CN1278534A - 荧光标记的高分子微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种吸附或键合有荧光分子或荧光探针的荧光标记高分子微球及其制备方法。现有技术中荧光标记的高分子微球局限于无机或金属粒子,合成效率低、成本高。本发明用高分子合成方法制得从纳米级到微米级高分子微球并吸附或键合有荧光分子或荧光探针,本发明方法效率高,成本低,使制得的微球作为荧光信号放大的载体,在生命科学领域有广泛用途。

Description

荧光标记的高分子微球及其制备方法

本发明是一种吸附或者键合有荧光分子或荧光探针的荧光标记高分子微球及其制备方法。

高分子微球具有许多独特的优点：比表面积大；微球粒径大小均一且可控制；聚合物来源广泛，包括天然及合成高分子；可选择各种共聚功能单体和聚合工艺，进行高分子微球设计等。因此，功能化的高分子微球(Functionalized PolymericMicrospheres)可广泛应用于许多领域，如生物化学和生物医学方面的药物定向输送，医用胶乳试剂，生物分子标记与示踪等，高性能聚合物涂料与油墨，有机／无机复合材料(Polymer Composites)，微胶囊化，聚合物微孔材料，催化、吸附及分离载体(如色谱柱填料)，以及作为信息工业和微电子工业等用途的尖端材料，此方向的研究已成为近年来的在材料学，高分子化学与物理学，生物学及生命学科等交叉学科领域的前沿命题，在生物、医学、药学、食品、化工等方面具有广泛的应用前景。

高分子微球的尺度可分为纳米级，亚微米级和微米级等。不同粒径的微球对应于不同的用途。多年来的研究表明，高分子微球可在胶体分散体系中进行聚合制备(其产物亦称聚合物胶粒，Latex particles)：如较为成熟的乳液聚合(EmulsionPolymerization)方法可制备亚微米级微球；分散聚合(Dispersion Polymerization)可合成微米级单分散高分子微球；兴起于八十年代初的微乳液聚合则是一种直接制备5-80nm聚合物纳米粒子的简单易行的新型聚合方法。微球的尺寸和结构(如核壳结构等)可通过不同的聚合方法及反应条件加以控制。荧光纳米微球的研究报导也仅局限于无机或金属纳米粒子，见J．Phys．Chem．B，1999，103，9080)，但存在着浓度稀，合成效率低，成本高的不足，而且由于微球制备的效率低，使荧光标记的效果也大大下降。一般来说，目前探针的标记方法主要有两种：放射性同位素标记及非放射性标记。其中放射性同位素的缺点是易造成放射性污染，非放射性标记则面临着重复性差，成本高，或灵敏度较低等问题。

本发明的目的是发明一种荧光标记的高分子微球。

本发明的目的是发明一种方法简便、效率高的荧光标记的高分子微球的制备方法，包括微球制备和微球的荧光标记。

本发明的荧光标记的高分子微球有三种尺寸大小：纳米级高分子微球是5-60nm，亚微米级高分子微球尺寸是60nm-1μm，微米级高分子微球尺寸是1μm-20μm，在上述高分子微球上吸附或者化学键合有荧光染料分子或荧光探针分子，该类微球可用于生物分子研究中的荧光探针，实现荧光信号的可控放大。

