CN112730835A - 一种chi3l1/ln检测卡、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CHI3L1/LN检测卡、其制备方法和应用，属于纳米材料和纳米医学领域，其中所述采用的稀土纳米探针为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，粒径为20nm～30nm，其组成为：NaErF4@NaYF4，其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。本发明的纳米探针为稀土氟化物纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将探针与抗体连接，标记产物稳定，具有灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可辅助医生判断患者在早期是否肝纤维化。

Description

一种CHI3L1/LN检测卡、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料和纳米医学领域，尤其是一种CHI3L1/LN检测卡、其制备方法和应用。
背景技术
肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，同时也是排列全球第三位的肿瘤相关致死原因。其发病率在我国仅次于肺癌，居第二位。我国每年约33万人死于肝癌，病死率高。肝癌中＞70％的人合并有肝硬化，而肝硬化患者有50％左右可进展为肝癌。肝纤维化导致的肝硬化被定义为肝纤维化的晚期阶段，由肝纤维化发展至肝硬化是一个连续的动态发展过程，且肝纤维化和早期肝硬化是可逆的，因此，早期发现肝纤维化并及时治疗，将肝纤维化控制在可逆阶段，至关重要。
CHI3L1基因位于人类染色体1q32.1，包含7948个碱基和10个外显子，其序列高度保守。CHI3L1为糖基水解酶家族成员之一，能结合壳多糖，但无壳多糖的活性，在炎症和组织重塑中起重要作用。CHI3L1在肝纤维化进展中具有多重角色：激活星状细胞的活化与增殖，参与纤维化细胞的形成；其催化区域能和IL-13Rα2的胞外区域特异性地结合，调节部分细胞反应，促进胶原蛋白等肝纤维化蛋白的产生；作为分泌的细胞外基质蛋白的组成部分，参与纤维化的形成，同时，通过信号通路，形成正向反馈，加速纤维化的进程。
近年来，大量的研究表明：YKL-40是一种功能强大的纤维化标志物，具有较高的诊断准确性，尤其是在HCV相关肝病中。它的测定可证实和提高诊断准确性，尤其是在肝纤维化的早期阶段；并且YKL-40血清标志物可预测晚期纤维化和肝硬化。随着肝纤维化程度的加重而增加。
肝纤维化的形成包含了三个方面，分别是肝损伤因子、细胞因子改变、细胞外基质代谢异常并组织重建；而肝纤维的异常沉积的细胞外机制有常常包含了胶原蛋白(I、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ)、蛋白多糖(HA)、糖蛋白(FN、LN、VN等)，因此当前认为具有诊断价值的指标为血清血清PCⅢ，HA，LN等。PCⅢ作为反应间质胶原合成的重要指标，其一个重要特点便可以在细胞外胶原纤维形成时或者形成以后依然保留着氨基酸的肽链，而随着胶原纤维的不断形成，这些没有被清除的肽段便开始脱离前胶原，并且以游离片段的形势出现在外周血中，并随着胶原纤维合成的活跃而不断增多。因此可以认为PCⅢ跟肝纤维化的活动存在密切相关性，并且在肝纤维化胶原合成时，早期主要主要为Ⅲ型。HA作为ECM中最重要的糖胺多糖成分，在肝纤维化早期，血清中的HA呈现出显著增加。HA不仅可以当作是反映肝纤维化的敏感指标，而且还能够直接反映肝功能的损伤程度
因此，将CHI3L1、LN、HA、PCⅢ等其他血清肝纤维化指标进行联合检测可提高肝纤维诊断的准确性和可靠性。现有技术中肝纤维化标志物仅针对单一的指标有LN、CHI3L1，检测方法主要有免疫比浊法、荧光免疫层析法、胶体金法等。其中胶体金法具有操作简单快速的优点，但灵敏度低且定量不准确；免疫比浊法较为敏感、准确，可应用于全自动生化仪，但需要仪器且耗时较长，适合处理大量样本，无法满足快速检测的目的；免疫荧光法是将抗体共价结合于荧光微球表面活性基团上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断结果，快速便捷可准确定量同时具有高灵敏度、标记物稳定等优点，在医学免疫检测领域广泛应用。
稀土纳米探针具有荧光寿命长、发射峰半峰宽很窄和Stokes位移大等光学特性，在检测中能够有效降低背景荧光的干扰，能够实现高灵敏度的分析检测，同时还能够进行多标记，实现同时检测样品中的多种物质。不仅如此，稀土纳米探针还具有高光化学稳定性、生物兼容性等特点，能够保证检测过程信号的稳定性，提高检测灵敏度，已经在体外诊断领域得到了广泛的应用。
因此拟基于稀土纳米探针优异的光学特性和生物兼容性，开发一种具有灵敏度高、快速测定血液中CHI3L1/LN、检测准确度高的试剂盒及方法具有重要意义。
发明内容
发明目的：提供一种CHI3L1/LN检测卡、其制备方法和应用，以解决背景技术中所涉及的问题。
技术方案：本发明提供一种CHI3L1/LN检测卡，包括：
底衬；作为所述CHI3L1/LN检测卡的基底；
包被膜；设置于所述底衬上表面的中部；
结合垫：搭接设置于所述包被膜的上表面的一端；
样品垫；搭接设置于所述结合垫的上表面的一端；
吸水纸；搭接设置于所述包被膜的上表面的另一端；
其中，所述结合垫喷涂有微球线，所述微球线为稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体；所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫；所述检测线包被有LN抗体2、CHI3L1抗体2，质控线包被有羊抗兔IgG抗体。
优选地，所述稀土纳米探针为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，其组成为：NaErF4@NaYF4；其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。
优选地，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。
