JP2617576B2 - 蛍光および反応速度を増強するための器具ならびにその使用法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般に螢光を検出するための器具に関する。
この器具は細菌および他の生体を迅速に同定し、他の生
物検体の酵素プロフイルを測定するために使用できる。

（従来の技術） 螢光原基質を酵素加水分解して検出可能な螢光種を得
ることが多様な診断用途に有用であることは知られてい
る。たとえば多数の研究者が、螢光原基質のパネルを用
いて未同定微生物を含有する試料中にどの酵素が存在す
るかを判定し、このプロフイルと既知のプロフイルとの
相関関係を調べて未知の微生物を同定する可能性につき
研究している。この螢光原検出システムを利用すること
が望まれているにもかかわらず、それを実用化不可能な
ものにする種々の理由から、その広範な利用はなされて
いない。

臨床分離物から検査室において微生物を同定する際に
重要な目標は迅速な同定である。大部分の商業的な細菌
同定システムは同定を行うために生体の分離後18〜24時
間以上を必要とする。現在の若干の“迅速”システムは
３〜13時間を要する。これらのシステムは一般に、一定
期間の生物増殖後に産出される糖またはアミノ酸代謝の
酸性または塩基性副生物の検出に依存している。

基質の酵素開裂を利用して特定の細菌種を同定するた
めの一方法は、米国特許第4,603,108号明細書（バスコ
ム）に記載されている。このバスコムの明細書には26種
の構成酵素に関する試験を含むキツトが記載されてい
る。各試験において酵素はそれが特異的基質と相互作用
する能力により判定される。試験用カードその他の器具
は多数のウエルまたは区画を備え、これらは別個に各酵
素試験に特異的な基質溶液を、各試験用の他の試薬と共
に含んでいる。使用に際しては細菌懸濁液を各区画に添
加すると、比較的短いインキユベーシヨン期間後に、検
出可能な生成物が生成する。次いで各試料中の対応する
酵素の量を比色法または螢光測定法による分光測定によ
り測定する。

上記明細書に記載された他の方法は、通常遭遇する細
菌群を迅速識別するために７種の試験を用いている。バ
スコムはこれら26試験アツセイ法または７試験アツセイ
法は菌種または菌種群について、独特の識別を与えると
教示している。それぞれの群または菌種に関する酵素活
性の定量測定を、あらかじめ同定された細菌の活性プロ
フイルとの比較により、その群または菌種の同定に用い
ることができる。この特異的試験は、フローセル（flow
cell）中での吸光度を測定することにより活性を測定
する。個々の試料分析および連続分析を採用しうる。バ
スコムの特許方法は大量のバイオマスおよび大きな流体
容量、ならびに比較的長いインキユベーシヨン期間を必
要とする。

他の科学者は微生物を同定するために螢光原基質を用
いた。ウエストレイ（Westley,J.W.）らは24種の細菌の
同定にα−アミノ酸−β−ナフチルアミド基質を用いる
ことにつき考察している（“各種アミノ酸のアミノペプ
チダーゼプロフイル”Annl．Micro.,15:822−825,196
7）。細菌は溶液に懸濁され基質溶液と共にインキユベ
ートされた。４時間のインキユベーシヨン後に、放出さ
れたβ−ナフチルアミンの螢光が測定された。

19種類のＬ−アミノ酸−β−ナフチルアミドの酵素加
水分解を測定するために螢光測定法を用いることにつき
記載した他の報文はピーターソン（Peterson,E.W.）ら
“アミノペプチダーゼプロフイルによる特定のグラム陰
性菌の迅速検出法";Ｊ．Food Sci.,43:1853−1856（19
78）である。各培養についてのプロフイルは４〜６時間
で得られた。

微生物の酵素活性プロフイルを得るために螢光原基質
を用いることに関する文献の論評はゴツドセイ（Goodse
y,J.H.）ら、“微生物の酵素活性プロフイルを用いた腸
内細菌（Enterobacteriaceae）の迅速同定法";J.Clin.M
icro.,13:483−490（1981）にある。ゴツドセイのグル
ープは腸内細菌科の539菌株についての研究において、1
8種類の螢光原基質を用いることを報告している。基質
を含有する緩衝液2ml中で37℃において最初の30分間、
加水分解速度を監視した。尿素以外の基質はすべてβ−
メチルウンベリフエロン、β−ナフチルアミンまたは７
−アミノ−４−メチルクマリンの誘導体であつた。

米国特許第4591554号明細書（クマラら）には、ウン
ベリフエロン誘導体を用いる螢光分析法が、少数の微生
物を検出し、その数を判定する手段として記載されてい
る。この方法では、ウンベリフエロン誘導体を試料溶液
に添加し、混合物溶液をインキユベートする。次いで不
溶性残渣（たとえば細胞）を除去し、通常の検出器によ
り螢光を読取る。次いで螢光の量と微生物数の関連を求
める。具体例には以下の実験が記載される。すなわち基
質を含有する溶液を細菌が含まれる溶液と混合する。イ
ンキユベーシヨン後にpHを調製し、混合物を遠心分離し
て不溶性細胞を除去する。次いで放出された４−メチル
ウンベリフエロンの螢光を測定する。場合により補酵素
を使用する。他の場合には、細胞を破壊して放出酵素量
を増加させる。

螢光原基質は生存生物中に存在する細胞外酵素のアツ
セイに有用であることも知られている（スナイダー（Sn
yder,A.）“微生物検出および同定におけるインビボ酵
素−基質螢光速度のパターン認識分析法";App.＆ Envir
o Micro, 51:969−977（1986）。反応時間は15分以下で
あつた。アツセイは緩衝液2ml中で行なわれた。この報
文は“誘導螢光による生存微生物の検出法”と題する、
シンシナチ大学を出願人とする国際特許出願の基礎をも
なしている（国際特許出願公開WO 86/05206号、1986年
９月12日付）。

酵素含量および活性の差に基づき細菌を識別するため
のさらに他の方法はチヨー・ポン・パウ（Chou−Pong P
au）ら、“二次元螢光データのパターン認識を用いて細
菌を‘識別する（fingerprinting）’ための迅速酵素
法";Clin．Chem. 32:987−991（1986）に記載されてい
る。このシステムでは、それぞれ異なる螢光部分を含む
６種類の螢光原基質の混合物が用いられる。螢光の増大
が30分間にわたつて監視される。螢光データのフーリエ
変換により被験微生物それぞれに特徴的な二次元配列が
得られる。この方法は測定を行い、数学的変換を行うた
めに、複雑かつ高価な装置を用いる必要がある。

遊離螢光体を診断に用いることは周知である。多くの
遊離螢光体は環境条件、たとえばpH、酸化還元電位また
は酸素分圧の変動によつて消光または増強されることが
知られている。これらの螢光体はそれらの螢光に影響を
与える環境条件を検出または監視するために用いられ
る。

試料中に存在する被分析体を螢光原基質の酵素加水分
解の検出または監視により同定または定量するための上
記方法はいずれも水性環境を必要とする。同様に、生物
学的試験系において環境の変化を監視するために遊離螢
光体を用いる場合も水性環境を必要とする。遊離螢光体
および螢光体原基質はそれらの安定性を最も良く維持す
るためには乾燥した状態を必要とするので、遊離螢光体
または螢光原物質を用いて受容できる貯蔵寿命を備えた
水性試験系を設計する際には問題が生じる。従つて設計
上の目的の１つは、遊離螢光体または螢光原基質を乾燥
状態で提供するという課題である。

