JP7030695B2 - 微生物の増殖または検出のための化学的に明らかな培地 - Google Patents

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Description

本発明は、広い範囲の微生物の検出のための、少なくとも１種の浸透圧保護化合物および少なくとも１種の脂肪酸を含む、化学的に明らかな培養培地に関する。
１９世紀から、複合培地と名付けられる汎用培養培地は、細菌、酵母およびカビの増殖および培養のために利用可能である。これらの培地を製造するためのプロセスおよび使用される主要な成分は、驚くべきことに、当時からその基本的な性質がほとんど変化していない。これらの微生物学的培地の主要な基礎は、それらに含有されるペプトンである。
目下のペプトンは、極めて広く多様な細菌、酵母およびカビの増殖を可能にする組み合わせおよび濃度で存在するように設計される。したがって、これらのペプトンの混合物は、生化学的に富み、よくバランスの取れた栄養源であり、通常は、塩、緩衝剤、および、速い増殖を最適化するために必須の他の原料の添加によって補完される。加えて、固形の培地は、一般に、十分に水に可溶性である。溶解後、培地は滅菌可能であり、これが必要であれば、原核生物および／または真核生物細胞の接種後に、コンタミネーションを防止しながらも同時に酸素を入れることを許容する、好適な都合の良い容器に提供され得る。続いて、培地および細胞を含む容器は、好適な温度でインキュベートされ、細胞増殖を可能する。
しかしながら、当該技術分野に精通した高度な経験を積んだ個人による、ペプトンのタイプの注意深い選択のみが、その生化学的組成において十分に広く、十分にバランスのとれた、栄養学的基礎を有する適切な培地をもたらし、極めて幅広い範囲の原核生物および真核生物の培養を可能にする。ペプトンの品質は、ペプトンのタイプ間、同じペプトンの異なる製造者間で変動し、同じ製造者からの異なるグレード間で変動し、単一の製造者からの同じグレードのバッチ間でさえも有意に変動する。しかしながら、この変動する品質の生化学的性質についてはあまり理解されておらず、バッチ間変動のレベルでは殊更にそうである。しかしながら、生化学的な変動は、確実に、１つには、用いられる天然原料の変動する品質に起因する。したがって、このような原料における栄養不足または栄養のアンバランスに起因して、ペプトンの全てのバッチが特定の培地レシピにおける使用のために常に好適であるとは限らず、このため、極めて幅広い範囲の原核生物および真核生物の増殖を可能にするために、すなわち、幅広い多様な細菌、酵母およびカビの許容できる増殖を支持するために、各バッチが注意深く選択されなければならない。
ペプトンの正確な組成は、知られていない。これは、細胞増殖促進をもたらすかかる天然の原料により提供される重要な栄養因子が、ある程度までは理解されているものの十分ではないことを意味する。あまり理解されておらず、同様に制御することが難しいのは、例えば、それが沈殿を引き起す培地内のかかる原料の負の物理化学的相互作用である。問題の複雑さは、あるペプトンが、別のペプトンのタイプとともに、塩、緩衝剤および従来の培地に典型的に存在する他の成分に加えて、混合される場合に増加する。よくバランスの取れた一般的な増殖培地の製造は、試行錯誤および長年の経験の問題である。添加される個々のペプトンのバッチ間の変動は、試験原核生物（細菌）および真核生物（酵母および真菌）株の所望の細胞増殖の全範囲を与えるのに好適でないバッチを、単独であろうと、または他のペプトンのタイプとの組み合わせであろうと、そのような培地を製造する生産プロセスから排除することができるように、適切に制御されるべきである。
これらの方策の後でさえも、極めて幅広い範囲の細胞株の増殖のためのそのような一般的な培地は、典型的には、環境モニタリング適用のための培地好適性を確認するために用いられる、広範な試験パネルにおいて試験される全ての細菌、酵母および真菌株を増殖させるために、必ずしも生化学的に十分にバランスが取れていないか、栄養価に富んでいない。一方では、ある種の細胞タイプは、培地に提供される生化学物質の正確なバランスに非常に敏感である。他方では、さらに、特に非常に偏好性の細胞は、それらの増殖性能を押し上げるために新鮮な血液または血液抽出物のような追加の補充物を必要とする。これらの培地でさえも、ある種の非常に偏好性の高い細胞タイプのための十分な栄養価に富む組成を有しておらず、環境サンプル中に典型的に見出される原核生物および真核生物細胞の広い範囲について、それらをそれらの使用に効果的にするための、増殖を支持する、または増殖を加速するための補充物のさらなる添加を必要とする。
近年、化学的に明らかな細胞培養培地が開発されている。しかしながら、今日まで、微生物の培養のための化学的に明らかな培地の生産者らは、原核生物（例えば、細菌）または真核生物（例えば、酵母または真菌または昆虫または哺乳動物の細胞）のいずれかの増殖を支持することに専念している。
WO 2007/135385は、例えば、細菌、とりわけNeisseria種の増殖のための化学的に明らかな培地を開示する。
GB 2464203は、Campylobacterの計数のための化学的に明らかな培地を開示する。
本発明の目的は、したがって、環境サンプル、食品および飲料産業からのサンプル、医薬サンプルまたは臨床サンプルなどの様々なサンプルにおいて典型的に見出される、原核生物および真核生物細胞の増殖の必要性を網羅する、例えば、よく知られているペプトンおよび／または抽出物ベースの培地に匹敵することができる、原核生物および真核生物種などの極めて広い範囲の微生物を増殖させるための土台を提供する、化学的に明らかな原料に基づく細胞培養培地を提供することである。
従来のペプトンベースの培地と本質的に同じ増殖能力を有する様々なサンプル中に典型的に見出される極めて広い範囲の原核生物および真核生物の増殖を支持することができる一般的な、非特異的な化学的に明らかな増殖培地を提供することができることを見出した。培地は、原核生物と真核生物の両方の典型的な単離体の大部分を増殖させるための適切な生化学的バランスを満たすのみならず、原核生物と真核生物の両方の偏好性の細胞の増殖を支持するための要件を同時に満たす。付随して、このような培地は、典型的には、明らかなインキュベーション条件において、従来のペプトンベースの複合培地よりもはるかに速い酵母およびカビの増殖も可能にする。
結果として、本発明は、少なくとも１種の浸透圧保護化合物および少なくとも１種の脂肪酸を含む、化学的に明らかな細胞培養培地に向けられる。
