TW202128982A - 細胞培養基 - Google Patents

Abstract

本發明係關於包含一或多種胺基酸之N-乳醯基衍生物之細胞培養基。一些胺基酸在細胞培養基中之不良溶解度藉由用N-乳醯基衍生物取代其而被克服。

Description

細胞培養基

本發明係關於包含一或多種胺基酸之N-乳醯基衍生物之細胞培養基。一些胺基酸在細胞培養基中之不良溶解度藉由用N-醯基衍生物部分或完全取代其而被克服。

細胞培養基支持且維持細胞在人工環境中生長。

視應支持生長之生物體之類型而定，細胞培養基包含多種組分(有時超過一百種不同的組分)之複雜混合物。

哺乳動物、昆蟲或植物細胞繁殖所需之細胞培養基通常比支持細菌及酵母生長之培養基複雜得多。

所研發之第一種細胞培養基係由未定義之組分組成，諸如血漿、血清、胚胎提取物或其他未定義之生物提取物或蛋白腖。因此隨著化學定義之培養基之出現，取得了重大進展。化學定義之培養基通常包含，但非排他地限於胺基酸、維生素、金屬鹽、抗氧化劑、螯合劑、生長因子、緩衝液、激素及熟習此項技術者已知之更多物質。

一些細胞培養基以無菌水性液體之形式提供。液體細胞培養基之缺點係其存放期較短且裝運及儲存困難。因此，當前以經精細研磨之乾粉混合物之形式提供許多細胞培養基。其出於溶解於水及/或水溶液中之目的而被製造，且在溶解狀態下，通常與其他補充劑一起經設計為細胞提供重要的營養基礎，以培養及/或產生來自該等細胞之生物藥物。

大多數生物藥物生產平台係基於分批進料細胞培養方案。目的通常係研發高效價細胞培養方法以滿足逐漸增加的市場需求且減少製造成本。除使用高性能重組細胞株以外，需要改良細胞培養基及方法參數以實現最大的生產潛力。

在分批進料方法中，基礎培養基支持初始生長及生產，且進料培養基防止養分耗盡且維持生產階段。選擇培養基以適應不同生產階段期間之不同代謝需求。包括進料策略及控制參數之方法參數設置界定了適用於細胞生長及蛋白質產生之化學及物理環境。

最佳化進料培養基係最佳化分批進料方法中之主要態樣。

進料培養基通常經高度濃縮以避免在生物反應器中稀釋產物(抗體或重組蛋白)。養分之控制添加直接影響培養物的生長速率及壽命。

胺基酸(amino acids；AA)係細胞培養基之必需組分，因為其係支持細胞生長之關鍵。此外，AA係使用哺乳動物細胞培養技術產生之重組蛋白質的關鍵構建塊。AA之溶解度係阻礙細胞培養基(cell culture media；CCM)及進料調配物之濃度的限制因素。此類濃度對於研發下一代製造平台將係必需的。特定言之，使用線內稀釋的生物製造方法需要高度濃縮之調配物，以減小必須儲存於槽中之CCM的體積(=減小製造足跡)，或一般而言，以減小在分批進料(fed-batch；FB)方法中添加之進料的體積且因此潛在地提高體積效價。

因此，發現一種提高胺基酸溶解度的方式將係有利的。

儘管已知N-乳醯基胺基酸對蛋白分解具有高度耐受性(Lorbert SJ等人：Oligomers and oligomeric segments of alpha-hydroxy carboxylic acids and alpha amino acids. US 2004/0048347，2004)，但是出乎意料地發現，在細胞培養基中胺基酸可用其N-乳醯基衍生物或其鹽置換。除其用作胺基酸來源之外，與其相應胺基酸相比，N-乳醯基衍生物呈現較高溶解度且因此可以用於高度濃縮之調配物中。

N-乳醯基胺基酸在食品工業中作為味覺活性胺基酸係已知的，其經由尤其在如醬油及肉類產品之食品中的乳酸桿菌(lactobacillus spp. )中的乳醯基轉移酶的作用由游離胺基酸形成(Zhao CJ，Schieber A，Ganzle MG：Formation of taste-active amino acids，amino acid derivatives and peptides in food fermentations - A review.Food Res Int 2016，89(Pt 1):39-47.)。

