CN102134253A - 光致发光纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类荧光纳米粒子与其制备方法及应用。此类荧光纳米粒子由含羧基共聚物基质材料和分散在所述基质材料中的稀土荧光染料构成；本发明的荧光纳米粒子制备方法包括将稀土配合物荧光染料和共聚物溶解于能与水混溶的有机溶剂中，将上述溶液加入水中，利用共沉淀-自组装过程形成所述荧光纳米粒子。本发明的荧光纳米粒子具有优异的长波激发发光性能、良好的稳定性以及可用于偶联生物分子的表面羧基。基于此类荧光纳米粒子的生物探针，在高灵敏荧光免疫分析以及生物成像等方面具有广阔应用前景。

Description

光致发光纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一类光致纳米粒子和一类可用于制备此类纳米粒子的稀土配合物荧光染料与它们的制备方法及应用，特别是一类基于稀土配合物荧光染料的荧光纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
稀土配合物荧光探针在生物成像、DNA检测、免疫分析等领域中有着重要的应用。其主要优势在于稀土配合物具有较长的发光寿命，较大的Stokes位移，锐线发射峰等特点。这些特点使其在生化分析中可以通过时间分辨技术有效滤除背景信号干扰，实现高灵敏度的检测，同时避免了传统的放射性标记方法带来的生物安全问题。
由于稀土离子的f-f跃迁受跃迁选择定则的限制，稀土离子本身的光吸收能力很弱，要获得较大的光致发光效率，需要对其进行敏化，即通过配体(或电荷转移态)吸光，并使能量转移至稀土离子激发态以实现稀土离子的高效发光。许多稀土配合物能被紫外光激发，获得较好的发光强度。然而，紫外激发光对生物体造成的损伤较大，背景信号较强，同时紫外光穿透深度小，这使紫外激发荧光探针的应用受到很多限制。因此，向长波方向扩展稀土配合物的激发窗口，研制具有优良可见光或近红外光激发发光能力的稀土配合物基荧光探针成为重要发展方向之一。
具有优良可见光和近红外光激发发光性能的稀土配合物非常有限。近年来，我们设计、合成了铕配合物Eu(tta)3dpbt(dpbt＝2-(N，N-二乙基苯胺-4-基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑-1-基)-1，3，5-三嗪，tta为噻吩甲酰三氟丙酮负离子)(Y.Wang，et al.，Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010)。并在此基础上设计、合成了一系列新型稀土配合物，它们均具有优良的可见光和近红外光激发发光性能(Y.Wang，et al.，Adv.Funct.Mater.2007，17，3663；王远，郝锐，马严，具有可见光激发发光性能的铕配合物及其合成方法，ZL 2007 1 0118978.8)。若将此类稀土配合物作为荧光探针应用于生物分析，将使得生物分析具有高灵敏度、高信噪比、穿透深度大、对生物体损伤与干扰小、分析成本低等优点。然而，绝大多数已知的具有可见与近红外光高效激发发光性能的稀土配合物为疏水性分子，且其在水溶液中的稳定性不高，因而难以在水溶液中直接使用这些配合物分子作为生物荧光探针。
一个解决此类问题的可行方案是将稀土配合物包埋于聚合物树脂或无机纳米粒子中。西鹏等(西鹏、顾晓华、黄象安、何玉鲜，无机—有机核壳式稀土聚合物材料及其制备方法，CN1966534)采用乳液聚合法以及溶胀包埋法将具有紫外光激发发光性能的疏水稀土配合物包埋于聚合物树脂中，制备了具有紫外光激发发光性能的纳米粒子；陈扬和袁景利等(陈扬，基于荧光能量转移原理发光的稀土纳米粒子及制备方法，CN 1304523C；袁景利，谭明乾，叶志强，王桂兰，一种功能性纳米稀土微粒及其制备和应用，CN1298807C)分别采用微乳液法或溶胶凝胶法将亲水性的稀土配合物包埋于二氧化硅为基质的纳米粒子中，制备了具有紫外光激发发光性能的基于稀土配合物的纳米材料。但是以通常的疏水高分子为基质的纳米粒子在水溶液中易发生团聚，且其粒径较大，散射信号强。二氧化硅基质由于难以形成致密包裹层，也常常导致形成的纳米粒子中的荧光染料的泄漏。最近袁景利等利用三个含硅氧烷基团的化合物(APS-BHHCT-Eu3+dpbt，3-aminopropyl(triethoxyl)silane，tetraethyl orthosilicate)在反向微乳液中水解共缩合的方法合成了可被可见光激发发光的荧光纳米粒子。(Jing Wu，Jingli Yuan，Yafeng Guan等，Journal of MaterialsChemistry，2009，19，1258-1264)。此类纳米粒子表面含有胺基，可用于与生物分子偶联，Eu发光配合物包裹于氧化硅为主的基质材料中。但是，此类纳米粒子对可见光具有很强的散射能力，其紫外-可见吸收光谱中Eu配合物的吸收峰很小，且叠加于很强的散射带之上，表明其光致发光强度等性能不太理想。此外由于含有胺基，此类纳米粒子在中性及弱酸性条件下表面荷正电，荷正电的纳米粒子在生物分析中更易导致非特异性吸附。
理想的基于稀土配合物的纳米荧光探针应具有以下特征：1)在水溶液中具有良好的分散性和稳定性；2)纳米粒子中的稀土配合物或其聚集体具有强的光致发光能力，特别是可见光及近红外光激发发光能力，纳米粒子发光强度大，对激发光和发射光散射能力较弱；3)纳米粒子表面具有可供偶联生物分子的活性基团，并具有较好的生物相容性和小的非特异吸附能力。
本发明发明人曾采用已见诸报道的稀土配合物基荧光纳米粒子合成方法(例如微乳聚合法、烷氧基硅烷水解包埋法等)，对所设计、合成的Eu(tta)3dpbt等具有优异可见光和近红外光激发发光性能的稀土配合物实施纳米包埋以合成新型稀土配合物基荧光纳米粒子，但均难以获得令人满意的结果。其主要原因是此类具有优良可见光与近红外激发发光性能的稀土配合物的配体与稀土离子的配位作用较弱，通常的配合物包埋方法容易导致其发生配体解离或荧光淬灭，失去原有的光学特性。
发明内容
本发明的目的是提供一类荧光纳米粒子及其制备方法与应用。
本发明还提供了一类作为制备荧光纳米粒子的原料的，具有优异光致发光性能的新型稀土配合物及其合成方法。
本发明提供的作为制备荧光纳米粒子的原料的稀土配合物的结构通式如式I所示，
所述式I结构通式中，R1和R2均选自碳原子数为1至4的烷基中的任意一种基团。
本发明提供的制备上述铕离子配合物的方法，包括如下步骤：将式II结构通式所示化合物与式III结构通式所示化合物反应，得到所述铕离子配合物，
Figure GSA00000008419100032
所述式II结构通式中，R1和R2均选自碳原子数为1至4的烷基中的任意一种基团。
该方法中，所述式II结构通式所示化合物与式III结构通式所示化合物的摩尔比为1∶1；所述反应中，温度为-10～100℃；所述反应是在有机溶剂中进行的，所述有机溶剂选自四氢呋喃、乙醚、苯、甲苯、二甲苯、氯仿和二氯甲烷中的至少一种。
本发明提供的荧光纳米粒子，包括基质材料和分散在所述基质材料中的稀土配合物。
上述荧光纳米粒子，也可只由所述基质材料和分散在所述基质材料中的稀土配合物组成。其中，所述基质材料是由主链为碳氢链、侧基为羧基和疏水基团构成的高分子共聚物；所述稀土配合物荧光染料为在可见光和/或近红外光和/或紫外光激发下发射可见光或近红外光性能的稀土配合物。
所述基质材料中，所述疏水基团选自烷基、苯基、酯基和醚基中的至少一种，但不限于上述基团；所述基质材料选自甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸-丙烯酸酯共聚物、马来酸烷基酯-马来酸共聚物、马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物和苯乙烯-甲基丙烯酸酯-丙烯酸三嵌段共聚物中的至少一种，更优选甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物和苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物；所述稀土配合物选自式IV结构通式所示化合物、式V结构通式所示化合物、式VI结构通式所示化合物中的至少一种；
Figure GSA00000008419100041
