JPH0246280A - 蛍光および反応速度を増強するための器具ならびにその使用法 - Google Patents

蛍光および反応速度を増強するための器具ならびにその使用法

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JPH0246280A
JPH0246280A JP1158138A JP15813889A JPH0246280A JP H0246280 A JPH0246280 A JP H0246280A JP 1158138 A JP1158138 A JP 1158138A JP 15813889 A JP15813889 A JP 15813889A JP H0246280 A JPH0246280 A JP H0246280A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般に螢光を検出するための器具に関する。こ
の器具は細菌および他の生体を迅速に同定し、他の生物
検体の酵素プロフィルを測定するために使用できる。
（従来の技術） 螢光原基質を酵素加水分解して検出可能な螢光糧を得る
ことが多様な診断用途に有用であることは知られている
。たとえば多数の研究者が、螢光原基質のパネルを用い
て禾同定倣生物ｙｉ！′含有する試料中にどの酵素が存
在するかを判定し、このプロフィルと既知のプロフィル
との相関関係を調べて未知の微生物を同定する可能性に
つき研究している。この蛍光原検出システムを利用する
ことが望まれているにもかかわらず、それを実用化不可
能なものにする徨々の理由から、その広範な利用はなさ
れていない。
臨床分離物から検査室において微生物を同定する際に重
要な目標は迅速な同定である。大部分の商業的な細菌同
定システムは同定を行うために生体の分離後１８〜２４
時間以上を必要とする。現在の若干の°迅速”システム
は３〜１３時間を要する。これらのシステムは一般に、
一定期間の生物増殖後に産生される塘またはアミノ酸代
謝の酸性または塩基性副生物の検出に依存している。
基質の酵素開裂を利用して特定の細菌糧を同定するため
の一方法は、米国特許第４，６０３，１０８号明細書（
バスコム）に記載されている。このバスコムの明細書に
は２６徨の構成酵素に関する試験な宮むキットが記載さ
れ℃いる。各試験において酵素はそれが特異的基質と相
互作用する能力により判定される。試験用カードその他
の器具は多数のウェルまたは区画を備え、これらは別個
に各酵素試験に特異的な基質溶液を、各試験用の他の試
薬と共に含んでいる。使用に際し【は細菌懸濁液を各区
画に添加すると、比較的短いインキュベーション期間後
に、検出可能な生成物が生成する。
欠いて各試料中の対応する酵素の量を比色法または螢光
測定法による分光測定により測定する。
上記明細書に記載された他の方法は、通常遭遇する細菌
群を迅速鑑別するために７種の試験を用いている。バス
コムはこれら２６試験アツセイ法または７試験アツセイ
法は菌種または菌糧群について、独特の識別を与えると
教示している。それぞれの群または菌種に関する酵素活
性の定量測定を、あらかじめ同定された細菌の活性プロ
フィルとの比較により、その群または菌株の同定に用い
ることができる。この特異的試験は、フローセル（ｆｌ
ｏｗ　ｃａｌｌ）中での吸光度を測定することにより活
性を測定する。個々の試料分析および連続分析を採用し
つる。バスコムの特許方法は大量のバイオマスおよび大
きな流体容量、ならびに比較的長いインキュベーション
期間を必要とする。
他の科学者は微生物を同定するために螢光原基質を用い
た。ウェストレイ（Ｗａａｔｌａｙ、Ｊ、Ｍ’、）　　
らは２４樵の細菌の同定にα−アミノ酸−β−ナフデル
アミド基質を用いることにつき考察している（″各種ア
ミノ酸のアミノペグテダーゼプロフィル”Ａｐｐｌ、Ｍ
ｉｃｒｏ、、１５　：　８２２−８２５　。
１９６７）。細菌は溶液に懸濁され基質溶液と共にイン
キュベートされた。４時間のインキュベーション後に、
放出されたβ−ナフチルアミンの螢光が測定された。
１９種類のＬ−アミノ酸−β−ナフチルアミドの酵素加
水分解を測定するために螢光測定法を用いることにつき
記載した他の報又はピーターンン（Ｐａｔａｒｓｏｘ、
ＥＪｒ−）ら１アミノヘプチターセプロフイルによる特
定のダラム陰性菌の迅速検出法”；１．１部４臣ｃｉ、
、４３　：　１８５３−１８５６（１９７８）である。
各培養についてのプロフィルは４〜６時間で得られた。
微生物の酵素活性プロフィルを得るために螢光原基質を
用いることに関する文献の論評はゴツドセイ（Ｇｏｄａ
ａｙ＊）、Ｂ、）ら、“微生物の酵素活性プロフィルな
用いた腸内細菌（ＥｎｔｍｒｏｂａｃｔａｒｉａｃＢｍ
）−４９０（１９８１）にある。ゴツドセイのグループ
は腸内細菌科の５３９ｍ株についての研究において、１
８８ｉ類の螢光原基質を用いることを報告している。基
質を含有する緩衝液２１１１ｔ中で３７℃において最初
の３０分間、加水分解速度を監視した。尿素以外の基質
はすべ℃β−メチルウンペリフエロン、β−ナフチルア
ミンまたは７−アミノ−４−メチルクマリンめ誘導体で
あった。
米国特許第４５９１５５４号明細書（クマラも）には、
ウンベリフェロン酵導体を用いる螢光分析法が、少数の
微生物を検出し、その数を判定する手段として記載され
ている。この方法では、ウンベリフェロン辞導体を試料
溶液に添加し、混合物溶液をインキュベートする。次い
で不溶性残渣（たとえば細胞）を除去し、通常の検出器
により螢光を読取る。次いで螢光の量と微生物数の関連
を求める。具体例には以下の実験が記載される。
すなわち基質を含有する＃！液を細菌が含まれる浴液と
混合する。インキュベーション後にｐＨを調製し、混合
物を遠心分離して不溶性細胞を除去する。次いで放出さ
れた４−メチルウンペリフエロンの螢Ｊｊｔ、を測定す
る。場合により補酵素を使用する。他の場合には、細胞
を破壊して放出酵素量を増加させる。
螢光原基質は生存生物中に存在する細胞外酵素のアッセ
イに有用であることも仰られ℃いる（スナイダー（Ｓｎ
ｙｄｍｒ、Ａ、）″微生物検出および同定におけるイン
ビボ酵素−基質螢光速度のパターン認識分析法”　；　
Ａ　　、＆　Ｅｎｖｉデｏ　Ｍｉｃｒｏ、　５１　：９
６９−９７７（１９８６）。反応時間は１５分以下であ
った。アッセイは緩衝液２Ｎ中で行なわれた。この報文
は１誘導螢光による生存微生物の検出法”と題する、シ
ンシナテ大学を出願人とする国際特許出願の基礎ｔもな
している（国際特許出願公開１１７０８６１０５２０６
号、１９８６年９月１２日付）。
酵素含量および活性の差に基づき細菌を識別するための
さらに他の方法はチョー・ボン・パウ（Ｃｈｏｓ−Ｐｏ
ｎｇ　ＰａｇＬ）ら、“二次元螢光データのパターン認
識を用いて細菌を′識別する（　ｆｉｎｇ−デーｐｒｉ
ｎｔｉｎｇ）’ための迅速酵素法”　；　Ｃ１１ｎ、Ｃ
ｈｍｍ。
３２：９８７−９９１（１９８６）に記載されている。
このシステムでは、それぞれ異なる螢光部分を含む６種
類の螢光原基質の混合物が用いられる。螢光の増大が３
０分間にわたって監視される。
螢光データのフーリエ変換により被験微生物それぞれに
特徴的な二次元配列が得られる。この方法は測定を行い
、数学的変換を行うために、複雑かつ高価な装置を用い
る必要がある。
遊離螢光体を診断に用いることは周知である。
多くの遊離螢光体は環境条件、たとえばｐＨ１酸化還元
電位または酸素分圧の変動によって消光または増強され
ることが知られている。これらの螢光体はそれらの螢光
に影響を与える環境条件を検出または監視するために用
いられる。
試料中に存在する被分析体を螢光原基質の酵素加水分解
の検出または監視により同定または定量するための上記
方法はいずれも水性環境を必要とする。同様に、生物学
的試験系において環境の変化を監視するために遊離螢光
体を用いる場合も水性環境を必要とする。遊離螢光体お
よび螢光ぶ基質はそれらの安定性を最も良（維持するた
めには乾燥した状態を必要とするので、遊離螢光体また
は螢光原物質を用いて受容できる貯蔵寿命を備えた水性
試験系を設計する際には問題が生じる。従って設計上の
目的の１つは、遊離螢光体またをま螢光原基質を乾燥状
態で提供するという課題である。
螢光原基質を乾燥状態で保存する場合、それらは水性の
試験用懸濁液または溶液の添加後に速やかに定常状態の
反応に到達すべく＃素と反応し５る必要がある。螢光原
基質は水中で多様な溶解性を示すので、この目的は必ず
しも容易には達成されない。水溶性がきわめて低いのは
一般にリパーゼ基質である。この試りは低い水溶性ｔも
つ基質について特に困難である。
螢光物質に対する支持体として用いられている材料の１
つはセルロース系Ｆ紙である。ワットマン、４４Ｆ紙が