亦已在藥品或人類細胞模型之情況下描述N-乳醯基-胺基酸。根據Jansen RS等人之研究，N-乳醯基-胺基酸係來源於乳酸及胺基酸之CNDP2介導之反向蛋白分解的普遍存在之代謝物(Proc Natl Acad Sci U S A 2015，112(21):6601-6606)。在近期研究中，N-乳醯基-胺基酸被描述為與人類細胞模型中之胞內胺基酸濃度相關的胞外生物標記物。該等衍生物被描述為可用於區分腫瘤與正常細胞的生物標記物：Knott ME，Manzi M，Zabalegui N，Salazar MO，Puricelli LI，Monge ME：Metabolic Footprinting of a Clear Cell Renal Cell Carcinoma in Vitro Model for Human Kidney Cancer Detection.J Proteome Res 2018，17(11):3877-3888。

作為細胞培養基成分之N-乳醯基-胺基酸係未知的。

本發明因此係關於包含至少一種N-乳醯基-胺基酸之細胞培養基。若在下文中使用術語胺基酸，則其意謂游離胺基酸以及其鹽，如Na⁺ 、K⁺ 、Mg²⁺ 、Ca²⁺ 、Li⁺ ，較佳地為其Na⁺ 鹽。熟習此項技術者應瞭解，可使用游離胺基酸或可用如Na⁺ 之金屬相對離子取代H⁺ ，從而產生鹽。

在一個較佳實施例中，N-乳醯基-胺基酸係選自N-乳醯基-白胺酸、N-乳醯基-異白胺酸、N-乳醯基-纈胺酸、N-乳醯基-苯丙胺酸、N-乳醯基-酪胺酸及/或N-乳醯基-甲硫胺酸，最佳地為N-乳醯基-白胺酸及/或N-乳醯基-異白胺酸。

在一個較佳實施例中，細胞培養基包含式I之組分中之一或多者：

其中R₁ ⁺ 為H⁺ 或金屬離子，如Na⁺ 、K⁺ 、Mg²⁺ 、Ca²⁺ 、Li⁺ ，較佳地為Na⁺ ， R₂ 為胺基酸之特徵殘基。在胺基酸為白胺酸之情況下，式I之組分將為

在胺基酸為異白胺酸之情況下，式I之組分將為

在一個較佳實施例中，細胞培養基包含N-乳醯基胺基酸之鈉鹽。此較佳地意謂R₁ ⁺ 為Na⁺ 。

在一個較佳實施例中，細胞培養基為乾粉培養基。

在一個實施例中，尤其若細胞培養基為基礎培養基或灌注細胞培養基，則其包含一或多種N-乳醯基胺基酸以及相應的天然胺基酸。其意謂細胞培養基包含例如N-乳醯基-白胺酸及相應的天然白胺酸。在此情況下，天然意謂未經改性之胺基酸及/或其鹽。

在另一個較佳實施例中，細胞培養基為進料培養基。

進料培養基可包含一或多種N-乳醯基胺基酸及相應的天然胺基酸，但其亦可僅包含一或多種N-乳醯基胺基酸但不包含相應的天然胺基酸。

在一個較佳實施例中，若細胞培養基為進料培養基，則該培養基包含一或多種N乳醯基胺基酸但不包含相應的天然胺基酸。

在另一個較佳實施例中，細胞培養基為液體培養基，其具有8.5或更小之pH且包含濃度高於10 mmol/l之根據式I之至少一種N-乳醯基胺基酸。在進料培養基之情況下，濃度通常高於30 mmol/l。上限僅由乳醯基胺基酸之溶解度界定。溶解度可視溶劑、pH及鹽濃度而定。因此，通常有可能產生乳醯基胺基酸濃度為至多500 mmol/l或更高的液體培養基。

在一個較佳實施例中，液體培養基之pH在6.0與8.5之間，最佳地在6.5與7.8之間。

在一個實施例中，細胞培養基包含至少一或多種醣組分、一或多種胺基酸、一或多種維生素或維生素前驅物、一或多種鹽、一或多種緩衝液組分、一或多種輔因子及一或多種核酸組分。