所述式IV、式V和式VI结构通式中，La代表铕、镱或钕离子；R1和R2均选自碳原子数为1至4的烷基中的任意一种基团，R3、R4、R5、R6、R7和R8均选自甲基和H中的任意一种基团。式IV中的辅助配体为噻吩甲酰三氟丙酮负离子(简称为tta)，式V中的辅助配体为6，6，7，7，8，8，8-七氟-2，2-二甲基辛烷-3，5-二酮负离子(简称fod)，式VI中的辅助配体为萘基甲酰三氟丙酮负离子(简称nta)。
所述基质材料与所述稀土配合物的质量比为1～10,000∶1，优选3～1000∶1，更优选3～100∶1；所述高分子共聚物的数均分子量为3,000～150,000，优选50,000～10,000，更优选10,000～70,000；所述高分子共聚物中，羧基基团占所述高分子共聚物总质量的0.01％～40％，具体可为0.5-25％、0.5-15％、0.5-10％、1-25％、1-15％、1-10％、2-25％、2-15％、2-10％、3-25％、3-15％、3-10％、3-5％、2-3％、2-5％、5-25％、5-15％或5-10％，优选0.05-20％；所述荧光纳米粒子的粒径为10～200纳米，具体可为12-180nm、12-145nm、12-100nm、22-180nm、22-145nm、22-100nm、30-180nm、30-145nm、30-100nm、35-180nm、30-145nm、30-100nm、35-180nm、35-145nm、35-100nm、40-180nm、40-145nm、40-100nm、45-180nm、58-180nm、75-180nm、80-180nm、100-180nm、145-180nm、22-80nm、30-80nm或40-80nm，优选12-120nm。
本发明提供的制备上述荧光纳米粒子的方法，包括如下步骤：
1)将所述稀土配合物和所述基质材料溶于能与水混溶的有机溶剂中，得到所述稀土配合物和所述基质材料的有机溶液；
2)将所述步骤1)得到的有机溶液与水混匀，得到溶胶a；
3)除去所述溶胶a中的有机溶剂，离心分离后，将沉淀重新分散于水或缓冲溶液中，得到分散于水或缓冲溶液中的所述荧光纳米粒子。
该方法的步骤1)中，所述稀土配合物的浓度为1×10-4～10g/L，优选0.01～3g/L；所述基质材料的浓度为1×10-4～100g/L，优选0.01～10g/L；所述能与水混溶的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的至少一种；
步骤2)中，所述水的体积为所述步骤1)得到的有机溶液体积的1～1000倍，优选5～100倍；
步骤3)中，所述除去所述溶胶a中的有机溶剂的步骤中，温度为4～100℃，优选4～80℃；所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液和碳酸盐缓冲溶液中的至少一种。
上述制备荧光纳米粒子的方法为共沉淀包裹法，即将稀土配合物、共聚物溶解于能与水混溶的有机溶剂，将其加入水中，形成包有稀土配合物荧光染料的所述基质材料的纳米粒子。通过调变稀土配合物、共聚物的比例以及有机溶剂可以很方便地对荧光纳米粒子中稀土配合物含量、颗粒尺寸等参数进行调控。而荧光纳米粒子表面羧基的含量可以通过改变共聚物组成控制。
本发明还提供了一种胶体溶液，该溶液是将前述本发明提供的荧光纳米粒子分散于水或缓冲溶液中而形成的。
该胶体溶液中，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液和碳酸盐缓冲溶液中的至少一种。
本发明提供的上述荧光纳米粒子及由上述荧光纳米粒子分散于水或缓冲溶液中形成的胶体溶液在制备纳米荧光生物探针或生物成像发光标记物中的应用，也属于本发明的保护范围。
研制以可见光和近红外光激发高效发光稀土配合物荧光染料(例如，式IV、V、VI所示的稀土配合物荧光染料)为基础的，能在水溶液中稳定分散且表面含有易与生物分子键合的羧基的荧光纳米粒子必须解决制备过程中所述稀土配合物易被破坏而失去其发光特性的问题。导致这一问题的主要原因是可见光和近红外光激发高效发光稀土配合物荧光染料(例如，式IV、V、VI所示的稀土配合物荧光染料)的稀土离子与配体的配位作用较弱，许多含有胺基，羧基或硅羟基等基团的化合物(如乙酸，正丁胺，硅酸钠等)易与其反应，使配合物失去长波敏化发光的性能。本发明人发现接于含有疏水侧基的共聚物之碳氢链上的羧基与式IV、V、VI等具有优异可见光和近红外光激发发光性能的稀土配合物作用很弱，将其混合溶液加入水中即可生成具有优异可见光和近红外双光子激发发光性能和分散稳定性优良的荧光纳米粒子。导致这一出乎意料的现象的原因是由于所述共聚物之疏水侧基和碳氢主链造成了较强的位阻效应，使接于此类共聚物上的羧基在实验条件下难以与上述稀土配合物作用使之分解而失去其光学特性。将所述共聚物与所述稀土配合物溶于能与水混溶的有机溶剂形成溶液，在搅拌下将此溶液加入水中时，不溶于水的共聚物和稀土配合物发生自组装，聚合物的强疏水部分和疏水稀土配合物倾向于远离水，而聚合物中部分羧基则倾向暴露于表面并电离为羧酸根，使纳米粒子表面荷负电。由于粒子尺寸较小且表面荷负电，因此本发明提供的荧光纳米粒子在水和许多缓冲溶液中均具有很高的分散稳定性。由于所述稀土配合物分散于聚合物的强疏水部分构成的介质中，因此本发明提供的荧光纳米粒子具有优异的长波光激发发光性能和耐光稳定性。
上述原理使得本发明纳米粒子的基质材料共聚物具有较宽的选择范围，对共聚物碳氢链上的疏水侧基进行简单的代换，并不超出本发明的保护范围。
本发明提供的Eu(nta)3bpt等稀土配合物具有以下优点：此类配合物不仅具有高荧光量子产率(0.52，参比物为DCM的正丙醇溶液，20℃)，而且其荧光激发谱激发峰位于412nm处，尾部延展到460nm(浓度为1.0×10-5M)，而已报道的Eu(tta)3dpbt，Eu(nta)3dpbt等配合物(O.S.Wolfbeis，et al.，Anal.Chem.2006，78，5094-5101；Y.Wang，et al.Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010-5013)的荧光激发谱激发峰位于403nm，尾部延展至约440nm(浓度为1.0×10-5M)。由此可见，本发明提供的Eu(nta)3bpt等配合物具有更为突出的长波敏化铕离子发光性质。它们在生物传感、生化分析等方面具有重要应用价值。
本发明提供的荧光纳米粒子，具有如下优点：
1、具有优异的发光性能。本发明的荧光纳米粒子具有基于稀土配合物的发射峰窄、Stocks位移大、荧光寿命长的优点。本发明荧光纳米粒子在水溶液和缓冲溶液中对激发光和发射光散射能力弱，发光亮度高。当使用具有可见和近红外光激发发光性能的稀土配合物为荧光染料时，在可见光和近红外光激发下具有很高的荧光量子产率，例如本发明实施例1至3中制备的基于Eu(tta)3dpbt、Eu(fod)3dpbt或者Eu(nta)3bpt的荧光纳米粒子在可见光激发下的荧光量子产率高于0.3(计算时未扣除吸收处的散射强度)，由于所制备纳米粒子可含有较高含量的发光稀土配合物，因此其具有很高的可见光激发发光亮度。本发明的一些稀土配合物基荧光纳米粒子较溶解于有机溶剂中的同种稀土配合物具有更好的长波可见光激发发光性能，例如，与溶于甲苯中的Eu(tta)3dpbt相比，本发明的基于Eu(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的可见光区激发峰及激发窗口红边发生显著红移，其长波激发发光亮度(Φ×ε)更高。本发明的一些荧光纳米粒子同时具有优异的双光子激发发光性能，例如上述基于Eu(tta)3dpbt、Eu(fod)3dpbt或者Eu(nta)3bpt的荧光纳米粒子在近红外激光激发下，可发出明亮的红光，粒子中稀土配合物双光子激发作用截面达到30GM以上(1GM＝10-50cm4 s photo-1 molecule-1)。
2、稳定性好。在本发明提供的荧光纳米粒子中，由于所用共聚物具有两亲性，稀土配合物荧光染料分散于高分子基质材料的疏水环境中，避免了水分子以及水溶液中的其他成分与其作用。本发明提供的荧光纳米粒子表面含有羧基，使其在水溶液及一些缓冲溶液中具有很好的分散稳定性，分散于水中的纳米粒子表面带负电，有利于减少生物分析中的非特异性吸附。本发明的荧光纳米粒子同时具有很好的耐光、热稳定性。在激发光长时间照射的条件下，其发光强度下降幅度小于10％。