４”ｆｌｃ：Ｆｇいてピレン、ベンゾ〔α〕ピレン、ク
リセンおよび溶剤精製石炭の分析のためＫ、チュアン・
フォデイン（Ｔｕａｎ　Ｖｏ−Ｄｉ？ＩＡ）、“戸紙系
支持体上における多環式化合物のフルオレスセンス・ラ
インナローイングースペクトロメト　リー（ｆｌｓｏｒ
ｍｓｃａｎｃａ　　ｌｉｎｅ−ｎａｒｒｏｗイｎｇｇｐ
ａｃｔｒｏｍａｔｒｙ）　　”　；ＡｎａＬ、Ｃん−ｍ
、５８：３１３５−３１３９（１９８６）に用（・られ
ている。
ある感受性試験用品系列では螢光原基質を保持するため
にＦ紙が用いられる。センシタイタ−（Ｓａｎａｉｔｉ
ｔｒｍ　ｒ商標〕感受性パネル（ラジオメーター・オブ
・コペンハーゲン社の製品、デンマーク、コペンハーゲ
ンノの場合、螢光原基質が戸紙上に乾燥した状態で供給
される。使用する際にはＦ紙ストリップをプロス中に入
れ、螢光原基質を溶液中へ溶出させる。次いでプロスを
溶液感受性試験が行われるマイクロウェル内へ分配する
。
微生物または病理学的状態を判定するために酵素グロフ
ィルを調べる際に遭遇する他の問題は、バイオマスが不
適当であるという問題である。微生物判定試験において
望ましいことは、同定すべき微生物が臨床試料よりｍｍ
されたオーバーナイト画線平板から、または直接に陽性
の血液培養バイアルから分離されたコロニーから得られ
ることである。これらの状況下ではいずれも、得られる
微生物数が限られている。同様に、生物試料を内性酵素
含量につき調べる場合、分析に用いられる生物学的流体
または組織の量が限られている。従って判定を行５のに
必４！なバイオマスの量を最小限に抑えるべきである。
迅速に結果を得るためには、高いバイオマス濃度が必要
である。これら２基準を満たすためには試験系を妥当な
程度に可能な限り小規模化すべきである。少量のバイオ
マスの使用を可能にするために小規模化することによっ
て他の問題が生じる。螢光原基質の量および得られる＃
素濃度が一定であれば、系の小規模化によつ又単位時間
当たりに加水分解される基質の童が減少する。単位時間
当たりの総螢光変化も低下する。
従つ℃、許容できる貯蔵寿命をもち、必要な試料のバイ
オマス童が少な（、試料の添加後に速やかに平衡化して
動力学的定常状態に達し、かつ高い螢光信号を与える小
規模化された系が求められている。
（発明の構成） 本発明の器具はその上部または内部に固定された反応速
度および螢光増強用支持体を少なくとも１個有するキャ
リヤーを備えている。反応速度および螢光増強用支持体
には、螢光原基質、β−メチルウンペリフエロン、７−
アミノ−４−メチルクマリン、β−ナフチルアミン、フ
ルオレセインおよびレゾルフィンよりなる群から選ばれ
る乾燥物質が沈着している。反応速度および螢光増強用
支持体は有効量の乾燥物質を保持するのに十分な表面積
をもつ。
好ましくはこの器具は複数の反応速度および螢光増強用
支持体を備え、乾燥物質は螢光原基質である。
特に好ましい形態においては、反応速度および螢光増強
用支持体は、高い表面積一対一容量比をもつ材料から作
成される。きわめて好ましくは表面積および気孔率は、
支持体の気孔内に感容される水性試料により湿潤しうる
有効量の乾燥物質を保有するのに十分なものでなければ
ならない。
乾燥物質は、これを適切な無水溶剤に溶解し、この溶液
を反応速度および螢光増強用支持体に沈着させることに
より、その反応速度および螢光増強用支持体上に沈着さ
せることが好都合である。
溶剤は適切な手段、たとえば減圧乾燥により除去される
。あるいは上記物質の溶液をその反応速度および螢光増
強用支持体に吸収させることもでき、この反応速度およ
び螢光増強用支持体は分析される検体を受容する気孔を
残すのに十分な表面積−対一容量比をもつ。次いで、乾
燥物質を乾燥保持した反応速度および螢光増強用支持体
は、好ましくは低湿および低温の環境で、長期間保存す
ることができる。
本発明の酵素判定法は螢光原基質、β−メチルウンペリ
フエロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、β−す７
チルアミン、フルオレセインおよびレゾルフィンよりな
る群から選ばれる乾燥物質を使用して、生物検体中に存
在するｌもしくは２種類以上の酵素の水準を迅速に測定
し、または酵素のプロフィルを判定する。本方法は疾病
状態をスクリーンするのに有用であフ（たとえば精液中
のアルカリホスファターゼが過度であることは前立腺癌
を示唆する）、かつ検体中に存在する生体を同定するの
に有用である。大部分の場合、測定される生体は細菌で
あろう。しかし他の微生物、たとえば真菌を同定するこ
ともできる。本発明方法は微生物懸濁液および体液また
は分散組織試料を含めた種々の生物検体の酵素プロフィ
ルを判定するのにも有用である。本方法は、螢光原基質
、遊離螢光体または両者を種々の濃度の選ばれた抗生物
質と併用して生物の代謝または増殖の存否を検出するこ
とにより、選ばれた生物に関する抗生物質感受性および
最小抑制薬物濃度を検知するためにも利用できる。
本発明の酵素判定法においては、流体試料を複数の反応
速度および螢光増強用支持体の５ちｌまたは２以上に添
加する。反応速度および螢光増強用支持体はそれぞれ、
螢光原基質、またはβ−ウンベリフェロン、７−アミノ
−４−メチルクマリン、β−ナフチルアミン、フルオレ
セインおよびレゾルフィンよりなる群から選ばれる螢光
体を乾燥保有する。試料中に存在する酵素がそれらの基
質を加水分解する。基質が螢光原性である場合、加水分
解速度は螢光性生成物の生成速度を測定することにより
測定される。基質が螢光原性でない場合、反応速度およ
び螢光増強用支持体は酵素基質、および加水分解生成物
（たとえば酸、塩基、□ｔ）の存在下で増強または消光
される乾燥した遊離螢光体を沈着保有する。この方法で
、その基質を加水分解する酵素の存在が検出され、所望
により試料中の１または２種類以上の酵素の反応速度プ
ロフィルが確立される。次いで試料の酵素反応速度プロ
フィルを分析する。
微生物同定の場合、未知微生物を同定するために反応速
度プロフィルを既知微生物の基準酵素反応速度プロフィ
ルと比較する。抗生物質感受性および最低発育阻害濃度
の試験に際しては、対照試料の酵素活性の存在と比較し
て抗生物質の存在下での酵素活性の不在は、抗生物質の
有効性を指示する。
本発明の反応速度および螢光増強用支持体を乾燥螢光原
基質と共に用い、これらが流体試料中のそれらの酵素と
接触すると、酵素−基質相互作用の実質的な増強が観察
される。酵素−基質相互作用の反応速度は、速やかに平
衡化して動力学的定常状態になるのが観察されるという
点で増強される。水に易溶性の基質は速やかに溶解する
。これによってこれらの基質は速やかに動力学的定常状
態に達する。意外にも、境界的な水浴性をもつと考えら
れていた螢光原基質ですら、速やかに定常状態の反応条
件に達する。低い溶解性をもつ基質は、それらが適切な
特性を備えた反応速度および螢光増強用支持体上にあら
かじめ沈着し℃いる場合、流体状の生物検体と接触した
際に高い酵素特異性反応速度を示す。
本発明の反応速度および螢光増強用支持体の他の利点は
、純粋に液状の環境内で測定した場合の同一螢光体の螢
光と比較してそれらが大幅に螢光を増強することである
。意外にも、螢光体と支持体の相互作用によって螢光が
著しく増幅される。
固形支持体内のいずれの深さにおいても散乱および吸光
によって螢光体く到達する励起線の強度は低下するはず
であるから、この所見は予想した結果に反するものであ
る。また固形支持体のいずれの深さにおいても生じる放
出螢光の強度も支持体による散乱および吸光のため低下
するはずである。
従って、あらかじめ固形支持体に吸収されている、一定
強度の励起線により励起された透明な螢光体溶液から得
られる外部螢光信号は、透明な溶液のみを等しい励起エ
ネルギーで照射したものから得られる信号より強度が低
いであろう。本発明においては反応速度および螢光増強
用支持体の材料を適切に選ぶことにより、螢光体溶液を
固形支持体に吸収させた場合に螢光信号は多数倍太き（
なる。
図面について簡単に説明する。
第１図は平面支持体に固定された反応速度および螢光増
強用支持体を備えた本発明器具の好ましい構造を示す。
第２図は試験ウェル内に反応速度および螢光増強用支持
体を備えた本発明器具の構造の別形態を示す。
第３図は本発明により反応速度および螢光増強用支持体
に沈着した４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ
クトシドの、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）による加水分解
速度を示す（実施例２）。図中、（ロ）はＤＳＣＣＯＮ