螢光原基質を乾燥状態で保存する場合、それらは水性
の試験用懸濁液または溶液の添加後に速やかに定常状態
の反応に到達すべく酵素と反応しうる必要がある。螢光
原基質は水中で多様な溶解性を示すので、この目的は必
ずしも容易には達成されない。水溶性がきわめて低いの
は一般にリパーゼ基質である。この試みは低い水溶性を
もつ基質について特に困難である。

螢光物質に対する支持体として用いられている材料の
１つはセルロース系紙である。ワツトマン、No.4紙
が４゜Kにおいてピレン、ベンゾ〔ａ〕ピレン、クリセ
ンおよび溶剤精製石炭の分析のために、チユアン・フオ
デイン（Tuan Vo−Dinh）、“紙系支持体上における
多環式化合物のフルオレスセンス・ラインナローイング
・スペクトロメトリー（fluorescence line−narrowing
spectrometry）";Anal.Chem. 58:3135−3139（1986）
に用いられている。

ある感受性試験用品系列では螢光原基質を保持するた
めに紙が用いられる。センシタイター（Sensititre,
商標）感受性パネル（ラジオメーター・オブ・コペンハ
ーゲン社の製品、デンマーク、コペンハーゲン）の場
合、螢光原基質が紙上に乾燥した状態で供給される。
使用する際には紙ストリツプをブロス中に入れ、螢光
原基質を溶液中へ溶出させる。次いでブロスを溶液感受
性試験が行われるマイクロウエル内へ分配する。

微生物または病理学的状態を判定するために酵素プロ
フイルを調べる際に遭遇する他の問題は、バイオマスが
不適当であるという問題である。微生物判定試験におい
て望ましいことは、同定すべき微生物が臨床試料より調
製されたオーバーナイト画線平板から、または直接に陽
性の血液培養バイアルから分離されたコロニーから得ら
れることである。これらの状況下ではいずれも、得られ
る微生物数が限られている。同様に、生物試料を内性酵
素含量につき調べる場合、分析に用いられる生物学的流
体または組織の量が限られている。従つて判定を行うの
に必要なバイオマスの量を最小限に抑えるべきである。
迅速に結果を得るためには、高いバイオマス濃度が必要
である。これら２基準を満たすためには試験系を妥当な
程度に可能な限り小規模化すべきである。少量のバイオ
マスの使用を可能にするために小規模化することによつ
て他の問題が生じる。螢光原基質の量および得られる酵
素濃度が一定であれば、系の小規模化によつて単位時間
当たりに加水分解される基質の量が減少する。単位時間
当たりの総螢光変化も低下する。

従つて、許容できる貯蔵寿命をもち、必要な試料のバ
イオマス量が少なく、試料の添加後に速やかに平衡化し
て動力学的定常状態に達し、かつ高い螢光信号を与える
小規模化された系が求められている。

（発明の構成） 本発明は、 下記支持体を支持するキャリアー； セルロース製またはpH中和ガラス繊維製の少なくとも
１つの支持体；および 上記支持体上に付着した乾燥状態のａ）蛍光原基質ま
たはｂ）蛍光体と非蛍光原基質； を含む器具であって、ａ）支持体上に蛍光原基質を含む
場合には、支持体上に供される液体サンプル中の加水分
解酵素により加水分解される蛍光原基質の加水分解反応
速度および蛍光放出を、そしてｂ）支持体上に蛍光体と
非蛍光原基質とを含む場合には、支持体上に供される液
体サンプル中の加水分解酵素により加水分解される非蛍
光原基質の加水分解速度および蛍光体による蛍光放出
を、増強するための上記器具、 を提供する。

本発明において、蛍光原基質は蛍光体の誘導体であ
り、該蛍光原基質は好ましくはβ−メチルウンベリフェ
ロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、β−ナフチル
アミン、フルオレセインおよびレゾルフィンからなる群
から選択される化合物の誘導体である。蛍光原基質は加
水分解酵素によって加水分解されることにより蛍光体を
放出する。

本発明の器具はその上部または内部に固定された反応
速度および螢光増強用支持体を少なくとも１個有するキ
ヤリヤーを備えている。反応速度および螢光増強用支持
体には、螢光原基質、β−メチルウンペリフエロン、７
−アミノ−４−メチルクマリン、β−ナフチルアミン、
フルオレセインおよびレゾルフインよりなる群から選ば
れる乾燥物質が沈着している。反応速度および螢光増強
用支持体は有効量の乾燥物質を保持するのに十分な表面
積をもつ。

好ましくはこの器具は複数の反応速度および螢光増強
用支持体を備え、乾燥物質は螢光原基質である。

特に好ましい形態においては、反応速度および螢光増
強用支持体は、高い表面積一対一容量比をもつ材料から
作成される。きわめて好ましくは表面積および気孔率
は、支持体の気孔内に感容される水性試料により湿潤し
うる有効量の乾燥物質を保有するのに十分なものでなけ
ればならない。

乾燥物質は、これを適切な無水溶剤に溶解し、この溶
液を反応速度および螢光増強用支持体に沈着させること
により、その反応速度および螢光増強用支持体上に沈着
させることが好都合である。溶剤は適切な手段、たとえ
ば減圧乾燥により除去される。あるいは上記物質の溶液
をその反応速度および螢光増強用支持体に吸収させるこ
ともでき、この反応速度および螢光増強用支持体は分析
される検体を受容する気孔を残すのに十分な表面積一対
一容量比をもつ。次いで、乾燥物質を乾燥保持した反応
速度および螢光増強用支持体は、好ましくは低湿および
低温の環境で、長期間保存することができる。

本発明の酵素判定法は螢光原基質、β−メチルウンベ
リフエロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、β−ナ
フチルアミン、フルオレセインおよびレゾルフインより
なる群から選ばれる乾燥物質を使用して、生物検体中に
存在する１もしくは２種類以上の酸素の水準を迅速に測
定し、または酵素のプロフイルを判定する。本方法は疾
病状態をスクリーンするのに有用であり（たとえば精液
中のアルカリホスフアターゼが過度であることは前立腺
癌を示唆する）、かつ検体中に存在する生体を同定する
のに有用である。大部分の場合、測定される生体は細菌
であろう。しかし他の微生物、たとえば真菌を同定する
こともできる。本発明方法は微生物懸濁液および体液ま
たは分散組織試料を含めた種々の生物検体の酵素プロフ
イルを判定するのにも有用である。本方法は、螢光原基
質、遊離螢光体または両者を種々の濃度の選ばれた抗生
物質と併用して生物の代謝または増殖の存否を検出する
ことにより、選ばれた生物に関する抗生物質感受性およ
び最小抑制薬物濃度を検知するためにも利用できる。

本発明の酸素判定法においては、流体試料を複数の反
応速度および螢光増強用支持体のうち１または２以上に
添加する。反応速度および螢光増強用支持体はそれぞ
れ、螢光原基質、またはβ−ウンベリフエロン、７−ア
ミノ−４−メチルクマリン、β−ナフチルアミン、フル
オレセインおよびレゾルフインよりなる群から選ばれる
螢光体を乾燥保有する。試料中に存在する酵素がそれら
の基質を加水分解する。基質が螢光原性である場合、加
水分解速度は螢光性生成物の生成速度を測定することに
より測定される。基質が螢光原性でない場合、反応速度
および螢光増強用支持体は酵素基質、および加水分解生
成物（たとえば酸、塩基、O₂）の存在下で増強または消
光される乾燥した遊離螢光体を沈着保有する。この方法
で、その基質を加水分解する酵素の存在が検出され、所
望により試料中の１または２種類以上の酵素の反応速度
プロフイルが確立される。次いで試料の酵素反応速度プ
ロフイルを分析する。

