JP2006061023A - マイクロチャンバーアレイを用いたスクリーニング方法およびスクリーニング装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明のスクリーニング方法およびスクリーニング装置は、アレイ状に配置された複数のマイクロチャンバーを有する基板を用いて、スクリーニング対象となる試料から、目的とする酵素活性を有するタンパク質あるいは当該タンパク質を産生する微生物をスクリーニングするというものである。この方法および装置では、酵素活性を有するタンパク質と蛍光基質との酵素反応によって発生する蛍光を検出することによって、マイクロチャンバー内に存在する酵素活性を有するタンパク質あるいはそのタンパク質を産生する微生物を検出する。
【選択図】 なし
Description
「特集:コンビナトリアル・バイオエンジニアリング」、バイオインダストリー、2001年、18巻、6月号、7〜17頁、56〜72頁 Nippon Nogeikagaku Kaishi, Vol.78, No.5, 27〜30(2004年5月1日発行)
本発明のスクリーニング方法は、アレイ状に配置された複数のマイクロチャンバーを有する基板上に蛍光基質を添加する工程と、タンパク質あるいは微生物を含む試料を上記基板上に滴下する工程と、タンパク質あるいは微生物と上記蛍光基質との酵素反応によって発生する蛍光を検出することによって、上記マイクロチャンバー内に存在する酵素活性を有するタンパク質あるいはそのタンパク質を産生する微生物を検出する工程と、を含むものである。
本発明のスクリーニング装置は、試料中から酵素活性を有するタンパク質あるいはそのタンパク質を産生している微生物をスクリーニングする装置である。このスクリーニング装置は、アレイ状に配置された複数のマイクロチャンバーを有する基板と、上記基板上で発生する蛍光を検出する蛍光検出器とを備えており、上記蛍光検出器が、酵素活性を有するタンパク質と蛍光基質との酵素反応によって発生する蛍光を検出することによって、上記マイクロチャンバー内に存在する酵素活性を有するタンパク質あるいはそのタンパク質を産生する微生物を検出する。
本実施例では、まず、リパーゼ分泌発現酵母を以下の手順で作製した。
Geotrichum candidum lipase lip1遺伝子の5’側にEcoRI、 3’側にSalIのサイトができるプライマーを用いて、polymerase chain reaction (PCR)を行った。得られたPCR産物をEcoRI, SalIで切断した後、同様にEcoRI, SalIで処理した酵母用分泌用ベクターpYE22mと連結することにより、Geotrichum candidum lipase分泌発現プラスミドpYEGCL1を構築した。構築したpYEGCL1のGeotrichum candidum lipase遺伝子部分の塩基配列はデオキシターミネーター法によりエラーがないことを確認した。pYEGCL1でSaccharomyces cerevisiae EH1315株を形質転換し、リパーゼ分泌発現酵母を作製した。プラスミド導入の確認は、形質転換株から抽出した遺伝子を鋳型としてGeotrichum candidum lipase遺伝子の両端のプライマーを用いてPCRを行い、Geotrichum candidum lipase遺伝子サイズ1.6kb付近でのバンドの増幅で確認した。
上記の手順で調製されたGeotrichum candidum lipase分泌発現酵母を合成培地10 mLで2日間、30℃で振とう培養後、培養液を3000rpm、4℃、10分で遠心分離し、集菌した。得られた菌体はPBS 10 mLで懸濁後、同条件の遠心分離にて集菌した。菌体の洗浄をもう一度行い、洗浄菌体はPBS 1 mLに懸濁した。濁度をOD600で測定した。4℃に保った状態のマイクロチャンバーアレイ(内径20μm)上に、懸濁酵母 40 μl(OD600=0.6相当)を散布し、4℃で10分間放置した。さらにその液面に添わせるように基質(0.1 mmol/l(0.1mM) MU-C18/ 1% DMF/ 50mmol(50 mM) リン酸緩衝液(pH7.0))360 μlを加え、4℃で10分間放置した。滑らすようにカバーガラスを乗せ、水分を押し出し、その後プレートを湿度100%のインキュベーター(室温)内で1時間反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した(励起波長 320 nm、検出波長 450 nm)。
本実施例では、まず、リパーゼ表層発現酵母を以下の手順で作製した。
Geotrichum candidum lipase lip1遺伝子の5’側にEcoRI、 3’側にXhoIのサイトができるプライマーを用いてpolymerase chain reaction (PCR)を行った。得られたPCR産物をEcoRI, XhoIで切断した後、同様にEcoRI, XhoIで処理した酵母用分泌用ベクターpCASS25と連結することにより、Geotrichum candidum lipase表層発現プラスミドpCASS25GCL1を構築した。構築したpCASS25GCL1のGeotrichum candidum lipase遺伝子部分の塩基配列はデオキシターミネーター法によりエラーがないことを確認した。PCASS25GCL1でSaccharomyces cerevisiae EH1315株を形質転換し、リパーゼ表層発現酵母を作製した。プラスミド導入の確認は、形質転換株から抽出した遺伝子を鋳型としてGeotrichum candidum lipase遺伝子の両端のプライマーを用いてPCRを行い、Geotrichum candidum lipase遺伝子サイズ1.6kb付近でのバンドの増幅で確認した。
