CN101009192B - 光子计数方法和设备 - Google Patents
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Abstract
考虑灵敏地、线性地和准确地对单个光子计数的光子计数电子装置和方法。用于对进入光电倍增管的光子数准确计数的方法，包含步骤：对由光子产生的电子脉冲数目计数；用定时时钟测量电子脉冲的持续时间，其中定时时钟能够对时间上交迭的光子数目计数；用强度鉴别器测量电子脉冲的强度，其中强度鉴别器能够对强度交迭的光子数目计数；以及将电子脉冲数目、时间上交迭的光子数目以及强度交迭的光子数目求和，所述和等于光子总数。
Description
技术领域
本发明涉及光子计数电子装置和方法，该电子装置和方法考虑灵敏地、线性地和精确地对单光子计数。本发明包括这样的装置和方法，其用于使用定时计数器和强度鉴别器测量交迭的脉冲，因此改善准确计数光子的能力。该光子计数方法可以在用于光子检测的各种光学设备(如发光计或荧光分析仪)中实现。
背景技术
发光方法已经用作光学方法来确定分析物或分子的数量。发光反应具有范围很广的分析和生物学应用，该发光反应包括光发射化学反应(化学发光、CL)、光发射生物反应(生物发光、BL)以及电致发光。发光分析(assay)的优点包括：由于在光子计数和酶放大的当前技术的很高的灵敏度，在几秒中产生的快速信号，以及分析不需要外部激励光源。在很多情况下，这些过程正代替放射性核素(nuclide)的使用。由于发光剂(agent)变得更有效，因此有更多的研究正利用发光分析作为分析工具。已经开发了化学发光基底，如二氧环杂丁烷、氨基苯二酰一肼、吖啶鎓(acridinium)酯和酰肼(hydrazide)。这些化合物由水解酶催化并且产生的产物发光。生物发光反应通常比化学发光更有效。BL通常与萤火虫荧光素酶相关联。AquaLite(SeaLite Sciences，Georgia)是来自水母的发光蛋白的一种重组(recombinant)形式。可以触发它在几秒内的单一步骤中产生其所有的光。已经为很多酶标记物(碱性磷酸(酯)酶(alkalinephosphatase)、半乳糖苷酶(galactosidase)、辣根过氧(化)物酶(horseradishperoxidase)等)开发CL和BL方法。这些酶与用于随后的基底反应的二级抗体或分析物共轭。
在典型的夹心免疫测定(sandwich immunoassay)中，分析物被夹在所述抗体共轭体和固定不动的探针之间。在任何时间的发光强度是用于阳性标识(positive identification)的分析物或酶共轭体的浓度的直接测量。新开发的二氧环杂丁烷提供600分子(10-21摩尔)的检测灵敏度，使它比基于荧光的分析灵 敏几个量级。酶用于催化发光反应，而不是发光物质(species)直接附加到目标分析物或它绑定(binding)的共轭物(partner)。只要存在足够的基底，酶的催化转换(turnover)能力允许每秒发生几千个可能的发光反应。在使用基于二氧环杂丁烷的化合物(如Lumigen公司(Southfield，Michigen)的Lumi-PPD和Lumi-PS-1)的解决方案中，可以检测少于10-21摩尔的碱性磷酸(酯)酶。当Lumi-PPD被添加到包含碱性磷酸(酯)酶的微井(microwell)时，产生的化学发光在5-10分钟后达到最大，并且保持一个多小时不变。商业上可以得到各种发光检测设备(例如，发光计)。
随着技术的发展，有必要检测femtomole(毫微微摩尔)、attomole(微微微摩尔)、zetomole(10-21摩尔)或单分子量的很少量的分析物。对高灵敏度的光学检测，光电倍增管(PMT)是最广泛使用的检测器。PMT工作在两个不同的模式：光电流和光子计数。设计光电流模式以检测具有丰富的光子的强光信号。如果输入的光子连续地到达PMT中，那么它将是光电流应用。但是，如果输入的光子数量低，例如每个光子互相独立地到达PMT中，那么光电流测量将失败。这是因为没有如下的模数转换器(ADC)，该模数转换器能够足够快地执行转换从而能够测量由一个光子产生的光电流。