少なくとも１種の浸透圧保護化合物および少なくとも１種の脂肪酸の組み合わせが、多様な微生物の増殖を促進する、普遍的な、化学的に明らかな、かつ完全に合成の培養培地を生み出すことを可能にすることを見出した。
浸透圧保護化合物（または相溶性溶質）は、浸透圧調節物質として作用し、生物が過剰な浸透圧ストレスから生き残ることを助ける小分子である。これらの分子は、細胞内に蓄積され、細胞の周囲と細胞基質との浸透圧差を平衡化する。典型的な浸透圧保護剤のカテゴリーは、例えば、アミノ酸、糖、またはポリカチオン（例えば、プロリン、コリン、サッカロース、トレハロース、スペルミジン…）である。好ましいカテゴリーは、アミノ酸またはペプチドである。
好ましい態様において、浸透圧保護化合物は、ベタイン（トリメチルグリシン）、エクトイン、プロリン、コリン、サッカロース、トレハロースおよびスペルミジンからなる群から選択される。特に好ましい態様において、浸透圧保護剤は、ベタイン（トリメチルグリシン）およびエクトインからなる群から選択される。さらにより好ましくは、浸透圧保護化合物は、ベタインである。
典型的には、培養培地中の浸透圧保護化合物の濃度は、培養培地の１０～３６０ｍｇ／ｌの範囲である。好ましい態様において、培養培地中の浸透圧保護化合物の濃度は、培養培地の２０～１６０ｍｇ／ｌの範囲である。より好ましい態様において、培養培地中の浸透圧保護化合物の濃度は、培養培地の８０～１２０ｍｇ／ｌの範囲である。さらにより好ましくは、浸透圧保護化合物の濃度は、培養培地の１００ｍｇ／ｌである。
脂肪酸は、飽和または不飽和のいずれかである長い脂肪族尾部（鎖）を有するカルボン酸である。本発明により用いられる脂肪酸は、均一な、または均一でない数の炭素原子を有し、飽和または不飽和であり得る。炭素原子の数は、典型的には、４個と２８個との間である。好ましくは、炭素原子の数は、６個と２２個との間、より好ましくは、８個と２０個との間である。不飽和の脂肪酸は、少なくとも１つの二重結合を有するが、より多くの、例えば、２、３、４、５または６つの二重結合を有することができる。本発明により用いられる脂肪酸の例は、ミリストレイン酸、オレイン酸、リノール酸、ステアリン酸、パルミチン酸、アラキジン酸またはサピエン酸である。好ましい態様において、脂肪酸は、ミリストレイン酸、オレイン酸、リノール酸およびステアリン酸からなる群から選択される。より好ましくは、脂肪酸は、オレイン酸である。
典型的には、培養培地中の脂肪酸の濃度は、培養培地の５～４０ｍｇ／ｌの範囲である。好ましくは、濃度は、培養培地の１０～３０ｍｇ／ｌの範囲、より好ましくは２０ｍｇ／ｌである。
細胞培養は、細胞が培養される任意のセットアップである。
細胞培養は、細胞の培養に好適な任意の容器、例えば、ペトリティッシュ、接触プレート(contact plate)、ボトル、チューブ、ウェル、ベッセル、バッグ、フラスコまたはタンクにおいて行うことができる。典型的には、容器は、使用の前に滅菌される。インキュベーションは、典型的には、好適な温度、浸透圧、通気、撹拌などの好適な条件下で行われる。当業者は、細胞の増殖／培養を支持または維持するための好適なインキュベーション条件を知っている。
本発明による細胞培養培地（同義に使用：培養培地）は、細胞のインビトロ増殖を維持および／もしくは支持し、ならびに／または特定の生理学的状態を支持する成分の任意の混合物である。それは、化学的に明らかな培地である。細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持するのに必要な全ての成分を含むことができ、あるいは別々に添加されるさらなる成分と組み合わされる、選択された成分の添加のために使用することができる。好ましくは、細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持するのに必要な全ての成分を含む。
本発明による細胞培養培地は、多くの様々な種類の生物、例えば、細菌細胞のような原核生物細胞、または酵母、真菌、藻類、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような真核生物細胞、または古細菌の増殖に、またはその増殖を維持／支持に好適であるように設計される。好ましくは、それらは、原核生物細胞および真核生物細胞の増殖を維持／支持する。
増殖が本発明による培地によって維持／支持される細胞の例は以下のとおりである。
－ 細菌：
Achromobacter種 野生型
Acinetobacter lwoffii ATCC（登録商標）17925（商標）
Bacillus clausii ATCC（登録商標）700160
Bacillus halodurans 野生型
Bacillus okuhidensis 野生型
Bacillus pumilus 野生型
Bacillus subtilis ATCC（登録商標）6633（商標）
Bacillus subtilis 野生型
Burkholderia種 野生型
Clostridium sporogenes ATCC（登録商標）11437（商標）
Clostridium sporogenes ATCC（登録商標）19404（商標）
Corynebacterium tuberculostearicum 野生型
Escherichia coli ATCC（登録商標）25922（商標）
Escherichia coli ATCC（登録商標）8739（商標）
Kocuria rhizophila ATCC（登録商標）9341（商標）
Leifsonia種 野生型
Methylobacterium extorquens ATCC（登録商標）43645（商標）
Methylobacterium extorquens NBRC 15911
Methylobacterium fujisawaense 野生型
Methylobacterium mesophilicum ATCC（登録商標）29983（商標）
Methylobacterium亜種 野生型
Micrococcus luteus ATCC（登録商標）10240（商標）
Micrococcus lylae 野生型
Paenibacillus lautus 野生型
Pantoea種 野生型
Propionibacterium acnes ATCC（登録商標）6919（商標）
Pseudomonas aeruginosa ATCC（登録商標）9027（商標）
Ralstonia pickettii ATCC（登録商標）27511（商標）
Ralstonia pickettii 野生型
Salmonella typhimurium ATCC（登録商標）14028（商標）