本發明進一步關於一種用於產生根據本發明之細胞培養基之方法，其係藉由 a)  將根據式I之一或多種N-乳醯基-胺基酸與該細胞培養基之其他組分混合 b)  對步驟a)之混合物進行研磨。

在一個較佳實施例中，步驟b)在銷釘研磨機、菲茨研磨機(fitz mill)或噴射研磨機中進行。

在另一個較佳實施例中，在研磨之前將來自步驟a)之混合物冷卻至低於0℃之溫度。

本發明進一步關於一種用於培養細胞之方法，其係藉由 a)  提供生物反應器 b)  將待培養之細胞與根據本發明之細胞培養基混合。 c)  培育步驟b)之混合物。

在一個實施例中，生物反應器為灌注生物反應器。

本發明亦關於一種用於在生物反應器中培養細胞之分批進料方法，其係藉由 -  將細胞及水性細胞培養基填充至生物反應器中 -  在該生物反應器中培育該等細胞 -  在進料培養基之情況下，在整個時間內連續地或在細胞培育時間內一次或若干次向生物反應器中添加細胞培養基 其中該進料培養基為包含至少一種N-乳醯基胺基酸之根據本發明之細胞培養基。

較佳地，進料培養基具有低於pH 8.5之pH且包含濃度高於10 mmol/l之至少一種N-乳醯基胺基酸。

較佳地，N-乳醯基胺基酸為N-乳醯基白胺酸及/或N-乳醯基異白胺酸。

圖1展示具有其特徵殘基之天然胺基酸的例示性結構。

關於圖2至圖20之其他細節可見於實例中。

N-乳醯基胺基酸係經由其胺基共價連接至乳醯基殘基之胺基酸。乳醯基殘基係乳酸之化學部分CH₃ CH(OH)CO−。

根據本發明之N-乳醯基胺基酸係例如可藉由化學或生物合成獲得之產物。

N-乳醯基胺基酸可經由乳酸桿菌中之如乳醯基轉移酶之酶(Zhao CJ，Schieber A，Ganzle MG：Formation of taste-active amino acids，amino acid derivatives and peptides in food fermentations - A review.Food Res Int 2016，89(Pt 1):39-47)或藉由CNDP2介導之反向蛋白分解(Jansen RS,等人：N-lactoyl-amino acids are ubiquitous metabolites that originate from CNDP2-mediated reverse proteolysis of lactate and amino acids.Proc Natl Acad Sci U S A 2015，112(21):6601-6606)在活體內及在微生物中合成。

亦在含有酶(例如，催化肽鍵形成之酶，諸如絲胺酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、金屬蛋白酶、酯酶或鹼性蛋白酶)、α-羥基羧酸(或衍生物，諸如相應的酯、酸鹵化物、醯胺、酸酐或烯酮)及α-胺基酸(或衍生物，諸如相應的酯、酸鹵化物、醯胺、酸酐或烯酮)之混合物中描述了使用生物催化方法合成N-乳醯基胺基酸(Lorbert SJ等人：Oligomers and oligomeric segments of alpha-hydroxy carboxylic acids and alpha amino acids. US 2004/0048347，2004)。

已描述了幾種用於合成N-乳醯基胺基酸之化學方法。來自Sforza S，Cavatorta V，Galaverna G，Dossena A，Marchelli R：Accumulation of non-proteolytic aminoacyl derivatives in Parmigiano-Reggiano cheese during ripening.International Dairy Journal 2009，19(10):582-587之Lac-Phe合成例示性地描述於實例1中。