3、本发明提供的制备方法简便、可控性强，解决了具有优良可见光和近红外光激发发光性能性能稀土配合物的纳米包埋问题，使其优异的发光性能在纳米粒子中得以基本保持或进一步提高。
荧光纳米粒子表面的羧基可用于生物分子的键合以制备性能优异的纳米荧光探针。本发明提供的荧光纳米粒子的优异光致发光性能使其非常适用于合成灵敏度高、穿透深度大、对生物样品损伤小的纳米荧光生物探针。各种抗原、抗体、酶、DNA、RNA，如免疫球蛋白IgG，甲胎蛋白AFP等，均可采用本发明所提供的荧光纳米粒子进行标记。标记后获得的纳米荧光生物探针可以用于生物分析，例如高灵敏荧光免疫分析，生物荧光成像以及生物芯片等。
附图说明
图1为实施例1制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于Eu(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的粒径分布图(动态光散射法测定，纳米粒子粒径分布范围为52～66nm，平均粒径58nm)。
图2为实施例1制备的荧光纳米粒子的透射电镜照片。
图3为实施例1制备的荧光纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。
图4为实施例1制备的荧光纳米粒子的荧光激发谱(发射波长λem＝614nm)。
图5为实施例1制备的荧光纳米粒子的荧光发射谱(激发波长λex＝412nm)。
图6为实施例2制备的以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质材料，基于Eu(tta)3dpbt配合物的荧光纳米粒子的粒径分布图(动态光散射法测定，纳米粒子尺寸范围85～115nm，平均粒径100nm)。
图7为实施例2制备的荧光纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。
图8为实施例2制备的荧光纳米粒子的荧光激发光谱(发射波长λem＝614nm)。
图9为实施例3制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于Eu(nta)3bpt的荧光纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。
图10为实施例3制备的荧光纳米粒子的荧光激发谱(发射波长λem＝620nm)。
图11为实施例3制备的荧光纳米粒子的荧光发射谱(激发波长λex＝425nm)。
图12为实施例3制备的荧光纳米粒子的粒径分布(动态光散射法测定，纳米粒子粒径分布范围为20～26nm，平均粒径22nm)。
图13为实施例3制备的Eu(nta)3bpt甲苯溶液的紫外-可见吸收光谱。
图14为实施例3制备的Eu(nta)3bpt甲苯溶液的荧光激发谱(发射波长λem＝620nm)。
图15为实施例3制备的Eu(nta)3bpt甲苯溶液的荧光发射谱(激发波长λex＝412nm)。
图16为实施例9制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于Nd(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的荧光发射谱(激发波长λex＝412nm)。
图17为实施例10制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于Yb(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的荧光发射谱(激发波长λex＝412nm)。
图18为实施例11制备的以丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于Eu(tta)3·3H2O的荧光纳米粒子的荧光激发谱(发射波长λem＝614nm)。
图19为实施例13中荧光强度随检测物中人IgG浓度变化图，荧光生物探针为荧光纳米粒子标记的羊抗人IgG。
图20为实施例13中荧光强度随检测物中人IgG浓度变化图，荧光生物探针为商购FITC标记的羊抗人IgG。
图21为实施例14中对宫颈癌细胞Hela的荧光成像图，A为明场成像图，B为荧光成像图(激发波长λex＝405nm)。
具体实施方式
为了更具体地说明本发明，现给出若干实施例，但本发明所涉及的内容并不仅仅局限于这些实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，实施例中所用试剂均可商购获得。
实施例1、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Eu(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的制备
取甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量为50,000，羧基基团质量分数：1.0％)和Eu(tta)3dpbt(结构如式VII所示)溶解于丙酮中，得到成丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为1g/L，Eu(tta)3dpbt浓度为0.1g/L的丙酮溶液。在搅拌下，将20mL上述溶液滴加入80mL水中，继续搅拌10min。于30℃下蒸发除去丙酮，离心分离，离心转速为25000rpm(50000G)，将所得沉淀重新分散于纯水中，制得所述表面含羧基的荧光纳米粒子的溶胶。
Figure GSA00000008419100091
如图1所示，动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米粒子的平均粒径为58nm，粒径分布范围52～66nm。荧光纳米粒子透射电子显微镜照片如图2所示，此类荧光纳米粒子呈球形，电镜照片中纳米粒子粒径分布和动态光散射测试结果相吻合。
图3为所制备的荧光纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱，由图中可以看到，荧光纳米粒子在可见区的吸收峰位于412nm，荧光纳米粒子对可见光的散射强度较弱。荧光光谱测试结果表明，所制备的荧光纳米粒子具有优异的可见光激发发光性能，其可见区激发峰位于412nm，尾部延展到470nm。荧光纳米粒子的荧光激发谱(λem＝614nm)如图4所示，其荧光发射谱(λem＝412nm)如图5所示。以4-dicyanomethylene-2-methyl-6-p-dimethylaminostyrl-4H-pyran(简称DCM)的正丙醇溶液为参考物(荧光量子产率Φ＝0.57)，在波长为410nm激发光照射下，测得此荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.30(本发明所有实例在计算量子产率时均未扣除吸收处的散射强度)。在波长为830nm的近红外激光激发下，上述荧光纳米粒子可发出明亮的红光，以染料Rhodamine B为参考物测得其双光子激发作用截面为40GM(1GM＝10-50cm4 s photo-1 molecule-1)。上述结果表明包埋于所制备荧光纳米粒子中的稀土配合物Eu(tta)3dpbt结构完整，保持了其优异的发光特性。所制备的荧光纳米粒子在水溶液或磷酸盐缓冲溶液(PBS)中具有优良的分散稳定性，放置3个月没有观察到沉淀。所制备的荧光纳米粒子具有优异的光稳定性，经412nm光照射1小时后，其发光强度减弱程度小于10％。Zeta电位测试结果表明，分散于水中的所制备荧光纳米粒子的zeta电位为负18mV。
该实施例中，式VII所示Eu(tta)3dpbt化合物是按照Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010-5013中所述方法制备的。
实施例2、以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质的基于Eu(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的制备