微生物同定の場合、未知微生物を同定するために反応
速度プロフイルを既知微生物の基準酵素反応速度プロフ
イルと比較する。抗生物質感受性および最低発育阻害濃
度の試験に際しては、対照試料の酵素活性の存在と比較
して抗生物質の存在下での酵素活性の不在は、抗生物質
の有効性を指示する。

本発明の反応速度および螢光増強用支持体を乾燥螢光
原基質と共に用い、これらが流体試料中のそれらの酵素
と接触すると、酵素−基質相互作用の実質的な増強が観
察される。酵素−基質相互作用の反応速度は、速やかに
平衡化して動力学的定常状態になるのが観察されるとい
う点で増強される。水に易溶性の基質は速やかに溶解す
る。これによつてこれらの基質は速やかに動力学的定常
状態に達する。意外にも、境界的な水溶性をもつと考え
られていた螢光原基質ですら、速やかに定常状態の反応
条件に達する。低い溶解性をもつ基質は、それらが適切
な特性を備えた反応速度および螢増強用支持体上にあら
かじめ沈着している場合、流体状の生物検体と接触した
際に高い酵素特異性反応速度を示す。

本発明の反応速度および螢光増強用支持体の他の利点
は、純粋に液状の環境内で測定した場合の同一螢光体の
螢光と比較してそれらが大幅に螢光を増強することであ
る。意外にも、螢光体と支持体の相互作用によつて螢光
が著しく増幅される。固形支持体内のいずれの深さにお
いても散乱および吸光によつて螢光体に到達する励起線
の強度は低下するはずであるから、この所見は予想した
結果に反するものである。また固形支持体のいずれの深
さにおいても生じる放出螢光の強度も支持体による散乱
および吸光のため低下するはずである。従つて、あらか
じめ固形支持体に吸収されている、一定強度の励起線に
より励起された透明な螢光体溶液から得られる外部螢光
信号は、透明な溶液のみを等しい励起エネルギーで照射
したものから得られる信号より強度が低いであろう。本
発明においては反応速度および螢光増強用支持体の材料
を適切に選ぶことにより、螢光体溶液を固形支持体に吸
収させた場合に螢光信号は多数倍大きくなる。

図面について簡単に説明する。なお、以下の説明にお
いて用いられる省略記号については次のとおりである。
DSCCONはDisc Tape Control（ディスクテープ対照）の
略であり、DSCTSTはDisc Tape Substrate（ディスクテ
ープ基質）の略であり、DSCWELCONはDisc Well Control
（ディスクウエル対照）の略であり、DSCWELLSはDisc W
ell（ディスクウエル）の略であり、WELCONはWell Cont
rol（ウエル対照）の略であり、DSCはDisc（ディスク）
の略であり、DSCONはDisc Control（ディスク対照）の
略であり、ORGはOrganism（生物）の略であり、そしてC
ONTはControl（対照）の略である。

第１図は平面支持体に固定された反応速度および螢光
増強用支持体を備えた本発明器具の好ましい構造を示
す。

第２図は試験ウエル内に反応速度および螢光増強用支
持体を備えた本発明器具の構造の別形態を示す。

第３図は本発明により反応速度および螢光増強用支持
体に沈着したβ−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドの、大腸菌（E.coli）による加水分解速度を
示す（実施例２）。図中、（□）はDSCCON;（＋）はDSC
TST;（◇）はDSCWELCON;（△）はDSCWELTSTを表わす。

第４図は本発明により反応速度および螢光増強用支持
体に沈着したβ−メチルウンベリフエリルパルミテート
の、緑膿菌（P.aeruginosa）による加水分解速度を示す
（実施例４）。図中、（□）はWELL;（＋）はWELCON;
（◇）はDSC;（△）はDSCONを表わす。

第５図は本発明により反応速度および螢光増強用支持
体に沈着したβ−メチルウンベリフエリルホスフエート
の、肺炎桿菌（K.pneumoniae）による加水分解速度を示
す（実施例４）。図中、（□）はWELL;（＋）はWELCON;
（◇）はDISC;（△）はDISCONを表わす。

第６図は霊菌（S.Marcescens）がＬ−ロイシン−７−
アミノ−４−メチルクマリンを加水分解する速度を示す
（実施例５）。図中、（□）はORG、（＋）はCONT;
（◇）はORG;（△）はCONT;（×）はORG;（▽）はORGを
表わす。

第７図は霊菌がＬ−フエニルアラニン−７−アミド−
４−メチルクマリンを加水分解する速度を示す（実施例
５）。図中、（□）はORG;（＋）はCONT;（◇）はORG;
（△）はCONT;（×）はORG;▽ORGを表わす。

第８図は霊菌がＬ−アラニン−７−アミド−４−メチ
ルクマリンを加水分解する速度を示す（実施例５）。図
中、（□）はORG;（＋）はCONT;（◇）はORG;（△）はC
ONT;（×）はORG;（▽）はORGを表わす。

第９図はβ−メチルウンベリフエロンの螢光信号に対
するpHの影響を示す（実施例８）。図中、（□）は740
−Ｅセルロース；（＋）は液体を表す。

第１図に示すように、本発明の好ましい試験器具10は
適宜な数および列の反応速度および螢光増強用支持体11
をキヤリヤー12、たとえばカードその他の表面支持体上
に固定することにより製造される。キヤリヤーは好まし
くは（ただし必須ではない）硬質であり、平面である。
適切な材料にはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩
化ビニル、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、
フルオロポリマー、ポリカーボネート、およびアクリル
樹脂が含まれる。ポリプロピレンが好ましい。

あるいはキヤリヤーは複数の試験ウエル14を備えたト
レー13またはストリツプ、すなわち通常のマイクロウエ
ルトレーまたはストリツプであつてもよい。この場合、
器具は反応速度および螢光増強用支持体11を、目的とす
る用途に適した列および数の試験ウエル14それぞれ内に
配置することにより組立てられる。

反応速度および螢光増強用支持体に適した材料の選択
には、幾つか考慮すべき点がある。一般に反応速度およ
び螢光増強用支持体はそれに沈着した乾燥状態の螢光原
基質または遊離螢光体と反応性であつてはならず；反応
速度および螢光増強用支持体は好ましくは螢光を増強す
る性質をもつべきであり、それ自身は実質的な螢光を示
してはならず；反応速度および螢光増強用支持体は有効
量の乾燥基質または螢光体を保持するのに十分な、好ま
しくは試料の懸濁液または溶液を受容するのに十分な表
面積一対一体積比をもつべきであり；反応速度および螢
光増強用支持体は流体試料によつてぬれるのに十分な程
度に親水性でなければならず；かつ反応速度および螢光
増強用支持体は疎水性物質を保持しうる多数の部位を含
むべきである。本発明の反応速度および螢光増強用支持
体として用いるのに適した材料には、α−セルロースお
よびpH中和ガラス繊維が含まれる。特に好ましいものは
コツトンリトン紙の形のα−セルロース（たとえばシユ
ライヘル・ウント・シユル、ニユーハンプシヤー州キー
ン、から入手されるNo.740−Ｅおよび903の紙）、およ
びハイドロフイリツク HDC（Hydrophilic HDC、商標）
（ポール・バイオサポート社、ニユーヨーク州グレン・
コープ）の表示で研究開発量において入手される支持体
マトリツクスである。

一般に反応速度および螢光増強用支持体の厚さおよび
表面積は、本発明方法の至適化に際し有力な基準であ
る。反応速度および螢光増強用支持体が基質を沈着保持
する場合、反応速度および螢光増強用支持体の厚さは、
試料中に存在する１種または２種以上の有効酵素との反
応に有効な量の基質を保有するのに十分なものでなけれ
ばならない。同様に、支持体に沈着した乾燥状態の螢光
体のみが施される場合は、その厚さは処理に際し目的と
する反応系の残りの成分を受容するのに十分なものであ
ることが好ましい。一般に0.1〜2.0mmの厚さが適切であ
る。0.2〜1.0mmの厚さを採用するのが好都合であり、0.
5〜約0.9mmの厚さが好ましし。厚さは表面積と共に、反
応速度および螢光増強用支持体を完全にぬらすのに必要
な流体の容量を決定する。

