钟。使用图像解析软件ImageJ解析取得的图像。作为图像内的荧光阳性粒子数，对在荧光像中相比阴性粒子的最大荧光辉度更高的辉点进行计数。另外，图像内的全磁性粒子数在明视野像中用ImageJ的Threshold对图像内的信号进行二值化，用Particle工具进行计数。
(7)结果
平均粒径和阳性粒子数的相关示于图4。图4的折线坐标图的纵轴是相对于全粒子数的阳性粒子的比例。再者，相对于全粒子数的阳性粒子的比例(％)根据[(用荧光显微镜计数的阳性粒子数)/(用荧光显微镜计数的全粒子数)]×100算出。如图4所示，使用平均粒径的小的磁性粒子的方可检测更多的阳性粒子。
(实施例3)受试物质浓度和阳性粒子数的相关
(1)固定抗体的磁性粒子的调制
除了代替实施例2(1)所述的磁性粒子而使用1.4×106个平均粒径2.8μm的磁性粒子(Dynabeads抗体-偶联试剂盒、Life Technologies制)之外，与实施例2(1)同样地，调制固定抗HBs抗体的磁性粒子的悬浮液。
(2)HBs抗原的捕获
对在上述(1)中调制的粒子悬浮液进行集磁，除去上清。向其中添加80μL的HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂(Sysmex制)，使磁性粒子分散。向其中添加20μL的将HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C0(0IU/mL)、C1(0.25IU/mL)、C2(2.5IU/mL)、C1用HISCL(注册商标)受试体稀释液稀释10倍的抗原溶液(0.025IU/mL)及稀释100倍的抗原溶液(0.0025IU/mL)之任何，42℃、温育40分钟。集磁，除去上清之后，添加100μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(3)第二捕获抗体的结合
集磁后，除去上清。向其中添加100μL用HISCL(注册商标)HBsAg R3试剂用稀释液(Sysmex制)将1mg/mL生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)倍稀1000释而调制的第二捕获抗体溶液。再者，此第二捕获抗体的表位与第一捕获抗体的表位不同。使磁性粒子分散，42℃、反应20分钟。集磁，除去上清之后，添加100μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(4)HRP的结合
集磁后，除去上清。向其中添加100μL的用PBS(pH 7.4)稀释1000倍的Pierce链霉亲和素Poly-HRP(Thermo Scientific制)。使磁性粒子分散，25℃、反应10分钟。集磁，除去上清之后，添加100μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行2次。
(5)酶反应
将TSA试剂盒#22with HRP,链霉亲和素和Alexa Fluor 488酪胺(制品编号T20932、Life Technologies制)的30％H2O2用扩增缓冲剂稀释，调制0.005％底物缓冲液。将酪胺-Alexa Fluor 488用底物缓冲液稀释20倍。向在上述(4)中调制的粒子悬浮液添加各10μL的稀释的酪胺-Alexa Fluor 488，使磁性粒子分散。于25℃、进行30分钟酶反应。集磁后，除去上清。向其中添加100μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。向其中添加10μL的PBS(pH7.4)，使磁性粒子分散。
(6)利用显微镜的检测
采集10μL的粒子悬浮液，滴到沉查用检镜载玻片(松浪硝子工业株式会社制)。为了检测作为荧光物质的Alexa Fluor 488而使用设置适合的波长的激发滤光器及荧光滤光器的荧光显微镜(BZX710、KEYENCE制)，使用40×物镜而对明视野像、及荧光像进行摄像。荧光像取得时的曝光时间设为1/5秒钟。使用图像解析软件ImageJ解析取得的图像。作为图像内的荧光阳性粒子数，对在荧光像中相比阴性粒子的最大荧光辉度更高的辉点进行计数。在另外，图像内的全磁性粒子数在明视野像中用ImageJ的Threshold对图像内的信号进行二值化，用Particle工具进行计数。
(7)结果
摄像的图像示于图5。以0IU/mL，则绝大部分全部磁性粒子是阴性。一方面，在含HBs抗原的试样中观察到辉点。在HBs抗原浓度0.25IU/mL的检测中摄像的图像的扩大图示于图6。由于磁性粒子本身有自身荧光，即使是阴性粒子，也可观察到一定的荧光，如用箭头表示，在阳性粒子上，粒子表面的一部分被强标记。这样，使用荧光显微镜，则可明确地识别阳性粒子和阴性粒子。另外，如从图5明了，HBs抗原浓度越变高，辉点数越变多。提示由此方法能对HBs抗原浓度进行定量。
(实施例4)
与实施例3(1)～(4)同样地，取得形成复合物的磁性粒子的悬浮液。对于此粒子悬浮液，除了最后添加5μL的PBS(pH 7.4)而使磁性粒子分散之外，与实施例3(5)同样地进行酶反应。与实施例3(6)同样地对全粒子和阳性粒子进行计数。
(比较例1)
(1)阵列的制作
将盖玻片(Neo盖玻片24×32No.1、松波硝子工业制)浸渍到10N KOH中一晚。其后，用去离子水浸渍10次而进行清洗。在180℃的热板上干燥之后，于室温静置，使盖玻片的温度返回至室温。在盖玻片上滴下约70μL的CYTOP(注册商标)(CTL-809、旭硝子制)，使用旋涂仪(MS-A100、三笠株式会社制)，用以下的程序A旋转包被。
<程序A>
斜坡5秒钟
500rpm 10秒钟
斜坡5秒钟
2000rpm 30秒钟
斜坡5秒钟
结束
在热板上进一步于180℃加热1小时。此CYTOP(注册商标)的滴下、将旋转包被及加热的操作再重复3次，在盖玻片上形成厚度约4μm的CYTOP(注册商标)层。为了在此层形成直径数μm的微细的孔(以下，也称为“微孔”)，进行光刻处理。将正型的光刻胶(AZ-4903、AZElectronic Materials制)滴到CYTOP(注册商标)层上，用以下的程序B旋转包被。
<程序B>
斜坡5秒钟
500rpm 10秒钟
斜坡5秒钟
4000rpm 60秒钟
斜坡5秒钟
结束
将残留在盖玻片的边缘的刻胶用含100％乙醇的纱布擦拭。于55℃烘干3分钟之后，110℃、5分钟烘干。将光掩膜用丙酮清洗，设置于掩模对准器(SAN-EI Electric制)。向掩模对准器的试样台设置涂布光刻胶的盖玻片，使玻璃和光掩膜接触，将UV光用Power＝256照射35秒钟。其后，在显像液(AZ Developer、AZ Electronic Materials制)中浸渍5分钟，显像。其后，用超纯水(MilliQ(注册商标))洗涤。使用反应性离子蚀刻装置(RIE-10NR、SAMCO制)，在以下的过程条件下进行O2等离子体蚀刻。
<过程条件>
O250sccm,压力10Pa,工率50W,时间30min
由本工序干法蚀刻未积层刻胶的CYTOP(注册商标)，在盖玻片基板上形成了微细的开口。将蚀刻后的玻璃浸渍到丙酮中，进行15分钟超声波处理。接下来，液取代为乙醇，进行15分钟的超声波处理。再液取代为超纯水，进行15分钟的超声波处理。由以上制作在盖玻片上形成有多个微孔的CYTOP(注册商标)基板。各微孔是直径约5μm的圆柱形状，深度是直径约4μm，邻接的2个微孔的中心间的距离是约10μm。
(2)盖玻片的制作
准备形成了直径1mm的贯通孔的厚度3mm的石英。向此石英的一面滴下约70μL的CYTOP(注册商标)，用上述的程序A旋转包被。在热板上于180℃烘干1小时。由此，制作具备厚度约2μm的CYTOP(注册商标)层的盖玻片。
(3)阵列的制作
在上述(1)中制作的CYTOP(注册商标)基板的CYTOP(注册商标)层侧贴附厚度60μm的两面带(No.5606、日东电工制)，制作阵列。两面带“U”字型贴附到未形成微孔的部分。将盖玻片以形成了CYTOP(注册商标)层的面侧成为CYTOP(注册商标)基板侧的方式贴附CYTOP(注册商标)基板和盖玻片。由此，在CYTOP(注册商标)基板和盖玻片之间形成了空间。再者，贴附时，盖玻片上的贯通孔调整为在形成了微孔的部分和两面贴附了带的部分之间。在贯通孔和“U”字型的开口部之间存在微孔，自贯通孔导入的流体通过形成了微孔的区域，成为到达“U”字型的开口部的构成。
(4)检测
与实施例3(1)～(4)同样地，取得形成复合物的磁性粒子的悬浮液。作为标记底物，使用QuantaRed Enhanced Chemifluorescent HRP Substrate kit(Catalog#15159、ThermoScientific制)。对粒子悬浮液进行集磁，除去上清。向其中添加将QuantaRed ADHPConcentrate、QutantaRED Stable Peroxide Solution、QutantaRED Enhanced Solution以1:50:50混合的底物溶液30μL。反应后，从贯通孔向阵列导入粒子悬浮液30μL。在冰冷却的管架(IR-1、Towalabo制)上，使导入试样的阵列静置5分钟，实施脱气处理。其后，从贯通孔向阵列导入疏水性溶剂(FC-40、Sigma-Aldrich制)70μL。由此，在阵列的微孔中形成了微小液滴。从阵列漏出的悬浮液或疏水性溶剂每次用KimWipe除去。将阵列用铝箔遮光，在设定为42℃的恒温槽(Shaking Incubator SI-300C、ASONE制)内静置5分钟。为了检测QuantaRed而使用设置适合的波长的激发滤光器及荧光滤光器的荧光显微镜(BZX710、KEYENCE制)，使用40×物镜而对明视野像及荧光像进行摄像。荧光像取得时的曝光时间是1/11秒钟。将取得的图像用图像解析软件ImageJ解析。在荧光像中以比封入粒子的阴性孔的最大荧光辉度高的辉点作为阳性孔进行计数。另外，封入微孔的全粒子数在明视野像中用ImageJ的Threshold对图像内的信号进行二值化，用Particle工具进行计数。