本发明用微乳液聚合方法制备高分子纳米微球，包括正相(水包油，O／W)体系制备疏水聚合物纳米微球，如聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯等；反相(油包水，W／O)体系可制备亲水性聚合物纳米微球如聚丙烯酰胺，聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸羟乙酯等。正相体系制备纳米微球采用一种改进的高固含量微乳液聚合方法：先将少量约1／3的单体、乳化剂、连续相配成均相微乳液，将该微乳液搅拌并升温至25-80℃，然后体系通N₂气5-10分钟后加入引发剂，同时将剩余单体、功能单体逐滴加入反应体系中，维持1-6小时内滴完，以400-650转／分速度搅拌，滴加完毕继续反应0．5-3．5小时即可。反应体系中正相反应各反应物浓度是：乳化剂浓度0．1-30wt％，单体浓度1-50wt％，功能单体浓度0．2-20wt％，引发剂浓度0．5-10mM(以体系为100ml计算)，其余为连续相去离子水。反相反应体系将全部单体、乳化剂、水和连续相配成均相微乳液，然后搅拌升温至25-80℃，体系通N₂气后加入引发剂引发聚合，其余条件与步骤同正相体系。反相反应各反应物浓度是：乳化剂浓度2-40wt％，单体浓度1-15wt％，功能单体浓度0．2-8wt％，水的浓度2-15wt％，引发剂浓度0．5-10mM(以体系为100ml计算)，其余为油性连续相。加入功能单体的目的是使高分子微球上带反应性的官能团，这些官能团可与荧光分子化学键合，然后剩余的官能团继续与生物分子键合；或微球吸附荧光分子后，其表面官能团能与生物分子键合。不同性质和聚合活性的单体如带羧基(-COOH)的甲基丙烯酸(MAA)，丙烯酸(AA)或衣康酸(IA)等，带羟基(-OH)的甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)以及含双键的聚氧乙烯大单体等，含环氧基的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，有胺基的甲基丙烯酸胺乙酯(AEM)，甲基丙烯酸二乙胺基乙酯(DEAEM)与甲基丙烯酸叔丁基胺乙酯(TBAEM)，含醛基(-CHO)的丙烯醛(acrolein，AL)，含氰基的氰基丙烯酸酯(alkylcyanoacrylate，AN)，含异氰酸酯基(-NCO)的TMI^(dimethyl meta-isopropenyl benzyl isocyanate，美国Cytec公司)，乙烯基吡啶(vinylpyridine，VP)等等。

正相体系采用的乳化剂有阴离子型的十二烷基硫酸钠(SDS)，非离子型的壬基酚聚氧乙烯醚(NP系列)，辛基酚聚氧乙烯醚(OP系列)，吐温(Tween)，斯盘(Span)等，阳离子型的十六烷基溴化铵(CTAB)以及两亲性的卵磷脂(lecithin)，以及它们的复配体系等，另外还可加入助乳化剂如正戊醇等。单体可为St，MMA等，功能性共聚单体可为含羧基的MAA，AA或IA等，含羟基的HEMA或HPMA，以及含双键的聚氧乙烯大单体等，含环氧基的GMA，含胺基的AEM或TBAEM等，含醛基的丙烯醛，含氰基的AN，含异氰酸酯基的TMI^，乙烯基吡啶(VP)等等。采用的引发体系有水溶性的过硫酸铵(APS)，过硫酸钾(KPS)，V-50(WakoChemicals)，油溶性的过氧化二苯甲酰(BPO)，偶氮二异丁腈(AIBN)，芳基偶氮氨基化合物，芳基偶氮硫醚等，以及氧化还原引发体系如过硫酸铵(APS)／四甲基乙二胺(TMEDA)，Vitamin C／双氧水，亚铁盐／双氧水，二甲基苯胺／BPO等。

反相体系采用的乳化剂有磺基琥珀酸盐(AOT)，吐温(Tween)，斯盘(Span)，以及它们的复配体系等，还可加入一些醇类助乳化剂如丙醇(Propanol)，环己醇(Cyclohexanol)，辛醇(Octanol)等。单体可为AM，AA，MAA，NaAA，HEMA等。油性连续相采用苯类试剂如甲苯(Toluene)，二甲苯(Zylene)等，烷烃类的癸烷(decane)，庚烷(Heptane)等，以及煤油，石蜡油等等。使用的引发体系有AIBN，BPO，KPS，UV光引发剂如二苯酮(BPH)等。合成方法为常规的反相微乳液聚合，即一次性将单体、乳化剂、水和连续相配成均相微乳液，然后引发进行聚合反应，乳化剂浓度为2-40wt％，油性连续相浓度为20-70wt％，单体浓度为1-15wt％，水的浓度为2-15wt％。由于反相体系使用的多数亲水性单体自身就含有羧基、羟基等官能团，因此制备的微胶乳粒子可直接成为功能化的亲水性高分子纳米微球加以使用，其粒径在5-60nm之间。将反应获得的纳米微球按通常的吸附或者化学键合方法，结合荧光染料分子或者荧光探针分子即可。

采用常规乳液聚合制备功能化高分子亚微米级微球：正如微乳液体系一样，乳液聚合也可分为正相(水包油，O／W)和反相(油包水，W／O)乳液聚合，其体系构成如单体、乳化剂(助乳化剂)、引发剂等基本与微乳液体系相同。两者的不同之处在于乳液体系的乳化剂含量一般远低于微乳液体系，为0．1-3wt％，单体浓度一般在10-50wt％，制备的胶乳粒径在亚微米级60nm-1μm。具体的乳液聚合体系组成可参考上面的微乳液体系。