：　（＋）はＤＳＣＴＳＴ；　（◇）はＤＳＣＷＥＬＣ
ＯＮ；　（△）　ＤＳ　ＣＷＥ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ｔ　　を
表わす。
第４図は本発明により反応速度および螢光増強用支持体
に沈着した４−メチルウンベリフェリルパルミテートの
、緑膿菌（Ｐ、ａ−デ舊σ１ｎｏｓα〕による加水分解
速度を示す（実施例４）。図中、（口〕はＦＦ’ＥＬＬ
；（＋ハエｆｌ’ＥＬｃＯＮ；　（◇）はＤＳＣ；（Δ
）はＤＳＣＯＮを表わす。
第５図は本発明によジ反応速度および螢光増強用支持体
に沈着した４−メチルウンベリフェリルホスフェートの
、肺炎桿菌（Ｋ、　ｎａｓｍｏｎｉａｍ　）　Ｋよる加
水分解速度を示す（実施例４〕。図中、（ロ）はＷＥＬ
Ｌ；　（＋）はＷＥＬＣＯＮ；　（◇）はＤｉｓｃ；（
Δ）はＤＩＳＣＯＮを表わす。
第６図は霊＠　（Ｓ、Ｍａｒａａａｃａｎｘ　）がＬ−
ロイシン−７−アミノ−４−メチルクマリンを加水分解
する速度を示す（実施例５）。図中、（ロ）はＯｘＧ、
（＋）はＣ０ＮＴ；　（◇）はＯＲＧ；　（Δ）はＣ０
ＮＴ；　（ｘ）は０ＲＧＹ（）はＯＲＧを表わす。
第７図は霊園がＬ−フェニルアラニン−７−アミド−４
−メチルクマリンを加水分解する速度を示す（実施例５
）。図中、（ロ）はＯＲＧ；（＋）はＣ０ＮＴ；　（０
）はＯＲＧ；　（Δ）ｋｌｃＯＮＴ；　（Ｘ）ｉｔＯＲ
Ｇ；ＯＲＧを表わす。
第８図は霊菌がＬ−アラニン−７−アミド−４−メチル
クマリンを加水分解する速度を示す（実施例５］。図中
、（ロ）はｏｘＧ；Ｃ＋）はＣ０ＮＴ；（０ｍ０ＲＧ；
　（Δ）はＣ０ＮＴ；　（ｘ）はＯＲＧ；（Ｖ）はＯＲ
Ｇを表わす。
第９図はβ−メチルウンペリフエロンの螢光信号に対す
るｐＨの影響を示す（実施例８）。図中、（ロ）は７４
０−Ｅセルロース；（＋）は液体を表す。
第１図に示すように、本発明の好ましい試験器具１０は
適宜な数および列の反応速度および螢光増強用支持体１
１をキャリヤー１２、たとえばカードその他の表面支持
体上に固定することにより製造される。キャリヤーは好
ましくは（ただし必須ではない）硬質であシ、平面であ
る。適切な材料にはポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リ塩化ビニル、アクリロニトリル−ブタジェン−スチレ
ン、フルオロポリマー、ポリカーボネート、およびアク
リル樹脂が含まれる。ポリプロピレンが好ましい。
あるいはキャリヤーは複数の試験ウェル１４を備えたト
レー１３またはストリップ、すなわち通常のマイクロウ
ェルトレーまたはストリップであってもよい。この場合
、器具は反応速度および螢光増強用支持体１１を、目的
とする用途に適した列および数の試験ウェル１４それぞ
れ内に配置することにより組立てられる。
反応速度および螢光増強用支持体に適した材料の選択に
は、幾つか考慮すべき点がある。一般に反応速度および
螢光増強用支持体はそれに沈着した乾燥状態の螢光原基
質または遊離螢光体と反応性であってはならず；反応速
度および螢光増強用支持体は好ましくは螢光を増強する
性質をもつべきであり、それ自身は実質的な螢光を示し
てはならず；反応速度および螢光増強用支持体は有効量
の乾燥基質または螢光体を保持するのに十分な、好まし
くは試料の懸濁液または溶液を受容するのに十分な表面
積一対一体積比をもつべきであり；反応速度および螢光
増強用支持体は流体試料によってぬれるのに十分な程度
に親水性でなければならず；かつ反応速度および螢光増
強用支持体は疎水性物質を保持しうる多数の部位を含む
べきである。本発明の反応速度および螢光増強用支持体
として用いるのに適した材料には、α−セルロースおよ
びｐＨ中和ガラス繊維が含まれる。特に好ましいものは
コツトンリント紙の形のα−セルロース（たと、ｔばシ
ュライへル・ラント・シュル、ニューハンプシャー州キ
ーン、かう入手される腐７４０−Ｅおよび９０３の紙）
、およびハイドロライリツク　ＨＤ　Ｃ（Ｈｔｄｒｏｐ
ｈｔｌｔｃ　ＨＤＣ，商標〕（ポール・パイオサ、ポー
ト社、ニューヨーク州グレン・コープ）の表示で研究開
発量において入手される支持体マトリックスである。
一般に反応速度および螢光増強用支持体の厚さおよび表
面積は、本発明方法の至適化に際し有力な基準である。
反応速度および螢光増強用支持体が基質を沈着保持する
場合、反応速度および螢光増強用支持体の厚さは、試料
中に存在する１種または２種以上の有効酵素との反応に
有効な量の基質を保有するのに十分なものでなければな
らない。
同様に、支持体に沈着した乾燥状態の螢光体のみが施さ
れる場合は、その厚さは処理に際し目的とする反応系の
残りの成分を受容するのに十分なものであることが好ま
しい。一般に０．１〜２．　Ｏｗｍの厚さが適切である
。０．２〜１．０　ＩＯＩの厚さを採用するのが好都合
であり、０．５〜約０．９　ｍの厚さが好ましい。厚さ
は表面積と共に、反応速度および螢光増強用支持体を完
全にぬらすのに必要な流体の容量を決定する。
反応速度および螢光増強用支持体の形状は決定的ではな
い。反応速度および螢光増強用支持体は直径約１．０〜
約１０．０ｍの直円柱（ディスク）として成形されるこ
とが好都合であり、これは乾燥状態の基質、遊離螢光体
または両者を保持するのに有効な表面積、約０．８〜約
８０ｍ”に相当する。
反応速度および螢光増強用支持体の気孔率１〜１００μ
ｌが適切である。１〜７５μｌの気孔率を採用しつる。
気孔率は好ましくは約１μ！（０，００１ｅＣ）　〜約
２５　ｐｌ　　（０，０２５ｃｃ）である。
本発明に有用な基質は試料中に存在する酵素と反応性で
あることが認められている螢光原基質および非螢光原基
質である。螢光原基質は通常は有機および無機の酸、配
糖体およびペプチドの螢光原同族体から選ばれる。
本発明の酵素判定法を微生物の同定に用いる場合、螢光
原基質それぞれを調製するために同一の螢光体を用いる
ことが好ましいが、異なる基質につき異なる螢光体を用
いてもよい。螢光体は天然基質部分にいずれかの適切な
手段で、通常は共有結合により結合される。適切な螢光
体にはβ−メナルウンベリフエロン、７〜アミノ−４−
メチルクマリンおよび他のクマリン誘導体、β−ナフチ
ルアミン誘導体、ならびにレゾルフィンおよびフルオレ
セインの同様な付加生成物が含まれるが、これらに限定
されない。
本発明の反応速度および螢光増強用支持体は好ましくは
以下により調製される。螢光原基質または遊離螢光体を
適切な溶剤、たとえばジメチルスルホキシドまたはクロ
ロホルムに溶解する。溶解した基質または遊離螢光体を
その反応速度および螢光増強用支持体に沈着させる。溶
液を反応速度および螢光増強用支持体に沈着させたのち
、溶剤を適宜な手段、たとえば減圧乾燥により除去する
ことができる。こうして基質は反応速度および螢光増強
用支持体に保持される。次いで反応速度および螢光増強
用支持体は、好ましくは低温および低湿の粂件下に、長
期間保存することができる。
好ましい器具はカード上に固定された反応速度および螢
光増強用支持体を備え℃いる。この形態は流体をウェル
または容器に入れる必要がない。
本発明の好ましい一形態においては、セルロースシート
の一方の面に接着剤を塗布し、平面プラスチック、ポリ
プロピレン製支持体上ヘダイにより打抜（と、プラスチ
ック表面に付着した個々のセルロースディスクが残され
る。各ディスクに螢光原基質または遊離螢光体を塗布し
、乾燥したのち、次いで流体溶液または懸濁液を各ディ
スクに直接に乗せ、螢光を計測器により読取る。用いる
流体容量がディスクを飽和するの國必要な容量より少な
いか、またはほぼこれ（等しい場合、流体を収容するた
めにウェルまたは容器を必要としない。
本発明の酵素判定法により、臨床試料から単離された微
生物を迅速に同定することができる。この種の臨床試料
には尿、糞便、創傷、咽喉、性器試料、または普通は無
菌の体液、たとえば血液もしくは脳を髄液が含まれる。
微生物は通常は同定の前に検体から単離される。
細菌培養コロニーは生物検体から調製される場合は十分
な増殖期間（通常は約１８時間）後に採取される。採取
したコロニーを本発明方法による同定に適した水性液体
に懸濁する。調製された微生物または生物検体の懸濁液
を直接に反応速度および螢光増強用支持体上に沈着させ
る。
アッセイは無傷の細胞について実施することもできるが
、酵素利用度を高めるために細胞にちる種の処理を施す
ことが望ましいであろう。たとえば細胞膜透過性を高め
るために低水準の界面活性剤を用いろことができる。極
端な例としては細胞膜を完全に破壊することが望ヱしい
であろう。細胞膜に希望する様式で影響を与えるのに適
した既知の処理法をいずれも採用できる。