Serratia marcescens 野生型
Sphingomonas parapaucimobilis 野生型
Sphingomonas paucimobilis ATCC（登録商標）29837（商標）
Sphingomonas paucimobilis 野生型
Staphylococcus aureus ATCC（登録商標）25923（商標）
Staphylococcus aureus ATCC（登録商標）6538（商標）
Staphylococcus epidermidis ATCC（登録商標）12228（商標）
Staphylococcus epidermidis 野生型
Staphylococcus hominis ATCC（登録商標）27844（商標）
Stenotrophomonas maltophilia ATCC（登録商標）13637（商標）
Streptococcus pyogenes ATCC（登録商標）12344（商標）
Streptococcus pyogenes ATCC（登録商標）21059（商標）
－ 酵母：
Candida albicans ATCC（登録商標）10231（商標）
Debaryomyces hansenii DSM 3428
Exophiala種 野生型
－ カビ：
Aspergillus brasiliensis ATCC（登録商標）16404（商標）
Aspergillus brasiliensis 野生型
Aspergillus sydowii DSM 63373
Penicillium commune ATCC（登録商標）10428（商標）
例えば、本発明による化学的に明らかな培養培地は、グラム陽性微生物およびグラム陰性微生物、例えば、ヒト皮膚コンタミナント、水コンタミナント、酵母およびカビ、例えば、Bacillus subtilis、Clostridium sporogenes、Propionibacterium acnes、Staphylococcus aureus、Aspergillus brasiliensis、Candida albicans、Escherichia coli、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium fujisawaense、Methylobacterium mesophilicum、Pseudomonas aeruginosa、Paenibacillus lautus、Ralstonia pickettii、Staphylococcus epidermidisなどの増殖を支持してもよい。
化学的に明らかな細胞培養培地は、化学的によく特徴付けられている「明らかな」原料からなる細胞培養培地である。これは、培地に用いられている全ての化学物質の化学的な組成が知られていることを意味する。化学的に明らかな培地は、化学的にはっきりしない酵母、動物または植物組織からならない；それらはペプトン、フィーダー細胞、血清、抽出物もしくは消化物、または、化学的に不明瞭なタンパク質および／もしくはペプチドおよび／もしくは加水分解物を培地に提供し得る他の成分を含まない。化学的に不明確であるか、またははっきりしない化学成分は、その化学的組成および構造がよく知られていないものであり、はっきりせずにかつ変動する組成で存在し、または、アルブミンまたはカゼインからのタンパク質消化物の化学的組成および構造の評価に匹敵する、莫大な実験的努力によることにしか明らかにできなかったものである。化学的に明らかな培地は、化学的に明らかなタンパク質またはペプチドを含んでもよい。
粉末状細胞培養培地または乾燥粉末培地は、典型的には、粉砕プロセスまたは凍結乾燥プロセスにより生ずる細胞培養培地である。これは、粉末状細胞培養培地が、典型的には、細かい顆粒の粒子状培地であり、液体培地ではないことを意味する。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と互換的に用いられてもよい；しかしながら、本明細書で用いられる「乾燥粉末」は、単に、造粒された材料の肉眼的外観を指し、別段の指示がない限り、材料が複合体化または凝集した溶媒を完全に含まないことを意味することを意図しない。粉末状細胞培養培地はまた、例えば、ローラー圧縮によって乾式造粒される造粒された細胞培養培地であり得る。
原核生物および真核生物の一般的な増殖を支持するための本発明の培地は、この目的のために用いられる標準的な培地に匹敵する（視覚的な）増殖特性を示すし、したがって、これらは、典型的には、
ａ．検出される傾向にある大部分の細胞の細胞増殖を促進するための生化学物質のバランスを含有する
ｉ）極めて幅広い範囲の原核生物および真核生物のニーズを供給するのに十分な特定の生化学物質を含有するが、同時に
ｉｉ）ある種の感受性細胞株の増殖を有意に阻害するほど高い、特定の生化学物質の濃度を含有しない
ｂ．多くの原核生物および真核生物種に存在する栄養要求性のギャップを橋渡しするのに好適な豊富な栄養ベースを含有する
ｃ．増殖が、
ｉ）有意に延長された遅滞期、または
ｉｉ）それらが細胞損傷および／または過度の細胞同化活性に打ち勝つのに十分な代謝活性を回復することができないことによる細胞死
を導き得る、広範囲のデノボ酵素合成によって不必要に遅れないように、細胞に供給することができるある種の複雑な生化学物質を含有する。
細胞のインビトロの増殖を維持および／または支持するために必要な全ての成分を含む細胞培養培地は、典型的には、少なくとも１以上のサッカリド(saccharide)成分、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤成分、１以上の補因子および１以上の核酸成分（窒素塩基）を含む。
これはまた、組換えタンパク質、例えば、ｒインスリン、ｒＢＳＡ、ｒトランスフェリン、ｒサイトカインなどを含んでもよい。好ましくは、培地は、組み換えタンパク質を含まない。
培地は、ピルビン酸ナトリウム、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック製品の成分（エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに基づくブロックコポリマー）、特にPluronic F 68もしくはKolliphor P 188もしくはLutrol F 68と時折呼ばれるPoloxamer 188および／または化学的に調製された非イオン性界面活性剤などの表面活性成分を含んでもよい。好適な非イオン性界面活性剤の１つの例は、ポロキサマーとも呼ばれる第一級ヒドロキシル基で終端をなす二官能性ブロックコポリマー界面活性剤であり、例えば、BASF（Germany）から商標名pluronic（登録商標）で入手可能である。そのようなプルロニック製品の成分は、以下において単にプルロニックと呼ばれる。キレート剤、ホルモンおよび／または増殖因子を添加してもよい。