此外，我们还可利用种子乳液聚合和无皂乳液聚合制备单分散的亚微米级功能化胶乳。无皂乳液聚合制备的的功能化胶粒由于表面基本无乳化剂覆盖，十分有利于下一步的功能化。种子乳液聚合分两步进行：第一步先合成单分散的小粒径的种子乳液，第二步加入适量的单体、乳化剂充分溶胀后，加入引发剂反应。种子乳液聚合采用的体系与常规的乳液聚合配方基本一致，第二步反应只是在第一步得到的乳胶粒子上继续生长，这样便可制备尺寸较大(D＞140nm)的单分散聚合物胶乳。无皂乳液聚合即不加乳化剂直接将单体在水分散体中聚合，高分子链端的带电荷引发剂碎片等可稳定产物胶乳粒子。无皂乳液聚合体系也与常规乳液聚合相似，只是不加乳化剂，一般单体的浓度为1-15wt％，引发剂浓度为1-8mM，还经常加入一些pH调节剂如0．1-1mM的碳酸氢钠，其余为去离子水。反应得到的胶粒尺寸在数百纳米左右。然后用吸附法或者化学键合法结合荧光染料分子或荧光探针分子即可。

制备功能化的微米级微球在分散共聚合体系中进行，体系中主单体为1-40wt％，功能性单体为0．5-20wt％，分散稳定剂为0．001-3wt％，引发剂浓度范围是0．01-5wt％，此法可简便制得0．8-20μm的窄分布聚合物微球。

若在极性介质中进行的分散聚合，可制备窄分布的微米级高分子微球，极性介质如甲醇，乙醇，乙醇／水，乙醇／乙氧基乙醇等。

采用分散聚合技术制备功能化高分子微米级微球：应用的分散介质醇类如乙醇，甲醇，丙醇等，醇／水介质体系，脂肪烃类等。单体是苯乙烯类单体，甲基丙烯酸酯类单体，丙烯酸类单体以及其它类单体，如乙烯基吡啶(VP)等。功能性共聚单体可为含羧基的甲基丙烯酸(MAA)，丙烯酸(AA)或衣康酸(IA)等，含羟基的甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)，以及含双键的聚氧乙烯大单体等，含环氧基的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，有胺基的甲基丙烯酸胺乙酯(AEM)，甲基丙烯酸二乙胺基乙酯(DEAEM)与甲基丙烯酸叔丁基胺乙酯(TBAEM)，含醛基(-CHO)的丙烯醛(acrolein，AL)，含氰基的氰基丙烯酸酯(alkylcyanoacrylate，AN)，含异氰酸酯基(-NCO)的TMI^(dimethyl meta-isopropenyl benzyl isocyanate，美国Cytec公司)等等。引发剂是油溶性的过氧化二苯甲酰(BPO)，偶氮二异丁腈(AIBN)，芳基偶氮氨基化合物，芳基偶氮硫醚等，以及氧化还原引发体系如过硫酸铵(APS)／四甲基乙二胺(TMEDA)，Vitamin C／双氧水，亚铁盐／双氧水，二甲基苯胺／BPO等。分散稳定剂有聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，羟基纤维素类(如HPC)和聚丙烯酸(PAA)等，以及AB型和ABA型嵌段共聚物(如PSt-b-PHEMA)。制得的微米级微球用吸附法或者化学键合法结合荧光染料分子或荧光探针分子即可。

本发明合成过程采用的常规主单体如苯乙烯(St)，甲基丙烯酸酯类单体如甲基丙烯酸甲酯(MMA)等，及亲水性单体丙烯酰胺类单体如丙烯酰胺(AM)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，丙烯酸(AA)，丙烯酸钠(NaAA)，甲基丙烯酸(MAA)等；交联剂为二甲基丙烯酸酯类(如EGDMA)，三甲基丙烯酸酯类，二乙烯基苯(DVB)等；另外还使用一些不同性质官能团和聚合活性的功能单体。

在上述高分子微球上结合荧光染料分子(Fluorescent Dyes)或其它荧光探针分子，便可以得到从纳米至微米级尺度的荧光高分子微球。荧光分子与微球的结合方式可分为吸附和化学键合两种。可广泛采用各种荧光分子如荧光素(Fluorescein，如FITC等)，若丹明(Phodamine，如Rhodamine Red-X，Rhodamine 6G)，青色素(Cyaninedyes，如Cy2，Cy3，Cy5)，Texas Red(TR)，Tetramethyl RhodamineIsothiocyanate(TRITC)，YOYO，Nile系列(Blue，red等)(胺基)，蛋白荧光试剂如二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)，荧光胺等，或荧光探针分子芘(Pyrene)，或改性的芘类探针如PyCOR_f，pyranine等。