实施例4的结果示于图7，比较例1的结果示于图8。在图7中，示HBs抗原浓度和相对于全粒子数的阳性粒子数的比例(％)的相关。再者，相对于全粒子数的阳性粒子的比例(％)根据(用荧光显微镜计数的阳性粒子数)/(用荧光显微镜计数的全粒子数)×100算出。在图8中，示HBs抗原浓度和相对于被封入微孔的全粒子数的阳性孔数的比例(％)的相关。再者，相对于封入微孔的全粒子数的阳性孔数的比例(％)根据(阳性孔数)/(封入微孔的全粒子数)×100算出。由任何的方法均伴随HBs抗原浓度的增加而阳性粒子或阳性孔的比例增加。
(实施例5)使HRP聚合物结合的载体粒子的检测
(1)使HRP聚合物结合的磁性珠的调制及检测
将生物素化磁性粒子(平均粒径2.8μm、Sysmex制)的表面用封闭缓冲液(1×PBS/1％Casein)封闭2小时之后，将生物素化磁性粒子用稀释缓冲液(1×PBS/1％Casein/0.1％Tween20)分散。将结合链霉亲和素的HRP聚合物(SA-HRP聚合物50、100、200及400聚体、Stereospecific Detection Technologies制)以5.4fM的浓度使用稀释缓冲液稀释，一边将各溶液和生物素化磁性粒子1.5×106个以1600rpm搅拌，一边于室温反应1.5小时。另外，作为对照，生物素化磁性粒子与稀释缓冲液搅拌(以下，也称为“空白磁性粒子”)。将反应后的生物素化磁性粒子用清洗缓冲液(1×PBS/0.1％Tween20)清洗。清洗后，在含0.005％过氧化氢的扩增缓冲剂(LifeTechnologies制)20μL中，一边将生物素化磁性粒子和5μM的Alexa488标记酪胺(LifeTechnologies制)以1600rpm搅拌，一边于室温反应30分钟。将反应后的生物素化磁性粒子用清洗缓冲液清洗之后，使粒子分散于200μL的鞘液(FACS Flow,Becton Dickinson制)，以低流量模式使用流式细胞仪(FACS Verse,Becton Dickinson制)而测定各粒子的荧光及散射光的强度，对粒子数进行计数。激发光的波长使用488nm、荧光滤光器的波长使用527/32nm。
(2)结果
将空白磁性粒子、及结合了SA-HRP聚合物400聚体的磁性粒子用FCM测定的结果示于图9A及B。在图9A及B中，横轴示荧光强度，纵轴示侧方散射光强度(粒子的大小)。以空白磁性粒子的平均荧光强度+5SD的值作为阈值。将此阈值在图9A及B中用虚线表示，以荧光强度比阈值大的粒子作为阳性粒子，以其余作为阴性粒子。对图9A和B进行比较，则在结合了SA-HRP聚合物400聚体的磁性粒子上见到阳性粒子数的明显的升高。从而，表示能由FCM进行目的分子的检测。对于结合了空白磁性粒子及各种聚合度的SA-HRP聚合物的磁性粒子，对阳性粒子之中荧光强度上位100个平均荧光强度的值和HRP聚合物的聚合度的关系进行标绘的结果示于图9C。如图9C所示，得知聚合度增加，则阳性粒子的荧光强度也升高，其变化的比例是大致1。得知与HRP聚合物的聚合度成比例而粒子上的荧光标记酪胺的蓄积量增加。对阳性粒子的比例和HRP聚合物的聚合度的关系进行标绘的结果示于图9D。再者，阳性粒子的比例(％)根据[(用流式细胞仪计数的阳性粒子数)/(用流式细胞仪计数的全粒子数)]×100算出。如图9D所示，得知聚合度增加，则阳性粒子数也增加。以上提示，通过以结合了多个HRP的聚合物作为催化剂使用，可实现无需在FCM的隔区化的数字检测。
(实施例6)使用含芳香族π共轭系聚合物结构的荧光物质的受试物质的检测
(1)固定抗体的磁性粒子的调制
根据附属的说明书而使用Dynabeads抗体-偶联试剂盒(Life Technologies制)，将与HBs抗原结合的抗体(Sysmex制)(以下，也称为“抗HBs抗体”)固定于直径2.8μm的磁性粒子，得到粒子悬浮液。
(2)HBs抗原的捕获
对在上述(1)中调制的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加80μL的稀释液(0.1M MES、0.15M NaCl、0.1％BSA、pH 6.5)，使磁性粒子分散。使用的磁性粒子的数是106个。向得到的粒子悬浮液添加20μL的将HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C1(0.25IU/mL)用稀释液(0.1M MES、0.15M NaCl、0.1％BSA、pH 6.5)稀释而调制的0.1IU/mL、0.033IU/L、0.011IU/mL、0.004IU/mL及0.001IU/mL的任何的抗原溶液，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应2小时。将粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，对磁性粒子进行集磁，除去上清。向其中添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、HISCL清洗液添加及搅拌的操作再进行1次。
(3)第二捕获抗体的结合
对在上述(2)中得到的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加100μL用HISCL(注册商标)HBsAg R3试剂用稀释液(Sysmex制)将1mg/mL生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)稀释5000倍而调制的第二捕获抗体溶液。再者，此第二捕获抗体的表位与第一捕获抗体的表位不同。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应45分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(4)HRP单体的结合
对在上述(3)中得到的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加100μL的用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释的50pM链霉亲和素-HRPmonomeric(SDT制)。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行2次。
(5)酶反应
对在上述(4)中得到的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加各50μL的将TSA Plus Biotin Kit(Perkin Elmer制，制品编号NEL749B001KT)的Biotin Amplification Reagent溶液用1×Plus Amplification Diluent稀释20倍的溶液，使磁性粒子分散。在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内进行30分钟酶反应。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(6)荧光标记
对在上述(5)中得到的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加各20μL的用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释20倍的Brilliant Violet(商标)421链霉亲和素(BioLegend制)溶液，使磁性粒子分散。在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。对磁性粒子进行集磁而除去上清，添加10μL的0.1％Tween/PBS(pH7.4)。
(7.1)利用流式细胞仪的检测
分注5μL的在上述(6)中得到的粒子悬浮液，添加200μL的PBS(pH 7.4)，使磁性粒子分散。使得到的粒子悬浮液流过流式细胞仪(FACS Verse、Becton Dickinson制)，对各磁性粒子的荧光强度进行测定。激发光的波长使用408nm，检测器光学滤器使用BD HorizonV450用的滤器。其中，以仅测定阴性粒子时的最大荧光强度+5SD作为阈值，以有此阈值以上的荧光强度的磁性粒子作为阳性粒子进行计数。另外，以有不足此阈值的荧光强度的磁性粒子(阴性粒子)和阳性粒子的总数作为全粒子进行计数。此全粒子数表示供于检测的磁性粒子的总数。
(7.2)由荧光显微镜的检测
取5μL在上述(6)中得到的粒子悬浮液，滴到沉查用检镜载玻片(松浪硝子工业制)。为了检测作为荧光物质的Brilliant Violet(商标)421而使用设置适合的波长的激发滤光器及荧光滤光器的荧光显微镜(BZ-X710、KEYENCE制)，使用20×物镜而取得明视野像及荧光像。荧光像取得时的曝光时间设为200毫秒。
(8)结果
使用Brilliant Violet(商标)421荧光标记的磁性粒子的荧光显微镜像示于图10。如图10所示，辉点数HBs抗原浓度依赖性地增加。利用流式细胞仪的测定结果示于图11。阳性粒子的比例(％)根据[(用流式细胞仪计数的阳性粒子数)/(用流式细胞仪计数的全粒子数)]×100算出。如图11所示，确认阳性粒子的比例抗原浓度依赖性地增加。
(实施例7)载体粒子浓度的探讨
(1)固定抗体的磁性粒子的调制