在反应中产生的光子的数目与分析物的数量成正比。使用光子计数能力的光检测对研究随很少量分析物发生的事件很重要。光子计数是检测分子事件的最好的方法之一。现有的光子计数系统基于PMT和光子计数电路的结合。光子计数PMT具有这样的能力：对光子计数并且检测单个光子事件，如从发光(luminescence)或单个分子荧光产生的光子。当光子计数PMT具有检测每个单个光子的灵敏度并且对光子的数目计数时，它具有光学非线性和不准确的缺点。到达检测器的光子未被正确计数。通常，PMT输出对应于进入的光子的电子脉冲。一个光子产生一个脉冲。但是，当输入的光信号稍微增强时，光子可能交迭并且因此导致电子脉冲交迭。交迭的脉冲变为长脉冲，而不是单个的短脉冲。因为光子计数电路通过对电子脉冲的数目计数来测量光强度，所以长脉冲将被认为是一个脉冲。在这种情况下，光子计数系统不能准确地对光子计数，并且将产生光学非线性。
授予Butler等人的美国专利No.5,401,951公开了用于光电倍增管的过载保护的方法和装置，这里通过引用合并了该专利的全部内容。光源照到光电倍增管，该光电倍增管产生与入射的照射成比例的信号，该信号发送到光 子计数电子装置。光子计数电子装置产生与到光电倍增管的输入光子成比例的信号，并且也提供输出到频率电压转换器。频率电压转换器用于调制高电压放大器，该放大器控制光电倍增管的输出。当光子计数电子装置向频率电压转换器指示由光电倍增管产生的光子超过了预定的最大值时，高电压放大器降低光电倍增管的增益。
授予Rusu等人的美国专利No.6,596,980公开了用于光电倍增管的过载保护的方法和装置，这里通过引用合并了该专利的全部内容。一种使用时间相关的光子计数测量集成电路中电信号脉冲的统计变化的方法和装置。
授予Kash等人的美国专利No.6,342,701公开了用于时间相关的光子计数的系统，这里通过引用合并了该专利的全部内容。该系统使用一个或更多光子检测器，以产生对应于从目标读取的光子的电子脉冲。该系统使用鉴别器(discriminator)，其第一输入耦合到从脉冲光源输出的触发，第二输入用于接收电子脉冲。
上述专利中没有一个公开对单个光子数计数的方法。本发明包括使用用于测量交迭脉冲的定时计数器和强度鉴别器，对单个光子准确计数的装置和方法。
发明内容
本发明的一个目的是将定时时钟计数器集成到光子计数电路中，从而通过正确地对时间上交迭的光子计数来改善光子计数的准确性。
本发明的一个目的是将强度鉴别器集成到光子计数电路中，从而通过正确地对强度交迭的光子计数来改善光子计数的准确性。
本发明的一个目的是将定时时钟计数器和强度鉴别器集成到光子计数电路中，从而改善光子计数的准确性。
本发明的一个目的是改善用于测量从发光反应产生的光子的光子计数准确性和光学线性。
本发明的一个目的是合并额外的定时时钟和强度鉴别计数器到检测单个光子的PMT电路中。
本发明对于检测各种应用的单个光子强度具有灵敏和准确的优点。但是，应该理解的是，虽然指示本发明的优选实施例，但是给出详细的说明和特定的例子是为了说明而不是限制。进而，如本领域的技术人员将变得明白，本 发明的教导可以被应用到用于测量各种样本浓度的设备。
本发明的一些方面涉及一种用于对进入光电倍增管的光子数目准确计数的方法，包含步骤：(a)对由光子产生的电子脉冲数目计数；(b)用定时时钟测量电子脉冲的持续时间，其中定时时钟对时间上交迭的光子数目计数；以及(c)将(a)中的电子脉冲数和(b)中时间上交迭的光子数求和，其中所述和表示光子总数。
本发明的一些方面涉及一种用于对进入光电倍增管的光子数目准确计数的方法，包含步骤：(a)对由光子产生的电子脉冲数目计数；(b)用定时时钟测量电子脉冲的持续时间，其中定时时钟对时间上交迭的光子数目计数；(c)用强度鉴别器测量电子脉冲的强度，其中强度鉴别器对强度交迭的光子数目计数；以及(d)将(a)中的电子脉冲数、(b)中时间上交迭的光子数以及(c)中强度交迭的光子数求和，而所述和表示光子总数。
根据本发明的又一方面，还提供了一种用于对由光电倍增管检测的离散的光子的数目计数的方法，包含步骤：确定与进入光电倍增管的光子相对应的电子脉冲的数目，其中至少一个电子脉冲包括若干个与脉冲时间轮廓交叠的两个或多个离散光子相对应的交迭脉冲；确定在每个电子脉冲内存在的交迭脉冲的数目；以及基于电子脉冲的数目、和在所述电子脉冲中存在的交迭脉冲时所述交迭脉冲的数目，确定检测的离散的光子的总的数目，其中确定交迭脉冲的数目的步骤包括用定时时钟确定每个电子脉冲的持续时间以对时间上交迭的光子数目计数的步骤、和用强度鉴别器确定每个电子脉冲的强度级别以对强度上交迭的光子数目计数的步骤之中的至少一个步骤。