本发明吸附法结合荧光分子的条件是将高分子微球加入含荧光染料分子或荧光探针分子的乙醇溶液中，此吸附液中一般荧光分子的浓度是0．1-1wt％，将4．5-8ml浓度是0．5-2wt％高分子微球稀释液加入0．5ml荧光分子的乙醇溶液中，在20-50℃温度下搅拌2-5小时，然后移入透析袋中透析4-6天，以除去未吸附的荧光分子和少量游离的乳化剂分子及引发剂碎片离子。产物用pH=7-7．5的40-50mM磷酸缓冲液稀释10³-10⁴倍即可。

化学键合法的条件是将聚合好的高分子胶乳破乳，离心沉淀。分离沉淀物，用水洗涤沉淀物，再在真空烘箱中干燥以除去小分子，提高制备效率，然后在荧光分子的溶液中反应3-5小时，反应温度40-70℃，反应结束后再将产物反应液分散滴加入水中，待有微球析出时收集微球，再加入少量乳化剂如壬基酚聚氧乙烯醚(NP)或吐温(Tween)，重新分散至pH=7-7．5的40-50mM磷酸缓冲液中稀释10³-10⁴倍即可。反应液中高分子微球浓度是0．1-1wt％，荧光分子浓度是0．01-0．1wt％，反应溶剂可以是酮类如丁酮。带羟基的功能化高分子微球与荧光分子FITC的化学键合反应可用以下示意图表示：

羟基功能化高分子纳米微球与FITC在丁酮中的反应

高分子微球化学键合荧光染料分子或荧光探针分子也可以在惰性溶剂中进行，如二甲苯、醋酸丁酯等。

荧光高分子微球表面剩余的官能团可与生物分子上的官能团发生化学键合反应而产生牢固的偶合。可将荧光高分子微球分散于缓冲液中，通过直接键合，偶联试剂或活化试剂与生物分子结合。例如微球表面的-COOH可在DCCI存在下，用N-羟基琥珀酰亚胺活化，与生物分子如蛋白上的-NH₂发生反应而键合；微球上的-NH₂可用戊二醛偶联与蛋白上的-NH₂键合；微球上的-OH也可与生物分子上的-COOH反应键合，或与溴化氰生成亚胺再与生物分子上的氨基键合，等等。

已接上荧光分子的高分子微球还可与一些非放射性标记物通过化学键合或吸附法进一步功能化，成为荧光微球探针，如生物素(biotin)或亲和素(avidin)，地高辛(digoxigenin)，光生物素(photobiotin)，补骨脂素，接一些抗体或抗原、受体或配基及蛋白等等。例如亲和素可以很强地吸附于PSt或PMMA微球上。需要时也可接一段较长的连接臂(Spacer)，使荧光标记微球与生物分子连接时不会因臂短而产生构象障碍或导致失活，可采用的试剂为EZ-link^TMNHS-LC-Biotin(Pierce，Co．)或两端基为-NHS的偶联试剂，对含羟基微球也可先与溴化氰反应，再用ε-氨基葵酸作为“手臂”，产物的端羧基活化后便可与生物分子的氨基反应而键合。经亲和素修饰的荧光微球可与生物素化的寡核苷酸链或DNA链产生特异性结合，用于DNA微矩阵(DNAMicroarray)及基因芯片的荧光信号检测，可通过荧光信号的放大，提高检测灵敏度。

本发明合成的荧光高分子微球的突出特点是高分子微球作为荧光信号放大的载体，即每个微球上连接了大量荧光分子，其用途十分广泛，至少在以下生命科学的前沿领域有着极有吸引力的产业化实用价值：其一为基因芯片(Genomic Chips)或生物芯片(Bio-chips)的荧光信号放大载体，成为结构和功能基因组学研究的有力工具。目前，基因芯片技术中原位杂交荧光检测采用的是单荧光分子PCR的标记手段，寡聚核苷酸链(Oligonucleotide)上只能标记很有限的荧光分子(如Cyanine dyes，Fluorescein等)，因此荧光信号很弱，需要采用激光共聚焦显微镜等复杂的荧光检测技术，设备价格昂贵且检测过程需很长时间，效率较低。纳米级高分子微球的尺寸与生物分子如核苷酸，蛋白质等尺度相当，表面连接或包埋大量荧光分子(10-10³个数量级／微球)的此类聚合物微球接于DNA核苷酸链上，便可替代以上的传统芯片杂交荧光标记技术，并实现荧光信号呈数量级的放大，用一般的荧光显微镜加CCD图象分析系统就能快速简便进行检测，从而大为降低基因芯片的成本，为其大规模普遍的临床应用铺平道路，具有突破性意义。其二为不同粒径的荧光高分子微球在细胞组织功能，分子生物学，蛋白质功能组学，酶固定和临床诊断等方面的广泛应用价值。荧光高分子微球同样可标记蛋白质及活性的生物分子或组织如细胞等，并实现在活性条件下的示踪，也可固定蛋白质分子并跟踪其功能化过程等等。