根据附属的说明书而使用Dynabeads抗体-偶联试剂盒(Life Technologies制)，将抗HBs抗体(Sysmex制)固定于直径2.8μm的磁性粒子，得到粒子悬浮液。
(2)HBs抗原的捕获
对在上述(1)中调制的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加80μL的HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂用稀释液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。磁性粒子数是5×106个。向得到的粒子悬浮液添加20μL的HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C1(0.25IU/mL)，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应2小时。对将粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，磁性粒子进行集磁，除去上清。向其中添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、HISCL清洗液添加及搅拌的操作再进行1次。
(3)第二捕获抗体的结合
对在上述(2)中得到的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加100μL的用HISCL(注册商标)HBsAg R3试剂用稀释液(Sysmex制)将1mg/mL生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)稀释5000倍而调制的第二捕获抗体溶液。再者，此第二捕获抗体的表位与第一捕获抗体的表位不同。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应45分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(4)HRP单体的结合
对在上述(3)中得到的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加100μL的用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH7.4)稀释的50pM链霉亲和素-HRP monomeric(SDT制)。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行2次。
(5)酶反应
对在上述(4)中得到的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加将TSA Plus Biotin Kit(制品编号NEL749B001KT、Perkin Elmer制)的BiotinAmplification Reagent溶液用1×Plus Amplification Diluent稀释20倍的溶液至磁性粒子的浓度成为20×106个/mL、200×106个/mL、1000×106个/mL或5000×106个/mL。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内进行30分钟酶反应。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(6)荧光标记
对在上述(5)中得到的粒子悬浮液中的磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加各20μL的用0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释20倍的Brilliant Violet(商标)421链霉亲和素(BioLegend制)溶液。使磁性粒子分散，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。对磁性粒子进行集磁而除去上清，添加10μL的0.1％Tween/PBS(pH 7.4)。
(7)利用流式细胞仪的检测
将在上述(6)中得到的粒子悬浮液添加到200μL的PBS(pH 7.4)中，使磁性粒子分散。使得到的粒子悬浮液流过流式细胞仪(FACS Verse、Becton Dickinson制)，对各磁性粒子的荧光强度进行测定。激发光的波长使用408nm，检测器光学滤器使用BD Horizon V450用的滤器。其中，以仅测定阴性粒子时的最大荧光强度+5SD作为阈值，以有此阈值以上的荧光强度的磁性粒子作为阳性粒子进行计数。另外，以有不足此阈值的荧光强度的磁性粒子(阴性粒子)和阳性粒子的总数作为全粒子进行计数。此全粒子数表示供于检测的磁性粒子的总数。
(8)结果
如图13所示，在粒子浓度20×106～1000×106个/mL的范围中，阳性粒子的比例是大致一定的。但是，当粒子浓度是5000×106(5×109)个/mL时，阳性粒子的比例急增。这被认为是由于粒子浓度过高，粒子间的距离变得非常地近，信号扩散导致的。即认为，自由基化酪胺不仅是结合于捕获HBs抗原的载体粒子，还结合于未捕获HBs抗原的载体粒子。从而，使酶和底物反应之时，粒子浓度优选不足5×109个/mL。
(实施例8)使用荧光粒子及HRP聚合物的受试物质的检测
(1)在载体粒子上的抗原抗体反应
根据附属的说明书而使用平均粒径1μm的磁性粒子(Dynabeads Myone-COOH、LifeTechnologies制)，将作为第一捕获抗体的抗HBs抗体(Sysmex制)固定于磁性粒子。将得到的磁性粒子(粒子数1.5×106个)用1％BSA/PBS于室温封闭2小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向其中添加80μL的HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂(Sysmex制)，使磁性粒子分散。向其中添加20μL的将HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C0(0IU/mL)、或者C1用HISCL(注册商标)受试体稀释液稀释10倍的抗原溶液(0.025IU/mL)。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应2小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，作为第二捕获抗体添加100μL的1.3nM生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)。再者，此第二捕获抗体的表位与第一捕获抗体的表位不同。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
将结合了链霉亲和素的聚合度400的HRP聚合物(链霉亲和素Poly-HRP80Conjugate、Stereospecific Detection Technologies制)用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释而调制51pM的酶溶液。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加300μL的酶溶液。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(2)酶反应
将TSA Biotin System(制品编号NEL700001KT、Perkin Elmer制)的Biotin酪胺溶液用Amplification Diluent稀释20倍。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加50μL的稀释的Biotin酪胺溶液。使磁性粒子分散，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(3)荧光粒子的固定
作为检测用粒子，使用链霉亲和素修饰的平均粒径300nm的荧光粒子(F1-XC 030、Merck公司制)。将此荧光粒子用HISCL(注册商标)HBsAg R3试剂用稀释液(Sysmex制)稀释100倍。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加50μL的荧光粒子的悬浮液，使磁性粒子分散。在对磁性粒子的悬浮液遮光的状态下，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应20分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(4)利用流式细胞仪的检测
对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加20μL的PBS(pH 7.4)，使磁性粒子分散。将得到的粒子悬浮液之中的10μL用200μL的FACS Flow(Becton Dickinson制)稀释。使得到的粒子悬浮液流过流式细胞仪(FACS Verse、Becton Dickinson制)，对各磁性粒子的荧光强度进行测定，对粒子数进行计数。激发光的波长使用488nm，检测器光学滤器使用FITC检测用的滤器。
(5)结果