個々の微生物を同定するのに必要な反応速度および螢光
増強用支持体の数は微生物に依存するであろう。ある場
合には単一支持体で十分であろう。
他の場合にはある微生物を他のきわめて類似するプロフ
ィルをもつものから区別するために、４０以上の異なる
支持体が必要となるかも仰れない。
この酵素判定法においては、調製法は関係なく流体試料
を反応速度および螢光増強用支持体それぞれに沈着させ
る。前記のよ５にそれぞれの反応速度および螢光増強用
支持体は、螢光原基質（または遊離螢光体）の識別点ま
たはその濃度において他と異なる。好ましくは、反応速
度および螢光増強用支持体は試料で満たされるが、反応
速度および螢光増強用支持体の表面上の遊離流体は最小
限に抑えられる。好ましい寸法範囲の反応速度および螢
光増強用支持体に関する一般的な飽和容量は約３〜約２
５μ！である。
適宜な期間、一般には約２〜約３０分、ののち、個々の
螢光体に適した励起および発光波長を用いて螢光計によ
り反応速度および螢光増強用支持体を検査することによ
って、酵素と各基質の反応の程度を測定する。
次いで酵素と複数の螢光原基質との反応速度プロフィル
を調べ、得られたプロフィルを既知微生物の基準速度プ
ロフィルと比較して、そのプロフィルを生じた特定の微
生物を同定する。
初期螢光の読みは反応速度および螢光増強用支持体それ
ぞれＫつき接種後回能な限り速やかにエピフルオレスセ
ンス（ａｐｉｆｌｓｏｒｍａｃｍｘｃｔｔ　）法により
行い、その際励起および発光波長は個々の螢光体につき
適宜選ばれる。次いで後続の読みを選ばれた時間間隔で
行う。一定のインキュベーション期間−２〜３０分間が
好都合でちる−にわたって螢光の読みを蓄積するために
１分間隔、または他のいずれかの期間を採用する。
次いで反応速度および螢光増強用支持体それぞれにつき
反応速度を判定する。これらの速度を試料懸濁液の濁り
度に正規化する。この種の反応から得られる螢光強度の
範囲が広いため、使用する基質のうちある橿のものにつ
いては可変光度計検出感度を採用することが好ましい。
この可変感度を得るための一手段は、螢光発光を監視す
るために用いられる光電子増倍管に与える高電圧を変化
させることである。この調節は手動でまたは自動的に制
御される。反応を監視するために用いる感度に対し反応
速度を正規化することも好ましい。
この方法を未知微生物の同定に利用する場合は、反応速
度および螢光増強用支持体すべてについての速度プロフ
ィルを求め、次いで既知微生物のデータベースからあら
かじめ確立した速度プロフィルと比較する。次いで未知
微生物の最良同定を得るために、適宜なアルゴリズムを
用いることができる。たとえば−同定法においては、個
々の基準菌株が一定の速度範囲内の基質加水分解速度を
与える確率を、複数の基質それぞれにつき判定する。
次いで未知微生物の実際の加水分解速度を各基準菌株に
関する確率を含むデータベースと比較して、未知微生物
が特定の対照菌株それぞれの一員である尤度（１ｉｋｅ
ｌｉｈｏｏｄ）を判定する。次いで、未知微生物が基準
菌株と同−程である尤度を基準菌種すべての尤度の和で
徐することにより、上記で求めた尤度を未知微生物に正
規化する。これらの正規化された尤度を次いで１００倍
して、これらをチで表わす。最高率の尤度をもつ基準菌
株は未知微生物が最も可能性のある菌株である。望まし
くはデータの入手および分析はコンピューターにより行
われる。
本発明の反応速度および螢光増強用支持体を用いること
Ｋよる他の利点は、流体の螢光の計器測定がより高い再
現性を示すことである。歩容量の流体の螢光をマイクロ
ウェル内で測定すると、ウェル表面の疎水性によってメ
ニスカスの形状が変動し、測定精度に影響を与えるであ
ろう。と（歩容量の流体はウェルの底を必ずしも均一に
覆わないので、ウェル内への流体滴の装入も重要になる
。
これらの問題は希釈液に界面活性剤を添加することによ
って、またはプラスチック婁ウェルの表面処理によって
、一部は克服できるが、これらの処理は系にとって付加
的な複雑さを生じる（たとえば界面活性剤は生体の細胞
膜に影響を与える）。
通常の系においてきわめて濁り度の高い細菌懸濁液を使
用することも螢光の測定に影響を与える。
純粋に液状の系においては、これらの混濁した懸濁液（
はぼマクファーランド／Ｉ６４の濃度）は励起エネルギ
ーの多（を直接に散乱および吸収することにより螢光の
絖みな妨げる。本発明の反応速度および螢光増強用支持
体を用いると、細菌は反応速度および螢光増強用支持体
に内包される。本発明の系においては、きわめて濁り度
の高い懸濁液も目的とする螢光測定にほとんど影響を与
えない。
以下の例はさらに本発明の種々の特色を説明するもので
あって、特許請求の範囲に定められる本発明の範囲を限
定するものではない。
実施例１゜ マイクロウェルトレー内に配置されたメチルウンベリフ
ェロンを読取るべく設計された螢光針（マイクロフルオ
ル（ＭｔｅｒｏＦＬＵＯＲ商標）リーダー、ダイナチッ
ク−ラボラトリーズ社、２２０２１バージニア州シヤン
テイリー）を用いて、遊離螢光体β−メチルウンペリフ
エロン（シグマ・ケミカル・カンノくニー　６３１７８
ミズーリ州セントルイス〕および７−アミノ−４−メチ
ルクマリン（ポリサイエンシズＬ１８９７６ペンシルベ
ニア州ワリントン〕の螢光特性につき調べた。
濃度および容量と螢光の関係につきβ−メチルウンペリ
フエロンを用いて調べた。この螢光体を黒色ポリスチレ
ン製マイクロウェルトレー（マイクロフルオル（商標）
”Ｅ’プレート、カタログ４０１１−０１０−７８０、
ダイナチック・ラボラトリーズ社、バージニア州シャン
テイリー）に分配した。以下のプロトコールに従った。
試薬用アルコールに溶解した螢光体２５μノを各試験ウ
エルニ分配し：アルコールを３５℃のインキュベーター
中で蒸発乾固させ；ｐＨ８，０に調整された０、ＩＭ、
ＥＥＰＰＳ緩衝ｆＦｉ、（ユナイテイツド・ステーク・
バイオケミカル・コーボレーショ／）によＶ螢光体を再
構成し；プレートを読取った。結果を第１表に相対螢光
単位で示す。
第 表 存在する螢光体全量および再構成用緩衝液の容量の関数
としてのβ−メチルウンペリフエロンの相対螢光０．０
　　　　　　　６　　１０　　１５　　２８　　２９０
．０１５６　　　５４　　６９　　７５　　８４　　９
８０，０６２５２２９２７４２５４３１７３２７０，１
２５４４０５３６５４１６２０６４０このデータは螢光
信号がウェル内に存在する螢光体の量に正比例すること
を示す。いずれか１種の螢光体濃度については、容量の
増加と共に信号の増強する傾向があることも認められる
。
上記ときわめて類似する実験を同じプロトコールにより
行った。ただし、セルロースＦ紙（カタログ／１６７４
０−Ｅ、シュライヘル・ラント・シュル社、ニューハン
プシャー州キー７０３４３１）から打抜いたディスク上
にβ−メチルウンペリフエロンを沈着させ、これを黒色
マイクロウェルトレー（ダイナチック社製マイクロフル
オル（商標）“Ｂ”プレート）の底に置いた。この実験
で得たデータを第２表に示す。
第　　　２　　　表 各ウェル内に配置したＰ紙ディスクを用いた場合の存在
する螢光体全量および再編成用緩衝液の容量の関数とし
てのβ−メチルウンペリフエロンの相対螢光 ０．０ ０．０１５６ ０．０３１３ ０．０６２５ ０．１２５ 注釈：ディスクおよび螢光体を含有するウェルに関する
上記の数値は、読取り前にブランクのセルロースディス
クおよび対応する量の緩衝液を含むウェルを用いて測定
した螢光値を差引いたものである。
ディスクを含まないウェル内のβ−メチルウンペリフエ
ロンの場合と同様に、セルロースディスクを含むウェル
内の螢光も一定容量の再構成用緩衝液については螢光体
の添加量に正比例する。しかし、セルロースディスク存
在下での螢光は再構成用緩衝液の容量が増加するのに伴
って減少する。
事実、観察された螢光は螢光体の最終濃度（μｍ／Ｍ）
にほぼ正比例する。この効果は等しいトレーのウェル内
にディスクが存在しない場合に見られたものと逆である
。これらと同じ傾向は、他の実験において再構成用緩衝
液がディスク当たり４．８．１６および２４μノ程度の
少容量添加された場合ですら認められた。直径６．３５
ｍｍ　（０，２５インチ）のセルロースディスクを飽和
させるためには約２５μ！の流体が必要である。
螢光体７−アミノ−４−メチルクマリンを用いて同様な
実験を反復した。用いたプロトコールは前記の実験で用
いたものと等しい。データを第３表に示す。
セルロースディスクを含む、および含まないマイクロウ
ェル内の、螢光体全量および再構成用緩衝液の容量の関
数としての７−アミノ−４−メチルクマリンの相対螢光 全クマリン量再構成用緩衝液全量（μＡり０．０　　　
　　１４５　　９９　　　８５０．２５０　　　５４８