本发明采用微乳液、乳液和分散聚合方法可制得从纳米级到微米级的高分子微球，方法简便，效率提高，且合成的荧光高分子微球对生物组织细胞无特异亲合性，对探针杂交影响甚小或基本无影响，在生命科学领域中有重要的应用价值和发展前景。

实施例一：含羧基荧光高分子纳米微球的制备

荧光高分子纳米微球的制备可分为两个步骤：微乳液聚合方法合成功能化纳米微球及纳米微球接上荧光分子。1．微乳液聚合制备功能化纳米级高分子微球

采用改进型高固含量微乳液聚合技术合成高浓度的功能化高分子纳米胶乳。实施例一具体采用的微乳液聚合体系参见下表：

表1．微乳液聚合制备含羧基的高分子纳米胶乳体系配方(每100份重量)^*

	单体	交联剂	功能单体	乳化剂	助乳化剂	连续相	引发剂
								组成	St	DVB	AA	SDS	1-Pentanol	去离子水	KPS
含量	8％	0．2％	0．8％	1．5％	0．2％	88．3％	2mM

^*比例为重量百分数，反应温度60℃。

合成步骤为：先将少部分St单体与乳化剂、助乳化剂、去离子水配成均相透明的微乳液(预微乳液)；将预微乳液搅拌并升温至60℃，体系通氮气5分钟，加入引发剂，引发体系开始聚合；引发开始后，即将大部分单体，全部交联剂和功能单体的混合液以很慢速度逐滴滴入正在聚合的体系中，维持60℃和N₂氛，搅拌速度约为600转／分，1-4小时滴完。然后继续反应1-3小时，使单体反应完全，结束反应。微胶乳产物为淡蓝色半透明状胶乳，用Malvem 4700光散射仪测得胶乳粒子的粒径为28nm，微球表面含羧基。2．荧光高分子纳米微球的制备

实施例一采用的荧光分子为FITC，可通过吸附作用或直接化学键合与含羧基纳米微球结合。

吸附法：将4．5ml浓度为0．5-2wt％微球带羧基的高分子纳米胶乳加入0．5mlFITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持搅拌。体系搅拌2-5小时后移入透析袋中透析4-6天，以除去未吸附的荧光分子和少量游离的乳化剂分子及引发剂碎片离子。产物用pH=7．5的50mM磷酸缓冲液稀释10⁴倍，即可用于生物分子的标记。

化学键合法：功能化高分子纳米胶乳用大量甲醇破乳，离心沉淀。沉淀物分离出来后用大量的水和甲醇反复洗涤数次，然后在真空烘箱中干燥以除去小分子。整个分离纯化过程温度控制低于50℃。FITC所含-NCS可与微球上的羧基产生化学反应而键合，反应在40-70℃的丁酮溶液中进行，FITC量为2mg，羧基微球的浓度为5mg／ml(丁酮)，反应可在惰性有机溶剂如二甲苯、醋酸丁酯、酮类等中进行，反应3-5小时后停止。将荧光高分子微球的丁酮分散液逐滴加入水中，在界面处有固体微球析出，收集这些微球再加少量NP或Tween乳化剂重新分散至pH=7．5的50mM磷酸缓冲液，稀释10³倍后即可用于生物分子的标记。另外，还可将将亲和素(Avidin)加入纳米级荧光微球分散液，通过蛋白的强吸附作用进一步功能化，成为亲和素标记的荧光高分子微球，可与生物素(biotin)特异性结合，作为生物分子如核酸杂交的荧光探针。实施例二：含羟基与吡啶基的荧光高分子纳米微球的制备1．微乳液聚合制备功能化纳米级高分子微球