从测定结果制成的直方图示于图14。在图14中，纵轴示粒子数，横轴示粒子的荧光强度。另外，实线是添加稀释的C1(抗原浓度0.025IU/mL)时的直方图，虚线是添加C0(抗原浓度0IU/mL)时的直方图。由于校准物C0不含抗原，图14中的虚线的峰示未固定了作为受试物质的HBs抗原的阴性粒子。在图14中的实线的直方图中，确认了荧光强度低的峰和荧光强度高的多个峰。由于荧光强度低的峰与虚线的峰大致重叠，认为显示阴性粒子。一方面，荧光强度高的多个峰被认为示固定了HBs抗原的阳性粒子。存在多个峰被认为是由与载体粒子结合的荧光粒子的数的差异。如图14所示，得知即使代替由荧光染料的标记而使用荧光粒子，可也将阳性粒子与阴性粒子区别检测。
(实施例9)使用荧光粒子及HRP单体的受试物质的检测
(1)在载体粒子上的抗原抗体反应
与实施例8同样地，向平均粒径1μm的磁性粒子(Dynabeads Myone-COOH、LifeTechnologies制)固定抗HBs抗体(Sysmex制)。将得到的磁性粒子(粒子数1.5×106个)用1％BSA/PBS于室温封闭2小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向其中添加80μL的HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂(Sysmex制)，使磁性粒子分散。向其中添加20μL的将HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C0(0IU/mL)、C1用HISCL(注册商标)受试体稀释液稀释10倍的抗原溶液(0.025IU/mL)及稀释100倍的抗原溶液(0.0025IU/mL)的任何。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应2小时。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，作为第二捕获抗体添加100μL的1.3nM生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)。再者，此第二捕获抗体的表位与第一捕获抗体的表位不同。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
将结合了链霉亲和素的HRP单体(链霉亲和素HRP Conjugate、StereospecificDetection Technologies制)用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释而调制51pM的酶溶液。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加300μL的酶溶液。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
(2)酶反应
将TSA Biotin System(制品编号NEL700001KT、Perkin Elmer制)的Biotin酪胺溶液用Amplification Diluent稀释20倍。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加50μL的稀释的Biotin酪胺溶液。使磁性粒子分散，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
(3)荧光粒子的固定
将链霉亲和素修饰的平均粒径300nm的荧光粒子(F1-XC 030、Merck公司制)用HISCL(注册商标)HBsAg R3试剂用稀释液(Sysmex制)稀释100倍。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加50μL的荧光粒子的悬浮液，使磁性粒子分散。在对磁性粒子的悬浮液遮光的状态下，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应20分钟。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
(4)利用流式细胞仪的检测
对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加20μL的PBS(pH 7.4)，使磁性粒子分散。将得到的粒子悬浮液之中的10μL用200μL的FACS Flow(Becton Dickinson制)稀释。使得到的粒子悬浮液流过流式细胞仪(FACS Verse、Becton Dickinson制)，对各磁性粒子的荧光强度进行测定，对粒子数进行计数。激发光的波长使用488nm，检测器光学滤器使用FITC检测用的滤器。其中，以仅测定阴性粒子时的最大荧光强度+5SD作为阈值，以有此阈值以上的荧光强度的磁性粒子作为阳性粒子进行计数。另外，以有不足此阈值的荧光强度的磁性粒子(阴性粒子)和阳性粒子的总数作为全粒子进行计数。此全粒子数表示供于检测的磁性粒子的总数。
(5)结果
图15显示HBs抗原浓度和相对于全粒子数的阳性粒子数的比例(％)的相关。阳性粒子的比例(％)根据[(用流式细胞仪计数的阳性粒子数)/(用流式细胞仪计数的全粒子数)]×100算出。如图15所示，阳性粒子的比例抗原浓度依赖性地增加。从而得知，在使荧光粒子与载体粒子结合时，即使作为催化剂使用HRP单体，也可取得抗原浓度依赖性的信号。
(实施例10)荧光粒子的粒径的探讨
(1)在载体粒子上的抗原抗体反应
除了代替实施例8中记载的磁性粒子而使用平均粒径2.8μm的磁性粒子(LifeTechnologies制)之外，与实施例8同样地，向磁性粒子固定抗HBs抗体(Sysmex制)。将得到的磁性粒子(粒子数1.5×106个)用1％BSA/PBS于室温封闭2小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向其中添加80μL的HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂(Sysmex制)，使磁性粒子分散。向其中添加20μL的HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C0(0IU/mL)、或者C1(0.25IU/mL)。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应2小时。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，作为第二捕获抗体添加100μL的1.3nM生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)。再者，此第二捕获抗体的表位与第一捕获抗体的表位不同。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
将结合链霉亲和素的HRP单体(链霉亲和素HRP Conjugate、StereospecificDetection Technologies制)用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释而调制51pM的酶溶液。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加300μL的酶溶液。使磁性粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
(2)酶反应
将TSA生物素System(制品编号NEL700001KT、Perkin Elmer制)的生物素酪胺溶液用扩增稀释液稀释20倍。除去对磁性粒子进行集磁，上清之后，添加50μL的稀释的生物素酪胺溶液。使磁性粒子分散，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
(3)荧光粒子的固定
作为链霉亲和素修饰的荧光粒子，准备平均粒径160nm、200nm、300nm、400nm及500nm的荧光粒子(均Merck公司制)。这些荧光粒子相对于磁性粒子的平均粒径(2.8μm)，各自有5.7％、7.1％、10.7％、14.3％及17.8％的平均粒径。将这些荧光粒子各自用HISCL(注册商标)HBsAg R3试剂用稀释液(Sysmex制)稀释100倍。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加50μL的荧光粒子的悬浮液，使磁性粒子分散。在对磁性粒子的悬浮液遮光的状态下，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应20分钟。进而，与实施例8同样地，将使用HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)的磁性粒子的清洗操作进行2次。
(4)利用流式细胞仪的检测
对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加20μL的PBS(pH 7.4)，使磁性粒子分散。将得到的粒子悬浮液之中的10μL用200μL的FACS Flow(Becton Dickinson制)稀释。使得到的粒子悬浮液流过流式细胞仪(FACS Verse、Becton Dickinson制)，对各磁性粒子的荧光强度进行测定，对粒子数进行计数。激发光的波长使用488nm，检测器光学滤器使用FITC检测用的滤器。
(5)结果
