CN102816833A - 一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖的试剂盒,特别涉及利用滤纸干血片中的总半乳糖与NAD反应生成荧光物质NADH的原理,快速检测新生儿体内总半乳糖浓度水平的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性,通过本发明的试剂盒实现对新生儿足跟血干血片样品中的总半乳糖浓度水平进行快速判断,从而辅助新生儿半乳糖血症的确诊。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖的试剂盒,特别涉及利用滤纸干血片中的总半乳糖与NAD反应生成荧光物质NADH的原理,快速检测新生儿体内总半乳糖浓度水平的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性,通过本发明的试剂盒实现对新生儿足跟血干血片样品中的总半乳糖浓度水平进行快速判断,从而辅助新生儿半乳糖血症的确诊。
背景技术
新生儿半乳糖血症(galactosemia),是临床上较为常见的一种染色体隐性遗传代谢病。是由于半乳糖转变成葡萄糖的代谢途径中相关酶的先天性缺陷导致半乳糖正常代谢途径受阻,体内的半乳糖通过焦磷酸酶旁路途径、半乳糖醇及半乳糖酸途径等代谢半乳糖,从而使得半乳糖及其旁路代谢产物堆积引起半乳糖血症。
目前已知有三种酶缺乏会造成新生儿代谢障碍,分别是:半乳糖激酶(galactokinase)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(galactose-1-phosphate uridyltransferase)及尿苷二磷酸半乳糖-4-异构酶(UDP galactose-4-epimerase),其中以半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶缺失为经典乳糖血症。新生儿体内由于半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的缺失,从而阻断体内半乳糖代谢,导致半乳糖以及中间产物半乳糖-1-磷酸积聚,进而侵犯新生儿肝、肾、脑等身体器官,严重时新生儿在婴幼儿时不能存活。目前,该代谢缺陷病在欧美人群中发病率约为1/30000,我国发病率较低,但近年来也呈上升趋势。
由于半乳糖血症的临床表现并无特异性,所以其诊断较多地依赖于实验室检查,目前实验室常用的诊断方法有酶学检测以及代谢产物检测。
酶学检测:发展起始于1966年,主要方法为Beutler实验简介检测红细胞中GALT酶活性的方法。该方法的原理在于若GALT活性正常,在全血或者血滤纸片中加入混有尿苷-二磷酸葡糖、半乳糖-1-磷酸(Gal-1-P)、三磷酸吡啶核苷酸(TPN)混合物,孵育一段时间后,生成的α-1-磷酸葡糖在变位酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)存在的情况下可以将氧化型TPN可以还原成还原型的TPN,后者在波长为465μm的紫外灯的激发下产生荧光。此方法虽简单易操作,并且是诊断半乳糖血症的金标准,但相关研究表明,温度及湿度过高均会引起假阴性或假阳性结果,同时该诊断方法依赖于G6PD的存在,G6PD的缺陷同样出现假阳性结果。
代谢产物检测:半乳糖血症的直接表现是机体或体液中异常高浓度的半乳糖及旁路代谢产物(主要是半乳糖-1-磷酸)的积聚,因而目前常根据检测新生儿体内的代谢产物浓度来进行半乳糖血症的诊断。现阶段,对半乳糖代谢产物的检测常采用细菌抑制法、串联质谱法、气相-液相色谱法以及荧光分析法等手段。其中细菌抑制法因涉及细菌的培养,对采血要求较高,同时细菌老化、噬菌体和细菌含量比例,以及突变株稳定性均影响诊断结果,故不建议采用。串联质谱法和气相-液相色谱法对技术要求较高,且成本较高、不易于操作,亦不适宜大规模筛查工作。
荧光分析法是现阶段疾病筛查常用的一种方法,主要是利用某些物质受紫外光或可见光照射激发后,能发出比激发光波长更长荧光的特性的一种定性、定量分析方法。荧光分析是一种较为先进的分析方法,它比质谱法、光谱法等应用更为普及。荧光分析法的最大特点是灵敏度高,比分光光度法的灵敏度高2-3个数量级;其次选择性强;最后操作简便、省时、成对相对低廉。有利于大规模疾病筛查工作的顺利进行。