如上例仍采用改进型高固含量微乳液聚合技术，具体采用非离子乳化剂壬基酚聚氧乙烯醚(NP系列)，及氧化还原引发的微乳液聚合体系，参见下表：表2．微乳液聚合制备含羧基与吡啶基的高分子纳米胶乳体系配方(每100份重量)^*

	单体	功能单体1	功能单体2	乳化剂	复配乳化剂	连续相	引发剂
								组成	St	HEMA	VP	NP 40NP 10	SDS	去离子水	APS／TMEDA
含量	8％	0．6％	0．8％	3．8％	0．1％	86．5％	2mM

^*比例为重量百分数，反应温度25℃。

合成步骤为：先将少部分St单体与复配乳化剂、去离子水配成均相透明的微乳液(预微乳液)；将预微乳液搅拌并恒温在25℃，体系通氮气5分钟，加入引发剂，引发体系开始聚合；引发开始后，先将大部分单体逐滴缓慢加入正在聚合的体系中，滴至一半时，将功能单体的混合液以很慢速度逐滴滴入，维持25℃和N₂氛，搅拌速度约为600转／分，1-4小时滴完。然后继续反应1-3小时，使单体反应完全，结束反应。2．荧光高分子纳米微球的制备

采用离子键合法，即利用微球表面的吡啶基与FITC的羧基之间在酸催化条件下可离子键合，将荧光染料分子FITC接于高分子纳米微球上，微球表面的羟基可经活化后接上生物分子。具体步骤为：将微球带羟基与吡啶基的高分子纳米胶乳加入FITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持搅拌。体系搅拌2-5小时后移入透析袋中透析4-6天，以除去未反应的荧光分子和少量游离的乳化剂分子及引发剂碎片离子。产物用pH=7．5的50mM磷酸缓冲液稀释10⁴倍，即可用于生物分子的标记。实施例三：含羧基亚微米级荧光高分子微球的制备

亚微米级荧光高分子微球的制备同上可分为两个步骤：乳液聚合方法合成功能化亚微米级微球及亚微米级微球接上荧光分子。1．乳液聚合制备功能化亚微米级高分子微球

乳液聚合适于制备亚微米级高分子微球，其采用的体系基本与微乳液聚合相同。

表3．乳液聚合制备含羧基的高分子纳米胶乳体系配方(每100份重量)^*

	单体	交联剂	功能单体	乳化剂	调节剂	连续相	引发剂
								组成	St	DVB	AA	AerosolMA	NaHCO3	去离子水	KPS
含量	30％	1％	2．2％	1．0％	0．1％	65．7％	3．6mM

^*比例为重量百分数，反应温度90℃。

合成步骤为：1．5g2-异辛基丁二酸磺酸钠(Aerosol MA，or AMA)和0．1gNaHCO₃溶于55．7g去离子水中，加入30g苯乙烯单体，1g交联剂DVB，于90℃通N₂条件下，搅拌乳化1h，将引发剂KPS溶于10g去离子水中，加热至90℃后，一次加入反应器，恒温90℃，引发开始半小时后，逐滴加入功能单体AA，滴完后反应10h，得到含羧基的聚苯乙烯胶乳产物，胶粒尺寸在70nm左右。2．亚微米级荧光高分子微球的制备

如前例所示，荧光分子FITC可通过吸附作用或直接化学键合与含羧基亚微米级微球结合。

吸附法：将4．5ml浓度为0．5-2wt％微球带羧基的高分子胶乳加入0．5ml FITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持搅拌。体系搅拌2-5小时后移入透析袋中透析4-6天，以除去未吸附的荧光分子和少量游离的乳化剂分子及引发剂碎片离子。产物用pH=7．5的50mM磷酸缓冲液稀释10⁴倍，即可用于生物分子的标记。

化学键合法：功能化亚微米级高分子胶乳用大量甲醇破乳，离心沉淀。沉淀物分离出来后用大量的水和甲醇反复洗涤数次，然后在真空烘箱中干燥以除去小分子。FITC所含-NCS可与微球上的羧基产生化学反应而键合，反应在40-70℃的丁酮溶液中进行，FITC量为2mg，羧基微球的浓度为5mg／ml(丁酮)，反应也可在惰性有机溶剂如二甲苯、醋酸丁酯、酮类等中进行，反应3-5小时后停止。将荧光高分子微球的丁酮分散液逐滴加入水中，在界面处有固体微球析出，收集这些微球再加少量NP或Tween乳化剂重新分散至pH=7．5的50mM磷酸缓冲液，稀释10³倍后即可用于生物分子的标记。实施例四：含醛基亚微米级单分散荧光高分子微球的制备1．采用无皂乳液聚合方法制备无皂单分散或窄分布亚微米级高分子微球。体系配方为：