优选地，所述稀土纳米探针的制备活化方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入油酸、1-十八烯、铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaErF4纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
优选地，所述结合垫上喷涂的稀土纳米探针标记的LN、CHI3L1、兔IgG抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
优选地，所述检测线中LN抗体2和CHI3L1抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
本发明还提供一种CHI3L1/LN检测卡的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：根据权利要求3所述的制备方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体：对步骤一的活化稀土纳米探针按照50～200μg/200μl加入LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用CHI3L1抗体2、LN抗体2和羊抗兔IgG抗体作为检测线T1、T2线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备结合垫：用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上用稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体喷涂一条线，烘干；
步骤五：制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
步骤六：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述CHI3L1/LN检测卡。
优选地，所述步骤三中，用微球稀释液将稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球稀释液为含0.5％BSA、10％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
本发明还提供一种CHI3L1/LN检测卡在制备肝纤维化检测药物或材料上的应用。
优选地，所述肝纤维化检测药物或材料为CHI3L1/LN检测试剂盒，其包括：
CHI3L1/LN检测卡；
含有定标曲线的ID卡，由CHI3L1/LN检测卡测定不同抗原浓度的质控品，以质控品抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
本发明还提供一种CHI3L1/LN检测试剂盒定量检测CHI3L1/LN的方法，包括以下步骤：
步骤一：以血清/血浆/全血样本作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将血液样本加入到CHI3L1/LN检测卡加样孔中；
步骤四：将CHI3L1/LN检测卡插入干式荧光免疫分析仪的检测槽；
步骤五：干式荧光免疫分析仪进行分析，15min读取/打印检测结果，其中LN>140ng/ml，CHI3L1>34ng/ml提示患者肝有纤维化的可能。
有益效果：本发明涉及一种CHI3L1/LN检测卡、其制备方法和应用，本发明的原理在于：本试剂采用荧光免疫层析原理，检测人血清、血浆和全血中的LN、CHI3L1水平。含LN、CHI3L1的血液样本稀释液层析至结合垫，与稀土纳米荧光微球标记的LN、CHI3L1抗体结合形成反应复合物，反应复合物在层析作用下沿着NC膜前移，移至检测线处，分别被检测线包被的LN抗体2和CHI3L1抗体2捕获，形成最终反应复合物。用光源(808nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上稀土纳米探针发出荧光(670nm)，在此荧光范围内生物体自发荧光较弱。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1～10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
采用了上述技术方案后，本发明具有积极的效果：
(1)本发明的纳米探针为稀土氟化物纳米材料，具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将探针与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
(2)稀土掺杂纳米材料具有稳定的物理化学性质，窄带发射，宽Stokes位移，长寿命等优点，从而排除激发光干扰，可通过时间分辨延迟检测消除本底荧光干扰，在生物标记过程中不容易受环境影响。稀土发光材料尤其是稀土氟化物具有较低的声子能量，且物理化学性能稳定，适合于稀土发光材料的基质材料，它能减少激活离子激发态的无辐射驰豫从而提高激活离子的发光效率。因此采用稀土氟化物纳米粒子作为标记物，发光寿命长，激发波长为808nm，发射波长为540nm、670nm和1540nm，同时具有近红外及可见光三发射可避免激发光源的干扰，同时结合时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和准确性，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
(3)本发明利用稀土氟化物作为基质，通过不同稀土离子的掺杂，合成了高性能的氟化铒钠包覆氟化钇钠纳米探针，全铒掺杂的纳米材料通过表面包覆一层氟化钇钠壳层，提高能量转化的效率，具有高灵敏度的特点，方便了其检测，故而制备出了光化学性质稳定强、发光寿命长的稀土纳米探针。
(4)本发明利用NaErF4@NaYF4纳米稀土颗粒的上转换发光特性，制成生物示踪颗粒，应用于体外诊断试剂，与传统的稳定态发光检测技术相比，由于信号/噪声比显著增大，其检测灵敏度大大提高。在肝纤维化细胞检测中，由于上转发光现象产生于晶体结构内部，完全避免发光淬灭；具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
附图说明
图1为本发明的CHI3L1/LN检测卡的结构示意图。
图2为NaErF4@NaYF4稀土纳米探针在808nm激发下的荧光光谱图。