それが含んでもよい他の成分は、乳酸、チオグリコール酸、チオスルファート、テトラチオナート、ジアミノブタン、ミオイノシトール、ホスファチジルコリン（レシチン）、スフィンゴミエリン、鉄含有化合物（鉄硫黄クラスターを含む）、尿酸、カルバモイルホスファート、コハク酸、オロチン酸、ホスファチジン酸、プトレシン、トリグリセリド、ステロイド（コレステロールを含む）、メタロチオニン、酸素、グリセロール、尿素、アルファ－ケトグルタラート、アンモニア、グリセロホスファート、デンプン、グリコーゲン、グリオキサラート、イソプレノイド、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、脂質（ミセルのそれらを含む）、トリブチリン、ブチリン、コール酸、デスオキシコール酸、ポリホスファート、アセタート、タルトラート、マラート、オキサラートおよび／またはアセトンの純粋な化合物、塩、コンジュゲートおよび／または誘導体である。
サッカリド成分は、グルコース、ガラクトースもしくはフルクトース（モノサッカリドの例）またはスクロース、ラクトースもしくはマルトース（ジサッカリドの例）のような全てのモノ－もしくはジ－サッカリド、または、糖アルコールのようなそれらの誘導体である。サッカリド成分は、オリゴ－またはポリサッカリドであってもよい。
本発明によるアミノ酸の例は、タンパク質新生アミノ酸、とりわけ、必須アミノ酸である、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびに非タンパク質新生アミノ酸、例えばＤ－アミノ酸などである。
チロシンは、Ｌ－またはＤ－チロシン、好ましくはＬ－チロシンを意味する。
システインは、Ｌ－またはＤ－システイン、好ましくはＬ－システインを意味する。
アミノ酸前駆体および類似体も含まれる。
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、様々なレチノイド、おおび４つのカロテノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）（アスコルビン酸のリン酸塩を含む）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体および類似体も含まれる。
塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸塩、カリウムおよびナトリウムなどの無機イオン、またはＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、ＶおよびＺｎなどの微量元素を含む成分である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、一塩基性リン酸ナトリウム無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム無水物（ＭｇＳＯ４）、二塩基性リン酸ナトリウム無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）である。
緩衝剤の例は、重炭酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、カルシフェロール、コリン、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ（還元型および／または酸化型）、コバラミン、ビタミンＢ１２、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、フラビンアデニンジヌクレオチド、グルタチオン（還元型および／または酸化型および／または二量体として）、ヘム、ヘミン、ヘモグロビン、フェリチン、ヌクレオチドリン酸および／または誘導体（例えば、アデノシンリン酸）、補酵素Ｆ４２０、ｓ－アデノシルメチオニン、補酵素Ｂ、補酵素Ｍ、補酵素Ｑ、アセチルＣｏ－Ａ、モリブドプテリン、ピロロキノリンキノン、テトラヒドロビオプテリンの化合物、塩、複合体および／または誘導体である。
本発明による核酸成分は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、キサンチンおよび／またはヒポキサンチンのようなヌクレオ塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、キサントシン、イノシン、グアノシンおよびチミジンのようなヌクレオシド、およびアデノシン一リン酸、またはアデノシン二リン酸、またはアデノシン三リン酸のようなヌクレオチドであり、これらに限定されないが、それらのデオキシ－および／またはリン酸誘導体および／または二量体、三量体および／またはＲＮＡおよび／またはＤＮＡのような多量体を含む。
これらに限定されないが、用いられる濃度において細胞増殖特性に負の影響を与えることなく、培地および／または１以上のその成分の透明度および／または溶解性を増加させるような、物理化学的特性を改善する化合物、例えば、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤、デタージェント(detergents)、界面活性剤、乳化剤（ポリソルベート８０など）、中和剤、（ポリソルベート８０など）、ミセル形成剤、ミセル阻害剤、および／またはポリプロピレングリコール、ポリエチレンアルコール、および／またはカルボキシメチルセルロールなどを添加してもよい。
培地は、典型的には、糖および／または糖混合物および／または糖二量体および／または糖多量体および／またはそれらの誘導体などの炭水化物を含有する。典型的には、グルコースは、主な炭水化物糖成分である。グルコースは、通常、水性培地溶液中０．００１ｍＭ～２５０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ～１００ｍＭ、さらにより好ましくは１ｍＭ～１０ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭの濃度で培地中に含まれる。
典型的には、培地は、１リットル当たり１０ｍｇから３ｇまでの範囲で、好ましくは１リットル当たり４０ｍｇから１ｇまでの範囲で各アミノ酸を含む。
培地は、典型的には、ビタミンを含む。培地中のビタミンの典型的な量は、１リットル当たり５μｇ～１０ｍｇの範囲、好ましくは１リットル当たり５０μｇ～６ｍｇの範囲である。