表4．无皂乳液聚合制备含醛基的亚微米级单分散高分子胶乳体系配方^*

	单体	交联剂	功能单体	连续相	引发剂
						组成	St	DVB	AL	去离子水	V-50
含量	1．5g	0．1g	1．2g	2000ml	5．5mM

^*反应温度60℃。

合成步骤为：将St单体，交联剂DVB，功能单体丙烯醛及引发剂V-50混合加入去离子水中，通氮气10min后升温至60℃开始反应，维持搅拌反应8小时，得粒径为150nm左右的含醛基无皂PS胶乳。

无皂乳液聚合制备的亚微米级聚合物胶乳的特点为胶粒粒径窄分布且表面不含乳化剂，清洁的表面易于后处理以直接连接生物活性分子。2．亚微米级单分散荧光高分子微球的制备

采用吸附法制备含醛基的亚微米级单分散荧光高分子微球：将4．5ml浓度为0．5-2wt％带醛基的亚微米级无皂高分子胶乳加入0．5ml FITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持搅拌。体系搅拌2-5小时后移入透析袋中透析4-6天，以除去未吸附的荧光分子及引发剂碎片离子。产物用pH=7．5的50mM磷酸缓冲液稀释10³倍，即可用于生物分子的标记。荧光微球表面的醛基在下一步可在缓冲液中与生物分子如蛋白上的-NH₂键合，从而实现生物分子的荧光标记。另外，还可将将亲和素(Avidin)加入亚微米级荧光微球分散液，通过蛋白的强吸附作用进一步功能化，成为亲和素标记的荧光高分子微球，可与生物素(biotin)特异性结合，作为生物分子如核酸杂交的荧光探针。实施例五：含胺基微米级单分散荧光高分子微球的制备1．采用分散聚合方法制备功能化的单分散高分子微球。体系组成参见下表5：

表5．乳液聚合制备含羧基的高分子纳米胶乳体系配方(每100份重量)^*

	单体	交联剂	功能单体	分散剂	连续相	引发剂
							组成	St	DVB	AEM	PVP	乙醇／水	AIBN
含量	12．4％	0．2％	1．5％	0．6％	75％／10％	0．3％

^*反应温度70℃．聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，甲基丙烯酸胺乙酯(AEM)

合成步骤为：先称取PVP、AEM溶于乙醇／水介质中，再称取AIBN、DVB溶于苯乙烯中。然后将乙醇溶液和苯乙烯溶液转移至250ml装有温度计、机械搅拌器和冷凝管的四颈瓶中，通入N₂在常温下搅拌30分钟，搅拌速度约为600转／分。然后升温至70℃，开始反应。控制反应温度和N₂流速，聚合24小时。反应结束后，自然冷却至室温，得到的聚合产物粒子的粒径为1．5μm左右。

取分散聚合制得的胶乳10ml置于40ml离心管中，再加入25ml乙醇／水(重量比为20．1)混合溶剂混合，在高速离心机中离心沉淀15分钟，转速为8000转／分。弃去上层清液，再加入35ml乙醇／水混合溶剂洗涤，再次离心，如此重复三次，然后将固体物配成一定浓度的乙醇分散液待用，或加少量乳化剂重新在水中分散为微米级高分子分散体。2．微米级单分散荧光高分子微球的制备

采用吸附法制备含胺基的微米级单分散荧光高分子微球：将4．5ml浓度为0．5-2wt％带胺基的微米级高分子分散体加入0．5ml FITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持搅拌。体系搅拌2-5小时后离心将荧光微球分离，并用乙醇和水交替反复洗涤。产物用pH=7．5的50mM磷酸缓冲液稀释10⁴倍(还可加少量NP或Tween乳化剂)，即可用于生物分子的标记。荧光微球表面的胺基在下一步可在缓冲液中加活化偶联试剂如戊二醛与生物分子如蛋白上的-NH₂键合，从而实现生物分子的荧光标记。

另外，还可将将亲和素(Avidin)加入微米级荧光微球分散液，通过蛋白的强吸附作用进一步功能化，成为亲和素标记的荧光高分子微球，可与生物素(biotin)特异性结合，作为生物分子如核酸杂交的荧光探针。