图3为NaErF4@NaYF4稀土纳米探针透射电镜图，纳米探针粒径在20-30nm。
图4为发明的CHI3L1/LN二联检测试剂盒CHI3L1质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制的标准曲线图。
图5为发明的CHI3L1/LN二联检测试剂盒LN质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制的标准曲线图。
图6为本发明的CHI3L1/LN二联检测试剂盒与杭州普望生物技术有限公司酶联免疫吸附法检测CHI3L1试剂盒对同一样本的检测结果对比曲线图。
图7为本发明的CHI3L1/LN二联检测试剂盒与北京热景生物技术有限公司上转发光发检测LN试剂盒对同一样本的检测结果对比曲线图。
附图标记为：底衬1、样品垫2、结合垫3、微球线31、包被膜4、检测线T1 41、检测线T2 42、质控线43、吸水纸5。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
本发明通过采用荧光免疫层析原理，检测人血清、血浆和全血中的LN、CHI3L1水平。含LN、CHI3L1的血液样本稀释液层析至结合垫，与稀土纳米荧光微球标记的LN、CHI3L1抗体结合形成反应复合物，反应复合物在层析作用下沿着NC膜前移，移至检测线处，分别被检测线包被的LN抗体2和CHI3L1抗体2捕获，形成最终反应复合物。用光源(808nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上稀土纳米探针发出荧光(670nm)，在此荧光范围内生物体自发荧光较弱。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1～10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
如附图1所示，一种CHI3L1/LN检测卡，包括：底衬1、样品垫2、结合垫3、微球线31、包被膜4、检测线T1 41、检测线T2 42、质控线43、吸水纸5。
其中，底衬1作为所述CHI3L1/LN检测卡的基底；包被膜4设置于所述底衬上表面的中部；结合垫3搭接设置于所述包被膜4的上表面的一端；样品垫2搭接设置于所述结合垫3的上表面的一端；吸水纸5搭接设置于所述包被膜4的上表面的另一端；所述结合垫3喷涂有微球线，所述微球线为稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体；所述包被膜4上依次设置有检测线T1 41、检测线T2 42和质控线43，所述检测线靠近所述结合垫3；所述检测线T1 41包被有LN抗体2、所述检测线T2 43包被有CHI3L1抗体2，质控线43包被有羊抗兔IgG抗体。
由于采用上转发光技术，通过不同稀土离子的掺杂，合成全铒掺杂核结构，由于晶格中纳米级颗粒构成的独特结构，可由红外光激发而发射上转发光，与LN抗体1、CHI3L1抗体1配合，通过扫描分析光电信号，实现对目标抗原或抗体的现场快速检测。在肝纤维化检测中，由于上转发光现象产生于晶体结构内部，完全避免发光淬灭；具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
在进一步实施例中，所述稀土纳米探针为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，其组成为：NaErF4@NaYF4；其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。利用采用稀土氟化物作为基质，通过不同稀土离子的掺杂，合成了高性能的氟化铒钠包覆氟化钇钠纳米探针，全铒掺杂的纳米材料通过表面包覆一层氟化钇钠壳层，提高能量转化的效率，具有高灵敏度的特点，方便了其检测，故而制备出了光化学性质稳定强、发光寿命长的稀土纳米探针。
在进一步实施例中，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。采用稀土氟化物纳米粒子作为标记物，发光寿命长，激发波长为808nm，发射波长为540nm、670nm和1540nm，同时具有近红外及可见光三发射可避免激发光源的干扰，同时结合时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和准确性，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
在进一步实施例中，所述稀土纳米探针的制备活化方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入油酸、1-十八烯、铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaErF4纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
在进一步实施例中，所述结合垫上喷涂的稀土纳米探针标记的LN、CHI3L1、兔IgG抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
在进一步实施例中，所述检测线中LN抗体2和CHI3L1抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
本发明还提供一种CHI3L1/LN检测卡的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：根据权利要求3所述的制备方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体：对步骤一的活化稀土纳米探针按照50～200μg/200μl加入LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用CHI3L1抗体2、LN抗体2和羊抗兔IgG抗体作为检测线T1、T2线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备结合垫：用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上用稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体喷涂一条线，烘干；