文獻中已描述了其他合成方法，例如Lac-Glu已在Frerot E，Chen T：Identification and quantitation of new glutamic acid derivatives in soy sauce by UPLC/MS/MS.Chem Biodivers 2013，10(10):1842-1850中由L-乳酸及L-麩胺酸酯合成，以主要得到Lac-AA之L形式。使用LC-MS SRM進行表徵。類似地，Lac-Val在氫解之後以56%之總產率由L-乳酸及H-Val-OBzl甲苯磺酸鹽以兩個步驟合成。最後，在一當量之PyBOP®(苯并三唑基氧基-參[吡咯啶基]-六氟磷酸鏻)及過量二異丙基乙胺存在下，經由經胺基酯保護之胺基酸與(+)-(S)-乳酸之間的單個偶合反應的合成描述於Frerot E，Escher D：Flavored products and a process for their preparation.  US5780090，1998.中，且提供了Lac-Glu、Lac-Ala、Lac-Leu、Lac-Ile、N-乳醯基-酪胺酸(Lac-Tyr)及Lac-Met之NMR及LC-MS資料。

N-乳醯基胺基酸較佳地為根據式I之化合物。

其中R₁ ⁺ 為H⁺ 或金屬離子，如Na⁺ 、K⁺ 、Mg²⁺ 、Ca²⁺ 、Li⁺ ，較佳地為Na⁺ ，R₂ 為胺基酸之特徵殘基。 胺基酸之特徵殘基係胺基酸之獨特部分。特徵殘基係給予胺基酸特徵特性以使得其可區別於其他胺基酸之部分。舉例而言，一些特徵胺基酸殘基為極性的，其他為非極性的，一些特徵胺基酸殘基為脂族的，其他為芳族的。圖1展示具有一些例示性特徵殘基R₂ 之胺基酸的一般結構。

根據本發明之細胞培養基為維持及/或支持細胞活體外生長的組分之任何混合物。其可為複合培養基或化學定義之培養基。細胞培養基可包含維持及/或支持細胞活體外生長所必需的所有組分或僅一些組分，使得分開添加其他組分。根據本發明之細胞培養基之實例為包含維持及/或支持細胞活體外生長所必需的所有組分以及培養基補充劑或進料的完全培養基。在一個較佳實施例中，細胞培養基為完全培養基或進料培養基。完全培養基(亦稱為基礎培養基)之pH通常在6.5與7.8之間。進料培養基之pH較佳地低於8.5，較佳地在6.0與8.5之間。

通常，根據本發明之細胞培養基用於維持及/或支持生物反應器中之細胞生長。

進料或進料培養基係一種細胞培養基，其並非為支持細胞培養物中初始生長及產生之基礎培養基，而是在後期添加以防止養分耗盡且維持生產階段之培養基。與基礎培養基相比，進料培養基可具有更高濃度之一些組分。舉例而言，一些組分，諸如包括胺基酸或碳水化合物之養分可以基礎培養基中濃度之約5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至約1000倍存在於進料培養基中。

哺乳動物細胞培養基為維持及/或支持哺乳動物細胞活體外生長之組分的混合物。哺乳動物細胞之實例為人類或動物細胞，較佳地CHO細胞、COS細胞、I VERO細胞、BHK細胞、AK-1細胞、SP2/0細胞、L5.1細胞、融合瘤細胞或人類細胞。

化學定義之細胞培養基係不包含任何化學成分不確定的物質之細胞培養基。此意謂培養基中所用之所有化學物質之化學組成為已知的。化學定義之培養基不包含任何酵母、動物或植物組織；其不包含飼養細胞、血清、提取物或消化物或可在培養基中產生化學成分未充分確定之蛋白質的其他組分。化學成分不確定或位充分確定之化學組分為化學組成及結構未知、存在於不同組合物中或可僅藉由巨大實驗努力確定之組分，該巨大實驗努力與評估如白蛋白或酪蛋白之蛋白質的化學組成及結構相當。

粉狀細胞培養基或乾粉培養基為通常由研磨方法、凍乾方法或乾式或濕式造粒方法產生之細胞培養基。其意謂粉狀細胞培養基為顆粒狀、微粒狀培養基，並非液體培養基。除非另外規定，否則術語「乾粉」可與術語「粉末」互換使用；然而，如本文所使用之「乾粉」僅係指顆粒狀材料之大體外觀且並不意欲意謂完全不含錯合或聚結溶劑的材料。由研磨或凍乾方法產生之乾粉培養基通常具有小於0.5 mm，例如在0.05與0.5 mm之間的粒度。