典型的には、培地は塩を含む。１種の塩の量は、典型的には、１リットル当たり２μｇ～１０ｍｇの範囲、好ましくは１リットル当たり１０μｇ～７ｍｇの範囲、より好ましくは１リットル当たり１．７ｍｇから１リットル当たり最大６．６ｍｇまでである。特定の塩はまた、はるかに高い量で存在してもよい；ＮａＣｌの濃度は、例えば、１リットルあたり最大５ｇまでであり得る。
培地に含まれる核酸の典型的な量は、１リットル当たり０．５～１０ｍｇの範囲、好ましくは１リットル当たり１～５ｍｇの範囲である。
培地は、典型的には、全てのタンパク質新生アミノ酸（および／またはそれらの誘導体および／またはそれらのコンジュゲートおよび／またはそれらの二量体（純粋および／または混合））を含有する。固体培地中の濃度は、ある種のアミノ酸が水性培地中で反応して、溶液中の純粋なアミノ酸がそれによって枯渇するアミノ酸をしたがって間接的に含有する生成物を形成するので、水中において溶解後の濃度と著しく異なる可能性があることに留意しなければならない。このプロセスは、他の容易に反応する構成要素、例えば、これに限定されないがビタミンＣに生じてもよく、および／または、実際にはアミノ酸が互いにまたはそれ自身と反応してもよい。このプロセスは、酸素濃度や、微量元素および／または超微量元素、特に成分として直接的に添加される、および／またはコンタミナントとして存在する、Ｃｕ（ＩＩ）および／またはＦｅ（ＩＩＩ）のような遷移金属イオンの存在に依存する酸化プロセスであってもよい。
本発明による培地に含まれてもよいさらなる成分は以下のとおりである。
－ 重炭酸アンモニウム
－ 色指示薬
－ 蛍光性基質
本発明による化学的に明らかな培養培地は、少なくとも１種の蛍光性基質をさらに含むことができる。蛍光性基質は、微生物により合成される酵素に接触すると切断され、蛍光性となる複合分子である。放出される蛍光は、ＵＶまたは可視スペクトルの放射線を用いて増殖培地を照射することにより、分光光度計で検出可能である。蛍光性基質の例は、フルオレセイン誘導体（フルオレセイン誘導体、メチルウンベリフェロン誘導体または（Biosynth社により開発された）Aldols（商標））である。
典型的には、好適な細胞培養培地は、２～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５～３０ｇ／Ｌの典型的な組成を有する。ゲル化剤を含むそのような培地は、典型的には、１ｇ／Ｌと５０ｇ／Ｌとの間、より好ましくは２ｇ／Ｌと３０ｇ／Ｌとの間のゲル化剤に起因して追加の重量を有する。
培地の浸透圧は、典型的には、５０ｍＯｓｍと１０００ｍＯｓｍとの間、より好ましくは１５０ｍＯｓｍと５００ｍＯｓｍとの間である。
細胞培養培地は、乾燥粉末培地、液体培地または半固体培地であり得る。半固体培地の場合において、培地は、化学的に明らかな成分に加えてゲル化剤を含む。好適なゲル化剤の例は、アガロースである。好ましい態様において、培養培地は、液体培地である。
本発明はさらに、成分を組み合わせるおよび混合するステップを含む、上記で定義される培養培地を調製する方法に向けられる。
粉末状細胞培養培地は、好ましくは、全ての成分を混合し、それらを粉砕することによって生産される。成分の混合は、粉砕によって乾燥粉末状細胞培養培地を生産する当業者に知られている。好ましくは、混合物のすべての部分がほぼ同じ組成を有するように、全ての成分を完全に混合する。組成物の均一性が高いほど、均質な細胞増殖に関して、得られる培地の品質は優れる。
粉砕は、粉末状細胞培養培地を生産するのに好適な任意のタイプのミルで行うことができる。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミル(fitz mill)またはジェットミルである。ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルが好ましく、ピンミルが非常に好ましい。
当業者は、そのようなミルをどのように運転するか知っている。
約４０ｃｍのディスク直径を有する大規模装置ミルは、例えば、典型的には、ピンミルの場合において、毎分１～６５００回転で運転し、好ましくは毎分１～３０００回転である。
粉砕は、標準的な粉砕条件下で行うことができ、１０μｍと３００μｍとの間、最も好ましくは２５μｍと１００μｍとの間の粒径を有する粉末をもたらす。
好ましくは、粉砕に供される混合物の全ての成分は乾燥している。これは、それらが水を含む場合、それらは結晶化水のみを含むが、１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、最も好ましくは２重量％以下の未結合または非配位水分子を含むことを意味する。
好ましい態様において、粉砕は、不活性雰囲気中で行われる。好ましい不活性保護ガスは窒素である。
別の好ましい態様において、混合物の全ての成分は、粉砕する前に凍結される。粉砕の前の含有物の凍結は、０℃を下回る、最も好ましくは－２０℃を下回る温度で含有物の冷却を確保する任意の手段により行うことができる。好ましい態様において、凍結は、液体窒素で行われる。この手段において、含有物は、例えば、ミルに導入する前に、含有物を保存する容器内に液体窒素を注ぐことにより液体窒素で処理される。好ましい態様において、容器は、フィーダーである。容器がフィーダーである場合、液体窒素は、好ましくは、含有物が導入されるフィーダーの側面または側面の近くに導入される。
典型的には、成分は、２～２０秒にわたり液体窒素で処理される。
好ましくは、成分の冷却は、ミルに入られる全ての成分が０℃を下回る、最も好ましくは－２０℃を下回る温度である様式において行われる。
好ましい態様において、全ての含有物は、混合物がそれらからフィーダー、最も好ましくは計量スクリューフィーダーに移される容器に入れられる。フィーダーでは、含有物は、時折さらに混合され、（フィーダーのタイプに応じて）さらに冷却される。凍結された混合物は、その後、ミル中で粉砕される混合物が依然として、好ましくは０℃を下回る、より好ましくは－２０℃を下回る温度を有するように、フィーダーからミルに移される。
典型的には、混合時間は、フィーダー中の含有物の混合物の滞留時間が１分より長く、好ましくは１５分と６０分との間であることを意味する。
投与量スネイル(dosage snail)とも呼ばれる計量スクリューフィーダーは、典型的には、毎分１０～２００回転の速度で運転され、好ましくは毎分４０～６０回転で運転される。
典型的には、ミルの温度は－５０℃～と３０℃との間に維持される。好ましい態様において、温度は約１０℃に維持される。