与稀释的C1(抗原浓度0.25IU/mL)反应，将结合荧光粒子的磁性粒子用FCM测定的结果示于图16A、B、C、D及E。在这些图中，横轴示荧光强度，纵轴示前方散射光强度(粒子的大小)。在这些图中，确认了荧光强度低的集团和荧光强度高的集团。认为荧光强度低的集团是未结合荧光粒子的阴性粒子的集团，荧光强度高的集团是结合了荧光粒子的阳性粒子的集团。如这些图所示，得知通过设定适合的阈值，可区别阴性粒子和阳性粒子。特别是示，使用平均粒径300nm以上的荧光粒子，则可明确地区别阴性粒子和阳性粒子。
(实施例11)使用多底物体的载体粒子的检测
(1)HRP的捕获
向平均粒径2μm的磁性粒子(micromerM-COOH、micromod PartikeltechnologieGmbH制)固定生物素结合BSA(Sysmex制)。使得到的磁性粒子(粒子数106个)分散于80μL的PBS(pH 7.4)。将结合链霉亲和素的HRP(链霉亲和素Poly-HRP80Conjugate、Stereospecific Detection Technologies制)用PBS(pH 7.4)稀释而调制100pg/mL的HRP溶液。另外，作为0pg/mL的HRP溶液使用PBS(pH 7.4)。向上述的粒子悬浮液80μL添加20μL的0pg/mL或100pg/mL的HRP溶液，在设定为1600rpm、25℃的恒温槽内反应1小时。将各粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，集磁后，除去上清，添加80μL的PBS(pH 7.4)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、PBS添加及搅拌的操作再进行1次。
(2)多底物体的调制
作为发生荧光的支持体，使用结合了链霉亲和素的Qdot(注册商标)Nanocrystal(Qdot(注册商标)585链霉亲和素Conjugate、invitrogen制)。将此Nanocrystal用TSA plus生物素试剂盒(Life technologies制)中的扩增缓冲剂稀释5倍，调制Nanocrystal溶液。再者，在Qdot(注册商标)585链霉亲和素Conjugate上，对于1个Nanocrystal，结合了多个(通常5～10分子)的链霉亲和素。将此Nanocrystal溶液和上述试剂盒中的生物素-酪胺和扩增缓冲剂混合，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应20分钟而调制含固定多个酪胺分子的Nanocrystal(多底物体)的溶液。
(3)酶反应
对在上述(1)中得到的各粒子悬浮液中的载体粒子进行集磁，除去上清。其中，添加各20μL的上述的含多底物体的溶液。使载体粒子分散，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。将各粒子悬浮液从振荡恒温槽取出，集磁后，除去上清，添加80μL的PBS(pH 7.4)，用涡旋混合器搅拌。将此集磁、除去上清、PBS添加及搅拌的操作再进行1次。
(4)利用显微镜的检测
对在上述(3)中得到的各粒子悬浮液中的载体粒子进行集磁，除去上清。向其中添加50μL的PBS(pH 7.4)而搅拌。从得到的粒子悬浮液采集10μL，滴到沉查用检镜载玻片(松浪硝子工业制)。为了检测作为荧光物质的Qdot(注册商标)585而使用设置适合的波长的激发滤光器及荧光滤光器的荧光显微镜(BZX710、KEYENCE制)，使用40×物镜而对明视野像及荧光像进行摄像。荧光像取得时的曝光时间设为1/10秒钟。使用图像解析软件ImageJ解析取得的图像。作为图像内的荧光阳性粒子数，对在荧光像中相比阴性粒子的最大荧光辉度更高的辉点进行计数。另外，图像内的全磁性粒子数在明视野像中用ImageJ的Threshold对图像内的信号进行二值化，用Particle工具进行计数。
(5)结果
相对于全粒子数的阳性粒子数的比例(％)及相对于用荧光显微镜观察的全粒子的面积的阳性粒子的面积的比例(％)示于表3。相对于全粒子数的阳性粒子的比例(％)根据(用荧光显微镜计数的阳性粒子数)/(用荧光显微镜计数的全粒子数)×100算出。相对于用显微镜观察的全粒子的面积的阳性粒子的面积的比例(％)根据(在用荧光显微镜观察的荧光像中的荧光部分的面积的总和)/(在用荧光显微镜观察的明视野像中的粒子的面积的总和)×100算出。再者，“在用荧光显微镜观察的荧光像中的荧光部分的面积”及“在用荧光显微镜观察的明视野像中的粒子的面积”不是粒子的表面积，而是图像上的面积。在表3中所示的值的解析中，使用从添加100pg/mL的HRP溶液时的信号值减去作为背景添加PBS(HRP浓度0pg/mL)时的信号值的值。
【表3】
| HRP浓度(pg/mL) | 阳性粒子数的比例(％) | 阳性粒子的面积的比例(％) |
| 100 | 18.8 | 21.7 |
如表3所示，得知即使作为底物使用结合多个酪胺分子的支持体，也可检测载体粒子。
(实施例12)载体粒子的粒径的探讨
(1)在载体粒子上的抗原抗体反应
作为磁性粒子，准备平均粒径30μm的聚合物乳胶粒子(Micromer-COOH、micromodPartikeltechnologie GmbH制)及平均粒径100μm的聚合物乳胶粒子(Micromer-COOH、micromod Partikeltechnologie GmbH制)。向这些聚合物乳胶粒子作为第一捕获抗体固定抗HBs抗体(Sysmex制)。将得到的聚合物乳胶粒子(均粒子数105个)用1％BSA/PBS于室温封闭2小时。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清。向其中添加80μL的HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂(Sysmex制)，使聚合物乳胶粒子分散。
将HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C5用HISCL(注册商标)受试体稀释液稀释而调制抗原浓度0.0025IU/mL、0.025IU/mL及0.25IU/mL的抗原溶液。向上述的粒子悬浮液添加20μL的HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)的C0(0IU/mL)或调制的抗原溶液。使聚合物乳胶粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。
对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清之后，作为第二捕获抗体添加100μL的1.3nM生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)。再者，此第二捕获抗体的表位与第一捕获抗体的表位不同。使聚合物乳胶粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使聚合物乳胶粒子分散。
将结合链霉亲和素的HRP(链霉亲和素HRP Conjugate、StereospecificDetection Technologies制)用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释而调制51pM的酶溶液。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清之后，添加100μL的酶溶液。使聚合物乳胶粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此离心分离、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(2)酶反应
将TSA生物素System(制品编号NEL700001KT、Perkin Elmer制)的生物素酪胺溶液用扩增稀释液稀释100倍。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清之后，添加50μL的稀释的生物素酪胺溶液。使聚合物乳胶粒子分散，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。
(3)荧光标记
将结合链霉亲和素的荧光染料(Brilliant Violet(商标)421链霉亲和素、BioLegend制)用Stain Buffer(Becton Dickinson制)稀释100倍而调制荧光染料溶液。对在上述(2)中得到的粒子悬浮液进行离心分离，除去上清之后，添加20μL的调制的荧光染料溶液。在对粒子悬浮液遮光的状态下，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清。向聚合物乳胶粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使聚合物乳胶粒子分散。
(4)利用显微镜的检测
对在上述(3)中得到的各粒子悬浮液进行离心分离，除去上清。向其中添加20μL的PBS(pH 7.4)而搅拌。从得到的粒子悬浮液采集10μL，滴到沉查用检镜载玻片(松浪硝子工业制)。为了检测Brilliant Violet(商标)421而使用设置适合的波长的激发滤光器及荧光滤光器的荧光显微镜(BZX710、KEYENCE制)，使用20×物镜而对明视野像及荧光像进行摄像。荧光像取得时的曝光时间设为1/30秒钟。使用图像解析软件ImageJ解析取得的图像。作为图像内的荧光阳性粒子数，对在荧光像中相比阴性粒子的最大荧光辉度更高的辉点进行计数。另外，图像内的全磁性粒子数在明视野像中用ImageJ的Threshold对图像内的信号进行二值化，用Particle工具进行计数。
(5)结果