附图说明
当参照附图阅读时，从下面的示范性实施例的详细说明，本发明另外的目的和特征将变得更清楚，并且将最好地理解发明本身。
图1显示没有交迭脉冲的情况下(a)光子脉冲、(b)电子脉冲和(c)数字计数脉冲的时间轮廓图(profile)。
图2显示(a)光子脉冲、(b)电子脉冲、(c)规则的数字计数脉冲以及(d)具有额外的定时时钟的新的数字计数脉冲的时间轮廓图，其中电子脉冲的持续时间用于计算时间上交迭的光子数目。
图3显示(a)光子脉冲、(b)电子脉冲、(c)规则的数字计数脉冲、(d)额外的 强度鉴别器以及(e)具有额外的强度鉴别器的新的数字计数脉冲的时间轮廓图，其中脉冲的强度用于计算强度交迭的光子数目。
具体实施方式
从下面本发明的示范性实施例的详细说明，本发明另外的目的和特征将变得更清楚，并且将最好地理解发明本身。
光电倍增管提供极高的灵敏度和超快的响应。光电倍增管具有高带宽和百万量级的无噪声增益。这使它们对检测极弱的光或短的光脉冲是理想的。光电倍增管可以用于检测具有波长从115nm到1700nm的光子。典型的光电 倍增管包括：光电发射阴极(光电阴极)，其后跟着电子倍增器和电子集电极(阳极)。用于光子计数的PMT是预先选择的具有很低暗电流的管。当PMT与用于单个光子检测的光子计数电路集成时，它变为很灵敏的光学设备。在一个实施例中，本发明的光电倍增管检测具有波长从115nm到1700nm的光子，最好波长在500到1000nm之间。
设计传统的单个光子计数电路以检测一系列没有交迭的单个光子。例如，图1显示由计数器测量的(a)光子脉冲10、(b)电子脉冲20和(c)数字计数脉冲30的时间轮廓图。该图显示顺序进入检测器并且响应于三个单独的电子脉冲的三个光子1、2和3。当电子脉冲强度超过某个强度阈值15时，它被数字地计数为一个光子。因此，三个电子脉冲1、2和3被计数为三个光子。在这种情况下，系统准确并线性地对光子计数。
每个进入的光子之间的持续时间是随机变量的函数。当光信号略微增强时，进入检测器的光子可能交迭。图2显示(a)光子脉冲12、(b)电子脉冲22、(c)规则的数字计数脉冲32以及(d)具有额外的定时时钟的新的数字计数脉冲42的时间轮廓图。当脉冲太接近时，多个脉冲时间轮廓开始交迭。例如图2中有六个进入检测器的光子1、2、3、4、5和6，但是使用传统的光子计数系统它们被计数为两个光子1和5。这是因为计数器将长或短的脉冲视为单个脉冲。本发明通过引入额外的定时时钟测量数字计数脉冲42的持续时间来纠正这个问题。因为单个光子脉冲持续时间是已知的，所以可能测量在长的电子脉冲中出现了多少个交迭的光子。通过增加定时时钟计数器，它可以用脉冲的时间周期的和测量时间上交迭的光子数目。在此增加的情况下，如图2-(d)中所示，光子的正确数目将出现。在一个实施例中，该时钟具有小于100ns、更好小于大约10ns、最好小于大约1ns的时间分辨率。
当光信号增强时，一些光子可能同时或完全同时进入检测器。上述定时时钟仍然不能处理两个光子同时到达检测器的情况。图3显示(a)光子脉冲14、(b)电子脉冲24、(c)规则的数字计数脉冲34、(d)额外的强度鉴别器44以及(e)具有额外的强度鉴别器的新的数字计数脉冲54的时间轮廓图。编号1，2和3的光子没有任何问题，但是编号4和5的光子产生了强电子脉冲，并且被计数为单个光子。这是因为所有传统的电路只具有一个强度辨别级别。本发明引入额外的强度鉴别器，它具有如图3-(d)中所示的多个级别或阈值15和16，用于对强度交迭的光子计数。因此，它可以根据它的强度级别计算交迭 的光子数目。如图3-(e)中所示，使用多强度鉴别器可以准确地测量完全强度交迭的光子4和5。强度辨别计数器将测量高强度的脉冲并对正确的光子数目计数。通过软件程序或计算机软件程序计算光子总数。具有这些新计数器的可编程或可重新配置光子计数电路，将显著改善单个光子检测的灵敏度和可靠性。
