CN107064007B - 时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板及其制备和使用方法。时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板包括黑色酶标板；黑色酶标板上设有96个酶标孔；96个酶标孔中均含有稀土荧光固态物质。时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺，包括以下步骤：(1)将不同量的稀土金属溶液与增强剂、交联剂、单体、溶剂和引发剂混合均匀；(2)将混合后的溶液等体积的加入96个酶标孔中；(3)采用热引发或者紫外光照引发的方式，使酶标孔中的固体荧光材料聚合成具有一定刚性的稀土荧光固态物质。

Description

时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板及其制备和使用方法
技术领域
本发明涉及时间分辨荧光分析技术领域，特别是涉及一种评价时间分辨荧光酶标分析仪性能指标及计量特性的测试标准板。
背景技术
荧光是物质受激辐射产生的一种发光现象。当物质分子受到特定波长的光源照射时，分子吸收光子并使得处于基态的电子受激跃迁到激发态，处于激发态的电子不稳定，在跃迁回基态的过程中多余的能量以光子的形式释放出来，从而产生发光现象。通过此种方式发出的光称为荧光。
时间分辨荧光分析法(TRFIA)实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析时激发光与发射光不在同一直线上，通常呈90°，而且发射波长与激发波长之间存在一个位移，因此荧光分析方法可以克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。但是，激发光的杂散光仍然会成为提高分析特异性与灵敏度的瓶颈。为了消除杂散光的影响，提出了时间分辨荧光分析方法，该方法利用了稀土金属荧光(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长而普通荧光标志物荧光寿命非常短的特点，在激发光照射后当激发光消失时，普通荧光标志物的荧光也随之消失，但是稀土金属的荧光寿命较长，可达1～2ms，因此在激发光停止以后等待几十到几百微秒以后再接收发射光路上的荧光信号，就可以克服样品背景荧光的影响，实现高灵敏、高特异性的分析。在各种稀土金属中，最常用的稀土金属是铕(Eu)和铽(Tb)，Eu荧光寿命可达1ms，但是它在水中不稳定，加入增强剂后可以克服。
时间分辨荧光酶标分析仪是利用时间分辨荧光现象进行物质定性和定量分析仪的仪器，它具有背景干扰小、灵敏度高的特点。时间分辨荧光酶标分析仪综合了免疫反应的高特异性、酶标分析仪的高通量和荧光信号高灵敏度的优势，克服了样品背景荧光信号的干扰，近年来在食品安全、临床检验等领域得到了广泛的应用。时间分辨荧光酶标分析仪通常一板可以进行96或384个样品的检测，并且可以使用第三方检测试剂。
时间分辨荧光酶标分析仪检测过程和原理一般如下：首先在酶标板中包被上抗体，然后将待检测的样本加入到酶标孔中，样本中的待测化合物就被包被在酶标孔上的特异性抗体捕获，经过洗涤后再次加入稀土金属标记的检测抗体，检测抗体与结合在捕获抗体上的目标物再次结合，形成“夹心汉堡式”的结构。接着经过洗涤后通过时间分辨荧光酶标仪检测抗体上标记的Eu的时间分辨荧光信号。荧光强度与产物的量正相关，产物的量与待检测样本中目标化合物的含量正相关。因此，可以根据反应后酶标孔中荧光信号的强度判定待测样品中目标化合物的含量。
时间分辨荧光酶标分析仪检测结果的准确度与仪器的计量性能密切相关，这些计量性能包括发射波长准确度、激发波长准确度、灵敏度、重复性、线性等指标，这些计量性能指标的确认和校准必须通过计量标准来实现。时间分辨荧光酶标分析仪从光学结构原理上多采用滤光片作为分光元件，滤光片的波长准确度可以将滤光片拆下来在经过计量检定合格的紫外分光光度计上进行检测校准。但是灵敏度、重复性、线性等计量性能指标的计量标准较为欠缺，也没有制定相应的仪器检定规程或校准规范，无法进行仪器的检定或校准，仪器分析测量结果的质量难以保证，研制时间分辨荧光酶标分析仪的计量标准成为当务之急。
发明内容
本发明的第一目的是要填补现有时间分辨荧光酶标分析仪计量标准的空白，提供一种高稳定性、免维护、易于操作、价格便宜的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板，对时间分辨荧光酶标仪的灵敏度、重复性和线性等计量性能指标进行检定和校准。
本发明的第二目的是提供一种时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺。
本发明的第三目的是提供一种时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的使用方法。
时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板，包括黑色酶标板；黑色酶标板上设有96个酶标孔；所述96个酶标孔中均含有稀土荧光固态物质。
本发明所述的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板，其中，所述稀土荧光固态物质中含有稀土金属及增强剂。
本发明所述的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板，其中，所述稀土荧光固态物质为长寿命稀土荧光固态物质。
本发明所述的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板，其中，所述稀土荧光固态物质的基体为高分子聚合物，采用共聚法在酶标孔中直接聚合而成。
本发明所述的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板，其中，所述96个酶标孔呈8行12列的矩形阵列均匀分布。
时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺，包括以下步骤：