结果示于图18。在图18中，纵轴示阳性粒子数，横轴示抗原浓度。白色圆点示平均粒径30μm的载体粒径的数据，黑色圆点示平均粒径100μm的载体粒径的数据。阳性粒子数根据[(用荧光显微镜计数的阳性粒子数)/(用荧光显微镜计数的全粒子数)]×(每1测定的粒子数)算出。如图18所示，即使使用平均粒径是30μm及100μm的载体粒子，也可检测HBs抗原浓度依赖性的信号。
(实施例13)多重检测
(1)在载体粒子上的抗原抗体反应
向平均粒径2.8μm的磁性粒子(Dynabeads、Life Technologies制)固定作为第一捕获抗体的抗IL-6抗体(R&D systems制)。另外，向平均粒径4.5μm的磁性粒子(Dynabeads、Life Technologies制)，将作为第三捕获抗体的抗HBs抗体(Sysmex制)固定于磁性粒子。将得到的磁性粒子(均粒子数1×107个)用1％BSA/PBS于室温封闭2小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向其中添加250μL的HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将得到的2种粒子悬浮液混合而得到含固定抗IL-6抗体的磁性粒子及固定抗HBs抗体的磁性粒子的粒子悬浮液(500μL、粒子数2×107个)。
作为受试物质，使用HBs抗原及重组型人IL-6的混合物。具体而言，将HISCL(注册商标)HBsAg校准物(Sysmex制)及recombinant human IL-6(Biolegend制)用HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂(Sysmex制)稀释，混合至成表4中所示的浓度而调制抗原试样。作为不含抗原的试样(抗原试样1)，使用HISCL(注册商标)HBsAg R1试剂(Sysmex制)。
【表4】
| HBsAg(IU/mL) | IL-6(pg/mL) | |
| 抗原试样1 | 0 | 0 |
| 抗原试样2 | 0.013 | 0.1 |
| 抗原试样3 | 0.13 | 1 |
| 抗原试样4 | 1.3 | 10 |
将上述的粒子悬浮液(50μL)和抗原试样1、2、3或4(各50μL)混合，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应2小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加100μL的含作为第二及第四捕获抗体的浓度0.13μg/mL的生物素化抗HBs抗体(Sysmex制)及浓度0.2μg/mL的生物素化抗IL-6抗体(R&D Systems制)的1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)。使磁性粒子分散，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应45分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加100μL的含浓度5ng/mL的链霉亲和素结合HRP(Stereospecific Detection Technologies制)的1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)。使磁性粒子分散，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应1小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(2)酶反应
将TSA生物素System(制品编号NEL700001KT、Perkin Elmer制)的生物素酪胺溶液用扩增稀释液稀释100倍。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加50μL的稀释的生物素酪胺溶液。使磁性粒子分散，在设定为1300rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
(3)荧光标记
将结合链霉亲和素的荧光染料(Brilliant Violet(商标)421链霉亲和素、BioLegend制)用Stain Buffer(Becton Dickinson制)稀释100倍而调制浓度2μg/mL的荧光染料溶液。对在上述(2)中得到的粒子悬浮液进行离心分离，除去上清之后，添加20μL的调制的荧光染料溶液。在对粒子悬浮液遮光的状态下，在设定为1600rpm、25℃的振荡恒温槽内反应45分钟。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。
(4)利用流式细胞仪的检测
对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加150μL的FACS Flow(Becton Dickinson制)而使分散。使得到的粒子悬浮液流过流式细胞仪(FACS Verse、Becton Dickinson制)，对各磁性粒子的荧光强度及散射光强度进行测定，对粒子数进行计数。激发光的波长使用408nm，检测器光学滤器使用BD Horizon V450用的滤器。对在散射光强度和荧光强度的二维散点图上粒径2.8μm的集团及粒径4.5μm的集团中所含的粒子的荧光强度进行解析，对于各自的抗原而算出阳性粒子的比例(％)。
(5)结果
执行2次上述的检测，结果示于图19A及B。如图19A所示，阳性粒子的比例IL-6浓度依赖性地增加。另外，如图19B所示，阳性粒子的比例HBs抗原浓度依赖性地增加。从而得知，可由本实施方式的方法同时检测2种受试物质。
(实施例14)外泌体的检测
(1)在载体粒子上的抗原抗体反应
向平均粒径2.8μm的磁性粒子(Dynabeads、Life Technologies制)固定作为第一捕获抗体的抗CD147抗体(Becton Dickinson制)。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向得到的磁性粒子(粒子数1×106个)添加80μL的1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)，于37℃30分钟封闭。
作为受试物质，使用人大肠癌细胞株COLO1的培养上清来源的外泌体。具体而言，将COLO-1(Lyophilized exosomes from COLO1 cell culture supernatant、HansaBioMed制)用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释，调制外泌体浓度0.0015mg/mL、0.005mg/mL及0.015mg/mL的抗原溶液。作为不含抗原的试样(外泌体浓度0mg/mL)，使用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)。
对封闭的磁性粒子进行集磁，除去上清。向其中添加20μL的上述的试样。使磁性粒子分散，在设定为1000rpm、37℃的振荡恒温槽内反应1小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。
对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加100μL的浓度50ng/mL的生物素化抗CD9抗体(Biolegend制)。使磁性粒子分散，在设定为1000rpm、37℃的振荡恒温槽内反应1小时。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。将此集磁、除去上清、清洗液添加及分散的操作再进行1次。
将结合链霉亲和素的HRP(链霉亲和素HRP Conjugate、StereospecificDetection Technologies制)用1％BSA/0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释而调制51pM的酶溶液。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加100μL的酶溶液。使磁性粒子分散，在设定为1000rpm、37℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。
(2)酶反应
将TSA生物素System(制品编号NEL700001KT、Perkin Elmer制)的生物素酪胺溶液用扩增稀释液稀释100倍。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加50μL的稀释的生物素酪胺溶液。使磁性粒子分散，在设定为1000rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对磁性粒子进行集磁，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。
(3)荧光标记
将结合链霉亲和素的荧光染料(Brilliant Violet(商标)421链霉亲和素、BioLegend制)用0.1％Tween20/PBS(pH 7.4)稀释100倍而调制荧光染料溶液。对磁性粒子进行集磁，除去上清之后，添加50μL的调制的荧光染料溶液。在对粒子悬浮液遮光的状态下，在设定为1000rpm、25℃的振荡恒温槽内反应30分钟。对粒子悬浮液进行离心分离，除去上清。向磁性粒子添加200μL的HISCL(注册商标)清洗液(Sysmex制)，使磁性粒子分散。
(4)利用流式细胞仪的检测