反応速度および螢光増強用支持体の形状は決定的では
ない。反応速度および螢光増強用支持体は直径約1.0〜
約10.0mmの直円柱（デイスク）として成形されることが
好都合であり、これは乾燥状態の基質、遊離螢光体また
は両者を保持するのに有効な表面積、約0.8〜約80mm²に
相当する。反応速度および螢光増強用支持体の気孔率１
〜100μが適切であるい、１〜75μの気孔率を採用
しうる。気孔率は好ましくは約１μ（0.001c.c.）〜
約25μ（0.025c.c.）である。

本発明に有用な基質は試料中に存在する酵素と反応性
であることが認められている螢光原基質および非螢光原
基質である。螢光原基質は通常は有機および無機の酸、
配糖体およびペプチドの螢光原同族体から選ばれる。

本発明の酵素判定法を微生物の同定に用いる場合、螢
光原基質をそれぞれ調製するために同一の螢光体を用い
ることが好ましいが、異なる基質につき異なる螢光体を
用いてもよい。螢光体は天然基質部分にいずれかの適切
な手段で、通常は共有結合により結合される。適切な螢
光体にはβ−メチルウンベリフエロン、７−アミノ−４
−メチルクマリンおよび他のクマリン誘導体、β−ナフ
チルアミン誘導体、ならびにレゾルフインおよびフルオ
レセインの同様な付加生成物が含まれるが、これらに限
定されない。

本発明の反応速度および螢光増強用支持体は好ましく
は以下により調製される。螢光原基質または遊離螢光体
を適切な溶剤、たとえばジメチルスルホキシドまたはク
ロロホルムに溶解する。溶解した基質または遊離螢光体
をその反応速度および螢光増強用支持体に沈着させる。
溶液を反応速度および螢光増強用支持体に沈着させたの
ち、溶剤を適宜な手段、たとえば減圧乾燥により除去す
ることができる。こうして基質は反応速度および螢光増
強用支持体に保持される。次いで反応速度および螢光増
強用支持体は、好ましくは低温および低湿の条件下に、
長期間保存することができる。

好ましい器具はカード上に固定された反応速度および
螢光増強用支持体を備えている。この形態は流体をウエ
ルまたは容器に入れる必要がない。本発明の好ましい一
形態においては、セルロースシートの一方の面に接着剤
を塗布し、平面プラスチツク、ポリプロピレン製支持体
上へダイにより打抜くと、プラスチツク表面に付着した
個々のセルロースデイスクが残される。各デイスクに螢
光原基質または遊離螢光体を塗布し、乾燥したのち、次
いで流体溶液または懸濁液をデイスクに直接に乗せ、螢
光を計測器により読取る。用いる流体容量がデイスクを
飽和するのに必要な容量より少ないか、またはほぼこれ
に等しい場合、流体を収容するためにウエルまたは容器
を必要としない。

本発明の酵素判定法により、臨床試料から単離された
微生物を迅速に同定することができる。この種の臨床試
料には尿、糞便、創傷、咽喉、性器試料、または普通は
無菌の体液、たとえば血液もしくは脳脊髄液が含まれ
る。微生物は通常は同定の前に検体から単離される。

細菌培養コロニーは生物検体から調製される場合は十
分な増殖期間（通常は約18時間）後に採取される。採取
したコロニーを本発明方法による同定に適した水性液体
に懸濁する。調製された微生物または生物検体の懸濁液
を直接に反応速度および螢光増強用支持体上に沈着させ
る。

アツセイは無傷の細胞について実施することもできる
が、酵素利用度を高めるために細胞にある種の処理を施
すことが望ましいであろう。たとえば細胞膜透過性を高
めるために低水準の界面活性剤を用いることができる。
極端な例としては細胞膜を完全に破壊することが望まし
いであろう。細胞膜に希望する様式で影響を与えるのに
適した既知の処理法をいずれも採用できる。

個々の微生物を同定するのに必要な反応速度および螢
光増強用支持体の数は微生物に依存するであろう。ある
場合には単一支持体で十分であろう。他の場合にはある
微生物を他のきわめて類似するプロフイルをもつものか
ら区別するために、40以上の異なる支持体が必要となる
かも知れない。

この酵素判定法においては、調製法に関係なく流体試
料を反応速度および螢光増強用支持体それぞれに沈着さ
せる。前記のようにそれぞれの反応速度および螢光増強
用支持体は、螢光原基質（または遊離螢光体）の識別点
またはその濃度において他と異なる。好ましくは、反応
速度および螢光増強用支持体は試料で満たされるが、反
応速度および螢光増強用支持体の表面上の遊離流体は最
小限に抑えられる。好ましい寸法範囲の反応速度および
螢光増強用支持体に関する一般的な飽和容量は約３〜約
25μである。

適宜な期間、一般には約２〜約30分、ののち、個々の
螢光体に適した励起および発光波長を用いて螢光計によ
り反応速度および螢光増強用支持体を検査することによ
つて、酵素と各基質の反応の程度を測定する。

次いで酵素と複数の螢光原基質との反応速度プロフイ
ルを調べ、得られたプロフイルを既知微生物の基準速度
プロフイルと比較して、そのプロフイルを生じた特定の
微生物を同定する。

初期螢光の読みは反応速度および螢光増強用支持体そ
れぞれにつき接種後可能な限り速やかにエピフルオレス
センス（epifluorescence）法により行い、その際励起
および発光波長は個々の螢光体につき適宜選ばれる。次
いで後続の読みを選ばれた時間間隔で行う。一定のイン
キユベーシヨン期間−２〜30分間が好都合である−にわ
たつて螢光の読みを蓄積するために１分間隔、または他
のいずれかの期間を採用する。

次いで反応速度および螢光増強用支持体それぞれにつ
き反応速度を判定する。これらの速度を試料懸濁液の濁
り度に正規化する。この種の反応から得られる螢光強度
の範囲が広いため、使用する基質のうちある種のものに
ついては可変光度計検出感度を採用することが好まし
い。この可変感度を得るための一手段は、螢光発光を監
視するために用いられる光電子増倍管に与える高電圧を
変化させることである。この調節は手動でまたは自動的
に制御される。反応を監視するために用いる感度に対し
反応速度を正規化することも好ましい。

この方法を未知微生物の同定に利用する場合は、反応
速度および螢光増強用支持体すべてについての速度プロ
フイルを求め、次いで既知微生物のデータベースからあ
らかじめ確立した速度プロフイルと比較する。次いで未
知微生物の最良同定を得るために、適宜なアルゴリズム
を用いることができる。たとえば一同定法においては、
個々の基準菌株が一定の速度範囲内の基質加水分解速度
を与える確率を、複数の基質それぞれにつき判定する。
次いで未知微生物の実際の加水分解速度を各基準菌株に
関する確率を含むデータベースと比較して、未知微生物
が特定の対照菌株それぞれの一員である尤度（likeliho
od）を判定する。次いで、未知微生物が基準菌株と同一
種である尤度を基準菌種すべての尤度の和で徐すること
により、上記で求めた尤度を未知微生物に正規化する。
これらの正規化された尤度を次いで100倍して、これら
を％で表わす。最高率の尤度をもつ基準菌株は未知微生
物が最も可能性のある菌株である。望ましくはデータの
入手および分析はコンピューターにより行われる。