步骤五：制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
步骤六：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述CHI3L1/LN检测卡。
优选地，所述步骤三中，用微球稀释液将稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球稀释液为含0.5％BSA、10％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
本发明还提供一种CHI3L1/LN检测卡在制备肝纤维化检测药物或材料上的应用。
在进一步实施例中，所述肝纤维化检测药物或材料为CHI3L1/LN检测试剂盒，其包括：
CHI3L1/LN检测卡；
含有定标曲线的ID卡，由CHI3L1/LN检测卡测定不同抗原浓度的质控品，以质控品抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
本发明还提供一种CHI3L1/LN检测试剂盒定量检测CHI3L1/LN的方法，包括以下步骤：
步骤一：以血清/血浆/全血样本作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将血液样本加入到CHI3L1/LN检测卡加样孔中；
步骤四：将CHI3L1/LN检测卡插入干式荧光免疫分析仪的检测槽；
步骤五：干式荧光免疫分析仪进行分析，15min读取/打印检测结果，其中LN>140ng/ml，CHI3L1>34ng/ml提示患者肝有纤维化的可能。
下面结合实施例，对本发明作进一步说明，所述的实施例的示例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
(实施例1)
本实施例的稀土纳米探针，为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，粒径为20nm～30nm，其组成为：
NaErF4@NaYF4，其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。
进一步的，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。NaErF4@NaYF4稀土纳米探针在808nm激发下的荧光光谱图，如图2所示。NaErF4@NaYF4稀土纳米探针透射电镜图，如图3所示。
制备本实施例的稀土纳米探针的方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入体积比为3～6：7～14的油酸和1-十八烯，再按摩尔比例，加入1份铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物；在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至100～120℃，反应20～30分钟，再升温至150～160℃，反应10～15分钟，得到透明溶液；自然冷却至40～50℃，释放真空，加入摩尔浓度比为1～2：1.6～3.4的NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～300℃，反应1～2小时，离心处理，随后用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入体积比为3～6：7～14油酸和1-十八烯，加入醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，以及与油酸体积比为3～6：2～4的NaErF4纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～290℃，反应1～2小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；所述醋酸钇、NaOH、氟化铵物质的量之比为0.2～0.4：0.5～1：0.8～1.6；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行1～2min的超声波处理和离心处理(12000～14000rpm高速)，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，超声波处理2～3min；加入20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后12000～14000rpm高速离心5～15min，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
(实施例2)
如图1所示，本实施例的CHI3L1/LN检测卡，包括：
底衬1；作为所述CHI3L1/LN检测卡的基底；
包被膜4；设置于所述底衬1上表面的中部；
结合垫3：搭接设置于所述包被膜4的上表面的一端
样品垫2；搭接设置于所述结合垫3的上表面的一端；
吸水纸4；搭接设置于所述包被膜3的上表面的另一端；
其中，所述结合垫3喷涂有微球线31，所述微球线31为实施例1提供的稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体；所述包被膜4上依次设置有检测线T1 41、检测线T2 42和质控线43，所述检测线41靠近所述结合垫3，检测线T141、检测线T2 42和质控线43相互平行，间隔距离为3～5mm；所述检测线T1 41包被有CHI3L1抗体2，检测线T2 42包被有LN抗体2、质控线43包被有羊抗兔IgG抗体。
进一步的，所述结合垫3上喷涂的稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
更近一步的，所述检测线T1 41中CHI3L1抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，检测线T2 42中LN抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜所述质控线32中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