由乾式或濕式造粒方法(例如藉由噴霧乾燥、濕式造粒或乾式壓實)產生之乾粉培養基通常具有大於0.5 mm，例如在0.5與5 mm之間的粒度。乾式壓實通常在輥壓機中進行。US 6,383,810 B2揭示一種製造聚結真核生物細胞培養基粉末之方法。該方法包含用溶劑潤濕乾粉細胞培養基，且接著再乾燥經濕潤之培養基以獲得乾燥的聚結細胞培養基。

在一個實施例中，藉由乾式壓實製造根據本發明之乾粉培養基。

待與根據本發明之培養基一起培養之細胞可為原核細胞(如細菌細胞)，或真核細胞(如植物或動物細胞)。細胞可為正常細胞、永生化細胞、病變細胞、轉型細胞、突變細胞、體細胞、生殖細胞、幹細胞、前驅物細胞或胚胎細胞，其中任一者可為建立或轉型細胞株或獲自天然來源。

粒子之尺寸意謂粒子之平均直徑。若給出粒子之大小，則意謂至少80%、較佳地至少90%之粒子具有給定粒度或在給定粒度範圍內。粒徑藉由雷射光散射測定。

藉由用惰性氣體填充各別容器或裝置產生惰性氛圍。適合之惰性氣體為如氬氣之稀有氣體，或較佳地為氮氣。此等惰性氣體為非反應性的且防止發生非所要之化學反應。在根據本發明之方法中，產生惰性氛圍意謂例如藉由引入液氮或氮氣使氧氣濃度降低至低於10% (v/v)絕對濃度。

不同類型之研磨機為熟習此項技術者已知的。

亦稱為離心衝擊研磨機之銷釘研磨機粉碎固體，其中高速旋轉盤上之突出銷釘提供斷裂能量。銷釘研磨機例如由Munson Machinery(美國)、Premium Pulman(印度)或Sturtevant(美國)出售。

噴射研磨機使用壓縮氣體來加速粒子，從而使該等粒子在處理腔室中彼此衝擊。噴射研磨機例如由Sturtevant(美國)或PMT(奧地利)出售。

購自Fitzpatrick(美國)的菲茨研磨機使用具有葉片的轉子進行研磨。

連續進行之方法為不分批進行之方法。若研磨方法連續地運行，則意謂將配培養基成分歷經特定時間永久且穩定地被進料至研磨機中。

根據本發明之細胞培養基，尤其完全培養基通常包含至少一或多種醣組分、一或多種胺基酸、一或多種維生素或維生素前驅物、一或多種鹽、一或多種緩衝液組分、一或多種輔因子及一或多種核酸組分。

培養基亦可包含丙酮酸鈉、胰島素、植物蛋白質、脂肪酸及/或脂肪酸衍生物及/或普洛尼克酸(pluronic acid)及/或界面活性組分，如化學製備之非離子型界面活性劑。適合之非離子界面活性劑之一個實例為封端於一級羥基(亦稱為泊洛沙姆(poloxamer))之雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如以商標名pluronic ®購自德國BASF之泊洛沙姆。

醣組分均為單醣或二醣，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(單醣之實例)或蔗糖、乳糖或麥芽糖(雙醣之實例)。

根據本發明之胺基酸之實例為酪胺酸、蛋白型胺基酸，尤其必需胺基酸、白胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸，以及非蛋白型胺基酸，較佳地為L-胺基酸。

酪胺酸意謂L-酪胺酸或D-酪胺酸，較佳地為L-酪胺酸。

半胱胺酸意謂L-半胱胺酸或D-半胱胺酸，較佳地為L-半胱胺酸。

維生素之實例為維生素A(視黃醇、視黃醛、各種類視黃素及四類胡蘿蔔素)、維生素B1(硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B3(菸酸、菸鹼醯胺)、維生素B5(泛酸)、維生素B6(吡哆醇、吡哆醇胺、吡哆醛)、維生素B7(生物素)、維生素B9(葉酸、醛葉酸)、維生素B12(氰鈷維生素、羥基鈷維生素、甲基鈷維生素)、維生素C(抗壞血酸)、維生素D(麥角沉鈣醇、膽沉鈣醇)、維生素E(生育酚、參雙鍵生育酚)及維生素K(葉醌、甲萘醌類)。亦包括維生素前驅物。