本発明の反応速度および螢光増強用支持体を用いるこ
とによる他の利点は、流体の螢光の計器測定がより高い
再現性を示すことである。少容量の流体の螢光をマイク
ロウエル内で測定すると、ウエル表面の疎水性によつて
メニスカスの形状が変動し、測定精度に影響を与えるで
あろう。ごく少容量の流体はウエルの底を必ずしも均一
に覆わないので、ウエル内への流体滴の装入も重要にな
る。これらの問題は希釈液に界面活性剤を添加すること
によつて、またはプラスチツク製ウエルの表面処理によ
つて、一部は克服できるが、これらの処理は系にとつて
付加的な複雑さを生じる（たとえば界面活性剤は生体の
細胞膜に影響を与える）。

通常の系においてきわめて濁り度の高い細菌懸濁液を
使用することも螢光の測定に影響を与える。純粋に液状
の系においては、これらの混濁した懸濁液（ほぼマクフ
アーランドNo.4の濃度）は励起エネルギーの多くを直接
に散乱および吸収することにより螢光の読みを妨げる。
本発明の反応速度および螢光増強用支持体を用いると、
細菌は反応速度および螢光増強用支持体に内包される。
本発明の系においては、きわめて濁り度の高い懸濁液も
目的とする螢光測定にほとんど影響を与えない。

以下の例はさらに本発明の種々の特色を説明するもの
であつて、特許請求の範囲に定められる本発明の範囲を
限定するものではない。

実施例 1. マイクロウエルトレー内に配置されたメチルウンベリ
フエロンを読取るべく設計された螢光計（マイクロフル
オル（Micro FLUOR 商標）リーダー、ダイナテツク・
ラボラトリーズ社、22021バージニア州シヤンテイリ
ー）を用いて、遊離螢光体β−メチルウンベリフエロン
（シグマ・ケミカル・カンパニー、63178ミズーリ州セ
ントルイス）および７−アミノ−４−メチルクマリン
（ポリサイエンシズ社、18976ペンシルベニア州ワリン
トン）の螢光特性につき調べた。

濃度および容量と螢光の関係につきβ−メチルウンベ
リフエロンを用いて調べた。この螢光体を黒色ポリスチ
レン製マイクロウエルトレー（マイクロフルオル（商
標）“B"プレート、カタログNo.011−010−780、ダイナ
テツク・ラボラトリーズ社、バージニア州シヤンテイリ
ー）に分配した。以下のプロトコールに従つた。試薬用
アルコールに溶解した螢光体25μを各試験ウエルに分
配し；アルコールを35℃のインキユベーター中で蒸発乾
固させ;pH8.0に調整された0.1M・HEPPS緩衝液（ユナイ
テツド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレーシヨ
ン）により螢光体を再構成し；プレートを読取つた。結
果を第Ｉ表に相対螢光単位で示す。

このデータは螢光信号がウエル内に存在する螢光体の
量に正比例することを示す。いずれか１種の螢光体濃度
については、容量の増加と共に信号の増強する傾向があ
ることも認められる。

上記ときわめて類似する実験を同じプロトコールによ
り行つた。ただし、セルロース紙（カタログNo.740−
Ｅ、シユライヘル・ウント・シユル社、ニユーハンプシ
ヤー州キーン 03431）から打抜いたデイスク上にβ−
メチルウンベリフエロンを沈着させ、これを黒色マイク
ロウエルトレー（ダイナテツク社製マイクロフルオル
（商標）“B"プレート）の底に置いた。この実験で得た
データを第２表に示す。

注釈：デイスクおよび螢光体を含有するウエルに関する
上記の数値は、読取り前にブランクのセルロースデイス
クおよび対応する量の緩衝液を含むウエルを用いて測定
した螢光値を差引いたものである。

デイスクを含まないウエル内のβ−メチルウンベリフ
エロンの場合と同様に、セルロースデイスクを含むウエ
ル内の螢光も一定容量の再構成用緩衝液については螢光
体の添加量に正比例する。しかし、セルロースデイスク
存在下での螢光は再構成用緩衝液の容量が増加するのに
伴つて減少する。事実、観察された蛍光は螢光体の最終
濃度（μg/ml）にほぼ正比例する。この効果は等しいト
レーのウエル内にデイスクが存在しない場合に見られた
ものと逆である。これらと同じ傾向は、他の実験におい
て再構成用緩衝液がデイスク当たり４、８、16および24
μ程度の少容量添加された場合ですら認められた。直
径6.35mm（0.25インチ）のセルロースデイスクを飽和さ
せるためには約25μの流体が必要である。

螢光体７−アミノ−４−メチルクマリンを用いて同様
な実験を反復した。用いたプロトコールは前記の実験で
用いたものと等しい。データを第３表に示す。

デイスク存在下でのβ−メチルウンベリフエロンにつ
き先に示したように、７−アミノ−４−メチルウンベリ
フエロンも一定容量の再構成用緩衝液については、存在
する螢光体全量に正比例する相対螢光値を与える。セル
ロースデイスクの存在下では、一定の螢光体全量につい
ては再構成用緩衝液の添加に伴つて相対螢光が同様に低
下する。

セルロース製支持体に遊離螢光体を添加した場合に得
られる著しい螢光増強は、デイスクを含む場合のデータ
と含まない場合のデータを比較すると明らかである。

実施例 2. この例は、基質が基質反応速度および螢光増強用支持
体上で乾燥された場合、ウエルまたは容器は基質と接種
物の反応が起こるために必ずしも必要ではないことを証
明する。

ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解したβ−Ｄ−ガ
ラクトシドに結合したβ−メチルウンベリフエロンの0.
5％溶液の20μ、アリコートをセルロース（カタログN
o.740−Ｅ、シユライヘル・ウント・シユル社、ニユー
ハンプシヤー州キーン）デイスク８個それぞれに添加し
た。減圧乾燥によりDMSOを除去した。乾燥したデイスク
４個を96ウエル黒色ポリスチレン製マイクロウエルトレ
ーの上部に両面接着テープを用いて接着した。残り４個
のデイスクはそれぞれ上記トレーのウエル４個の底に挿
入した。テープ上のデイスク２個、およびトレーのウエ
ル内のデイスク２個にpH7.8の0.1Mトリス−食塩緩衝液
中の大腸菌（ATCC 25922）の懸濁液25μをそれぞれ
接種した。直径16mmのガラス試験管中の接種用懸濁液の
光学濃度はスペクトロニツク88分光光度計（バウシユ・
アンド・ロム、ニユーヨーク州ロチエスター、14692）
により測定して600nmで1.8であつた。残り４個のデイス
クは対照として用いるために緩衝液のみと共にインキユ
ベートされた。すべてのデイスクについての螢光増強速
度を１分間隔でダイナテツク、マイクロフルオル（商
標）リーダーにより監視した。第３図に示すように、ト
レー上にテープ付けしたデイスクについて得られた速度
の測定値はウエル内のデイスクについて得られたものに
匹敵した。従つて基質／接種物の反応による螢光増強速
度の満足すべき測定を行うためにウエルまたは容器は不
必要である。ウエルまたは容器の必要性が除かれること
により、物理的系の寸法を大幅に縮小することができ、
試験を実施するのに必要な接種容量についても同様であ
る。