将实例1中共聚物换为苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物(数均分子量为100,000，苯乙烯基团质量分数：40％，羧基基团质量分数：25％)，该嵌段共聚物的浓度为10g/L，离心转速改为4000rpm，制备得到以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质的基于Eu(tta)3dpbt的荧光纳米粒子。如图6所示，动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米粒子的平均粒径为100nm，粒径分布范围为85～115nm。图7为所制备的荧光纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱，由图中可以看到，荧光纳米粒子在可见区吸收峰位于415nm，纳米粒子对可见光的散射较弱。荧光纳米粒子的荧光激发谱(λem＝614nm)如图8所示，激发峰位于415nm，可见区激发窗口延展至470nm以上，荧光发射峰形与图5相似。在波长为410nm激发光照射下，以DCM的正丙醇溶液为参比物，测得所制备的荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.31。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米粒子的zeta电位为负28mV。
实施例3、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质的基于Eu(nta)3bpt的荧光纳米粒子的制备
将甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量：5,000，羧基基团质量分数：10％)以及Eu(nta)3bpt(结构如式VIII所示，其制备方法见实施例14)溶解于甲醇中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为0.02g/L，Eu(tta)3bpt浓度为2×10-3g/L的甲醇溶液。在搅拌条件下，将25mL上述溶液滴加入75mL水中，继续搅拌10min。于4℃真空旋转蒸发除去甲醇，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水中，制得表面含羧基的荧光纳米粒子的溶胶。
图9为所制备的荧光纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱，由图中可以看到，荧光纳米粒子在可见区吸收峰位于425nm，纳米粒子对可见光的散射强度较弱。荧光光谱测试结果表明，所制备的荧光纳米粒子具有优异的可见光激发发光性能，其可见区激发峰位于425nm，尾部延展到470nm。荧光纳米粒子的荧光激发谱(λem＝614nm)如图10所示，其荧光发射谱(λem＝425nm)如图11所示。如图12所示，动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米粒子的平均粒径为22nm，粒径分布范围20nm～26nm。在波长为410nm激发光照射下，以DCM的丙醇溶液为参考物测得此荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.30。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米粒子的zeta电位为负21mV，经415nm光照射0.5小时后，其荧光强度减弱10％。
实施例4、以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质的基于Eu(fod)3dpbt的荧光纳米粒子的制备
将苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物(数均分子量为50,000，羧基基团质量百分数为2％)和Eu(fod)3dpbt(结构如式IX所示)溶于丙酮中，配制成苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物浓度为25g/L，Eu(fod)3dpbt浓度为0.5g/L，按照实施例1中所述步骤制备得到以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质的基于Eu(fod)3dpbt的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，制备所得荧光纳米粒子的平均粒径为145nm。在波长为410nm激发光照射下，以DCM的丙醇溶液为参考物，测得此荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.25。Zeta电位测试结果表明，该荧光纳米粒子的zeta电位为负15mV。
该实施例中，式IX所示Eu(fod)3dpbt化合物是按照下述方法制备得到的：
取Eu(fod)3化合物0.05mmol溶解在30mL的四氢呋喃中制得溶液D，取dpbt配体化合物0.05mmol溶解于30mL四氢呋喃中制得溶液E，将溶液D逐滴加入溶液E中。25℃搅拌1h，减压蒸干溶剂，得结构如式IX的橙黄色固体72.7mg。其中，配体混合物dpbt按照Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010-5013中所述方法制备得到。
质谱(MALDI-TOF MS)分析测得分子离子峰M/Z＝1454；元素分析(质量百分含量)：C，43.66％(43.78％)；H，4.38％(4.02％)；N，7.43％(7.71％)，括号中为理论值；核磁共振谱表征证明产物为式IX所示配合物。
实施例5、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物和苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物的混合物为基质的基于Eu(nta)3bpt的荧光纳米粒子的制备
取0.1g甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量为50,000，羧基的质量百分数为3％)，0.05g苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物(数均分子量为20,000，羧基质量百分数为5％)，0.1gEu(nta)3bpt(结构如式VIII所示)溶于10ml丙酮，在搅拌和超声作用下将上述溶液加入90ml水中，按实施例1中所述步骤进行制备，得到以上述两种共聚物之混合物为基质的基于Eu(nta)3bpt的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，制备所得荧光纳米粒子的平均粒径为75nm。荧光光谱测试表明，其荧光激发光谱和发射光谱分别与图10和图11相似，以DCM的丙醇溶液为参比，测得此荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.30。荧光纳米粒子经415nm光照射1小时后，其发光强度减弱10％。
实施例6、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Eu(fod)3dpbt的荧光纳米粒子的制备
将甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量为3,000，羧基基团质量百分数为15％)和Eu(fod)3dpbt(结构如式IX所示)溶解于乙腈中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为1.0×10-3g/L，Eu(fod)3dpbt浓度为2.0×10-4g/L的乙腈溶液。在超声条件下，将1mL上述溶液滴加入100mL水中，继续超声10min。于80℃处理除去乙腈，离心分离，将所得沉淀重新分散于磷酸盐缓冲溶液中，制得表面含羧基的荧光纳米粒子的溶胶，其中所述荧光纳米粒子即为以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Eu(fod)3dpbt的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，制备所得荧光纳米粒子的平均粒径为12nm。以DCM的丙醇溶液为参考物，在波长为410nm激发光照射下，测得此荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.27。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米粒子的zeta电位为负20mV。