　２９９　　２４１０．５００　　　８８１　５２８　
　３５７０．０　　　　　　　　１　　　　２　　　　
　３Ｏ１２５０８１３１８ ０，５００１７２３２９ デイスク存在下でのβ−メチルウンペリフエロンにつき
先に示したように、７−アミノ−４−メチルウンペリフ
エロンも一定容量の再構成用緩衝液については、存在す
る螢光体全量に正比例する相対螢光値を与える。セルロ
ースディスクの存在下では、一定の螢光体全量について
は再構成用緩衝液の添加に伴って相対螢光が同様に低下
する。
セルロース裂支持体に遊離螢光体を添加した場合に得ら
れる著しい螢光増強は、ディスクを含む場合のデータと
含まない場合のデータを比較すると明らかである。
実施例２゜ この例は、基質が基質反応速度および螢光増強用支持体
上で乾燥された場合、ウェルまたは容器は基質と接種物
の反応が起こるために必ずしも必要ではないことを証明
する。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したβ−Ｄ−
ガラクトシドに結合した４−メチルウンペリフエロンの
０．５％溶液の２０μ！アリコートをセルロース（カタ
ロ／／１６７４０−Ｅ、シュライヘル・ラント・シュル
社、ニューハンプシャー州キーン）ディスク８個それぞ
れに添加した。減圧乾燥によりＤＭＳＯを除去した。乾
燥したディスク４個を９６ウ工ル黒色ポリスチレン製マ
イクロウェルトレーの上部に両面接着テープを用いて接
着した。残り４個のディスクはそれぞれ上記トレーのウ
ェル４個の底に挿入した。テープ上のディスク２個、お
よびトレーのウェル内のディスク２個にｐＨ７，８の０
．１　Ｍ　）リス−食塩緩衝液中の大腸菌（ＡＴＣＣ２
５９２２）の懸濁液２５μｌをそれぞれ接種した。直径
１６ｍのガラス試験管中の接種用懸濁液の光学濃度はス
ペクトロニック８８分光光度計（ハウシュ・アンド・ロ
ム、ニューヨーク州ロチェスタ−１４６９２）により測
定して６００　ａｍで１．８であった。残り４個のディ
スクは対照として用いるために緩衝液のみと共にインキ
ュベートされた。すべてのディスクについての螢光増強
速度を１分間隔でグイナテック、マイクロフルオル（商
標）リーダーにより監視した。第３図に示すように、ト
レー上にテープ付けしたディスクについて得られた速度
の測定値はウェル内のディスクについて得られたものに
匹敵した。従って基質／接種物の反応による螢光増強速
度の満足丁べき測定を行うためにウェルまたは容器は不
必要である。ウェルまたは容器の必要性が除かれること
により、物理的系の寸法を大幅に縮小することができ、
試験を実施するのに必要な接種容量についても同様であ
る。
実施例３゜ 螢光および反応速度を高める能力につき種々の支持体材
料を試験した。各支持体を試験するために、直径６．４
ｉｍ　（０，２５０インチ）のディスクを第４表に挙げ
た各材料のシート素材から打抜いた。
螢光原基質の０．５％溶液の２０　ｐｉ　アリコートを
各ディスクに添加した。試験された基質は４−メチルウ
ンベリフェリルホスフェート（緩衝液に可溶性の基質）
および４−メチルウンベリフェリルパルミテート（緩衝
液に不溶性の基質）であった。
基質を含有するディスクを減圧乾燥により乾燥させ、次
いで９６ウエルの黒色ポリスチレン製マイクロウエルト
レー（ダイナチック、マイクロフルオル（商標）“Ｂ”
）のウェルに挿入した。各ディスクに、ｐＨ７，８の０
．１　Ｍ　）リス−食塩緩衝液中の緑膿菌（ＡＴ（１’
ｃ　　２７８５３）の懸濁液を接覆した。直径１６１Ｅ
ＩＩの試験管中で測定した微生物懸濁液のａ胞密度は６
００　ｎｍで１．８であった。対照ディスクには緩衝液
のみを接種した。螢光増加を１分間隔でマイクロフルオ
ル（商標）リーダーにより監視した。
すべての支持体につき得られた結果を第４表にまとめる
。合成支持体は疎水性パルミテート基質との反応に乏し
かった。ナイロン製支持体はパルミテートを不安定にす
る傾向を示した。ガラス繊維製支持体は反応を阻害した
か、または基質を破壊した。セルロース製支持体は対照
の反応速度からの微生物の反応速度の識別性が最良であ
った。
微生物により得た４−メチルウンベリフェリルパルミテ
ート加水分解速度も、セルロース製支持体を用いた場合
の方が他の支持体を用いた場合より高（、より一貫性が
あり、かつセルロース製支持体はこの基質を不安定にし
なかった。
第　　４　　表 支持体試験結果 ジフルオリド 速度なし Ｐｔｈ、８−５ｂ 不織布 合成 ）でルミテート 速度なし Ｐｄｔ、５−５ｂ 不織布 合成 ノ寸ルミテート 速度なし セルロースＣ デプス・フィルター ＤＭＳＯに溶解 ウルトラボアｄ 膜 ノ寸ルミテート 速度なし Ｄ１２Ｏｆ 有機物なし 不定の結果 マイクロ ファイバーｇ 有機物なし 高度の制御 ガラスＡ／Ｅ エクストラｅシックｇ 屑２７／ ４０Ｅｂ Ｃｂ ＴＬクロスト グラフィー４ 結合剤　　　　　　高度の制御 プレフィルタ−一定の速度 コツトンリンター　一定の速度 再生　　　　　　　一定の速度 ニスター・ペース　一定の速度 上のセルロース ａ、ミリボア（マサテユセツツ州ベツドフォード）ｂ、
　　シュライヘル・ラント・シュルにューノ１ンプシャ
ー州キーン） 乙　アメリカンφフイルトロナ（）く−ジニア州すッチ
モンド〕 ｄ、ボール壷バイオサポートにューヨーク州グレンコー
プ） １．フィッシャー・サイエンティフィック（ペンシルペ
ニア州ピッツバーグ） ！、　　マイクロスイルトレーションーシステムズ（ジ
ョーシア州ダブリン） ｇ、ゲルマン・サイエンシズ（ミシガン州アンプーバー
） 五、イーストマン・コダックにューヨーク州ロチニスタ
ー） 実施例４゜ この例は、観察された螢光原基質加水分解速度がマイク
ロウェルの底で乾燥された基質より本発明の反応速度お
よび螢光増強用支持体上で乾燥された基質の場合の方が
大きいことを示す。
純ＤＭＳＯ中の４−メチルウンベリフェリルパルミテー
トの０．５％溶液の２０ｐＪｌアリコートをセルロース
ディスク（カタログ／１６７４０−Ｅ、シュライヘル拳
つント・シェル９１２個それぞれ、および黒色ポリスチ
レン製９６ウエル型マイクロウエルトレー（ダイナチッ
ク、マイクロフルオル（商標〕“Ｂ”）の空のウェル１
２個それぞれに添加した。ＤＭＳＯをディスクおよびト
レーから減圧乾燥により除去した。基質を含有するディ
スクをトレーの空のウェル１２個にそれぞれ挿入した。
基質含有ディスクを入れたウェル８個、および減圧乾燥
した基質を含むウェル８個にそれぞれｐＨ７，８のＱ、
　ｌ　Ｍ　）　＋７ス一食塩緩衝液中の緑膿菌（ＡＴＣ
Ｃ３５０３２）の懸濁液１００　ｐｉを接種した。細胞
密度を直径１６ｍの試験管中で測定して６００　ｎ％で
１．７６の値に調整した。残りの、ディスクを含むウェ
ル、および基質を含むウェルには微生物を含まない緩衝
液を入れて、対照として用いた。
基質の加水分解速度は１分間隔でマイクロフルオル（商
標）リーダー（ダイナチック）により螢光の増大を監視
することにより測定された。第４図に示すよう罠セルロ
ースディスク上で乾燥させた基質を用いて得た速度は、
ウェル内で直接に乾燥した基質を用いて得たものよりか
なり高かった。
いずれかの理論により拘束されることは意図しないが、
この螢光増強の理由の１つはディスクによりて基質沈着
および後続の基質／接覆物相互作用のための表面積がよ
り太き（なることであろう。
これを工、４−メチルウンベリフェリルパルミテートが
緩衝液不溶性であり、従って支持体表面の基質と液状接
種物との界面において主として酵素加水分解を受けるこ
とが予想されるからである。
上記と同様な実験において同じプロトコールにより、緩
衝剤可溶性の基質、４−メチルウンベリフェリルホスフ
ェートを用いる反応に際して、セルロースディスクによ
り螢光が増強されることの証明も得られた。この基質を
含むディスクおよびウェルに微生物、肺炎桿菌（ＡＴＣ
Ｃ３３４９５）を接種した。第５図に示すように、セル
ロースディスク上で乾燥させた基質について観察された
速度はトレーウェル中で直接に乾燥された基質について
観察された場合よりはるかに高かった。
この例は反応速度および螢光増強用支持体が、緩衝剤可
溶性および緩衝剤不溶性双方の螢光原基質について反応
速度を実質的に改良することの直接的証明を与える。従
って本発明によりセルロースディスクを使用すると、定
常状態の反応を速やかに達成し、かつ維持することがで
きる。
実施例５゜ 下ｉピの例は本発明の酵素判定法により観察された種々
の反応速度を示す。螢光原基質０．１１１！ｇを含有す
るペーパーディスク（４７４０−Ｅ、シニライヘル拳つ
ントーシェル）Ｋ霊菌（、（７’　　１３４３）の懸濁
液２５μｌを接種した。懸濁液の細胞密度は直径１６ｍ