本发明人利用荧光分析法技术发明一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖的试剂盒,应用于新生儿体内半乳糖及旁路代谢产物半乳糖-1-磷酸的总量检测,辅助于新生儿半乳糖血症的诊断。
国内目前现有的对新生儿半乳糖血症的实验室诊断,通常利用尿液作为检测样本,但尿液并不能真实反映新生儿体内总半乳糖含量,同时其不便于运输和保存,使新生儿筛查工作复杂,同时成本增加。与现有技术不同,本发明采用滤纸干血片为载体,采集新生儿足跟血,滴制血片,晾干。与常规新生儿筛查项目标本一致,无需另外采集,减轻筛查工作负担。同时新生儿总半乳糖在滤纸干血片中(2-8)℃中稳定性好,活性不易下降,更适合于临床应用。
本发明的试剂盒作为国内首个新生儿总半乳糖定量测定的试剂盒,选用新生儿足跟血滤纸干血片为检测样本,并整合荧光分析法,其性能达到并超过对照同类雷勃公司的进口半乳糖血症检测试剂盒,具有灵敏度高、稳定性好、操作简便、省时高效、成本低廉等显著优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用荧光分析技术进行新生儿总半乳糖定量测定的试剂盒。其基本原理是利用机体中总半乳糖(游离半乳糖+半乳糖-1-磷酸酶解半乳糖)在GDH催化下与NAD反应转变成半乳糖内酯,同时伴随发生NAD减少,NADH(可发荧光)增加的原理,依据波长355nm激发光和波长460nm发射光下NADH荧光强度。通过标准曲线,从而对新生儿体内总半乳糖含量进行定量测定。
为了实现本发明,我们采用了以下技术方案:
1)根据和对照同类进口试剂盒进行临床测值比较,对试剂盒所使用的原料进行筛选,从而确定最佳的原料,这一筛选过程包括校准品配制原料纯度、校准品配制基质、碱性磷酸酶(AFOS)使用浓度、半乳糖脱氢酶(GDH)使用浓度、氧化型辅酶I(NAD)使用浓度、白色遮光反应板的本底及变异大小。
2)确定试剂盒的组分及配方,包括:反应缓冲液配方、铜试剂配方等,并公开了碱性磷酸酶(AFOS)稀释液和半乳糖脱氢酶(GDH)稀释液配方。
1)本发明提供的一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖试剂盒,包括:(1)校准品滤纸干血片、质控品滤纸干血片、透明反应板、白色遮光反应板、反应缓冲液、碱性磷酸酶(AFOS)冻干品、半乳糖脱氢酶(GDH)冻干品、氧化型辅酶I(NAD)冻干品、铜试剂,和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶、板、片的包装盒。
根据本发明一个优选的实施方案,校准品滤纸干血片和质控品滤纸干血片由半乳糖-1-磷酸溶解在校准品和质控品基质中,并滴制在市售滤纸上。校准品和质控品滤纸干血片根据半乳糖-1-磷酸浓度不同分别编号A-F和C1、C2,其中半乳糖-1-磷酸可使用市售产品,市售滤纸优选Whatman903#滤纸。编号A-F的校准品滤纸干血片和C1-C2的质控品干血片加入半乳糖-1-磷酸如下表所示:
根据本发明所述的校准品滤纸干血片,其中校准品基质由脱纤维绵羊全血,使用生理盐水洗涤6次后,并采用生理盐水调整红细胞压积至0.55,轻轻混匀制备而成,其中脱纤维绵羊全血选用市售产品。
根据本发明一个优选的实施方案,碱性磷酸酶(AFOS)冻干品的浓度为25u/ml,稀释液组分为Tris-HCl(10mmol/L,pH8.0)、MgCL2·6H2O(1mmol/L)、KCl(50mmol/L)。
根据本发明一个优选的实施方案,半乳糖脱氢酶(GDH)冻干品浓度为6u/ml,稀释液组分为(NH4)2SO4(2.2mol/L)、EDTA(0.8mmol/L)、BSA(0.02%),pH=6.0。
根据本发明一个优选的实施方案,氧化型辅酶I(NAD)冻干品浓度为150mg/ml,溶剂为水溶液。
根据本发明一个优选的实施方案,反应缓冲液为Tris-HCl(100mmol/L,pH=8.6)。
根据本发明一个优选的实施方案,铜试剂为CuSO4·5H20(0.75mmol/L)、Na2CO3(30mmol/L)、酒石酸钾钠(0.5mmol/L)。
本发明的试剂盒采用样本类型为新生儿足跟血滤纸干血片。
利用本发明的试剂盒进行检测,具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测范围宽、无放射性污染的特点,非常适合于临床检测。
附图说明