Figure GSA00000008419100121
实施例7：以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质材料的基于Eu(nta)3bpt的荧光纳米粒子的制备
将苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物(数均分子量为50,000，羧基基团质量百分数为0.5％)和实施例3制备的Eu(nta)3bpt(结构如式VIII所示)溶解于四氢呋喃中，配制成苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物浓度为50g/L，Eu(nta)3bpt浓度为1g/L的四氢呋喃溶液。在超声条件下，将10mL上述溶液滴加入50mL水中，继续超声10min。于15℃旋转蒸发除去四氢呋喃，离心分离，将所得沉淀重新分散于Tris-HCl(pH＝8)缓冲溶液中，制得表面含羧基的荧光纳米粒子的溶胶，其中所述荧光纳米粒子即为以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质材料的基于Eu(nta)3bpt的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，制备所得荧光纳米粒子的平均粒径为180nm。荧光光谱表面，荧光激发光谱和发射光谱峰形分别与图10和图11光谱峰形相似，以DCM的丙醇溶液为参考物，在波长为410nm激发光照射下，测得此荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.30。
实施例8：以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Eu(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的制备
甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量：10,000，羧基基团质量分数：5％)以及Eu(tta)3dpbt溶解于二甲基甲酰胺中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物浓度为0.2g/L，Eu(tta)3dpbt浓度为0.02g/L的二甲基甲酰胺溶液。在磁力搅拌条件下，将10mL上述溶液滴加入10mL水中，继续搅拌15min。于100℃加热回流40分钟，离心分离，将所得沉淀重新分散于去离子水中，制得表面含羧基的荧光纳米粒子的溶胶，其中，所述荧光纳米粒子即为以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Eu(tta)3dpbt的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，制备所得荧光纳米粒子的平均粒径为40nm。荧光光谱测试结果表明，其可见区的激发峰位于412nm，以DCM的丙醇溶液为参考物，在波长为410nm激发光照射下，测得此荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.31。
实施例9：以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Nd(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的制备
Figure GSA00000008419100131
将实施例8中的Eu(tta)3dpbt换成Nd(tta)3dpbt，使Nd(tta)3dpbt浓度为1×10-4g/L，其他制备步骤与实施例8完全相同，得到以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Nd(tta)3dpbt的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米粒子的平均粒径为45nm。其荧光发射光谱如图16所示，主发射峰位于近红外区，波长为1064nm，Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米粒子的zeta电位为负24mV。
该实施例中，化合物Nd(tta)3dpbt(结构式如式X所示)是按照下述方法制备得到的：
在搅拌条件下，将1.0mmol的Nd(NO3)3·6H2O溶于15ml乙醇，得到Nd(NO3)3·6H2O的乙醇溶液，将该溶液逐滴加入到15ml含3.0mmol噻吩甲酰三氟丙酮的乙醇溶液中，室温搅拌，同时加入适量氨水，调节pH至7.0。在80-85℃下加热反应3h，冷却至室温。旋干乙醇，得到淡蓝色固体，用水反复洗涤此固体后，加入10ml苯，使固体溶解，用无水氯化钙干燥。滤除氯化钙，旋转蒸干溶剂，得到蓝色油状物，加入10ml石油醚，加热溶解，滤除不溶物后，旋干石油醚，真空干燥得到蓝色粉末状产物Nd(tta)3·2H2O。
取Nd(tta)3·2H2O化合物0.05mmol溶解在30mL的四氢呋喃中制得溶液B，取dpbt配体化合物0.05mmol溶解于30mL四氢呋喃中制得溶液C，将溶液B逐滴加入溶液C中。25℃搅拌1h，减压蒸干溶剂，得橙黄色固体Nd(tta)3dpbt。其中，所述dpbt配体化合物是按照Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010-5013中所述方法制备而得。
质谱(ESI-MS)表征测得[M+Na]+＝1247.3；元素分析(质量百分含量)：C，46.18％(46.11％)；H，3.62％(3.29％)；N，8.99％(9.15％)，括号中为理论值；核磁共振谱表征证明产物为Nd(tta)3dpbt配合物。
实施例10：以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Yb(tta)3dpbt的荧光纳米粒子的制备
将实施例8中的Eu(tta)3dpbt换成Yb(tta)3dpbt，其他操作步骤同实施例8中所述，得到以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Yb(tta)3dpbt的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，制备所得荧光纳米粒子的平均粒径为35nm。其可见区的激发峰位于412nm，荧光发射光谱如图17所示，主发射峰位于近红外区，发射波长分别为977nm和1024nm。Zeta电位测试结果表明，所制备荧光纳米粒子的zeta电位为负18mV。
该实施例中，混合物Yb(tta)3dpbt是按照实施例9中所述步骤，将Nd(NO3)3·6H2O换为Er(NO3)3·6H2O合成得到的，其结构如式XI所示。
质谱(ESI-MS)表征测得[M+Na]+＝1276.1；元素分析(质量百分含量)：C，44.31％(45.05％)；H，3.38％(3.22％)；N，9.47％(8.94％)，括号中为理论值；核磁共振谱证明按照上述方法所得产物为Yb(tta)3dpbt。
Figure GSA00000008419100151
实施例11：以丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Eu(tta)3·3H2O的荧光纳米粒子的制备
丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物(数均分子量：15,000，羧基基团质量百分数为5％)以及Eu(tta)3·3H2O(购于ACROS公司)溶解于丙酮中，配制成丙烯酸-丙烯酸酯共聚物浓度为5g/L，Eu(tta)3·3H2O浓度为5g/L的丙酮溶液。在磁力搅拌条件下，用微量注射器将500微升上述溶液注射加入100mL水中，继续搅拌10min。于40℃处理除去丙酮，离心分离，将所得沉淀重新分散于去离子水中，制得表面含羧基的荧光纳米粒子的溶胶，其中，所述荧光纳米粒子即为以丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于Eu(tta)3·3H2O的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，所制备的荧光纳米粒子的平均粒径为30nm。荧光光谱测试结果表明，此溶胶中荧光纳米粒子激发峰值位于377nm，发射峰值位于614nm，荧光量子产率为0.35。图18为该实验制备荧光纳米粒子的荧光激发谱，此类荧光纳米粒子具有良好的紫外光激发发光性能。
实施例12：以2-马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的共聚物为基质材料的基于Eu(tta)3bpt的荧光纳米粒子的制备
将2-马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物(数均分子量：8,000，羧基基团质量分数：0.5％)和Eu(tta)3bpt溶解于乙腈中，配制成2-马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的共聚物浓度为5g/L，Eu(tta)3bpt浓度为0.01g/L的乙腈溶液。在超声条件下，用注射器将1mL上述溶液注射加入100mL水中，继续超声10min。于80℃旋转蒸发除去乙腈，离心分离，将所得沉淀重新分散于磷酸盐缓冲溶液中，制得表面含羧基的荧光纳米粒子的溶胶，其中，所述荧光纳米粒子即为以2-马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物为基质材料的基于Eu(tta)3bpt的荧光纳米粒子。
动态光散射测试结果表明，制备所得荧光纳米粒子的平均粒径为80nm。荧光光谱测试结果表明，上述制备的纳米粒子具有优良的可见光激发发光性能，其可见区的激发峰位于425nm。以DCM的丙醇溶液为参考物，在波长为410nm激发光照射下，测得此荧光纳米粒子的荧光量子产率为0.24。
实施例13：纳米荧光生物探针(荧光纳米粒子标记山羊抗人IgG)的合成及其效果验证
以实施例2所制备的荧光纳米粒子为标记粒子标记山羊抗人IgG，以固相夹层荧光免疫分析法定量检测人IgG。具体方法如下所述：
取实施例2所制备的荧光纳米粒子溶胶10ml，离心洗涤后分散于10ml PBS(10mM)中，加入0.2ml浓度为10mg/ml的山羊抗人IgG溶液，0.2ml浓度为100mg/ml的N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide(EDC)溶液，0.1ml浓度为100mg/ml的N-hydroxysuccinimide(NHS)溶液，25℃摇床温育4.0h。离心洗涤三次，除去过量的山羊抗人IgG、EDC和NHS后将产物分散于含1mg/ml牛血清蛋白(BSA)的10mM PBS中，即制得检测人IgG的荧光探针抗IgG@LNP，放置于4℃下保存待用。
将山羊抗人IgG分散于50mM的pH＝9.16的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，使其浓度为5μg/mL。将此溶液加入酶标板中，每孔加入量为100μL，酶标板在4℃保温过夜。倒出山羊抗人IgG溶液后，用10mM PBS-Tween-20缓冲溶液(pH＝7.4，含0.5％Tween-20)清洗酶标板3次。之后，将BSA(1.0％)的10mM PBS-Tween-20缓冲溶液加入上述酶标板孔中，每孔加入量为100μL，将此酶标板放在恒温混匀仪中于25℃保温1.0h。倒出BSA溶液，用10mM PBS-Tween-20缓冲溶液清洗酶标板3次，在不同的孔中分别加入不同浓度的人IgG标准溶液，并于37℃温育1.0h.。倒出人IgG溶液，用10mM PBS-Tween-20缓冲溶液清洗酶标板3次。在样品孔中加入制备的荧光探针抗IgG@LNP，同时在对比孔中加入商购的FITC标记的山羊抗人IgG，并于37℃温育1.0h。最后将过量的溶液倒出，并用10mM PBS-Tween-20缓冲溶液清洗酶标板5次。
采用多功能酶标仪测量上述酶标板各孔荧光强度，样品孔激发波长为410nm，检测波长为614nm，实验结果如图19所示，对比孔激发波长为485nm，检测波长为525nm，实验结果如图20所示。实验结果表明，所合成纳米荧光探针抗IgG@LNP对人IgG的荧光免疫分析检测限为10ng/mL，而商购的FITC标记的山羊抗人IgG荧光探针对人IgG的荧光免疫分析检测限为500ng/mL。
实施例14：纳米荧光生物探针在宫颈癌细胞成像中的应用
在实施例3所制备的荧光纳米粒子表面偶联叶酸，使用所形成的生物探针与宫颈癌细胞Hela作用，在荧光显微镜下做Hela细胞的荧光成像。具体方法如下所述：
取实施例3所制备荧光纳米粒子溶胶10ml，离心分离，将沉淀分散于10ml PBS缓冲液(10mM)中，向其中加入0.2ml浓度为100mg/ml的EDC溶液，0.1ml浓度为100mg/ml的NHS溶液，25℃活化反应1.0h，将反应物离心分离，沉淀用10ml PBS(10mM)溶液洗涤，重新分散于10ml PBS(10mM)中，加入0.1ml浓度为10mg/ml的叶酸溶液，反应4.0h。将产物离心，沉淀用10ml PBS(10mM)溶液洗涤，除去过量的叶酸后将产物分散于含1mg/ml BSA的10mM PBS溶液中，即制得表面经叶酸修饰的纳米荧光探针FA@LNP，于4℃下保存待用。
取对数生长期的Hela细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化后，以3×104个/cm2的密度接种于共聚焦培养皿中。加入0.5ml德氏改良基础培养基(DMEM培养基)，在含有5％CO2的培养箱中于37℃培养24h，取出后用10mM PBS冲洗除去培养基，将荧光探针FA@LNP用DMEM培养基稀释10倍加入培养皿，常温温育2h。用10mM PBS冲洗三次，除去培养基和过量的荧光纳米粒子，使用荧光显微镜进行Hela细胞成像(如图21)，明场成像图(图21A)表明细胞状态良好，探针分子未造成细胞死亡，说明荧光探针FA@LNP毒性较低。荧光成像图如图21B所示，激发波长为405nm。图21B表明，荧光探针FA@LNP特异性修饰于Hela细胞表面，并且FA@LNP未发生明显聚集。
实施例14、制备式VIII所述Eu(nta)3bpt化合物
Figure GSA00000008419100171
在氩气保护下，100mmol二乙基苯胺与50mmol三聚氯嗪在80-90℃搅拌8-9h。将反应所得溶液冷却至室温，加入苯30ml，过滤除去不溶物，再将所得溶液减压蒸除溶剂，用石油醚做洗脱液，通过硅胶柱分离，得到产物2-(N，N-二乙基苯胺-4-基)-4，6-二氯-1，3，5-三嗪5g。
在氩气保护下，将新切的金属钾1.25mmol加入到无水四氢呋喃中；加入1.75mmol吡唑，加热回流3h产生吡唑负离子；将反应混合物置于冰浴中，向其中加入2-(N，N-二乙基苯胺-4-基)-4，6-二氯-1，3，5-三嗪0.5mmol，室温搅拌1h，然后在80-85℃的油浴中回流反应8-9h。反应液冷却后减压蒸除溶剂，用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液做洗脱液，通过硅胶柱分离，所得粗产品用石油醚和二氯甲烷的混合液重结晶，得到黄色针状晶体产物2-(N，N-二乙基苯胺-4-基)-4，6-二(吡唑-1-基)-1，3，5-三嗪(简称bpt)72mg。
取3mmol 4，4，4-三氟-1-(2-萘酚)-1，3-丁二酮(nta)溶于15ml无水乙醇中，在搅拌下加入3ml含1mmol氢氧化钠的水溶液，然后加入5ml含1mmol六水合氯化铕的水溶液，再向反应液中加入约100ml水，所得反应液加热到60℃搅拌反应4小时。将反应液冷却至室温，过滤，所得固体常温下真空抽空后溶于50ml无水乙醇，热过滤，滤液中加入100ml水，所得沉淀冷冻，过滤所得固体真空干燥，再用适量的正己烷洗涤固体，收集固体于50℃下真空干燥，得到0.85g产品Eu(nta)3·H2O。