将在上述(3)中得到的粒子悬浮液之中的5μL用200μL的FACS Flow(BectonDickinson制)稀释。使得到的粒子悬浮液流过流式细胞仪(FACS Verse、Becton Dickinson制)，对各磁性粒子的荧光强度进行测定，对粒子数进行计数。激发光的波长使用408nm，检测器光学滤器使用BD Horizon V450用的滤器。其中，以仅测定阴性粒子时的最大荧光强度+5SD作为阈值，以有此阈值以上的荧光强度的磁性粒子作为阳性粒子进行计数。另外，以有不足此阈值的荧光强度的磁性粒子(阴性粒子)和阳性粒子的总数作为全粒子进行计数。此全粒子数表示供于检测的磁性粒子的总数。
(5)结果
结果示于图20。如图20所示，阳性粒子的比例外泌体浓度依赖性地增加。从而得知，可由本实施方式的方法检测外泌体作为受试物质。
本申请关于在2015年3月13日申请的日本国专利申请特愿2015-50205号、在2015年8月28日申请的日本国专利申请特愿2015-169206号及在2016年1月28日申请的日本国专利申请特愿2016-14744号，将这些专利权利要求、说明书、附图及摘要的全部作为参照并入本说明书中。
【符号说明】
10、20、30、40、50、60、70、80、90、100：试剂盒
11、21、31、41、51、61、71、81、91、101：第1容器
12、22、32、42、52、62、72、82、92、102：第2容器
13、23、33、43、53、63、73、83、93、103：第3容器
14、34、44、64、74、84、94、104：第4容器
15、65、85、95：第5容器
66：第6容器
16、24、35、45、54、67、75、86、96、105：附带文书
17、25、36、46、55、68、76、87、97、106：捆包箱
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.受试物质的检测方法，其为检测试样中的受试物质的方法，其包括：
在载体粒子上形成含下列物质的复合物的工序：
能与上述受试物质结合的第一捕获物质、
一分子受试物质、
能与上述受试物质结合的第二捕获物质、和
催化剂；
使上述复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于上述载体粒子的工序；及
通过检测固定了上述反应产物的载体粒子，检测受试物质的工序，
由上述形成工序，每一个载体粒子捕获一分子受试物质，
在上述固定工序中，上述反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子，
上述形成工序包括将上述试样和含多个上述载体粒子的试剂混合的工序，
在上述固定工序及检测工序中，各载体粒子未被隔区化。
2.权利要求1所述的方法，其中
在上述固定工序中，通过将上述反应产物固定于上述载体粒子而上述载体粒子的光学性质发生变化，
在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的光学信息，检测上述受试物质。
3.权利要求1或2所述的方法，其中
上述固定工序在含固定了上述复合物的载体粒子和上述底物的溶液中执行，
上述复合物的催化剂和上述底物的反应在上述载体粒子分散到上述溶液中的状态下进行。
4.权利要求3所述的方法，其中在上述固定工序中，分散的载体粒子间的距离是至少3μm。
5.权利要求2～4之任一项所述的方法，其中上述固定工序包括使溶液中的上述载体粒子分散的工序。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中在上述固定工序中，上述溶液中的载体粒子的浓度是5×104个/mL以上并且1×109个/mL以下。
7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其中上述多个载体粒子的平均粒径是100μm以下。
8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中在上述固定工序中，在上述载体粒子上进一步固定检测用粒子。
9.权利要求8所述的方法，其中上述检测用粒子是荧光粒子。
10.权利要求8或9所述的方法，其中上述检测用粒子的平均粒径是上述载体粒子的平均粒径的5％以上。
11.权利要求10所述的方法，其中上述检测用粒子的平均粒径是上述载体粒子的平均粒径的10％以上。
12.权利要求1～11之任一项所述的方法，其中上述底物含支持体和多个底物分子。
13.权利要求12所述的方法，其中上述支持体发生能检测的信号。
14.权利要求13所述的方法，其中上述支持体含荧光物质。
15.权利要求1～14之任一项所述的方法，其中上述检测工序在含多个载体粒子的溶液中执行，各载体粒子在上述溶液中未被隔区化。
16.权利要求1～15之任一项所述的方法，其中上述底物是有标记的底物，
在上述固定工序中，生成有上述标记的反应产物，有上述标记的反应产物固定于上述载体粒子，
在上述检测工序中，基于固定于上述载体粒子的上述反应产物的标记，检测受试物质。
17.权利要求1～16之任一项所述的方法，其中在上述检测工序中，
对上述载体粒子的光学信息进行测定，
对上述光学信息的测定值和指定的阈值进行比较，
将上述测定值达到指定的阈值以上的载体粒子作为结合了上述反应产物的载体粒子进行检测。
18.权利要求8～11之任一项所述的方法，其中
在上述固定工序中，检测用粒子经反应产物而固定于载体粒子，
在上述检测工序中，通过检测固定了上述检测用粒子的载体粒子，检测受试物质。
19.权利要求16所述的方法，其中上述标记是荧光物质，上述光学信息是荧光强度。
20.权利要求19所述的方法，其中上述荧光物质含芳香族π共轭系聚合物结构。
21.权利要求1～20之任一项所述的方法，其中上述催化剂是酶。
22.权利要求21所述的方法，其中上述酶是多个酶分子聚合成的聚合物。
23.权利要求22所述的方法，其中上述酶分子的聚合物的聚合度是50以上并且400以下。
24.权利要求1～23之任一项所述的方法，其中
上述催化剂是过氧化物酶，
上述底物是标记酪胺，
上述反应产物是自由基化酪胺，
在上述固定工序中，通过上述自由基化标记酪胺固定于固定有使该标记酪胺自由基化的过氧化物酶的载体粒子，上述载体粒子的荧光强度发生变化，
在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的荧光强度，检测上述受试物质。
25.权利要求1～23之任一项所述的方法，其中
上述催化剂是过氧化物酶，
上述底物含检测用粒子和酪胺，
上述反应产物是自由基化酪胺，
上述检测用粒子是荧光粒子，
在上述固定工序中，上述自由基化酪胺固定于固定有使该酪胺自由基化的过氧化物酶的载体粒子，
通过向固定了酪胺的载体粒子进一步固定荧光粒子，上述载体粒子的荧光强度发生变化，
在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的荧光强度，检测上述受试物质。
26.权利要求1～23之任一项所述的方法，其中
上述催化剂是过氧化物酶，
上述底物含支持体和多个酪胺分子，
上述反应产物是自由基化酪胺，
在上述固定工序中，通过上述自由基化酪胺固定于固定有使该酪胺自由基化的过氧化物酶的载体粒子，上述载体粒子的荧光强度发生变化，
在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的荧光强度，检测上述受试物质。
27.权利要求1～26之任一项所述的方法，其中上述检测工序包括：
对结合了上述反应产物的载体粒子进行计数的工序；及
基于上述计数结果，对上述受试物质进行定量的工序。
28.权利要求27所述的方法，其中上述检测工序包括：
对供于检测的载体粒子的总数进行计数的工序；及
基于结合了上述反应产物的载体粒子的计数结果和上述总数的计数结果，对上述受试物质进行定量的工序。
29.权利要求27或28所述的方法，其中上述计数工序使用流式细胞仪或显微镜进行。
30.受试物质的检测方法，其为区别检测试样中的第一受试物质和与上述第一受试物质不同的种类的第二受试物质的方法，其包括：
形成第一复合物和第二复合物的工序，其中
在载体粒子上形成含下列物质的第一复合物：
能与上述第一受试物质结合的第一捕获物质、
一分子上述第一受试物质、
能与上述第一受试物质结合的第二捕获物质、和
催化剂，
在载体粒子上形成含下列物质的的第二复合物：
能与上述第二受试物质结合的第三捕获物质、
一分子上述第二受试物质、
能与上述第二受试物质结合的第四捕获物质、和
催化剂；
使上述复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于上述载体粒子的工序；及
通过检测固定了上述反应产物的载体粒子，区别检测上述第一受试物质及上述第二受试物质的工序，
上述形成工序包括将上述试样和含多个上述载体粒子的试剂混合的工序，
由上述形成工序，每一个载体粒子捕获一分子第一受试物质及第二受试物质之任一者，
在上述固定工序中，上述反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子，
由上述催化反应，发生能互相区别固定上述第一受试物质的载体粒子和固定上述第二受试物质的载体粒子的信号，
在上述固定工序及检测工序中，各载体粒子未被隔区化，
在上述检测工序中，基于上述能互相区别的信号，区别检测上述第一受试物质及上述第二受试物质。
31.权利要求30所述的方法，其中上述能互相区别的信号基于上述载体粒子的平均粒径。
32.权利要求30所述的方法，其中上述能互相区别的信号基于固定于上述载体粒子的反应产物。
33.权利要求32所述的方法，其中
上述能互相区别的信号是荧光，