実施例 3. 螢光および反応速度を高める能力につき種々の支持体
材料を試験した。各支持体を試験するために、直径6.4m
m（0.250インチ）のデイスクを第４表に挙げた各材料の
シート素材から打抜いた。螢光原基質の0.5％溶液の20
μアリコートを各デイスクに添加した。試験された基
質はβ−メチルウンベリフエリルホスフエート（緩衝液
に可溶性の基質）およびβ−メチルウンベリフエニルパ
ルミテート（緩衝液に不溶性の基質）であつた。基質を
含有するデイスクを減圧乾燥により乾燥させ、次いで96
ウエルの黒色ポリスチレン製マイクロウエルトレー（ダ
イナテツク、マイクロフルオル（商標）“B"）のウエル
に挿入した。各デイスクに、pH7.8の0.1Mトリス−食塩
緩衝液中の緑膿菌（ATCC 27853）の懸濁液を接種し
た。直径16mmの試験管中で測定した微生物懸濁液の細胞
密度は600nmで1.8であつた。対照デイスクには緩衝液の
みを接種した。螢光増加を１分間隔でマイクロフルオル
（商標）リーダーにより監視した。

すべての支持体につき得られた結果を第４表にまとめ
る。合成支持体は疎水性パルミテート基質との反応に乏
しかつた。ナイロン製支持体はパルミテートを不安定に
する傾向を示した。ガラス繊維製支持体は反応を阻害し
たが、または基質を破壊した。セルロース製支持体は対
照の反応速度からの微生物の反応速度の識別性が最良で
あつた。微生物により得たβ−メルンウンベリフエリル
パルミテート加水分解速度も、セルロース製支持体を用
いた場合の方が他の支持体を用いた場合より高く、より
一貫性があり、かつセルロース製支持体はこの基質を不
安定にしなかつた。

実施例 4. この例は、観察された螢光原基質加水分解速度がマイ
クロウエルの底で乾燥された基質より本発明の反応速度
および螢光増強用支持体上で乾燥された基質の場合の方
が大きいことを示す。

純DMSO中のβ−メチルウンベリフエリルパルミテート
の0.5％の20μアリコートをセルロースデイスク（カ
タログNo.740−Ｅ、シユライヘル・ウント・シユル）12
個それぞれ、および黒色ポリスチレン製96ウエル型マイ
クロウエルトレー（ダイナテツク、マイクロフルオル
（商標）“B"）の空のウエル12個それぞれに添加した。
DMSOをデイスクおよびトレーから減圧乾燥により除去し
た。基質を含有するデイスクをトレーの空のウエル12個
にそれぞれ挿入した。基質含有デイスクを入れたウエル
８個、および減圧乾燥した基質を含むウエル８個にそれ
ぞれpH7.8の0.1Mトリス−食塩緩衝液中の緑膿菌（ATCC
35032）の懸濁液100μを接種した。細胞密度を直径
16mmの試験管中で測定して600nmで1.76の値に調整し
た。残りの、ディスクを含むウエル、および基質を含む
ウエルには微生物を含まない緩衝液を入れて、対照とし
て用いた。

基質の加水分解速度は１分間隔でマイクロフルオル
（商標）リーダー（ダイナテツク）により螢光の増大を
監視することにより限定された。第４図に示すようにセ
ルロースデイスク上で乾燥させた基質を用いて得た速度
は、ウエル内で直接に乾燥した基質を用いて得たものよ
りかなり高かつた。いずれかの理論により拘束されるこ
とは意図しないが、この螢光増強の理由の１つはデイス
クによつて基質沈着および後続の基質／接種物相互作用
のための表面積がより大きくなることであろう。これ
は、β−メチルウンベリフエリルパルミテートが緩衝液
不溶性であり、従つて支持体表面の基質と液状接種物と
の界面において主として酵素加水分解を受けることが予
想されるからである。

上記と同様な実験において同じプロトコールにより、
緩衝剤可溶性の基質、β−メチルウンベリフエリルホス
フエートを用いる反応に際して、セルロースデイスクに
より螢光が増強されることの証明も得られた。この基質
を含むデイスクおよびウエルに微生物、肺炎桿菌（ATCC
33495）を接種した。第５図に示すように、セルロー
スデイスク上で乾燥させた基質について観察された速度
はトレーウエル中で直接に乾燥された基質について観察
された場合よりはるかに高かつた。

この例は反応速度および螢光増強用支持体が、緩衝剤
可溶性および緩衝剤不溶性双方の螢光原基質について反
応速度を実質的に改良することの直接的証明を与える。
従つて本発明によりセルロースデイスクを使用すると、
定常状態の反応を速やかに達成し、かつ維持することが
できる。

実施例 5. 下記の例は本発明の酵素判定法により観察された種々
の反応速度を示す。螢光原基質0.1mgを含有するペーパ
ーデイスク（No.740−Ｅ、シユライヘル・ウント・シユ
ル）に霊菌（AT 1343）の懸濁液25μを接種した。懸
濁液の細胞密度は直径16mmの試験管中で読取つて600nm
で1.76の光学濃度に調整された。第６図に示すように、
Ｌ−ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリンにつき
観察された時間の関数としての螢光増大のプロツトは10
分間の試験期間にわたつてほぼ直線的てあつた。基質Ｌ
−フエニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン
（シグマ）について得られた同様な反応速度プロツト
（第７図）はほぼ双曲線状であり、初期の誘導期に続い
て螢光がより速やかに増大した。Ｌ−アラニン−７−ア
ミド−４−メチルクマリンについて得られた反応速度曲
線（第８図）は放物形であり、初期の急速反応期に続い
て時間の経過と共に速度が漸減した。このように異なる
基質／微生物の組合わせによつて、異なる動力学的特性
をもつ速度が得られる。反応速度が直線であるかまたは
直線に近い場合、反応速度は線形回帰分析によつて、ま
たは初期および最終螢光測定値を用いる２点計算法によ
り推定できる。非線形の動力学的データはより高次の回
帰式により処理でき；初期誘導期、これに続く線状応答
期、続いて最終的静止期というＳ字形応答を示すデータ
は、曲線の直線的な中央部分を処理することにより分析
できる。

実施例 6. この例は、多様な微生物種をそれらが種々の螢光原基
質を加水分解する速度の差により区別しうることを証明
する。

デイスク当たり0.1mgの螢光原基質を含有するセルロ
ースデイスク（カタログNo.740−Ｅ、シユライヘル・ウ
ント・シユル）を黒色ポリスチレン製マイクロウエルト
レーのウエルに挿入し、pH7.8の0.1Mトリス−食塩緩衝
液中の微生物懸濁液50μを接種した。懸濁液の光学濃
度は600nmで1.76に調整された。被験基質には、β−メ
チルウンベリフェロンのパルミチン酸誘導体、β−−Ｄ
−グルコシド誘導体、ホスフェート誘導体およびガラク
トシド誘導体、またはＬ−アラニン−７−アミド−４−
メチルクマリンが含まれていた。被験微生物には黄色ブ
ドウ球菌（Staphylococcus aureus）（SA）、緑膿菌（P
A）、大腸菌（EC）、モルガネラ・モルガニ（Morganell
a morganii）（MM）およびエンテロバクター・エロゲネ
ス（Enterobacter aerogenes）（EA）が含まれていた。
対照（Ｃ）反応は緩衝液のみを接種することにより行わ
れた。基質加水分解速度（放出された螢光体ng/分）は
螢光の増大を１分毎に10分間、マイクロフルオル（商
標）リーダー（ダイナテツク）を用いて読取つて試料の
螢光に比例するデータ値を求め、次いで各反応速度曲線
の直線部分の勾配を線形回帰により算出することによつ
て判定された。第５表の結果は菌種／基質の組合わせそ
れぞれに関する平均加水分解速度±１標準偏差値を示
す。各平均は50回の速度実験、すなわち種当たり５菌
株、株当たり10試料、の平均を表わす。第５表には各基
質により識別される種を示す識別マトリツクスも含まれ
る。２種に関する平均速度（＋／−１標準偏差（ST
D））が重ならない場合、それらの速度は有意に異な
り、これら２種はその基質によつて識別されるとみなさ
れた。識別された対は（＋）により示される。その基質
によつて識別されなかつた対の種は空欄により示され
る。10種すべてがこの方法で５基質により識別された。