分别取53.7mg上述配合物和20mg bpt溶于10ml四氢呋喃中，将前者慢慢滴加入后者中，常温反应2小时，反应液减压旋干，加入少量无水乙醚后再加入适量的正己烷，待析出沉淀，收集固体，于70℃下真空干燥，得到58mg产品Eu(nta)3dpbt。
质谱(EI MS)表征测得分子离子峰M/Z＝1182(M-naphen)+；元素分析(质量百分含量)结果：C，55.83％(56.01％)；H，3.53％(3.39％)；N，8.56％(8.57％)，括号中为理论值；核磁共振谱证明产物是式VIII所示的化合物。图13为所制备的Eu(nta)3bpt化合物甲苯溶液的紫外-可见吸收光谱，由图中可以看到，可见区吸收峰位于412nm，相对Eu(tta)3dpbt化合物的吸收峰红移达10nm。Eu(nta)3bpt化合物甲苯溶液的荧光激发谱(λem＝620nm)如图14所示，Eu(nta)3bpt具有优异的可见光激发发光性能，其可见区激发峰位于412nm，尾部延展到460nm。其荧光发射谱(λem＝410nm)如图15所示，Eu(nta)3bpt化合物中Eu离子的5D0→7F2跃迁发射峰与Eu(tta)3dpbt化合物的不同，说明由于配体的改变，Eu离子的配位环境发生了较大变化。以DCM的正丙醇溶液为参考物，在波长为410nm激发光照射下，测得Eu(nta)3bpt化合物在20℃的荧光量子产率为0.52，相对于Eu(tta)3dpbt化合物提高了30％。

Claims (14)

1.式I结构通式所示铕离子配合物，
Figure FSA00000008419000011
所述式I结构通式中，R1和R2均选自碳原子数为1至4的烷基中的任意一种基团。
2.一种制备权利要求1所述铕离子配合物的方法，包括如下步骤：将式II结构通式所示化合物与式III结构通式所示化合物反应，得到权利要求1所述铕离子配合物，
Figure FSA00000008419000012
所述式II结构通式中，R1和R2均选自碳原子数为1至4的烷基中的任意一种基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述式II结构通式所示化合物与式III结构通式所示化合物的摩尔比为1∶1；所述反应中，温度为-10～100℃；所述反应是在有机溶剂中进行的，所述有机溶剂选自四氢呋喃、乙醚、苯、甲苯、二甲苯、氯仿和二氯甲烷中的至少一种。
4.荧光纳米粒子，包括基质材料和分散在所述基质材料中的稀土配合物。
5.根据权利要求4所述的荧光纳米粒子，其特征在于：所述荧光纳米粒子是由基质材料和分散在所述基质材料中的稀土配合物组成。
6.根据权利要求4或5所述的荧光纳米粒子，其特征在于：所述基质材料是由主链为碳氢链、侧基为羧基和疏水基团构成的高分子共聚物；
所述稀土配合物荧光染料为在可见光和/或近红外光和/或紫外光激发下发射可见光或近红外光性能的稀土配合物。
7.根据权利要求6所述的荧光纳米粒子，其特征在于：所述基质材料中，所述疏水基团选自烷基、苯基、酯基和醚基中的至少一种；所述基质材料选自甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸-丙烯酸酯共聚物、马来酸烷基酯-马来酸共聚物、马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物和苯乙烯-甲基丙烯酸酯-丙烯酸三嵌段共聚物中的至少一种，更优选甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物和苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物；
所述稀土配合物选自式IV结构通式所示化合物、式V结构通式所示化合物、式VI结构通式所示化合物中的至少一种；
Figure FSA00000008419000021
所述式IV、式V和式VI结构通式中，La代表铕、镱或钕离子；R1和R2均选自碳原子数为1至4的烷基中的任意一种基团，R3、R4、R5、R6、R7和R8均选自甲基和H中的任意一种基团。
8.根据权利要求4-7任一所述的荧光纳米粒子，其特征在于：所述基质材料与所述稀土配合物的质量比为1～10,000∶1，优选3～1000∶1，更优选3～100∶1；所述高分子共聚物的数均分子量为3,000～150,000，优选50,000～10,000，更优选10,000～70,000；所述高分子共聚物中，羧基基团占所述高分子共聚物总质量的0.01％～40％，具体为0.5-25％、0.5-15％、0.5-10％、1-25％、1-15％、1-10％、2-25％、2-15％、2-10％、3-25％、3-15％、3-10％、3-5％、2-3％、2-5％、5-25％、5-15％或5-10％，优选0.05-20％；所述荧光纳米粒子的粒径为10～200纳米，具体为12-180nm、12-145nm、12-100nm、22-180nm、22-145nm、22-100nm、30-180nm、30-145nm、30-100nm、35-180nm、30-145nm、30-100nm、35-180nm、35-145nm、35-100nm、40-180nm、40-145nm、40-100nm、45-180nm、58-180nm、75-180nm、80-180nm、100-180nm、145-180nm、22-80nm、30-80nm或40-80nm，优选12-120nm。
9.一种制备权利要求4-8任一所述荧光纳米粒子的方法，包括如下步骤：
1)将所述稀土配合物和所述基质材料溶于能与水混溶的有机溶剂中，得到所述稀土配合物和所述基质材料的有机溶液；
2)将所述步骤1)得到的有机溶液与水混匀，得到溶胶a；
3)除去所述溶胶a中的有机溶剂，离心分离后，将沉淀重新分散于水或缓冲溶液中，得到分散于水或缓冲溶液中的权利要求4-8中任一所述的荧光纳米粒子。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述稀土配合物的浓度为1×10-4～10g/L，优选0.01～3g/L；所述基质材料的浓度为1×10-4～100g/L，优选0.01～10g/L；所述能与水混溶的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的至少一种；
所述步骤2)中，所述水的体积为所述步骤1)得到的有机溶液体积的1～1000倍，优选5～100倍；
所述步骤3)中，所述除去所述溶胶a中的有机溶剂的步骤中，温度为4～100℃，优选4～80℃；所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液和碳酸盐缓冲溶液中的至少一种。
11.权利要求4-8任一所述荧光纳米粒子在制备纳米荧光生物探针或生物成像发光标记物中的应用。
12.权利要求4-8任一所述荧光纳米粒子分散于水或缓冲溶液中形成的胶体溶液。
13.根据权利要求12所述的胶体溶液，其特征在于：所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液和碳酸盐缓冲溶液中的至少一种。
14.权利要求12或13任一所述胶体溶液在制备纳米荧光生物探针或生物成像发光标记物中的应用。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103127889A (zh) * 2011-11-29 2013-06-05 北京大学 制备功能纳米粒子的减压诱导微射流混合法及其应用
CN104962021A (zh) * 2015-07-14 2015-10-07 苏州科淼新材料有限公司 一种新型夜光复合材料
CN105037662A (zh) * 2015-06-30 2015-11-11 陕西师范大学 一种光固化制备铕键合型荧光纳米二氧化硅微球的方法
CN105324667A (zh) * 2013-06-19 2016-02-10 柯尼卡美能达株式会社 生物体分子染色用的荧光纳米粒子及其制造方法
CN105778642A (zh) * 2016-03-15 2016-07-20 大连理工大学 一种水溶液中荧光稳定的稀土超疏水涂层的制备方法
CN105973472A (zh) * 2015-03-12 2016-09-28 北京大学 一种近红外荧光温度传感方法和材料