制作完成后，将其固定在与检测卡尺寸匹配的塑料底卡上，检测卡表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫2和包被膜3的部分分别预留加样孔和观察窗。
制备本实施例的CHI3L1/LN检测卡的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据实施例1提供的方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体：对步骤一的活化稀土纳米探针超声波处理1～2min后按照50～200μg/200μl加入LN/CHI3L1/兔IgG，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后12000～14000rpm高速离心5～15min，用含1％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用CHI3L1抗体2、LN抗体2和羊抗兔IgG抗体作为检测线T1、检测线T2和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用包被缓冲液将CHI3L1抗体2、LN抗体2和羊抗兔IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔3～7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
步骤四：制备结合垫：用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上将稀土纳米探针标记的LN、CHI3L1、兔IgG抗体用微球稀释液稀释8～30倍均匀喷涂一条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述微球稀释液为含0.5％BSA、10％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
步骤五：制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
步骤六：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述CHI3L1/LN检测卡。
(实施例3)
本实施例的CHI3L1/LN检测试剂盒，包括：
CHI3L1/LN检测卡：采用实施例2所提供的CHI3L1/LN检测卡；
含有定标曲线的ID卡：由CHI3L1/LN检测卡测定不同抗原浓度的质控品，以质控品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。
本实施例的CHI3L1/LN检测试剂盒定量检测CHI3L1、LN的方法，包括以下步骤：
步骤一：以血清/血浆/全血样本作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：使用合适量程的移液器吸取80μl待测血清/血浆/120μl全血样本加入到检测卡加样孔中，吸取及加样时注意不要产生明显气泡。
步骤四：将检测卡插入检测槽，按“检测”键，检测仪将自动对检测卡进行扫描(请严格控制加样后到检测的时间15min)。读取/打印检测结果，其中LN>140ng/ml，CHI3L1>34ng/ml提示患者肝有纤维化的可能。
(实施例4)
本实施例进行具体的实例试验并进行测定。
与实施例2的CHI3L1/LN检测卡结构一致，结合垫上微球线上使用特定的激发光(808nm)/发射光(670nm)波长的壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠纳米探针颗粒(NaErF4@NaYF4)(直径约20-30nm)标记LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体(100μg抗体/200μl纳米探针)，检测线包被CHI3L1抗体2和LN抗体2(0.5mg/ml)，质控线包被浓度为1mg/ml的羊抗兔IgG抗体。微球线用量为4μl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为1μl包被液量/cm膜。
在本实施例中，CHI3L1/LN检测试剂盒的制备包括以下步骤：
(1)氟化铒钠核结构合成：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入4.5mL油酸和12.5mL 1-十八烯，再按摩尔比例，加入1mmol醋酸铒，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入2.5mmol NaOH和4mmol氟化铵甲醇混合溶液，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至300℃，反应1.5小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于4mL环己烷中。
(2)核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠纳米探针的制备：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入3mL油酸和7mL1-十八烯，加入0.5mmol醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入1.25mmol NaOH和2mmol氟化铵甲醇混合溶液，2mL NaErF4纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至300℃，反应1小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米荧光探针。所述材料尺寸约为20nm，且形貌均一，发光性能好。纳米探针激发波长为808nm，发射波长为540nm、670nm和1540nm。
(3)稀土纳米探针的活化：
超声波处理稀土纳米探针2min后，取200μl纳米探针以14000rpm高速离心15min后，沉淀物用100mM，pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入50μl的100mg/ml碳二亚胺，混匀5min，再加入100μl的100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀15min后14000rpm高速离心15min，沉淀用pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml。