鹽之實例為包含無機離子之組分，諸如碳酸氫根、鈣離子、氯離子、鎂離子、磷酸根、鉀離子及鈉離子或微量元素，諸如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V及Zn。實例為五水合硫酸銅(II)(CuSO₄ ^. 5H₂ O)、氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl₂ ^. 2H₂ O)、氯化鉀(KCl)、硫酸鐵(II)、無水磷酸二氫鈉(NaH₂ PO₄ )、無水硫酸鎂(MgSO₄ )、無水磷酸氫二鈉(Na₂ HPO₄ )、六水合氯化鎂(MgCl₂ ^. 6H₂ O)、七水合硫酸鋅。

緩衝液之實例為CO₂ /HCO₃ (碳酸鹽)、磷酸鹽、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS及TRIS。

輔因子之實例為硫胺素衍生物、生物素、維生素C、NAD/NADP、鈷維生素、黃素單核苷酸及衍生物、麩胱甘肽、核苷酸、磷酸酯及衍生物。

根據本發明之核酸組分為核鹼基，如胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸(腺)嘧啶或尿嘧啶；核苷，如胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷及胸苷；及核苷酸，如單磷酸腺苷或二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。

與完全培養基相比，進料培養基可具有不同組成。其通常包含胺基酸、微量元素及維生素。其亦可包含醣組分，但有時出於生產原因，在單獨進料中添加醣組分。

適合之進料培養基可例如包含以下化合物中之一或多者：

L-天冬醯胺單水合物

L-異白胺酸

L-苯丙胺酸

L-麩胺酸單水合鈉

L-白胺酸

L-蘇胺酸

L-離胺酸單鹽酸鹽

L-脯胺酸

L-絲胺酸

L-精胺酸單鹽酸鹽

L-組胺酸單鹽酸鹽單水合物

L-甲硫胺酸

L-纈胺酸

單-鈉-L-天冬胺酸鹽-單水合物

L-色胺酸

氯化膽鹼

肌醇

菸鹼醯胺

泛酸鈣-D(+)

鹽酸吡哆醇

鹽酸硫胺氯化物

微粉化維生素B12(氰鈷維生素)

生物素

葉酸

核黃素

無水硫酸鎂

五水合硫酸銅(II)

七水合硫酸鋅

1,4-丁二胺二鹽酸鹽

四水合七鉬酸銨

水合硫酸鎘

四水合氯化錳(II)

六水合氯化鎳(II)

偏矽酸鈉

偏釩酸鈉

二水合氯化錫(II)

亞硒酸鈉(約45% SE)

單水合磷酸二氫鈉

檸檬酸鐵(III)銨(約18% FE)

根據本發明之冷凍意謂冷卻至低於0℃之溫度。

本發明之要旨係提供粉狀細胞培養基，例如藉由乾燥壓製製得之乾粉培養基，其可藉由僅摻合粉末及溶劑而容易地溶解於適合之溶劑中，使得粉末溶解且產生適用於培養細胞之液體細胞培養基，諸如完全培養基、培養基補充物、培養基子組或具有所要且均質濃度之培養基組分的進料。

粉狀細胞培養基之簡單溶解常常因為在水性溶劑中具有不佳溶解度之物質，尤其胺基酸而複雜化。舉例而言，L-酪胺酸在25℃之溫度下具有0.4 g/l的於水中之溶解度。此意謂約0.4 g L-酪胺酸可溶於1公升水中。但細胞培養基中之所要酪胺酸濃度通常較高。亦通常將在25℃下白胺酸之約22.1 g/kg及在25℃下異白胺酸之32.4 g/kg的溶解度視為不夠的。