(1)将不同量的稀土金属溶液与增强剂、交联剂、单体、溶剂和引发剂混合均匀；
(2)将混合后的溶液等体积的加入96个酶标孔中；
(3)采用热引发或者紫外光照引发的方式，使酶标孔中的固体荧光材料聚合成具有一定刚性的稀土荧光固态物质。
本发明所述的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺，其中，当采用热引发时，选用偶氮二异丁腈、过氧化二酰或过硫酸盐作为引发剂，在40℃～100℃温度区间引发自由基聚合反应。
本发明所述的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺，其中，当采用紫外光照引发时，选用安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚、安息香丁醚、二苯基乙酮或α，α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮引发聚合反应。
本发明所述的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺，其中，所述稀土金属溶液为包含有Eu、Tb、Sm、Dy元素中的一种或几种的溶液；所述增强剂为β-萘甲酰三氟丙酮、三辛基氧化膦和Triton X-100；所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯；所述单体为甲基丙烯酸；所述溶剂为甲醇或乙腈-水；所述引发剂为热引发剂或光引发剂；
用量比例分别为10mmol稀土元素、15mmolβ-萘甲酰三氟丙酮、50mM三辛基氧化膦和1mL Triton X-100，4mmol的甲基丙烯酸，10mL的甲醇或乙腈-水，20mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈。
时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的使用方法，采用稀土金属溶液国家标准物质作为标准，采用经过计量检定合格的荧光分光光度计对制备的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板各个酶标孔中的稀土荧光固态物质的荧光强度进行测定，采用标准曲线法计算出各个酶标孔的等效稀土金属浓度，作为该测试标准板的标准值。
本发明的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板及其制备和使用方法与现有技术相比，其突出效果在于：
(1)本发明填补了现有时间分辨荧光酶标分析仪计量标准的空白，提供了一种高稳定性、免维护、易于操作、价格便宜的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板，可对时间分辨荧光酶标仪的灵敏度、重复性和线性等计量性能指标进行检定和校准。
(2)本计量标准采用固态时间分辨荧光形式，与采用溶液形式及电子电路模拟时间分辨荧光信号的校准方式相比，时间分辨荧光信号重复性更好，稳定性更高。
(3)本计量标准可多次重复使用，使用之前无需进行溶液配制、加注等操作，减少了使用环节引入的不确定度。
下面结合附图说明及具体实施例对本发明的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板及其制备和使用方法作进一步说明。
附图说明
图1为时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的结构示意图；
图2为酶标孔的结构示意图。
具体实施方式
实施例1
结合图1-2所示，时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板，包括黑色酶标板(1)，材质为聚苯乙烯；黑色酶标板(1)上设有96个酶标孔(2)；所述96个酶标孔(2)中均含有稀土荧光固态物质(3)。
稀土荧光固态物质(3)中含有稀土金属及增强剂，为长寿命稀土荧光固态物质。稀土荧光固态物质(3)的基体为高分子聚合物，采用共聚法在酶标孔(2)中直接聚合而成。
96个酶标孔(2)呈8行12列的矩形阵列均匀分布。
实施例2
时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺，包括以下步骤：
(1)将不同量的稀土金属溶液与增强剂、交联剂、单体、溶剂和引发剂混合均匀；
(2)将混合后的溶液等体积的加入96个酶标孔中；
(3)采用热引发或者紫外光照引发的方式，使酶标孔中的固体荧光材料聚合成具有一定刚性的稀土荧光固态物质。
当采用热引发时，选用偶氮二异丁腈、过氧化二酰或过硫酸盐作为引发剂，在40℃～100℃温度区间引发自由基聚合反应。
当采用紫外光照引发时，选用安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚、安息香丁醚、二苯基乙酮或α，α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮引发聚合反应。
所述稀土金属溶液为包含有Eu、Tb、Sm、Dy元素中的一种或几种的溶液；所述增强剂为β-萘甲酰三氟丙酮、三辛基氧化膦和Triton X-100；所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯；所述单体为甲基丙烯酸；所述溶剂为甲醇或乙腈-水；所述引发剂为热引发剂或光引发剂；
用量比例分别为10mmol稀土元素、15mmolβ-萘甲酰三氟丙酮、50mM三辛基氧化膦和1mL Triton X-100，4mmol的甲基丙烯酸，10mL的甲醇或乙腈-水，20mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈。
实施例3