粉砕中の酸素レベルは、好ましくは１０％（ｖ／ｖ）を下回る。
プロセスを例えば、バッチ式でまたは連続的に運転することができる。好ましい態様において、本発明による方法を、ある時間にわたって、含有物の混合物を冷却のためのフィーダーに持続的に充填し、冷却した混合物をフィーダーからミルに持続的に充填することにより、連続的に行う。
乾燥粉末細胞培養培地は、取扱いを容易にするための圧縮物としても使用することができる。典型的には、圧縮された培地は、良好な溶解特性を有し、粉塵形成の減少により取り扱いがより容易である。
粉末培地は、好ましくはロールプレスで圧縮される。
ローラー圧縮機とも呼ばれるロールプレスは、当業者に知られている。典型的には、ロールプレスは、互いに約０．５～３ｍｍ、好ましくは１～２ｍｍの短い距離で配置されている２つの逆回転ロールを含む。好適なロールプレスは、典型的には、１０ｃｍと５０ｃｍとの間の幅のロールを有し、１０ｃｍと５０ｃｍとの間の長さを有するロール間のギャップを生じる。それでもなお、ロールのサイズ、したがって、ロール間のギャップの長さは、ロールプレスのサイズに応じて異なり得る。好ましい態様において、ギャップは１０ｃｍと１５ｃｍとの間の長さを有する。
混合された粉末材料を、逆回転ロールの間に引き入れ、ロール間のギャップ中で圧縮する。ロール間の距離およびそれらの表面構造は、得られる顆粒粒子の最終的なサイズおよび構造に影響を及ぼす。
ロールの表面は、好ましくは、波形にされている(riffled)。波形は、粉末をロールに粘着させ、プレスにより粉末を引き出すのに役立つ。
ロールプレスのプレス能力は、典型的には２０と１５０ｋＮ／ｃｍロール幅との間であり、好ましくは、ロールは、３０ｋＮと８０ｋＮとの間、最も好ましくは４０ｋＮと６０ｋＮとの間の力で、一緒にプレスされる。
細胞培養培地の成分が非常に感受性である場合には、圧縮手順は、不活性保護ガス雰囲気下で行うことができる。加えて、ロールプレスのロールは、しばしば、いくつかの成分は熱感受性であり、圧縮によって生じ得るわずかに上昇する温度にも耐えられない場合があるため、通常は冷却され、一定温度を維持される。
好ましい態様において、ロールプレスから放出された圧縮された細胞培養培地は、大きさによって直接区分(size)される。これは、例えば、ふるいにかけることによって、例えば１種以上の振動ふるいを用いて行うことができる。ふるいの孔の直径は、回収される顆粒の径による。本発明によるプロセスについては、典型的な直径は０．５～５ｍｍの間、好ましくはおよそ１～３ｍｍの間である。特に、ロールプレス中での乾式造粒が大きい圧縮物またはフレークをもたらす場合には、好ましくは、ふるいミル(sieve mill)を使用して、圧縮物またはフレークを好適な径の顆粒に造粒する。１つの好適なふるいミルは、１ｍｍと３ｍｍとの間のふるいサイズ(sieve size)を有する揺動ふるいミルＦＣ２００型（Bepex、GmbH）である。
本発明によるプロセスに好適なロールプレスは、例えば、Alexanderwerk、Sahut Coreur、HosokawaまたはFitzpatrick Companyから購入することができる。
既に説明したように、乾燥顆粒状細胞培養培地の粒子径は、ロールプレスから出た圧縮された培地を処理する方式による。培地をロールプレスから直接回収する場合には、培地は、典型的には、より大きい圧縮物またはフレークを含む。培地をふるいにかける場合には、粒子サイズは、ふるいのサイズによって決定される。しかし、包装のようなさらなる取扱いも、顆粒状細胞培養培地の一部の粒子が粉々になる可能性があるため、典型的には、平均粒子サイズに影響を与える。
好ましい態様においては、圧縮およびふるい掛け後、顆粒状細胞培養培地の粒子の８０％超が０．５ｍｍを超えるサイズを有する。
粉砕されたおよび／または圧縮された粉末状培地の使用のために、溶媒、好ましくは水（最も特別には蒸留水および／または脱イオン水または精製水または注射用水）または水性緩衝剤を培地に添加し、培地が溶媒に完全に溶解するまで成分を混合する。
溶媒はまた、生理食塩水、好適なｐＨ範囲（典型的には、ｐＨ１．０とｐＨ１０．０との間の範囲）を提供する可溶性酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、保存剤、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒、ならびに半固体媒体の生産のためのゲル化剤を含んでもよい。
培地は、好ましくは、使用前に滅菌される。滅菌は、好ましくは、濾過および／または熱処理（例えば、１２１℃で１５分間）および／または照射によって、液体状態で行うことができる。
細胞を添加する前の溶解した培地のｐＨは、典型的にはｐＨ２と１２との間、より好ましくはｐＨ４と１０との間、さらにより好ましくはｐＨ６と８との間、最も好ましくはｐＨ６．５～７．５の間、理想的にはｐＨ７．１～７．５の間である。
本発明による培養培地は、好気的および嫌気的増殖条件下で使用することができる。当業者は、好気的または嫌気的増殖のために取られるべきそれぞれの手段に精通している。典型的には、嫌気的培養条件のために、すなわち、培地の酸素含量を減少させる、または好ましくは排除することにより、酸素は除去される。好ましくは、添加物は、酸素が培養培地に侵入することを防止することにより、および／または培養培地容器内の捕捉されたエアスペースから酸素を除去することにより、嫌気的環境を作り出す。添加物は、還元剤、または酸素吸収剤、またはパラジウム触媒などのスカベンジャー、または酵素、例えば、モノ－および／またはジ－オキシゲナーゼ、および／またはスクシナートを含んでいてもよい。
広い範囲の原核生物および真核生物の両方を増殖させるという目的のために、原核生物および真核生物の両方の増殖を支持する浸透圧保護化合物および脂肪酸を、広く多様な化学的に明らかな細胞培養培地に添加して、これらの培地の適用性を改善することができることを見出した。
本発明はさらに、それゆえ、少なくとも１種の浸透圧保護化合物および少なくとも１種の脂肪酸を含む培地補充物に向けられる。補充物について、浸透圧保護化合物および脂肪酸の好ましい態様は、上に記載のとおり明らかである。
本発明の培地補充物は、典型的には、本発明の細胞培養培地と同じ様式で生産され、使用される。補充物は、乾燥粉末培地に添加され、溶解および使用の前に、この培地と完全に混合されてもよい。それはまた、細胞培養培地自体のような水または水性緩衝剤中に溶解され、その後溶解された細胞培地と混合されてもよい。
本発明の培地補充物で補充することができる化学的に明らかな培地の例は、以下である：