上述第一受试物质及上述第二受试物质基于固定了反应产物的载体粒子的荧光强度或荧光波长进行区别。
34.权利要求1～33之任一项所述的方法，其中上述第一捕获物质及上述第二捕获物质是抗体。
35.权利要求1～34之任一项所述的方法，其中受试物质是抗体、核酸、生理活性物质、囊泡、细菌、病毒、多肽、半抗原、治疗药剂或治疗药剂的代谢物。
36.权利要求35所述的方法，其中上述囊泡是外泌体。
37.权利要求1～36之任一项所述的方法，其中在上述形成工序中，各载体粒子未被隔区化。
38.权利要求1～37之任一项所述的方法，其中在上述固定工序中，每一个固定一分子受试物质的载体粒子固定多个分子的反应产物。
39.在权利要求1～38之任一项所述的受试物质的检测方法中使用的试剂盒，其含：
多个载体粒子，
上述第一捕获物质，
上述第二捕获物质，
上述催化剂，和
上述底物。
40.权利要求39所述的试剂盒，其还含检测用粒子。
41.权利要求39或40所述的试剂盒，其中上述底物含支持体和多个底物分子。
Claims (39)
1.受试物质的检测方法，其为检测试样中的受试物质的方法，其包括：
在载体粒子上形成含下列物质的复合物的工序：
能与上述受试物质结合的第一捕获物质、
一分子受试物质、
能与上述受试物质结合的第二捕获物质、和
催化剂；
使上述复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于上述载体粒子的工序；及
通过检测固定了上述反应产物的载体粒子，检测受试物质的工序，
由上述形成工序，每一个载体粒子捕获一分子受试物质，
在上述固定工序中，上述反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子，
上述形成工序包括将上述试样和含多个上述载体粒子的试剂混合的工序，
在上述检测工序中，各载体粒子未被隔区化。
2.权利要求1所述的方法，其中
在上述固定工序中，通过将上述反应产物固定于上述载体粒子而上述载体粒子的光学性质发生变化，
在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的光学信息，检测上述受试物质。
3.权利要求1或2所述的方法，其中
上述固定工序在含固定了上述复合物的载体粒子和上述底物的溶液中执行，
上述复合物的催化剂和上述底物的反应在上述载体粒子分散到上述溶液中的状态下进行。
4.权利要求3所述的方法，其中在上述固定工序中，分散的载体粒子间的距离是至少3μm。
5.权利要求2～4之任一项所述的方法，其中上述固定工序包括使溶液中的上述载体粒子分散的工序。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中在上述固定工序中，上述溶液中的载体粒子的浓度是5×104个/mL以上并且1×109个/mL以下。
7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其中上述多个载体粒子的平均粒径是100μm以下。
8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中在上述固定工序中，在上述载体粒子上进一步固定检测用粒子。
9.权利要求8所述的方法，其中上述检测用粒子是荧光粒子。
10.权利要求8或9所述的方法，其中上述检测用粒子的平均粒径是上述载体粒子的平均粒径的5％以上。
11.权利要求10所述的方法，其中上述检测用粒子的平均粒径是上述载体粒子的平均粒径的10％以上。
12.权利要求1～11之任一项所述的方法，其中上述底物含支持体和多个底物分子。
13.权利要求12所述的方法，其中上述支持体发生能检测的信号。
14.权利要求13所述的方法，其中上述支持体含荧光物质。
15.权利要求1～14之任一项所述的方法，其中上述检测工序在含多个载体粒子的溶液中执行，各载体粒子在上述溶液中未被隔区化。
16.权利要求1～15之任一项所述的方法，其中上述底物是有标记的底物，
在上述固定工序中，生成有上述标记的反应产物，有上述标记的反应产物固定于上述载体粒子，
在上述检测工序中，基于固定于上述载体粒子的上述反应产物的标记，检测受试物质。
17.权利要求1～16之任一项所述的方法，其中在上述检测工序中，
对上述载体粒子的光学信息进行测定，
对上述光学信息的测定值和指定的阈值进行比较，
将上述测定值达到指定的阈值以上的载体粒子作为结合了上述反应产物的载体粒子进行检测。
18.权利要求8～11之任一项所述的方法，其中
在上述固定工序中，检测用粒子经反应产物而固定于载体粒子，
在上述检测工序中，通过检测固定了上述检测用粒子的载体粒子，检测受试物质。
19.权利要求16所述的方法，其中上述标记是荧光物质，上述光学信息是荧光强度。
20.权利要求19所述的方法，其中上述荧光物质含芳香族π共轭系聚合物结构。
21.权利要求1～20之任一项所述的方法，其中上述催化剂是酶。
22.权利要求21所述的方法，其中上述酶是多个酶分子聚合成的聚合物。
23.权利要求22所述的方法，其中上述酶分子的聚合物的聚合度是50以上并且400以下。
24.权利要求1～23之任一项所述的方法，其中
上述催化剂是过氧化物酶，
上述底物是标记酪胺，
上述反应产物是自由基化酪胺，
在上述固定工序中，通过上述自由基化标记酪胺固定于固定有使该标记酪胺自由基化的过氧化物酶的载体粒子，上述载体粒子的荧光强度发生变化，
在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的荧光强度，检测上述受试物质。
25.权利要求1～23之任一项所述的方法，其中
上述催化剂是过氧化物酶，
上述底物含检测用粒子和酪胺，
上述反应产物是自由基化酪胺，
上述检测用粒子是荧光粒子，
在上述固定工序中，上述自由基化酪胺固定于固定有使该酪胺自由基化的过氧化物酶的载体粒子，
通过向固定了酪胺的载体粒子进一步固定荧光粒子，上述载体粒子的荧光强度发生变化，
在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的荧光强度，检测上述受试物质。
26.权利要求1～23之任一项所述的方法，其中
上述催化剂是过氧化物酶，
上述底物含支持体和多个酪胺分子，
上述反应产物是自由基化酪胺，
在上述固定工序中，通过上述自由基化酪胺固定于固定有使该酪胺自由基化的过氧化物酶的载体粒子，上述载体粒子的荧光强度发生变化，
在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的荧光强度，检测上述受试物质。
27.权利要求1～26之任一项所述的方法，其中上述检测工序包括：
对结合了上述反应产物的载体粒子进行计数的工序；及
基于上述计数结果，对上述受试物质进行定量的工序。
28.权利要求27所述的方法，其中上述检测工序包括：
对供于检测的载体粒子的总数进行计数的工序；及
基于结合了上述反应产物的载体粒子的计数结果和上述总数的计数结果，对上述受试物质进行定量的工序。
29.权利要求27或28所述的方法，其中上述计数工序使用流式细胞仪或显微镜进行。
30.受试物质的检测方法，其为区别检测试样中的第一受试物质和与上述第一受试物质不同的种类的第二受试物质的方法，其包括：
形成第一复合物和第二复合物的工序，其中
在载体粒子上形成含下列物质的第一复合物：
能与上述第一受试物质结合的第一捕获物质、
一分子上述第一受试物质、
能与上述第一受试物质结合的第二捕获物质、和
催化剂，
在载体粒子上形成含下列物质的的第二复合物：
能与上述第二受试物质结合的第三捕获物质、
一分子上述第二受试物质、
能与上述第二受试物质结合的第四捕获物质、和
催化剂；
使上述复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于上述载体粒子的工序；及
通过检测固定了上述反应产物的载体粒子，区别检测上述第一受试物质及上述第二受试物质的工序，
上述形成工序包括将上述试样和含多个上述载体粒子的试剂混合的工序，
由上述形成工序，每一个载体粒子捕获一分子第一受试物质及第二受试物质之任一者，
在上述固定工序中，上述反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子，
由上述催化反应，发生能互相区别固定上述第一受试物质的载体粒子和固定上述第二受试物质的载体粒子的信号，
在上述检测工序中，各载体粒子未被隔区化，
在上述检测工序中，基于上述能互相区别的信号，区别检测上述第一受试物质及上述第二受试物质。
31.权利要求30所述的方法，其中上述能互相区别的信号基于上述载体粒子的平均粒径。
32.权利要求30所述的方法，其中上述能互相区别的信号基于固定于上述载体粒子的反应产物。
33.权利要求32所述的方法，其中
上述能互相区别的信号是荧光，
上述第一受试物质及上述第二受试物质基于固定了反应产物的载体粒子的荧光强度或荧光波长进行区别。
34.权利要求1～33之任一项所述的方法，其中上述第一捕获物质及上述第二捕获物质是抗体。
35.权利要求1～34之任一项所述的方法，其中受试物质是抗体、核酸、生理活性物质、囊泡、细菌、病毒、多肽、半抗原、治疗药剂或治疗药剂的代谢物。
36.权利要求35所述的方法，其中上述囊泡是外泌体。
37.在权利要求1～36之任一项所述的受试物质的检测方法中使用的试剂盒，其含：
多个载体粒子，
上述第一捕获物质，
上述第二捕获物质，
上述催化剂，和
上述底物。
38.权利要求37所述的试剂盒，其还含检测用粒子。
39.权利要求37或38所述的试剂盒，其中上述底物含支持体和多个底物分子。
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