时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的使用方法：采用稀土金属溶液国家标准物质作为标准，采用经过计量检定合格的荧光分光光度计对制备的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板各个酶标孔中的稀土荧光固态物质的荧光强度进行测定，采用标准曲线法计算出各个酶标孔的等效稀土金属浓度，作为该测试标准板的标准值。
当用于重复性指标计量测试时，在时间分辨荧光酶标分析仪中按照使用的稀土金属的激发和发射波长进行测定，设置合适的检测增益、分析时间和荧光积分时间，对时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板某一酶标孔的时间分辨荧光强度重复测定6次，计算相对标准偏差作为重复性的表征。
当用于线性指标计量测试时，在时间分辨荧光酶标分析仪中按照使用的稀土金属的激发和发射波长进行测定，设置合适的检测增益、分析时间和荧光积分时间，对时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板上系列不同等效稀土金属浓度酶标孔的时间分辨荧光强度进行测定，然后将测得的时间分辨荧光强度与对应酶标孔的等效稀土金属浓度标准值进行最小二乘线性回归，计算出线性相关系数作为线性的表征。
当用于信噪比指标计量测试时，在时间分辨荧光酶分析仪中按照使用的稀土金属的激发和发射波长进行测定，设置合适的检测增益、分析时间和荧光积分时间，对时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板上某一等效稀土金属浓度酶标孔的时间分辨荧光强度和不含有稀土金属的酶标孔的时间分辨荧光强度进行分别测定，计算两个荧光强度的比值作为信噪比的表征。
为突出本发明的有益效果，还进行了以下对比例试验。
对比例1现有技术中的时间分辨荧光酶标分析仪测试板A
具体结构为：将Eu、Tb、Sm、Dy稀土元素中的一种或几种混合配制成溶液，将不同浓度的稀土溶液与增强剂混合后加入到黑色酶标板中，形成校准用的测试板。
对比例2现有技术中的时间分辨荧光酶标分析仪测试板B
具体结构为：采用电子技术模拟时间分辨荧光信号，在单片机的控制下，驱动LED发光，同时模拟时间分辨荧光光谱信号，经过衰减滤光后形成校准用的测试信号。
对比例3时间分辨荧光酶标分析仪测试板A的使用方法及效果
采用时间分辨荧光酶标分析仪测试板A和本发明实施例1对同一台时间分辨荧光酶标仪进行重复性计量指标的测试，连续测量6次计算时间分辨荧光信号的相对标准偏差作为重复性的表征。采用测试板A的相对标准偏差为2.3％，采用本发明装置的相对标准偏差为0.7％。
对比例4时间分辨荧光酶标分析仪测试板B的使用方法及效果
采用时间分辨荧光酶标仪测试板B和本发明实施例1对同一台时间分辨荧光酶标仪进行复现性计量指标的测试。仪器和测试板每次测试后均关机再开，重复6次计算时间分辨荧光信号的相对标准偏差作为重复性的表征。采用测试板B的相对标准偏差为5.6％，采用本发明装置的相对标准偏差为1.8％。
由对比例1-4和实施例1进行对比可知，
重复性％ 复现性％
本发明 0.7 1.8
测试板A 2.3 /
测试板B / 5.6
结论：本发明实施例1采用固体时间分辨荧光方式，在重复性、复现性等指标上都优于溶液及电子电路模拟方式的校准装置。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺，其特征在于：所述标准板包括黑色酶标板（1）；黑色酶标板（1）上设有96个酶标孔（2）；所述96个酶标孔（2）中均含有稀土荧光固态物质（3）；所述稀土荧光固态物质（3）中含有稀土金属及增强剂；所述稀土荧光固态物质（3）为长寿命稀土荧光固态物质；所述稀土荧光固态物质（3）的基体为高分子聚合物，采用共聚法在酶标孔（2）中直接聚合而成；
其制备工艺包括以下步骤：
（1）将不同量的稀土金属溶液与增强剂、交联剂、单体、溶剂和引发剂混合均匀；
（2）将混合后的溶液等体积的加入96个酶标孔中；
（3）采用热引发或者紫外光照引发的方式，使酶标孔中的固体荧光材料聚合成具有一定刚性的稀土荧光固态物质；
当采用热引发时，选用偶氮二异丁腈、过氧化二酰或过硫酸盐作为引发剂，在40℃～100℃温度区间引发自由基聚合反应；
当采用紫外光照引发时，选用安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚、安息香丁醚、二苯基乙酮或α，α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮引发聚合反应；
所述稀土金属溶液为包含有Eu、Tb、Sm、Dy元素中的一种或几种的溶液；所述增强剂为β-萘甲酰三氟丙酮、三辛基氧化膦和Triton X-100；所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯；所述单体为甲基丙烯酸；所述溶剂为甲醇或乙腈-水；所述引发剂为热引发剂或光引发剂；
用量比例分别为10 mmol 稀土元素、15 mmol β-萘甲酰三氟丙酮、50 mM三辛基氧化膦和1mL Triton X-100，4 mmol的甲基丙烯酸，10 mL的甲醇或乙腈-水，20 mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯；当采用热引发剂时，加入50 mg 偶氮二异丁腈。
2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的制备工艺，其特征在于：所述96个酶标孔（2）呈8行12列的矩形阵列均匀分布。
3.权利要求1或2所述工艺制备的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板的使用方法，其特征在于：采用稀土金属溶液国家标准物质作为标准，采用经过计量检定合格的荧光分光光度计对制备的时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板各个酶标孔中的稀土荧光固态物质的荧光强度进行测定，采用标准曲线法计算出各个酶标孔的等效稀土金属浓度，作为该测试标准板的标准值。
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