CN106537124A (zh) * 2014-05-14 2017-03-22 新加坡科技研究局 丙烯酸的检测
CN107064007A (zh) * 2017-06-27 2017-08-18 中国计量科学研究院 时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板及其制备和使用方法
CN110075767A (zh) * 2019-04-18 2019-08-02 天津大学 长余辉水凝胶及制备方法
CN111187256A (zh) * 2020-02-24 2020-05-22 北京工业大学 一种三嗪三吡唑化合物及其制备方法和应用
US20210061820A1 (en) * 2017-12-28 2021-03-04 Sekisui Chemical Co., Ltd. Metal complex particles and immunoassay reagent using same
CN115791727A (zh) * 2022-11-26 2023-03-14 吉林大学 脂溶性荧光探针在神经元死亡检测中的应用和检测方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2945159A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Wake Forest University Composite polydots and applications thereof
CN105440230B (zh) * 2016-01-06 2017-10-13 青岛大学 一种有机稀土固体胶束及其制备方法和提高太阳能电池光电转化效率的方法
US10527627B2 (en) * 2016-10-17 2020-01-07 New Life Medicine Technology Company Limited Urinary polyamines as prostate cancer detection biomarkers
CN108586505B (zh) * 2018-07-03 2020-12-04 广州工程技术职业学院 基于两个不同第一配体的铕配合物红光材料及制备方法
CN112480426B (zh) * 2020-12-09 2021-12-03 平顶山学院 一种用于铜离子和pH检测的金属有机框架材料及其制备方法和用途
CN115112730B (zh) * 2022-07-14 2024-05-24 山东理工大学 一种基于镧系金属配合物发光体的适配体传感器制备方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0915857A (ja) * 1995-06-29 1997-01-17 Hitachi Chem Co Ltd 着色画像形成材料、これを用いた感光液、感光性エレメント及びカラーフィルタの製造法
CN1278534A (zh) * 2000-06-13 2001-01-03 复旦大学 荧光标记的高分子微球及其制备方法
CN1298807C (zh) 2002-11-01 2007-02-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用
CN1200046C (zh) * 2003-01-28 2005-05-04 南京师范大学 纳米发光复合材料及其制备方法
BRPI0404073A (pt) * 2004-06-29 2006-02-21 Petrus D Amorim Santa Oliveira nanosonda de resposta imunológica
CN1304523C (zh) 2005-11-30 2007-03-14 东南大学 基于荧光能量转移原理发光的稀土纳米粒子及制备方法
DE102005062027A1 (de) * 2005-12-22 2007-06-28 Basf Ag Wässrige Dispersionen von Polymeren, die einen Fluoreszenzfarbstoff enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zum Markieren von Materialien
CN1966534A (zh) 2006-10-25 2007-05-23 东华大学 无机－有机核壳式稀土高分子材料及其制备方法
US20110117020A1 (en) * 2008-02-28 2011-05-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Imaging dendrimer nanoprobes and uses thereof
CN101899038B (zh) * 2009-05-31 2013-07-31 北京大学 近红外发光离子配合物及其制备方法

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103127889B (zh) * 2011-11-29 2016-01-13 北京大学 制备功能纳米粒子的减压诱导微射流混合法及其应用
CN103127889A (zh) * 2011-11-29 2013-06-05 北京大学 制备功能纳米粒子的减压诱导微射流混合法及其应用
US11054417B2 (en) 2013-06-19 2021-07-06 Konica Minolta, Inc. Fluorescent nanoparticles for biomolecular staining and manufacturing method for same
CN105324667A (zh) * 2013-06-19 2016-02-10 柯尼卡美能达株式会社 生物体分子染色用的荧光纳米粒子及其制造方法
CN105324667B (zh) * 2013-06-19 2018-08-24 柯尼卡美能达株式会社 生物体分子染色用的荧光纳米粒子及其制造方法
CN106537124A (zh) * 2014-05-14 2017-03-22 新加坡科技研究局 丙烯酸的检测
CN105973472A (zh) * 2015-03-12 2016-09-28 北京大学 一种近红外荧光温度传感方法和材料
CN105037662A (zh) * 2015-06-30 2015-11-11 陕西师范大学 一种光固化制备铕键合型荧光纳米二氧化硅微球的方法
CN104962021A (zh) * 2015-07-14 2015-10-07 苏州科淼新材料有限公司 一种新型夜光复合材料
CN105778642A (zh) * 2016-03-15 2016-07-20 大连理工大学 一种水溶液中荧光稳定的稀土超疏水涂层的制备方法
CN107064007A (zh) * 2017-06-27 2017-08-18 中国计量科学研究院 时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板及其制备和使用方法
CN107064007B (zh) * 2017-06-27 2024-04-02 中国计量科学研究院 时间分辨荧光酶标分析仪测试标准板及其制备和使用方法
US20210061820A1 (en) * 2017-12-28 2021-03-04 Sekisui Chemical Co., Ltd. Metal complex particles and immunoassay reagent using same
CN110075767A (zh) * 2019-04-18 2019-08-02 天津大学 长余辉水凝胶及制备方法
CN110075767B (zh) * 2019-04-18 2021-08-27 天津大学 长余辉水凝胶及制备方法
CN111187256A (zh) * 2020-02-24 2020-05-22 北京工业大学 一种三嗪三吡唑化合物及其制备方法和应用
CN115791727A (zh) * 2022-11-26 2023-03-14 吉林大学 脂溶性荧光探针在神经元死亡检测中的应用和检测方法

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