化学键合法：FITC所含-NCS可与洗涤后得到的微米级聚合物微球上的胺基产生化学反应而键合，反应在40-70℃的丁酮溶液中进行，FITC量为2mg，胺基微球的浓度为5mg／ml(丁酮)，反应也可在惰性有机溶剂如二甲苯、醋酸丁酯、酮类等中进行，反应3-5小时后停止。将荧光高分子微球的丁酮分散液逐滴加入水中，在界面处有固体微球析出，收集这些微球再加少量NP或Tween乳化剂重新分散至pH=7．5的50mM磷酸缓冲液，稀释10²倍后即可用于生物分子的标记。

Claims (10)

1．一种荧光标记的高分子微球，由高分子微球和荧光分子组成，其特征是纳米级高分子微球的尺寸是5-60nm，亚微米级高分子微球尺寸是60nm-1μm，微米级高分子微球尺寸是1-20μm，在上述高分子微球上吸附或者化学键合有荧光染料分子或荧光探针分子。

2．一种荧光标记的纳米级高分子微球的制备方法，其特征是在微乳液反应体系中进行，对于正相反应体系，先将少量单体、乳化剂、连续相配成均相微乳液，将微乳液搅拌并升温至25-80℃，体系通N₂后加入引发剂，然后将剩余单体、功能单体逐滴加入反应体系中，1-6小时滴完，以400-650转／分速度搅拌，滴加完毕继续反应0．5-3．5小时，其中

正相反应：    乳化剂浓度：  0．1-30wt％

              单体浓度：    1-50wt％

              功能单体浓度：0．2-20wt％

              引发剂浓度：0．5-10mM(以体系为100ml计算)

              其余为去离子水对于反相反应体系，将单体、乳化剂、水和连续相配成均相微乳液，然后搅拌并升温至25-80℃，体系通N₂后加入引发剂引发聚合，其它条件与步骤同正相体系，其中

反相反应：    乳化剂浓度：    2-40wt％；

              单体浓度：      1-15wt％

              功能单体浓度：  0．2-8wt％

              水的浓度：      2-15wt％

              引发剂浓度：0．5-10mM(以体系为100ml计算)

             其余为油性连续相聚合物微球制成后在微球上吸附或键合荧光染料分子或荧光探针分子即可。

3．一种荧光标记的亚微米级高分子微球的制备方法，其特征是在乳液聚合体系中进行，其乳化剂浓度是0．1-3wt％，单体浓度是10-50wt％，聚合物微球制成后在微球上吸附或键合荧光染料分子或荧光探针分子。

4．根据权利要求3所述的荧光标记的亚微米级高分子微球的制备方法，其特征是用种子乳液聚合或无皂乳液聚合制得单分散亚微米级高分子微胶乳。

5．一种荧光标记的微米级高分子微球的制备方法，其特征是在分散聚合体系中进行，体系中主单体浓度是1-40wt％，功能性单体的浓度是0．5-20wt％，分散剂的浓度是0．001-3wt％，引发剂的浓度是0．01-5wt％，微球制成后吸附或键合荧光染料分子或荧光探针分子。

6．根据权利要求4所述的荧光标记的微米级高分子微球的制备方法，其特征是分散共聚合是在极性介质中进行。

7．根据权利要求2，3，5所述的荧光标记的高分子微球的制备方法，其特征是在高分子微球上吸附或者化学键合荧光染料分子或荧光探针分子，吸附条件是：将高分子微球加入分散有荧光分子的乙醇溶液，吸附液中荧光分子浓度是0．1-1wt％，高分子微球浓度是0．5-2wt％，在20-50℃下，搅拌后透析，产物用磷酸缓冲液稀释即可，化学键合条件是：将聚合好的高分子微球乳液破乳，沉淀，分离沉淀后在荧光分子的溶液中反应3-5小时，反应温度40-70℃，微球浓度是0．1-1wt％，荧光分子浓度是0．01-0．1wt％，将该反应液逐滴加入水中分散，收集析出的固体微球，再加入乳化剂分散至磷酸缓冲液，稀释即可。

8．根据权利要求7所述的荧光标记的高分子微球的制备方法，其特征是高分子微球上化学键合荧光染料分子或荧光探针分子是在惰性溶剂中进行。

9．根据权利要求7所述的荧光标记的高分子微球的制备方法，其特征是荧光高分子微球与生物分子结合。

10．根据权利要求7所述的荧光标记的高分子微球的制备方法，其特征是荧光高分子微球与非放射性标记物结合。