(4)稀土纳米探针标记LN、CHI3L1抗体的制备：
在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照100μg/200μl加入LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体，混匀2小时，用含0.5％BSA的50mM、pH8.0Tris-HCl封闭液封闭1小时后14000rpm高速离心15min，用含1％(w/w)Nacl、0.5％(w/w)BSA、0.1％(w/w)Tween-20的50mM、pH8.0的Tris-HCl保存液中缓冲液洗涤两次并超声处理重悬至200μl于4℃避光保存。
(5)包被膜的制备：
分别用包被缓冲液(含2.5％(w/w)蔗糖的20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液)将CHI3L1抗体2、LN抗体2调整浓度到0.5mg/ml，羊抗兔IgG抗体调整浓度到1mg/ml，用量为1μl包被液量/cm膜，分别作为检测线T1、检测线T2和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线T1和检测线T2间隔4mm，在湿度<30％，温度45℃烘箱中烘干过夜，封袋，备用；
(6)结合垫的制备：
用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上将稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体用微球稀释液(含0.5％(w/w)BSA、10％(w/w)蔗糖的2mM硼酸缓冲液)稀释20倍均匀喷涂一条线，用量为4μl液量/cm样品垫。置于烘箱中，37℃烘干过夜。
(7)制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
(8)检测卡组装：
在底衬(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(尺寸为22*300mm，玻璃纤维棉材质)、结合垫(尺寸为10*300mm，玻璃纤维棉材质)、被膜(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的试纸条。
本发明CHI3L1/LN检测卡在使用时由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳设有两个开孔，分别为加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫2，塑料下壳上设置有固定检测试纸条的卡口，结果观察窗对应于检测线T1 41、检测线T2 42和质控线43，该CHI3L1/LN检测卡可以从该塑料外壳中取出。
CHI3L1/LN检测试剂盒中，每盒均含有标准曲线的ID卡(同批次标准曲线相同)，通过稀土纳米荧光试纸条测定不同抗原浓度的质控品，以质控品抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入ID卡并生成二维码，通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。
下面详细介绍标准曲线的绘制
在制备好的稀土纳米荧光试纸卡加入不同浓度CHI3L1/LN抗原质控品(每个浓度设三个重复，均由CHI3L1/LN抗原用20％小牛血清稀释得到)，加样层析15min后，通过激发光(808nm)/发射光(670nm)的稀土纳米荧光免疫分析仪读取C、T线荧光信号及C/T值。
实验结果及分析见表1和表2：
表1 CHI3L1标准曲线
Figure BDA0002933160630000151
表2 LN标准曲线
Figure BDA0002933160630000152
以抗原浓度和样本信号T/C平均值绘制标准曲线，曲线数据见表1和表2，标准曲线如图4至图5所示。其中CHI3L1/LN R值分别为0.9989、0.9987，通过该标线对样品中所含CHI3L1/LN浓度进行浓度定量测定。下面对CHI3L1/LN检测卡进行性能测试：
(1)最低检出限：用零值样本进行重复测定20次，计算20次结果的均值M与标准差SD，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限(M+2SD)，CHI3L1/LN结果分别为1.43ng/mL、4.43ng/mL，分别符合灵敏度标准1.5ng/mL、5ng/ml。
(2)线性范围：分别取CHI3L1 1.5～800ng/mL、LN 5～1000ng/mL之间六个浓度值，每个浓度重复测量三次，将测定浓度平均值于理论浓度进行线性分析，得到CHI3L1线性方程y＝0.0025x+0.035，r＝0.9988；LN线性方程y＝0.0024x-0.0027，r＝0.9987；表明本发明的CHI3L1/LN检测试剂盒在线性范围内相关性很好。
(3)精密度：取三批本实施例的试剂盒，分别检测重复性质控品三批批内CV，每批试剂盒用重复性质控品平行检测10次，其中CHI3L1 5ng/ml三批批内CV分别为5.91％、8.46％、9.32％，批间CV为8.12％，100ng/mL三批批内CV分别为7.09％、9.08％、8.87％，批间CV为8.14％；LN 10ng/mL三批批内CV分别为7.61％、5.80％、7.02％，批间CV为7.86％，100ng/mL三批批内CV分别为9.21％、7.50％、7.76％，批间CV为8.92％；均在10％以内。
(4)准确度：选择基础样本的质控物为检测样本，分为体积相同3份，在其中2份样本中分别加入不同浓度的准确度质控品，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶液，制成基础样本。对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算。计算回收率＝(分析样品浓度-基础样品浓度)/加入浓度×100％。CHI3L1回收样本20ng/mL的回收率为96.87％，400ng/mL的回收率为95.94％，平均回收率为103.23％；LN回收样本50ng/mL的回收率为96.18％，500ng/mL的回收率为103.86％，平均回收率为96.84％。偏差在10％以内。