本发明的一些方面提供了一种用于对进入光电倍增管的光子数目准确计数的方法，包含步骤：(a)对由光子产生的电子脉冲数目计数；(b)用定时时钟测量电子脉冲的持续时间，其中定时时钟对时间上交迭的光子数目计数；(c)用强度鉴别器测量电子脉冲的强度，其中强度鉴别器对强度交迭的光子数目计数；以及将计数步骤(a)中的电子脉冲数、测量步骤(b)中时间上交迭的光子数以及测量步骤(c)中强度交迭的光子数求和。所述和表示光子总数。在一个实施例中，光子总数被用于确定从发光反应产生的光子数量，其中从包含化学发光、生物发光和电致发光反应的组选择发光反应。
现在应该从上文理解到，为准确和线性地测量光子数目，光子计数电路至少包含一个定时时钟计数器和一个强度鉴别器。虽然所述光子计数设备和方法的例子被解释为检测发光信号，但是它也可以一般地应用于监视来自其它仪器如分光计、传感器和很多其它医学和非医学设备的光信号。虽然已参照特定实施例描述本发明，但是描述是说明性的以及不认为是限制本发明。本领域的技术人员可以进行各种修改和应用而不背离如权利要求描述的本发明真实的精神和范围。
Claims (14)
1.一种用于对由光电倍增管检测的离散的光子的数目计数的方法，包含步骤：
确定与进入光电倍增管的光子相对应的电子脉冲的数目，其中至少一个电子脉冲包括若干个与脉冲时间轮廓交叠的两个或多个离散光子相对应的交迭脉冲；
确定在每个电子脉冲内存在的交迭脉冲的数目；以及
基于电子脉冲的数目、和在所述电子脉冲中存在的交迭脉冲时所述交迭脉冲的数目，确定检测的离散的光子的总的数目，
其中确定交迭脉冲的数目的步骤包括用定时时钟确定每个电子脉冲的持续时间以对时间上交迭的光子数目计数的步骤、和用强度鉴别器确定每个电子脉冲的强度级别以对强度上交迭的光子数目计数的步骤之中的至少一个步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述持续时间提供与每个电子脉冲内的交迭脉冲的存在相对应的更宽脉冲宽度的存在的指示以及每个电子脉冲内的这种交迭脉冲的数目。
3.根据权利要求2所述的方法，其中如果在每个电子脉冲内存在交迭脉冲，则所述定时时钟对交迭脉冲的数目计数，其对应于离散的光子的数目。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述定时时钟具有小于100ns的时间分辨率。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述定时时钟具有小于10ns的时间分辨率。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述定时时钟具有小于1ns的时间分辨率。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述光电倍增管检测具有从115nm到1700nm波长的光子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述光电倍增管检测具有从500nm到1000nm波长的光子。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述光子总数由软件程序计算。
10.根据权利要求1所述的方法，其中被检测的所述光子的总数用于确定从发光反应产生的光子的数量。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述发光反应从包含化学发光、生物发光和电致发光反应的组选择。
12.根据权利要求1所述的方法，其中确定每个电子脉冲的强度级别的步骤包括确定在每个电子脉冲内与交迭脉冲相对应的多个强度级别的存在。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述强度鉴别器包括鉴别电路，以确定每个电子脉冲内的多个强度级别的存在。
14.根据权利要求12所述的方法，其中如果在每个电子脉冲内存在交迭脉冲，则所述强度鉴别器计数与交迭脉冲的数目相对应的多个强度级别的数目，其对应于离散的光子的数目。
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