图1为试剂盒的新生儿总半乳糖剂量-反应曲线图(直线回归曲线)。
图2为本发明的试剂盒同国外新生儿总半乳糖定量测定试剂盒(雷勃公司)临床血样总半乳糖测值比对的回归曲线。
具体实施方式
实施例1试剂盒的组成
1)校准品滤纸干血片,5套,分别编号A-F
2)质控品滤纸干血片,5套,分别编号C1-C2
3)碱性磷酸酶(AFOS),5瓶,为冻干品
4)氧化型辅酶I(NAD),5瓶,为冻干品
5)半乳糖脱氢酶(GDH),5瓶,为冻干品
6)反应缓冲液,1瓶,200mL
7)铜试剂,1瓶,100ml
8)透明反应板,5块
9)白色遮光反应板,5块
10)封片,10张
11)说明书,1份
实施例2试剂盒的使用方法
一、样本收集
对被采血新生儿足跟进行按摩或热敷,并用75%酒精消毒皮肤后,使用一次性采血针刺足跟内或外侧,深度小于3毫米,用干棉球拭去第一滴血,取第二滴血;将滤纸片接触血滴,切勿触及足跟皮肤,使血自然渗透至滤纸背面,至少采集三个血斑;样品收集后,滤纸应平放室内自然晾干,2-8℃保存。
二、试剂盒操作流程
步骤1:
试剂的准备:将除铜试剂外的所有试剂、血片及样本平衡至室温(指20-25℃范围,下同)。
将所需数量的透明反应板条置室温平衡。
用打孔器轧下校准品和待测样本的滤纸干血片(每片直径3.0mm左右),按顺序放入微孔反应条小孔中,然后各孔加入20ul80%的乙醇,37℃无振荡孵育60分钟(不用盖封片)。
步骤2:
1)试剂的准备
AFOS、NAD和GDH的准备:在每个冻干的AFOS、NAD和GDH底物试剂小瓶中加入2.0ml反应缓冲液,溶解,混匀(现配现用)。
混合反应液的配制:将上述三种试剂的复溶物全部加入19ml的反应缓冲液中,混匀,待用(96孔/板量)。
2)将白色遮光反应板置室温平衡。
3)在步骤1处理后的每孔中加入200μl混合反应液,盖上封片,37℃900rpm振荡孵育30分钟。
4)每孔加冷藏铜试剂(2-8℃)100μl,静置1分钟,然后每孔吸取200μl反应液至对应白色遮光反应板。
5)在激发波长355nm,发射波长460nm时测定荧光值。以校准品中半乳糖总浓度的浓度值为横坐标,NADH的CPS值为纵坐标绘制总半乳糖的剂量-反应曲线(直线回归曲线),参见附图1。根据各待测新生儿滤纸干血片样本的CPS值在相应剂量-反应曲线上可以查出该血片浓度。
实施例3反应体系的建立与优化
反应缓冲液的组分的优化:在反应其它组分不变的情况下,分别使用pH=8.0-8.6的Tris-HCl以及Tris-HCl、MgCl2、BSA混合液,进行新生儿总半乳糖定量测定,经多次重复实验,最终确定最佳的反应缓冲液为Tris-HCl(pH=8.6)。
碱性磷酸酶(AFOS)浓度的优化:在反应其它组分不变的情况下,分别使用浓度为0.05u/反应-0.20u/反应浓度梯度的碱性磷酸酶(AFOS),进行新生儿总半乳糖定量测定,经多次重复实验,最终确定最佳的碱性磷酸酶(AFOS)浓度为0.1u/反应。
碱性磷酸酶(AFOS)状态的优化:在反应其它组分不变的情况下,分别使用液体状态和冻干状态的碱性磷酸酶(AFOS),进行新生儿总半乳糖定量测定,经多次重复实验,新配碱性磷酸酶(AFOS)状态不影响反应体系,但37℃0天、3天、7天稳定性表明,碱性磷酸酶(AFOS)应用于试剂盒最佳状态为冻干品状态。
氧化型辅酶I(NAD)浓度的优化:在反应其它组分不变的情况下,分别使用浓度为0.2mg/反应-1.2mg/反应浓度梯度的氧化型辅酶I(NAD),进行新生儿总半乳糖定量测定,经多次重复实验,最终确定最佳的氧化型辅酶I(NAD)浓度为0.6mg/反应。
氧化型辅酶I(NAD)状态的优化:在反应其它组分不变的情况下,分别使用液体状态和冻干状态的氧化型辅酶I(NAD),进行新生儿总半乳糖定量测定,经多次重复实验,新配氧化型辅酶I(NAD)状态不影响反应体系,但37℃0天、3天、7天稳定性表明,氧化型辅酶I(NAD)状态应用于试剂盒最佳状态为冻干品状态。
半乳糖脱氢酶(GDH)浓度的优化:在反应其它组分不变的情况下分别使用浓度为0.01u/反应-0.04u/反应浓度梯度的半乳糖脱氢酶(GDH),进行新生儿总半乳糖定量测定,经多次重复实验,最终确定最佳的半乳糖脱氢酶(GDH)浓度为0.025u/反应。
半乳糖脱氢酶(GDH)状态的优化:在反应其它组分不变的情况下,分别使用液体状态和冻干状态的半乳糖脱氢酶(GDH),进行新生儿总半乳糖定量测定,经多次重复实验,新配半乳糖脱氢酶(GDH)状态不影响反应体系,但37℃0天、3天、7天稳定性表明,半乳糖脱氢酶(GDH)状态应用于试剂盒最佳状态为冻干品状态。