ａ）
化学物質 （ｇ／Ｌ）
ＮａＣｌ １．２
Ｋ２ＳＯ４ １．１
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１５
ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０２
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００１
Ｎａ２ＨＰＯ４ １０．８
ＫＨ２ＰＯ４ ０．５
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０．０
Ｄ－グルコース ７．０
（Appl. Microbiol. Biotechnol. (1988); 27:474-483, Rodriguez-Aparicio et al.から）。
ｂ）
Journal of Bacteriology, Nov. 2007, p. 8079-8087, Palmer et al.に開示された培地。
ｃ）
GB 2464203に開示された培地。
ｄ）
Journal of Bacteriology, May 1980, p. 714-719, Vol. 142, No. 2, Manning and Mitchellに開示された培地。
本発明の要旨は、化学的に明らかであり、極めて広い範囲の原核生物および真核生物の培養／増殖を支持する細胞培養培地を提供することである。培地は厳密な化学的配合物であるので、バッチ間の生産は変動を示さず、再現性を保証することができる。培地は、動物および植物由来のペプトンが実質的にないので、それらは、例えば医薬適用または環境試験において、それらの使用時にコンタミネーションの供給源となる可能性を非常に低くさせる。
本発明はさらに、上記で明らかな培養培地中の微生物を培養するための方法、および微生物の培養のための本発明による細胞培養培地の使用に向けられる。好ましい態様において、微生物は、細菌、酵母および真菌からなる群から選択される。
典型的には、培地は好適な容器に入れられ、微生物で接種される。好適な容器は、上記で定義されている。
細胞の増殖を可能にする培地のインキュベーションの温度は、典型的には０℃と１００℃との間、より典型的には１５℃と５０℃との間、なおより典型的には２０℃と３５℃との間である。サンプルを、例えば、室温（およそ２０°）で、例えば、２２．５℃で、または３２．５℃でインキュベートしてもよい。
一般に、接種後、培地は、それらを容易に検出することができるように、微生物のある程度の増殖を可能にするため時間インキュベートされる。従来の方法では、この時間は最低１日未満～１４日の範囲で行うことができる。一般に、インキュベーション時間は、約３～１４日の間、より一般的には７日と１４日との間である。
本発明による化学的に明らかな培地は、様々な適用において、例えば、バイオ医薬品または環境分野において、食品および飲料産業において、または診断において、従来の複合培養培地と置き換えることができる。例示的な適用を、以下に列挙する：
無菌およびバイオバーデン試験：
本発明による培地は、無菌およびバイオバーデン試験に使用することができる。中間材料および最終製品の無菌試験は、医薬品および医療用デバイスの製造の間に実証されなければならない。
サンプルのバイオバーデンレベルまたは無菌性を試験するための典型的な方法は、液体サンプルを、サンプルの存在し得るコンタミナントを保持するメンブレンフィルター上で濾過し、フィルターを培養培地中でインキュベートすることである。サンプルが濾過できない場合、サンプルを培養培地中に直接接種することができる。１以上のコンタミナントが存在する場合、透明な媒体は、細胞の発育により濁る。
この点に関して、本発明による化学的に明らかな培養培地の使用は、好ましくは、それが低濁度であっても容易に検出することができる透明な培地であるので、有利である。
この用途で使用されるフィルターは、サンプル中の任意の微生物を捕捉するのに十分に小さい孔のサイズを有する。そのようなフィルターは、典型的には、約０．１μｍから１．２μｍまでの孔径を有する。好ましくは、孔のサイズは、０．４５μｍ以下である。フィルターは、再生セルロース、混合セルロースエステル、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホンおよびポリフェニルスルホンなどの、そのような用途に一般的に使用される任意の好適な材料で形成することができる。
フィルターのためのホルダーは、単にファンネルなどのステンレス製のデバイスであってもよい。あるいは、試験全体（サンプリング、濾過、培地添加およびインキュベーション）を行うことができる閉鎖デバイスである、Steritest（商標）ＥＺデバイス（Merck Millipore）などの使い捨ての、滅菌された透明なフィルター含有デバイスを使用することができる。
環境試験：
施設内の微生物の環境レベルを試験するための典型的な方法は、デバイスを通して空気のサンプルを濾過し、微生物をフィルター上に保持することである。フィルターをその後、上述のように本発明による培養培地中でインキュベートすることができる。
食品および飲料試験：
飲料または飲料水の定期的な微生物学的制御も非常に重要である。飲料試験のための典型的な方法は、１ｍＬのサンプルをプレート中の１５ｍＬの溶解した培養培地と混合することである。凝固後、プレートをインキュベートし、目に見えるコロニーを計測する。
培地充填試験：
培地充填試験は、無菌生産プロセスが、例えば、医薬品または食品および飲料産業において、腐敗性細菌、酵母またはカビなどの微生物コンタミネーションにより影響を受けていないことを検証するために、定期的に行われる。典型的には、培地充填試験では、製品の生産の全プロセスが、それぞれの製品の代わりに滅菌培養培地でシミュレートされる。培地を、その後、上記で定義した無菌試験に供する別々のユニットに充填する。
特異的同定の前の前増菌(Pre-enrichment)：
さらなる側面において、本発明による培地は、同定前の微生物の前増菌に使用することができる。この目的のために、サンプルを培地に接種し、微生物を十分な時間増殖させる。所望の濃度に達するとすぐに、サンプルは、特異的な微生物学的同定などのさらなる処理に供される。
本発明のさらなる側面は、それゆえ、生存する微生物でコンタミネーションされているか否かを決定しようとするサンプル中の微生物を検出する方法であって、上で明らかなとおりの培養培地にサンプルを接種するステップ、および微生物の増殖を観察するステップを含むことを特徴とする、前記方法である。