已發現胺基酸之N-乳醯基衍生物一方面通常在水溶液中具有較高溶解度，且另一方面可用作各別胺基酸之替代物且同樣適合用作相應的天然胺基酸之細胞培養基組分。

較佳地，為實現最佳效能，根據本發明之細胞培養基包含天然胺基酸以及N-乳醯基胺基酸。在培養基為進料培養基或為被添加至包含天然胺基酸之基礎培養基的另一種培養基添加劑之情況下，該進料培養基或培養基添加劑可僅包含N-乳醯基胺基酸，但不包含相應的天然胺基酸。

通常，在基礎培養基及灌注培養基中，N-乳醯基胺基酸與相應的天然胺基酸之間的莫耳比在5:1與1:5之間，較佳地在5:1與1:1之間。

即用型液體基礎/灌注培養基以及進料培養基或培養基添加劑中之各乳醯基胺基酸之總濃度為極靈活的。上限僅由各別培養基中之乳醯基胺基酸之溶解度界定。因此，通常有可能產生乳醯基胺基酸濃度為至多500 mmol/l或更高的液體培養基。

N-乳醯基胺基酸之溶解度高於各別的天然胺基酸之溶解度(參見實例2中之表1及表2)。

為更大地提高N-乳醯基胺基酸之溶解度，鹽可藉由使衍生物與適合鹼反應而形成。鈉鹽為較佳的。

根據本發明之細胞培養基可包含一或多種，其意謂例如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個N-乳醯基胺基酸。

本發明之粉狀細胞培養基較佳地藉由混合所有組分且將其研磨來產生。組分之混合為熟習藉由研磨產生乾粉狀細胞培養基之技術者已知的。較佳地，充分混合所有組分以使得混合物之所有部分具有幾乎相同的組成。組成物之均一性愈高，所得培養基在均質細胞生長方面之品質就愈佳。

研磨可用適用於產生粉狀細胞培養基之任何類型的研磨機進行。典型之實例為球研磨機、銷釘研磨機、菲茨研磨機或噴射研磨機。較佳的為銷釘研磨機、菲茨研磨機或噴射研磨機，極佳地為銷釘研磨機。

熟習此項技術者知道如何運行此類研磨機。

在銷釘研磨機之情況下，盤直徑為約40 cm之大規模設備研磨機例如通常以1至6500轉/分鐘，較佳地1至3000轉/分鐘運行。

研磨可在標準研磨條件下進行，產生粒度在10與300 µm之間，最佳地在25與120 µm之間的粉末。

較佳地，進行研磨之混合物之所有組分為乾燥的。此意謂若其包含水，則其僅包含結晶水，但不超過未結合或未配位水分子之10重量%，較佳地不超過5重量%，最佳地不超過2重量%。

在一個較佳實施例中，研磨在惰性氛圍中進行。較佳的惰性保護氣體為氮氣。

在另一個較佳實施例中，混合物之所有組分在研磨之前冷凍。在研磨之前冷凍成分可藉由任何方式進行，該方式確保成分冷卻至低於0℃且最佳地低於-20℃之溫度。在一個較佳實施例中，冷凍用液氮進行。此意謂用液氮處理成分，例如藉由在將液氮引入研磨機中之前將液氮倒入其中儲存有該等成分之容器中。在一個較佳實施例中，容器為進料器。若容器為進料器，則液氮較佳地在進料器引入成分的一側或靠近該側引入。

通常，用液氮處理成分持續2至20秒。

較佳地，以一種使得進入至研磨機中之所有成分在低於0℃、最佳地低於-20℃之溫度下的方式進行冷卻成分。

在一個較佳實施例中，將所有成分放入容器中，混合物自其中輸送於進料器中，最佳地輸送於計量螺桿進料器中。在進料器中，視進料器之類型而定，有時進一步混合成分且另外冷卻該等成分。隨後將經冷卻之混合物自進料器轉移至研磨機以使得在研磨機中研磨之混合物較佳地仍具有低於0℃，更佳地低於-20℃之溫度。