の試験管中で読取って６００　ｎｔｎで１．７６の光学
濃度に調整された。第６図に示すように、Ｌ−ロイシン
−７−アミド−４−メチルクマリンにつき観察された時
間の関数とし℃の螢光増大のプロットは１０分間の試験
期間にわたってほぼ直線的であった。基質Ｌ−フェニル
アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン（シグマ）
について得られた同様な反応速度プロット（第７図）は
ほぼ双曲線状であシ、初期の誘導期に続いて螢光がより
速やかに増大した。Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メ
チルクマリンについて得られた反応速度曲線（第８図）
は放物形であり、初期の急速反応期に続いて時間の経過
と共に速度が漸減した。このように異なる基質／微生物
の組合わせによって、異なる動力学的特性をもつ速度が
得られる。反応速度が直線であるかまたは直線に近い場
合、反応速度は線形回帰分析によって、または初期およ
び最終螢光測定値を用いる２点計算法により推定できる
。非線形の動力学的データはより高次の回帰式により処
理でき；初期誘導期、これに続く線状応答期、続いて最
終的静止期とい５５字形応答を示すデータは、曲線の直
線的な中央部分を処理することにより分析できる。
５！施例６゜ この例は、多様な微生物種をそれらが種々の螢光原基質
を加水分解する速度の差により区別しうることを証明す
る。
ディスク当た９０．１１Ｒ９の螢光原基質を含有するセ
ルロースディスク（カタログ／１６７４０−Ｅ１シュラ
イヘル・ラント・シュル）を黒色ポリスチレン襲マイク
ロウェルトレーのウェルに挿入し、ｆ７．８のＯ，ｌＡ
ｆト！Ｊスー食塩緩衝液中の微生物懸濁液５０μｌを接
種した。懸濁液の光学濃度は６００　ｎｍで１．７６に
調整された。被験基質には４−メチルウンペリフエロン
のパルミチン酸誘導体、β−Ｄ−グルコシド、ホスフェ
ートおよびガラクトシド、ならびにＬ−アラニン−７−
アミド−４−メチルクマリンが含まれていた。被験微生
物には黄色ブドウ球菌（ＳｔａｐｈｙＥｏｃｏｃｃｗａ
ａ％ｒｒｓｓ　）　（Ｓ　Ａ　）、緑膿菌（ＦＡ）、大
腸菌（ｐｃ）、モルガネラ・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｓ
　ｌｅａ　ｍｏｒｇａｎｉｉ）（ＭＭ）およびエンテロ
バクタ−・エロゲネス（Ｅｎｔｍｒｏｂａｃｔａｒ　ａ
ａｒｏｇａｎａｓ　）　（ＥＡ）が含まれていた。対照
（（’）反応は緩衝液のみを接種することにより行われ
た。基質加水分解速度（放出された螢光体ｎり／４））
は螢光の増大を１分毎に１０分間、マイクロフルオル（
商標）リーダー（ダイナチック）を用いて読取って試料
の螢光に比例するデータ値を求め、次いで各反応速度曲
線の直線部分の勾配を線形回帰により算出することによ
って判定された。第５表の結果は菌種／基質の組合わせ
それぞれに関する平均加水分解速度±１標準偏差値を示
す。各平均は５０回の速度実験、すなわち穏当たり５菌
株、株当たり１０試料、の平均を表わす。第５表には各
基質により識別される種を示す職別マトリックスも含ま
れる。２ａ［に関する平均速度（＋／−１標準偏差（Ｓ
ＴＤ））が重ならない場合、それらの速度は有意に異な
り、これら２種はその基質によって識別されるとみなさ
れた。
識別された対は（−Ｆ）により示される。その基質によ
って識別されなかった対の稲は空欄により示される。１
０種すべてがこの方法で５基質により識別された。
４−メチルウンベリフェリル・α−Ｄ−ガラクトシド平
均 ０．０３ −０．１６ ２．５３ ０．２１ ５．９７ ０．１２ 平均 ０．２９ １７．０３ ０．００ ０．５６ １４．６５ ０．１３ 平均 −０，１０ １７，５４ ３５，４９ ４２，４９ ５０，３６ −０，０６ ＋ｌ５ＴＤ ０．２０ ０．１０ ４．３８ ０．１９ ８．４０ ０．６７ ＋ＬＳＴＤ ０．９８ ５３．２３ ０．９４ ０．９４ １９．０８ １．５３ ＋ｌ５ＴＤ ０．０２ ２５．０２ ４７．７５ ４８．７８ ６１．１８ ０．０７ ｌ５ＴＤ −０，１２ −０，４３ ０，６８ −０，１４ ３，５３ −０，４４ Ａ Ａ Ｃ Ｍ Ａ ４−メチルウンベリフェリル・β−Ｄ−グルコシドｌ５
ＴＤ −０，４０ −１９，１０ −０，９５ −０，８３ １０，２２ −１，２６ Ａ Ａ Ｃ Ｍ Ａ Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリンＬＳＴ
Ｄ −０，２３ １０，０６ ２３，２３ ３６，１９ ３９，５２ −０，１９ Ａ Ａ Ｃ Ｍ Ａ 実施例７゜ この試験は血液培養ボトルからと（一般的に；離される
２５種の細菌について細菌酵素速度分仏により得られる
種間識別ｇよび種内威別を試験するために企画された。
被験細菌を第６表に挙げ。
ｃｌｏａｃａａ） 徨すストー綱による 嫌気性菌 非発酵菌 腸内細菌科 シトロバクタ−・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔａ
デｆデ＃％ｎｄｉｉ　　） ブドウ球菌 表皮フ下つ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕａ　ａｐ
ｉｄａｒｒｎｉｄｉａ）レンサ球菌 ｆｃＬｍｃａｌｉｍ　Ｄ） 肺炎Ｖンサ球菌（Ｓｔｒｇｐｔｏｃｏｃｃｓａ　ｐｎｍ
ｓｔｎｏｎｓα−）酵母 カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃ
ａｎｓ　）４６種類の異なる螢光原基質につき試験した
。
これらの基質はβ−メチルウンペリフエロンまたは７−
アミノ−４−メナルクマリンで螢光標識された。この試
験では一般に以下の群の細菌性酵素、たとえばアミノペ
プチダーゼ、リノぐ−ゼ、またヲエグリコシダーゼによ
り触媒される螢光放出速度を画定した。
データは１分毎ＫＩＯ分間にわたって、この機能のため
に特別に構成された計測器により得られた。これは光源
として水銀アーク灯を備え、これは正規化のために内部
監視された。この試験に用いた励起波長は３６５　％惰
であった。４４０　ｎｍにおける発光を利得プログラム
可能光電子増倍管により監視した。計測器はツイアテク
（カリフォルニア州サン・ルイス・オビスボ）マイクロ
プロセッサ−により制御され、これは試料のＸ−Ｙ平行
移動をも制御し、データ処理も行った。試料の接株は自
動的に行われ、細菌懸濁液２５μｌが各基質部位に分配
された。
パネルはこれらの実験のために特にシュドラウスおよび
アポジー社（双方ともマリーランド州バルチモア）によ
り製造された。パネルは、それぞれ標準マイクロウェル
トレーの長さおよび幅をｔもつ平らな黒色ポリプロピレ
ンシートから作成さレタ。シュライへル・ウントーシュ
ル７４０−Ｅ吸取紙（０３４３１ニューノ１ンプシャー
州キーン〕を直径６Ｗｓに打抜き、接看剤バッキング（
シュドラウスＶ−２３）により上記プラスチック製支持
体に接着した。ディスク間隔は標準的マイクロウェルト
レーのウェルの場合と同一であった。
基質はこれらをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶
解し、この溶液２０μｌをパネル上の適宜なディスクに
沈着させることにより調製された。次いでパネルを３時
間の減圧蒸発により乾燥させ、密封された箔パウチ内に
乾燥剤と共に包装し、−２０℃に貯蔵した。接種物を用
いて試験する直前にパネルを室温にまで昇温させた。第
７表に使用した基質溶液を、第８表に標準液を挙げる。
第　　７　　表 基質溶液および略号 ４ＭＵ−α−Ｄ−ガラクトシド ４ＭＵ−α−Ｄ−グルコシド ４ＭＵ−α−Ｄ−マンノシド ４ＭＵ−α−Ｌ−アラビノシト ４ＭＵ−α−Ｌ−７２ピノフラノシド ４ＭＵ−β−Ｄ−セロピラノシド ４ＭＵ−β−Ｄ−フコシド ４ＭＵ−β−Ｌ−フコシド ４ＭＵ−β−Ｄ−ガラクトシド ４ＭＵ−β−Ｄ−グルコシド ４ＭＵ−β−Ｄ−グルクロニド ４ＭＵ−β−Ｄ−マンノシド ４ＭＵ−β−Ｄ−キシロシド ６．２５ ０．２５ クトｙミニド ４ＭＵ−ブチレート ４ＭＵ−カブリレート ４ＭＵ−エリアデート ４ＭＵ−Ｐ−グアニドベンゾエート ４ＭＵ−ヘプタノエート ４ＭＵ−２クレート ４ＭＵ−ノナノ二一ト ４ＭＵ−オレエート ４ＭＵ−パルミテート ４ＭＵ−プロピオネート ４ＭＵ−ステアレート ４ＭＵ−スルフェート ４ＭＵ−ホスフェート ４ＭＵ−ピロホスフェート ６．２５ ０．４ ６．２５ ６．２５ ４ＭＵ−ミリステート アルギニン−ＡＭＣ セリン−ＡＭＣ グルタメート−ＡＭＣ グリシン−ＡＭＣ イソロイシン−ＡＭＣ ロイシン−ＡＭＣ フェニルアラニン−ＡＭＣ プロリン−ＡＭＣ ピログルタメート−ＡＭＣ メチオニン−ＡＭＣ チロシン−ＡＭＣ バリン−ＡＭＣ オルニチン−ＡＭＣ ６，２５ ６，２５ ２，５ ０，８ ６，２５ ６，２５ ６，２５ ６，２５ ６，２５ 第　　８ 標準液 表 β−メチルウンペリフエロン　　４−ＭＵ　　　　Ｏ，