本発明はさらに、バイオバーデン、無菌、環境、食品および飲料または培地充填試験のための、本発明による細胞培養培地の使用に向けられる。
上および下に引用される全ての出願、特許及び刊行物の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
例：
全ての株についての試験手順：
－ フィルター滅菌した液体培養培地を、即座に調製するか、または使用前に冷蔵庫内の１２５ｍＬガラスボトルに保存する。
－ －８０℃でＨＥＰＥＳ／グリセロール中に保存していた株溶液の段階希釈を０．９％塩化ナトリウム溶液で行う。
－ 各培養培地ボトルに２０～５０ＣＦＵ／ｍＬで接種する。
－ 接種したボトルを、株に応じて２２．５℃±２．５℃および３２．５℃±２．５℃で最大１４日間インキュベートする。
－ 滅菌ボトルを対照として並行してインキュベートする。
－ 微生物の発育を各ボトルにおいて視覚的に観察する。
例１：
異なる栄養的ニーズを示す、Methylobacterium extorquensおよびStaphylococcus epidermidisの２つの微生物の増殖性能を、４０ｍｇから１ｇ／Ｌまでに及ぶアミノ酸、５ｍｇ／Ｌにおける窒素含有塩基、１０μｇ／Ｌから１．５ｍｇ／Ｌまでに及ぶ少数元素、５０μｇ／Ｌから５．６ｍｇ／Ｌまでのビタミン、デキストリン、ピルバート、および塩から成り立つ標準的な化学的に明らかな培地と、浸透圧保護化合物であるベタイン１００ｍｇ／Ｌおよび脂肪酸であるオレイン酸２０ｍｇ／Ｌの組み合わせで補充された同じ標準的な化学的に明らかな培地とにおいて評価する。１００ｍＬのフィルター滅菌した化学的に明らかな培地を即座に調製し、５０ＣＦＵ／ｍＬ未満の微生物を接種する。各接種された培養培地ボトルを、撹拌することなく、２２．５℃±２．５℃でインキュベートする。増殖は、毎日モニタリングされる濁度の増加により定義される。
Figure 0007030695000001
例２：
いくつかの株の時間増殖性能を、普遍的な標準的な培地であるトリプチック・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）と、浸透圧保護化合物であるベタイン１００ｍｇ／Ｌおよび脂肪酸であるオレイン酸２０ｍｇ／Ｌで補充された標準的な化学的に明らかな培地とにおいて観察する。１００ｍＬのフィルター滅菌した化学的に明らかな培地に、２０～５０ＣＦＵ／ｍＬの微生物を接種する。各接種された培養培地ボトルを、撹拌することなく、最大１４日間、２２．５℃±２．５℃（表１）および３２．５℃±２．５℃（表２）でインキュベートする。
Figure 0007030695000002
Figure 0007030695000003
結果は、ＴＢＳと本発明による合成培地との同等性を示す。いくつかの水コンタミナントは、合成培地においてより速く増殖することができる。
例３：
以下の例において、化学的に明らかな培地の酵母およびカビを増殖させる能力をそれらのそれぞれの視覚的な検出時間を研究することにより評価する。この目的のために、各場合において、１００ｍｌ液体培養培地のサンプルに３つの酵母および４つのカビを個別に接種し、撹拌すること無く、２２．５℃±２．５℃および３２．５℃±２．５℃においてインキュベートする。

Figure 0007030695000004

Claims (12)

  1. 少なくとも１種の浸透圧保護化合物および少なくとも１種の脂肪酸を含み、浸透圧保護化合物がベタインであることを特徴とする、化学的に明らかな培養培地であって、培地中の浸透圧保護化合物の濃度が、培養培地の１０～３６０ｍｇ／ｌの範囲であり、培地中の脂肪酸の濃度が、培養培地の５～４０ｍｇ／ｌの範囲である、前記培養培地。
  2. 浸透圧保護化合物が、トリメチルグリシンであることを特徴とする、請求項１に記載の化学的に明らかな培養培地。
  3. 脂肪酸が、ミリストレイン酸、オレイン酸、リノール酸、ステアリン酸、パルミチン酸、アラキジン酸またはサピエン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の化学的に明らかな培養培地。
  4. 脂肪酸が、オレイン酸であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の化学的に明らかな培養培地。
  5. 少なくとも１以上のサッカリド成分、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤成分、１以上の補因子および１以上の核酸成分（窒素含有塩基）をさらに含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の化学的に明らかな培養培地。
  6. 少なくとも１種の蛍光性基質をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の化学的に明らかな培養培地。
  7. 微生物を培養するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の化学的に明らかな培養培地の使用。
  8. 微生物が、細菌、酵母および真菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
  9. バイオバーデン、無菌、環境、食品および飲料、または培地充填の試験のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の化学的に明らかな培養培地の使用。
  10. 成分を組み合わせ、および混合するステップを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の化学的に明らかな培養培地を調製する方法。
  11. 生存する微生物でコンタミネートされているかどうかを決定しようとするサンプルから微生物を検出するための方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の培養培地にサンプルを接種するステップ、および微生物の増殖を観察するステップを含むことを特徴とする、前記方法。
  12. 少なくとも１種の浸透圧保護化合物および少なくとも１種の脂肪酸を含み、浸透圧保護化合物がベタインであることを特徴とする、化学的に明らかな培養培地のための、補充物であって、培地中の浸透圧保護化合物の濃度が、培養培地の１０～３６０ｍｇ／ｌの範囲であり、培地中の脂肪酸の濃度が、培養培地の５～４０ｍｇ／ｌの範囲である、前記補充物。
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