本实施例的CHI3L1/LN检测试剂盒的临床样本检测如下：
采集医院检测CHI3L1/LN血液样本各100份，用本发明的试剂盒分别和杭州普望生物技术有限公司酶联免疫吸附法检测CHI3L1试剂盒、北京热景生物技术有限公司上转发光发检测LN试剂盒进行检测比较。本发明试剂盒中，取血液样本80μl加入到检测卡加样孔中，层析15min后通过稀土纳米荧光免疫分析仪读取浓度，同一样本分别采用对比系统杭州普望生物技术有限公司酶联免疫吸附法检测CHI3L1试剂盒、北京热景生物技术有限公司上转发光发检测LN试剂盒进行浓度检测。对检测结果进行线性分析，如图6至图7所示，其相关性很好，CHI3L1R＝0.9934,LN R＝0.9929，P>0.05，平均相对偏差小于10％，结果符合临床分析要求，适合用于临床检测。
综上所述，本发明的试剂盒利用稀土纳米荧光免疫层析技术的灵敏性，结合干式免疫荧光分析仪，实现了高灵敏度、可准确定量、简便快捷的定量检测CHI3L1/LN抗体。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种CHI3L1/LN检测卡，其特征在于，包括：
底衬；作为所述CHI3L1/LN检测卡的基底；
包被膜；设置于所述底衬上表面的中部；
结合垫：搭接设置于所述包被膜的上表面的一端；
样品垫；搭接设置于所述结合垫的上表面的一端；
吸水纸；搭接设置于所述包被膜的上表面的另一端；
其中，所述结合垫喷涂有微球线，所述微球线为稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体；所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫；所述检测线包被有LN抗体2、CHI3L1抗体2，质控线包被有羊抗兔IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的CHI3L1/LN检测卡，其特征在于，所述稀土纳米探针为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，其组成为：NaErF4@NaYF4；
其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。
3.根据权利要求2所述的CHI3L1/LN检测卡，其特征在于，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。
4.根据权利要求1所述的CHI3L1/LN检测卡，其特征在于，所述稀土纳米探针的制备活化方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入油酸、1-十八烯、铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaErF4纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
5.根据权利要求1所述的CHI3L1/LN检测卡，其特征在于，所述结合垫上喷涂的稀土纳米探针标记的LN、CHI3L1、兔IgG抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
6.根据权利要求1所述的CHI3L1/LN检测卡，其特征在于，所述检测线中LN抗体2和CHI3L1抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
7.一种基于权利要求1至6任一项所述CHI3L1/LN检测卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：根据权利要求3所述的制备方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体：对步骤一的活化稀土纳米探针按照50～200μg/200μl加入LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用CHI3L1抗体2、LN抗体2和羊抗兔IgG抗体作为检测线T1、T2线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备结合垫：用结合垫处理液含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜，在结合垫上用稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体喷涂一条线，烘干；
步骤五：制备样本垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、1％蔗糖、0.5％Tween-20、0.5％BSA的50mM、pH8.0的Tris-HCl浸泡结合垫37度烘干过夜；
步骤六：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述CHI3L1/LN检测卡。
8.根据权利要求7所述的CHI3L1/LN检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，用微球稀释液将稀土纳米探针标记的LN抗体1、CHI3L1抗体1、兔IgG抗体稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球稀释液为含0.5％BSA、10％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
9.一种基于权利要求1至6任一项所述的CHI3L1/LN检测卡在制备肝纤维化检测药物或材料上的应用。
10.根据权利要求9所述的CHI3L1/LN检测卡在制备肝纤维化检测药物或材料上的应用，其特征在于，所述肝纤维化检测药物或材料为CHI3L1/LN检测试剂盒，其包括：
CHI3L1/LN检测卡；
含有定标曲线的ID卡，由CHI3L1/LN检测卡测定不同抗原浓度的质控品，以质控品抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
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