実施例 7. この試験は血液培養ボトルからごく一般的に単離され
る25種の細菌について細菌酵素速度分析により得られる
種間識別および種内識別を試験するために企画された。
被験細菌を第６表に挙げる。

46種の異なる螢光原基質につき試験した。これらの基
質はβ−メチルウンベリフエロンまたは７−アミノ−４
−メチルクマリンで螢光標識された。この試験では一般
に以下の群の細菌性酵素、たとえばアミノペプチダー
ゼ、リパーゼ、またはグリコシダーゼにより触媒される
螢光放出速度を測定した。

データは１分毎に10分間にわたつて、この機能のため
に特別に構成された計測器により得られた。これは光源
として水銀アーク灯を備え、これは正規化のために内部
監視された。この試験に用いた励起波長は365nmであつ
た。440nmにおける発光を利得プログラム可能光電子増
倍管により監視した。計測器はツイアテク（カリフオル
ニア州サン・ルイス・オビスポ）マイクロプロセツサー
により制御され、これは試料のＸ−Ｙ平行移動をも制御
し、データ処理も行つた。試料の接種は自動的に行わ
れ、細菌懸濁液25μが各基質部位に分配された。

パネルはこれらの実験のために特にシユトラウスおよ
びアポジー社（双方ともマリーランド州バルチモア）に
より製造された。パネルは、それぞれ標準マイクロウエ
ルトレーの長さおよび幅ををもつ平らな黒色ポリプロピ
レンシートから作成された。シユライヘル・ウント・シ
ユル740−Ｅ吸取紙（03431 ニユーハンプシヤー州キー
ン）を直径6mmに打抜き、接着剤バツキング（シユトラ
ウスＶ−23）により上記プラスチツク製支持体に接着し
た。デイスク間隔は標準的マイクロウエルトレーのウエ
ルの場合と同一であつた。

基質はこれらをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解
し、この溶液20μをパネル上の適宜なデイスクに沈着
させることにより調製された。次いでパネルを３時間の
減圧蒸発により乾燥させ、密封された箔パウチ内に乾燥
剤と共に包装し、−20℃に貯蔵した。接種物を用いて試
験する直前にパネルを室温にまで昇温させた。第７表に
使用した基質溶液を、第８表に標準液を挙げる。

被験接種物は５％ヒツジ血液を含むトリプチツクソイ
寒天上で、または培養困難な微生物についてはチヨコレ
ート寒天上で一夜インキユベートしたコロニーから調製
された。微生物懸濁液は16mm×125mmのねじ込みキヤツ
プ付きガラス製試験管中で610nmにおいて1.76の光学濃
度に調製された。希釈液は0.85％、NaCl、0.02％トライ
トンX100、および0.1Mトリスであり、これをpH8.0に滴
定した。各種につき５菌株を試験した。ただしペプトコ
ツカス・マグヌスおよびカンジダ・アルビカンスについ
ては４菌株のみを試験し、大腸菌については５菌株を二
重反復試験した。

計測器の水銀アーク灯からのビームを光学的にスプリ
ツトし、出力を光検出器により監視した。データは光源
差に関して計測器内正規化された。さらにデータは基質
に関する螢光データを適宜な遊離螢光基準β−メチルウ
ンベリフエロンまたは７−アミノ−４−メチルクマリン
の螢光で徐することにより外部正規化された。酵素速度
は従つて放出される遊離螢光体ng/分で表わされる。

各基質に関する閾値は緩衝液のみを接種した対照パネ
ルからの自然加水分解を調べることにより決定された。
これらを被験微生物すべてに関するデータベースからの
速度と比較した。対照速度と有意差を示す閾値速度を判
定した。

得られたデータは単位円射影法を用いる最隣接分析法
により分析された。これは以下のステツプを伴う。

１） １分および５分データ点に基づいて、または計測
器のダイナミツクレンジを越える読みに関する不履行速
度エステイメーター（default rate estimator）を用い
てデータを測定した。

２） この速度を各基質に関して選ばれた閾値と比較し
た。速度が閾値より小さい場合は比を１と設定し、他の
場合はその基質に関する速度対閾値の比を算出した。

３） この比のlogを求めた。

４） 各基質の比のlog値を平方し、次いでこれらの値
の和を求めた。

５） 次いでこの和の平方根を算出した（これが基質速
度ベクターの量である）。

６） 各基質に関するlog比を上記５において求めた量
で除する。

これにより基質の値は単位ベクターに正規化された。
この方法によつて実際の細胞密度を知ることなく種々の
細胞密度の接種物を直接に比較しうることが認められ
た。

試験した128菌株それぞれの最隣接は以下により算出
された。コンフユージヨンマトリツクスにおいて各基質
につき菌種対それぞれに対する絶対差を求めた。菌種対
内ですべての基質についての絶対差の和を算定した。
“未知”菌株と“基準”菌株との差が最小のものが、未
知菌株の最隣接または最良の同定を与えた。

この方法により被験菌株それぞれが95％の試験につい
てその最隣接としての同一種の他の菌株に一致した。以
下の菌種は誤認が生じた。 実際の菌種 誤認 肺炎桿菌 プロテウス・ミラビリス インフルエンザ菌 ヘモフイルス・パライン フルエンザ エンテロバクター・エロ 肺炎桿菌 ゲネス 大腸菌 シトロバクター・フロイ ンデイ 大腸菌 シトロバクター・フロイ ンデイ しかし95％の精度は市販される同定試験キツトとして
期待される性能の範囲内にある。

実施例 8. 螢光原基質および遊離螢光体を用いて生物試料の酵素
水準を測定することができる。若干の酵素の活性を伝統
的方法で酵素触媒反応の酸性および塩基性副生物を調べ
ることによつて測定した。螢光pH指示薬、たとえばβ−
メチルウンベリフエロンが適宜緩衝化された系において
この目的に有用である。β−メチルウンベリフエロンの
螢光はほぼpH6.2〜8.6においてはpHにより影響される。
この螢光の変化をマイクロウエル内ではなく本発明の螢
光増強用支持体上で測定すると、感度は大幅に高められ
る。

この例では試薬用アルコールに溶解したβ−メチルウ
ンベリフエロン500ngをシユライヘル・ウント・シユル7
40−Ｅ紙（ニユーハンプシヤー州キーン）の6mmデイ
スク上およびマイクロウエル（マイクロフルオル“B"
（商標）、ダイナテツク、バージニア州カンテイリー）
中に沈着させた。溶剤を蒸発により乾燥させた。螢光体
をビス−トリスプロパン緩衝液25μにより再構成し、
その際pHは6.2〜8.6において0.2ずつ上昇すべく調整さ
れた。螢光計（ダイナテツク）により螢光を読取つた。
第９図に示すデータから分かるように、螢光はセルロー
ス製支持体上においてはマイクロウエル内より大幅に増
強された。

伝統的な細菌同定法では一連の生化学物質を用い、こ
れらを未知の細菌種と共にインキユベートする。細菌が
物質と反応する場合、副生物は塩基性または酸性である
場合が多い。これらの副生物は適宜なpH指示薬、たとえ
ばフエノールレツドまたはブロムチモールブルーにより
検出できる。従つてこの種の反応は陽性または陰性であ
ると解釈され、細菌はこれらの陽性または陰性反応によ
り分類され、種分けされる。