反应步骤2的温度和时间优化:在反应其它组分和步骤不变的情况下,步骤2分别在常温、37℃反应30-60分钟,经多次重复实验,最终表明,步骤2最佳反应程序为37℃30分钟。
实施例4样本保存温度和时间的影响
一、试剂盒准备
使用实施例1的试剂盒。
二、检测样本来源
从医院收集新生儿滤纸干血片24例,编号:201201-201224,每份样本分装成9份。样本浓度范围为1.5-12mg/dl。
三、检测方法
将每份样本室温(20-25℃)保存0天、1天、2天和3天;将每份样本冰箱(2-8℃)保存0天、1天、3天、7天和14天;使用本试剂盒按照实施例2的方法对新生儿滤纸干血片进行测定。
四、检测结果
计算同一条件下保存的24份样本的均值及浓度降低的百分率,检测结果见表3。
表3样本储存温度和时间对新生儿活性的影响
结论:新生儿总半乳糖在滤纸干血片中较稳定,在室温(20-25℃)下可保存两天,2-8℃冰箱可以保存7天。
实施例5试剂盒的实验室性能
对实施例1的试剂盒进行实验室性能分析,结果如下:
1)最低检测量
1mg/dl。
2)准确性
试剂盒校准品与企业标准品同时进行平行双孔分析测定,以企业标准品为对照品,试剂盒校准品的总半乳糖的实测浓度与其标示浓度的比值均在0.9~1.1范围内。
3)剂量-反应曲线的线性
用直线回归原值数学模型拟合,新生儿总半乳糖在校准品滤纸干血片B(5mg/dl)至校准品滤纸干血片F(60mg/dl)之间的浓度范围内,剂量-反应曲线相关系数(r)为0.9998。
4)精密度(CV%)
分析内精密度为4.2%(n=10);分析间精密度为6.3%(n=10)。
5)特异性
L-半乳糖(100mg/dl)、果糖-6-磷酸(100mg/dl)、葡萄糖-1-磷酸(200mg/dl)、葡萄糖-6-磷酸(200mg/dl)等在本试剂盒的测定值均不高于1.0mg/dl。
实施例6试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比较
外购雷勃公司的新生儿半乳糖血症测定试剂盒,货号为6199850。收集180例样本(其中正常样本数为178例,阳性样本数为2例),每例样本采集滤纸干血片两份。利用实施例1中的考核试剂盒和雷勃对照试剂盒进行同时检测,检测结果参见附图2。以自制考核试剂测定样本的新生儿总半乳糖浓度结果为纵坐标,以雷勃对照试剂盒测定样本的新生儿总半乳糖浓度结果为横坐标进行相关性分析,回归方程为:Y=0.980X-0.55,相关系数r=0.956,结果表明,本发明试剂盒同国外同类试剂盒测值具有显著相关性。
Claims (7)
1.一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖(Total Galactose)的试剂盒,试剂盒包括:分别装有反应缓冲液、铜试剂、碱性磷酸酶(AFOS)冻干品、氧化型辅酶I(NAD)冻干品、半乳糖脱氢酶(GDH)冻干品并加盖封密的多个试剂瓶,五块96孔透明反应板、五块96孔白色遮光反应板、五套校准品滤纸干血片、五套质控品滤纸干血片,和分隔并集中包装这些试剂瓶、板、片的包装盒,其特征还在于对新生儿足跟血滤纸干血片样品中的总半乳糖浓度水平进行快速检测。
2.根据权利要求1的试剂盒,其特征还在于反应缓冲液由Tris-HCl(100mmol/L,pH8.6)组成。
3.根据权利要求1的试剂盒,其特征还在于铜试剂由CuSO4(1.5mmol/L)、Na2CO3(62.5mmol/L)与KNaC4H4O6·4H2O(1mmol/L)组成。
4.根据权利要求1的试剂盒,其特征还在于碱性磷酸酶(AFOS)冻干品的浓度为25U/ml、稀释液组分为Tris-HCl(10mmol/L,pH8.0)、MgCL2·6H2O(1mmol/L)、KCl(50mmol/L);氧化型辅酶I(NAD)冻干品的浓度为150mg/ml、溶剂为水溶液;半乳糖脱氢酶(GDH)冻干品的浓度为6U/ml、稀释液组分为(NH4)2SO4(2.2mol/L)、EDTA(0.8mmol/L)、BSA(0.02%),pH=6.0。
7.根据权利要求1的试剂盒,其特征还在于采用样本类型为新生儿足跟血滤纸干血片。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121212 |