０１２０，８ ７−アミノ−４−メチル　　　ＡＭＣＯ，０１２クマリ
ン　　　　　　　　　　　　　　０．８被験接徨物は５
％ヒツジ血液を含むトリブチツクソイ寒天上で、または
培養困難な微生物についてはチョコレート寒天上で一夜
インキエペートしたコロニーから調製された。微生物懸
濁液は１６ｘｍｘ１２５ｍｌのねじ込みキャップ付きガ
ラス製試験管中で６１　Ｇｙ−において１．７６の光学
濃度に調製すれた。希釈液ｔｔｏ、ｓ　５　％　　Ｎａ
Ｃ１，０，０２Ｔｏ　）ライドンＸ１００．および０．
ＩＡｆ）リスであり、これをｐＨ８，ＯＫ滴定した。各
種につき５菌株を試験した。ただしベプトコツカス・マ
グヌスおよびカンジダ・アルビカンスについては４菌株
のみを試験し、大腸菌については５Ｉ！株を二重反復試
験した。
計測器の水銀アーク灯からのビームを光学的にスプリッ
トし、出力を光検出器によフ監視した。
データは光源差に関して計測器内正規化された。
さらにデータは基質に関する螢光データを適宜な遊離螢
光基準β−メチルウンペリフエロンまたは７−アミノ−
４−メチンクマリンの螢光で徐することにより外部正規
化された。酵素速度は従って放出される遊離螢光体ｎ１
１分で表わされる。
各基質に関する閾値は緩衝液のみを接種した対照パネル
からの自然加水分解を調べることにより決定された。こ
れらを被験微生物すべてに関するデータベースからの速
度と比較した。対照速度と有意差を示す閾値速度を判定
した。
得られたデータは単位円射影法を用いる最隣接分析法に
より分析された。これ・工以下のステップを伴う。
１）　　１分および５分データ点に基づいて、または計
測器のダイナミックレンジを越える読みに関する不履行
速腿エステイメーター（ｄａｆａｓｌｔｒａｔｅ　ａｓ
ｔｉｍａｔｏデ）を用いてデータを測定した。
２）この速度を各基質に関して選ばれた閾値と比較した
。速度が閾値より小さい場合は比を１と設定し、他の場
合はその基質に関する速度対閾値の比を算出した。
３）この比のｌｏｇを求めた。
４）各基質の比のｌｏｇ値を平方し、次いでこれらの値
の和を求めた。
５）次いでこの和の平方根を算出した（これが基質速度
ベクターの量である）。
６）各基質に関するｌｏｇ比を上記５において求めた賃
で黙する。
これにより基質の値は単位ベクターに正規化された。こ
の方法によって実際の細胞密度を仰ることなく種々の細
胞密度の接種物を直接に比較しうろことが認められた。
試験した１２８菌株それぞれの最隣接は以下によｔ）ｌ
ｉｉ、出された。コン７ユージヨンマトリツクスにおい
て各基質につき！Ｉ種対それぞれに対する絶対差を求め
た。菌種対内ですべての基質についての絶対差の和を算
定した。１未知”菌株と１基準”菌株との差が最小のも
のが、未知菌株の最隣接または最良の同定を与えた。
この方法により被験菌株それぞれが９５−の試験につい
てその最隣接としての同一種の他の菌株に一致した。以
下の菌種は誤認が生じた。
肺炎桿菌 プロテウス・ミラビリス ンデイ しかし９５％の精度は市販される同定試験キットとして
期待される性能の範囲内にある。
実施例８゜ 螢光原基質および遊離螢光体を用いて生物試料の酵素水
準を測定することができる。若干の酵素の活性を伝統的
方法で酵素触媒反応の酸性および塩基性副生物を調べる
ことによって測定した。螢光ｐＨ指示薬、たとえばβ−
メチルウンペリフエロンが適宜緩衝化された系において
この目的に有用である。β−メチルウンペリフエロンの
螢光はほぼｐＨ６，２〜８．６におい又はｐＨにより影
響される。この螢光の変化をマイクロウェル内ではなく
本発明の螢光増強用支持体上で測定すると、感度は大幅
に高められる。
この例では試薬用アルコールに溶解したβ−メｆｋ’）
ンヘリフエロン５００ｔＬｇ　をシュライヘル・ラント
・シュルア４Ｏ−ＥＰｅにューハンフシャー州キーンン
の６龍デイスク上およびマイクロウェル（マイクロフル
オル”Ｂ”Ｃｍ１ｉＡ）、ダイナチック、バージニア州
カンティリー〕甲に沈着させた。溶剤を蒸発により乾燥
させた。螢光体をビス−トリスプロパン緩衝液２５μｌ
により再構成し、その際ｐＨは６．２〜８．６において
０．２ずつ上昇すべく調整された。螢光針（ダイナチッ
ク）くより螢光を読取った。第９図に示すデータから分
かるように、螢光はセルロース製支持体上においてはマ
イクロウェル内より大幅に増強された。
伝統的な細菌同定法では一連の生化学物質を用い、これ
らを未知の細菌種と共にインキエベートする。細菌が物
質と反応する場合、副生物は塩基性または酸性である場
合が多い。これらの副生物は適宜なｐＨ指示薬、たとえ
ばフェノールレッドまたをニブロムチモールブルーによ
り検出できる。
従ってこの種の反応は陽性または陰性であると解釈され
、細菌はこれらの陽性または陰性反応により分類され、
種分けされる。
本発明の反応速度および螢光増強用支持体上に沈着させ
た場合、ｐＩＩにより影響される螢光体、たとえばβ−
メチルウンペリフエロンを用いると、通常の試験法より
はるかに短い時間で細菌を同定することができる。
ウレアーゼの存在を調べることは細菌の同定に際し一般
に行われ、有用である。ウレアーゼが存在すると尿素が
加水分解され℃アンモニア、二酸化炭素Ｓよび水が生成
する。浴液中における最終生成物は炭酸アンモニウムで
あり、これによって溶液のｐＨが高まる。
本発明の器具を用いてウレアーゼの存在を調べた。尿素
（１０重量％）、β−メチルウンペリフエロン（５００
７１σ　）およびリン酸塩緩衝液（１，２５ｍＭ、　ｐ
Ｈ７，４）を含有する溶液をセルロースティスフ＜７４
０−Ｅ、シュライへル・ラント・シュル、ニューハンプ
シャー州キーン）に沈着させ、乾燥させた。次いでディ
スクをノーマルセーライン（０，８５％　ＮａＣ１）中
の微生物懸濁液２５μｌにより再構成した。微生物懸濁
液が２．０マクフア一ランド単位の密度になるべ（調整
された。螢光をインキュベーション直後および再びイン
キュベーションの１５分後に、室温で睨取った。観察さ
れた螢光単位の増大を第１０表に報告する。
第 表 プロテウス・ミラビリス（ＡＴＣＣ２０１１）　　　　
８６モルガネラ拳モルガニ（ＡＴＣＣ４３４）　　　　
９５７希釈液のみ モルガネラ・モルガニは強いウレアーゼ産生菌であり、
試験したプロテウス・ぐラビリスは弱いウレアーゼ産生
菌である。
実施例１１゜ ｍ累β−ラクタマーゼを発現する微生物（工、この酵素
により加水分解されるβ−ラクタム環を含むペニシリン
系およびセファロスポリン系抗生物質に対し耐性である
。下記のように一塩基性酸でＳるペニシリンＧのβ−ラ
クタム環が加水分解されると二塩基酸が得られる。
β−２クタマーゼおよび水の存在下では下記のように加
水分解される この現象を、本発明の反応速度および螢光増強用具を用
いたβ−ラクタマーゼの存在のアッセイに使用した。こ
の実験のために、水溶液状である場合にｐＨ８，０に調
整されたペニシリンＧ　６００μＶおよびβ−メチルク
ンベリフエロン５μＶを含有するセルロースディスクラ
調製した。ディスクを３５℃で一夜乾燥させた。
ｐＨ８，０に滴定された２　５９１１１Ｊン酸塩緩衝液
中に微生物懸濁液を調製し、３．０マク７ア一ランド単
位の密度に調整した。この懸濁液のアリコート（２５μ
ｌ　）を各ディスクに接種し、初期螢光を読取った。１
５分後に最終螢光を読取った。螢光信号の変化を測定し
た。標準β−２クタマーゼ試験による微生物の試験も行
ったにトロセフインディスク、ベクトン・デイツキンソ
ン・マイクロバイオロジー〇システムズ、マリ−ラント
州コツしイスビレ）。第１１表に報告するデータから認
められるように、商標的試験法においてβ−ラクタマー
ゼに関し陽性を与えた微生物は、陰性を与えた微生物よ
り実質的に大きな螢光減少を示した。さらに試験された
カタル球菌（Ｂ、ｃａｔａｒｒｈｔｚｌｔａ）の菌株は
試験された黄色ブドウ球菌の菌株より多量のβ−ラクタ
マーゼを産生ずることが知られてＸ１１る。
第 表 ＡＴＣＣ２９０７ 陰性対照　　　　　　　Ｎ／Ａ　　　　２７６　　　Ｎ
／Ａ
【図面の簡単な説明】
第１図は平面支持体に固定された反応速度および螢光増
強用支持体を備えた本発明器具の好ましい構造を示す。 第２図は試験ウェル内に反応速度および螢光増強用支持
体を備えた本発明器具の構造の別形態を示す。 これらの図において記号は下記のものを表わす。 ｌＯ：試験器具 １１：反応速度および螢光増強用支持体１２：キャリヤ
ー １３：トレー １４：ウェル 第３図は本発明により反応速度および螢光増強用支持体