本発明の反応速度および螢光増強用支持体上に沈着さ
せた場合、pHにより影響される螢光体、たとえばβ−メ
チルウンベリフエロンを用いると、通常の試験法よりは
るかに短い時間で細菌を同定することができる。

ウレアーゼの存在を調べることは細菌の同定に際し一
般に行われ、有用である。ウレアーゼが存在すると尿素
が加水分解されてアンモニア、二酸化炭素および水が生
成する。溶液中における最終生成物は炭酸アンモニウム
であり、これによつて溶液のpHが高まる。

本発明の器具を用いてウレアーゼの存在を調べた。尿
素（10重量％）、β−メチルウンベリフエロン（500n
g）およびリン酸塩緩衝液（1.25mM、pH7.4）を含有する
溶液をセルロースデイスク（740−Ｅ、シユライヘル・
ウント・シユル、ニユーハンプシヤー州キーン）に沈着
させ、乾燥させた。次いでデイスクをノーマルセーライ
ン（0.85％ NaCl）中の微生物懸濁液25μにより再構
成した。微生物懸濁液が2.0マクフアーランド単位の密
度になるべく調整された。螢光をインキユベーシヨン直
後および再びインキユベーシヨンの15分後に、室温で読
取つた。観察された螢光単位の増大を第10表に報告す
る。

モルガネラ・モルガニは強いウレアーゼ産生菌であ
り、試験したプロテウス・ミラビリスは弱いウレアーゼ
産生菌である。

実施例 9. 酵素β−ラクタマーゼを発現する微生物は、この酵素
により加水分解されるβ−ラクタム環を含むペニシリン
系およびセフアロスポリン系抗生物質に対し耐性であ
る。下記のように一塩基性酸であるペニシリンＧのβ−
ラクタム環が加水分解されると二塩基酸が得られる。

β−ラクタマーゼおよび水の存在下では下記のように
加水分解される この現象を、本発明の反応速度および螢光増強用具を
用いたβ−ラクタマーゼの存在のアツセイに使用した。
この実験のために、水溶液状である場合にpH8.0に調整
されたペニシリンG600μｇおよびβ−メチルウンベリフ
エロン５μｇを含有するセルロースデイスクを調製し
た。デイスクを35℃で一夜乾燥させた。

pH8.0に滴定された25mMリン酸塩緩衝液中に微生物懸
濁液を調製し、3.0マクフアーランド単位の密度に調整
した。この懸濁液のアリコート（25μ）を各デイスク
に接種し、初期螢光を読取つた。15分後に最終螢光を読
取つた。螢光信号の変化を測定した。標準β−ラクタマ
ーゼ試験による微生物の試験も行つた（ニトロセフイン
デイスク、ベクトン・デイツキンソン・マイクロバイオ
ロジー・システムズ、マリーランド州コツカイスビ
レ）。第11表に報告するデータから認められるように、
商標的試験法においてβ−ラクタマーゼに関し陽性を与
えた微生物は、陰性を与えた微生物より実質的に大きな
螢光減少を示した。さらに試験されたカタル球菌（B.ca
tarrhalis）の菌株は試験された黄色ブドウ球菌の菌株
より多量のβ−ラクタマーゼを産生することが知られて
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は平面支持体に固定された反応速度および螢光増
強用支持体を備えた本発明器具の好ましい構造を示す。 第２図は試験ウエル内に反応速度および螢光増強用支持
体を備えた本発明器具の構造の別形態を示す。 これらの図において記号は下記のものを表わす。 10:試験器具 11:反応速度および螢光増強用支持体 12:キヤリヤー 13:トレー 14:ウエル 第３図は本発明により反応速度および螢光増強用支持体
に沈着したβ−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラ
クトシドの、大腸菌による加水分解速度（実施例２）、 第４図はβ−メチルウンベリフエリルパルミテートの、
緑膿菌による加水分解速度、 第５図はβ−メチルウンベリフエリルホスフエートの、
肺炎桿菌による加水分解速度（実施例４）を示す。 第６図は霊菌がＬ−ロイシン−７−アミノ−４−メチル
クマリンを、 第７図はＬ−フエニルアラニン−７−アミド−４−メチ
ルクマリンを、 第８図はＬ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリ
ンを加水分解する速度を示す（実施例５）。 第９図はβ−メチルウンベリフエロンの螢光信号に対す
るpHの影響を示す（実施例８）。 入

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グリゴリー・タイス アメリカ合衆国メリーランド州21093, バルティモア，ウエストン・コート ３ (56)参考文献 特開 平２−16965（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−134563（ＪＰ，Ａ) 特公 昭42−25409（ＪＰ，Ｂ１)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記支持体を支持するキャリアー； セルロース製またはpH中和ガラス繊維製の少なくとも１
   つの支持体；および 上記支持体上に付着した乾燥状態のａ）蛍光原基質また
   はｂ）蛍光体と非蛍光原基質； を含む器具であって、ａ）支持体上に蛍光原基質を含む
   場合には、支持体上に供される液体サンプル中の加水分
   解酵素により加水分解される蛍光原基質の加水分解反応
   速度および蛍光放出を、そしてｂ）支持体上に蛍光体と
   非蛍光原基質とを含む場合には、支持体上に供される液
   体サンプル中の加水分解酵素により加水分解される非蛍
   光原基質の加水分解速度および蛍光体による蛍光放出
   を、増強するための上記器具。
2. 【請求項２】支持体が複数である、請求項１記載の器
   具。
3. 【請求項３】複数の支持体のうちのいくつかが蛍光原基
   質または蛍光体の種類または濃度に関してその他の支持
   体とは異なる、請求項２記載の器具。
4. 【請求項４】蛍光原基質がβ−メチルウンベリフェロ
   ン、７−アミノ−４−メチルクマリン、β−ナフチルア
   ミン、フルオレセインおよびレゾルフィンからなる群か
   ら選択される化合物の誘導体である、請求項２記載の器
   具。
5. 【請求項５】蛍光体が７−アミノ−４−メチルクマリン
   である、請求項１記載の器具。
6. 【請求項６】蛍光体がβ−メチルウンベリフェロンであ
   る、請求項１記載の器具。
7. 【請求項７】蛍光体がレゾルフィンである、請求項１記
   載の器具。
8. 【請求項８】蛍光体がフルオレセインである、請求項１
   記載の器具。
9. 【請求項９】キャリアーが複数の試験ウエルを有するマ
   イクロウエルプレートであり、かつ、支持体が該試験ウ
   エル中に存在する、請求項２記載の器具。
10. 【請求項１０】キャリアーが平面カードであり、かつ、
    支持体が該カードに固定されている、請求項２記載の器
    具。
11. 【請求項１１】液体試料中に存在する加水分解酵素を確
    認する方法であって、 請求項２記載の器具を用意し； 各支持体に液体試料の一部を添加し；そして ａ）蛍光原基質に対する加水分解酵素の作用により生成
    するか、あるいはｂ）非蛍光原基質に対する加水分解酵
    素の作用により変化する、蛍光を発する物質を各支持体
    において測定して、試料の酵素含有量のプロフィールを
    作成する； 工程からなる、上記確認方法。
12. 【請求項１２】液体試料中に存在する微生物の同定方法
    であって、 請求項３記載の器具を用意し； 各支持体に液体試料の一部を添加し； ａ）蛍光原基質に対する加水分解酵素の作用により生成
    するか、あるいはｂ）非蛍光原基質に対する加水分解酵
    素の作用により変化する、蛍光を発する物質を各支持体
    において測定して、試料の酵素含有量のプロフィールを
    作成し；そして 検出された酵素含有量に関するプロフィールを基準微生
    物の酵素含有量に関するプロフィールと比較することに
    より微生物を同定する； 工程からなる、上記同定方法。