上記の手順で調製されたGeotrichum candidum lipase表層発現酵母を合成培地10 mLで2日間、30℃で振とう培養後、培養液を3000rpm、4℃、10分で遠心分離し、集菌した。得られた菌体はPBS 10 mLで懸濁後、同条件の遠心分離にて集菌した。菌体の洗浄をもう一度行い、洗浄菌体はPBS 1 mLに懸濁した。濁度をOD600で測定した。4℃に保った状態のマイクロチャンバーアレイ(内径20μm)上に、懸濁酵母 40 μl(OD600=0.6相当)を散布し、4℃で10分間放置した。さらにその液面にそわせるように基質(0.1 mM MU-C18/ 1% DMF/ 50 mM リン酸緩衝液(pH7.0))360 μlを加え、4℃で10分間放置した。滑らすようにカバーガラスを乗せ、水分を押し出し、その後プレートを湿度100%のインキュベーター(室温)内で1時間反応させ、蛍光顕微鏡で観察した(励起波長 320 nm、検出波長 450 nm)。
海底から採取したTerrabacter属の海洋微生物(文献:J. Bacteriol. 179, 53-62, 1997:に記載のTerrabacter属の細菌の16SrRNAと相同性が100%の菌)を市販のmarine broth(Difco, cat no. 279110)10 mLで5日間、25℃で振とう培養後、培養液を8000rpm、4℃、5分で遠心分離し、集菌した。得られた菌体はPBS 10 mLで懸濁後、同条件の遠心分離にて集菌した。菌体の洗浄をもう一度行い、洗浄菌体はPBS 1 mLに懸濁した。濁度をOD600で測定した。4℃に保った状態のマイクロチャンバーアレイ(内径100μm)上に、懸濁酵母 40 μl(OD600=0.6相当)を散布し、4℃で10分間放置した。さらにその液面にそわせるように基質(0.1 mM Fluorescein-diC18/ 1% DMF/ 50 mM リン酸緩衝液(pH7.0))360 μlを加え、4℃で10分間放置した。滑らすようにカバーガラスを乗せ、水分を押し出し、その後プレートを湿度100%のインキュベーター(室温)内で1時間反応させ、市販のマイクロアレイスキャナ(CRBIOTMIIe-FIPC)で検出した(励起波長473nm、検出波長532nm)。
2 電動ステージ
3 CCDカメラ
4 PC
10 スクリーニング装置
Claims (8)
- アレイ状に配置された複数のマイクロチャンバーを有する基板上に、分解することによって蛍光を発する蛍光基質を添加する工程と、
タンパク質あるいは微生物を含む試料を上記基板上に滴下する工程と、
タンパク質あるいは微生物と上記蛍光基質との酵素反応によって発生する蛍光を検出することによって、上記マイクロチャンバー内に存在する酵素活性を有するタンパク質あるいはそのタンパク質を産生する微生物を検出する工程と、
を含むことを特徴とするタンパク質あるいは微生物のスクリーニング方法。 - 上記タンパク質は、微生物の細胞膜の表層に発現しているタンパク質であり、
上記の検出する工程では、上記複数のマイクロチャンバーのうち、蛍光を発するマイクロチャンバーを検出することによって、酵素活性を有するタンパク質を細胞膜の表層に発現している微生物を検出することを特徴とする請求項1に記載のスクリーニング方法。 - 上記マイクロチャンバーの内径は、5〜500μmであることを特徴とする請求項1または2に記載のスクリーニング方法。
- 上記の検出する工程の後に、
上記タンパク質が含まれているマイクロチャンバー内の内容物を取り出す工程をさらに含むことを特徴とする請求項1〜3の何れか1項に記載のスクリーニング方法。 - 試料中から酵素活性を有するタンパク質あるいはそのタンパク質を産生している微生物をスクリーニングする装置であって、
アレイ状に配置された複数のマイクロチャンバーを有する基板と、
上記基板上で発生する蛍光を検出する蛍光検出器とを備え、
上記蛍光検出器は、酵素活性を有するタンパク質と蛍光基質との酵素反応によって発生する蛍光を検出することによって、上記マイクロチャンバー内に存在する酵素活性を有するタンパク質あるいはそのタンパク質を産生する微生物を検出することを特徴とするタンパク質あるいは微生物のスクリーニング装置。 - 上記タンパク質は、微生物の細胞膜の表層に発現しているタンパク質であり、
上記蛍光検出器は、上記複数のマイクロチャンバーのうち、蛍光を発するマイクロチャンバーを検出することによって、酵素活性を有するタンパク質を細胞膜の表層に発現している微生物を検出することを特徴とする請求項5に記載のスクリーニング装置。 - 蛍光を発するマイクロチャンバー内の内容物を取り出すマイクロマニプレーターをさらに備えていることを特徴とする請求項5または6に記載のスクリーニング装置。
- 上記マイクロチャンバーの内径は、5〜500μmであることを特徴とする請求項5〜7の何れか1項に記載のスクリーニング装置。
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