に沈着した４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ
クトシドの、大腸菌による加水分解速度（実施例２）、 第４図は４−メチルウンベリフェリルパルミテートの、
緑膿菌による加水分解速度、 第５図は４−メチルウンベリフェリルホスフェートの、
肺炎桿菌による加水分解速度（実施例４）を示す。 第６図は霊菌がＬ−ロイシン−７−アミノ−４−メテル
クマリンを、 第７図はＬ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチ
ルクマリンを、 第８図はＬ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリ
ンを加水分解する速度をボす（実施例５）。 第９図はβ−メチルウンペリフエロンの螢光信号に対す
るｐＨの影響を示す（実施例８）。 代　　理 人

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、キャリヤー、 反応速度および螢光を増強する支持体少なくとも１個、
    ならびに 該支持体に沈着した螢光原基質、β−メチルウンペリフ
    エロン、７−アミノ−γ−メチルクマリン、β−ナフチ
    ルアミン、フルオレセインおよびレゾルフインよりなる
    群から選ばれる乾燥基質からなり、該支持体が有効量の
    乾燥基質を受容するのに十分な大きさの表面積を備えて
    いる、反応速度および螢光増強用試験器具。 ２、複数の支持体が施され、乾燥基質が螢光原基質であ
    り、複数の支持体のうち少なくとも若干が螢光原基質の
    識別点および濃度において複数の支持体のうちの他の支
    持体と異なる、請求項１記載の器具。 ３、支持体がさらに水性試料を受容するのに十分な気孔
    率を有する、請求項１記載の器具。 ４、支持体がセルロース製である、請求項１記載の器具
    。 ５、螢光原基質がクマリンの誘導体である、請求項２記
    載の器具。 ６、キャリヤーが複数の試験ウェルを備えたマイクロウ
    ェルプレートであり、支持体がこれらの試験ウェル内に
    ある、請求項２記載の器具。 ７、キャリヤーが平面カードであり、支持体が該カード
    に固定されている、請求項２記載の器具。 ８、請求項２に記載の試験器具を用意し； 流体試料を各支持体に添加し； 加水分解生成物の螢光を検出すべく各支持体を試験して
    、試料の酵素含量プロフィルを作成することよりなる、
    流体試料中に存在する酵素の判定法。 ９、反応速度および螢光増強性であり、４−メチルウン
    ペリフエロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、β−
    ナフチルアミン、フルオレセインおよびレゾルフインの
    誘導体よりなる群から選ばれる複数の螢光原基質を含有
    する複数の支持体それぞれに未知微生物の試料懸濁液を
    添加し； これら複数の螢光原基質それぞれに関する基質加水分解
    速度を測定し； これらの速度をデータベースにおける特徴として、また
    は特徴を誘導するために利用し；そして未知微生物に関
    する特徴を基準微生物に関する対応する特徴と比較する ことよりなる、未知微生物の同定法。 １０、基準微生物に関する特徴が未知微生物に関して用
    いたものと同じ方法により測定される、請求項９記載の
    方法。 １１、速度が支持体への懸濁液添加後の２時点間におけ
    る螢光の差を測定することにより判定される、請求項１
    ０記載の方法。 １２、懸濁液を支持体に添加する前に懸濁液の光学濃度
    を測定し、そして 懸濁液添加後の２時点において各支持体の螢光を測定し
    、各基質に関する測定速度を算出し、そして この速度測定値を上記光学濃度で除する ことにより各速度を光学濃度の変動に対し補正する、請
    求項１０記載の方法。 １３、各螢光原基質に測定されたうち最大の有意でない
    加水分解速度となるべく選ばれた閾値を指定し、そして
    未知微生物および基準微生物に関する各螢光原基質の特
    徴が 懸濁液添加後の２時点における各支持体の螢光を測定し
    、各基質に関する測定速度を算出し；各自の閾値より大
    きな加水分解速度を有する各基質に関しては、測定速度
    対各自の閾値の比の対数を計算し； そして 対応する閾値より小さいかまたはそれに等しい測定速度
    を有する各基質に関する特徴として値ゼロを指定する ことにより定められた対数である、請求項９記載の方法
    。 １４、各螢光原基質に測定されたうち最大の有意でない
    加水分解速度となるべく選ばれた閾値を指定し、そして
    未知微生物および基準微生物に関する各螢光原基質の特
    徴が 各自の光学濃度補正済み閾値より大きな光学濃度補正済
    み速度を有する各基質に関しては、光学濃度補正済み速
    度対各自の光学濃度補正済み閾値の比の対数を計算し； 対応する光学濃度補正済み閾値より小さいかまたはそれ
    に等しい光学濃度補正済み速度を有する各基質に関する
    特徴として値ゼロを指定することにより定められた対数
    である、請求項１２記載の方法。 １５、特徴が 懸濁液添加後の２時点において各支持体の螢光を測定し
    、各基質に関する測定速度を算出し、そして この速度を被験基質すべてに関する速度すべての平方和
    の平方根で除する ことにより定められる、請求項９記載の方法。 １６、各螢光原基質に測定されたうち最大の有意でない
    加水分解速度となるべく選ばれた閾値を指定し、そして
    各特徴が その閾値より大きな速度を有する各基質に関しては、速
    度対閾値の比の対数を計算し； その閾値より小さいかまたはそれに等しい速度を有する
    各基質に関する対数として値ゼロを指定し、次いで 各対数の平方和を算出し、そして 上記対数を上記平方和の平方根で除する ことにより定められる、請求項１２記載の方法。 １７、特徴の比較が 各基準微生物に関して未知微生物の各特徴と対応する基
    準微生物の特徴の差を算定し、 それぞれの差を平方し、そして これらの平方の和を求める ことを含む、請求項１１記載の方法。 １８、さらに、未知微生物の識別点として請求項１７に
    定める平方和のうち最小のものに対応する基準微生物を
    選ぶことよりなる、請求項１７記載の方法。 １９、データベースが同一種の複数の基準微生物の特徴
    を含み、さらに 請求項１７により定める一組のあらかじめ定められた数
    の平方和を選び、その際この組内の平方和はこの組に含
    まれないものより小さく、そして未知微生物の識別点と
    して、上記組内の平方和のうち最大数を有する基準微生
    物に対応する単一種の基準微生物を選ぶ ことよりなる、請求項１７記載の方法。 ２０、特徴の比較が 各基準微生物につき、未知微生物の各速度と対応する基
    準微生物の速度との差の絶対値を算定し、そして これらの絶対値の和を求める ことを含む、請求項１１記載の方法。 ２１、さらに、未知微生物の識別点として請求項２０に
    定める和の最小値に対応する基準微生物を選ぶことより
    なる、請求項２０記載の方法。 ２２、データベースが同一種の複数の基準微生物の特徴
    を含み、さらに 請求項２０により定める一組のあらかじめ定められた数
    の和を選び、その際この組内の和はこの組に含まれない
    ものより小さく、そして 未知微生物の識別点として、上記組内の和のうち最大数
    を有する基準微生物に対応する単一種の基準微生物を選
    ぶ ことよりなる、請求項１７記載の方法。 ２３、データベースが同一種の複数の基準微生物の特徴
    を含み、これらの特徴が これらの特徴をあらかじめ定められた数の隣接範囲の特
    徴に分け； 未知微生物に対応する特徴を含む範囲を判定し；各基準
    菌株および未知微生物の特徴を含む各範囲につき、デー
    タベース中の速度の総数のうちその菌株に相当しかつそ
    の範囲に含まれる分数を算出し； 各基準菌種につき、算出された分数をすべて互いに乗じ
    ；そして 未知微生物が対応する基準微生物として、最大積を有す
    る基準微生物を選ぶ ことにより比較される、請求項１０記載の方法。 ２４、さらに、基準微生物がその組内の特徴を示さない
    場合は常に、１未満の小さな正の数として分数を設定す
    ることよりなる、請求項２３記載の方法。
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