通常摻合時間，其意謂成分混合物在進料器中之滯留時間超過一分鐘，較佳地在15與60分鐘之間。

計量螺桿進料器，亦稱為劑量蝸管(dosage snail)，通常以10至200轉/分鐘之速度運行，較佳地以40轉/分鐘至60轉/分鐘運行。

通常，研磨機之溫度保持在-50℃與+30℃之間。在一個較佳實施例中，溫度保持為約10℃。

研磨期間之氧含量較佳地低於10% (v/v)。

該方法可例如分批地或連續地進行。在一個較佳實施例中，藉由歷經某一時間將成分混合物永久地填充至進料器中以用於冷卻且將經冷卻之混合物自進料器永久性地填充至研磨機中來持續進行根據本發明之方法。

在研磨之後，所得乾粉培養基可經進一步壓實以擴大粒子尺寸，例如藉由在輥壓機中乾式壓實。

為了使用粉狀培養基，將溶劑、較佳地為水(最特定言之蒸餾水及/或去離子水或純化水或注射用水)或水性緩衝液添加至培養基中，且混合組分直至培養基全部溶解於溶劑中且產生即用型液體培養基。

溶劑亦可包含生理食鹽水、提供適合之pH範圍(通常在pH 1.0與pH 10.0之間的範圍內)之可溶性酸或鹼離子、穩定劑、界面活性劑、防腐劑及醇或其他極性有機溶劑。

亦可添加其他物質，如用於調節pH之緩衝液物質、胎牛血清、糖等，至細胞培養基及溶劑之混合物中。所得液體細胞培養基隨後與待生長或維持之細胞接觸。

雖然包含較高濃度之一或多種天然胺基酸之培養基組合物由於非溶解胺基酸在與溶劑混合時將展示混濁，但其中胺基酸經相應N-乳醯基胺基酸完全或部分地取代之根據本發明之細胞培養基產生透明溶液，如藉由實例3以及圖2及圖3中之濁度量測所展示。

本發明進一步關於一種用於培養細胞之方法，其係藉由 a)  提供生物反應器 b)  將待培養之細胞與根據本發明之細胞培養基混合 c)  培育步驟b)之混合物。

在一個實施例中，生物反應器為灌注生物反應器。

生物反應器為其中可培養細胞之任何罐或槽。培育通常在適合條件，如適合溫度等下進行。熟習此項技術者知道用於支持或維持細胞生長/培養之適合的培育條件。

灌注生物反應器為其中可進行灌注細胞培養之生物反應器。其包含通常在細胞培養期間關閉的生物反應器罐，罐中之攪拌器，用於引入新鮮培養基之管線，用於移除來自該生物反應器之包含細胞、液體培養基及目標產物的收集流之收集管線，及收集管線中之在採集收集物之液體部分時保留細胞的細胞保留設備。關於提供關於有利設置之細節的灌注細胞培養之綜述可見於「Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing - A critical review」 Jean-Marc Bielser等人，Biotechnology Advances 36 (2018) 1328-1340。

已發現，本發明亦極其適用於製備進料培養基。由於某些胺基酸之可用性的侷限性，尤其在進料培養基必需之濃度中，該進料培養基無法以所要高濃度製備或其需要在如極鹼性pH之劇烈pH條件下製備。此可能負面地影響營養供應至細胞且在一定程度上藉由暴露於極端鹼性pH值而加速細胞死亡。

因此，此處需要在一種進料中及高濃度下包含所有所需組分之進料培養基。另外，進料之pH不應對細胞培養產生負面影響。

已發現，N-乳醯基胺基酸而非相應的天然胺基酸具有改良之溶解度且可用於高度濃縮之進料培養基中，在低於8.5之pH下對細胞生長及/或產率無任何不利影響且有時甚至有積極影響。

因此，本發明亦關於呈粉狀培養基形式或溶解之後呈液體培養基形式的進料培養基。

所得液體培養基包含一或多種濃度通常高於10 mmol/l或甚至高於50 mmol/l，且較佳地具有8.5或更低之pH之N-乳醯基胺基酸。

在一個較佳實施例中，pH在6.5與7.8之間。

本發明亦關於一種用於在生物反應器中培養細胞之方法，其係藉由 -  將細胞及水性細胞培養基填充至生物反應器中 -  在該生物反應器中培育該等細胞 -  在整個時間內連續地或在細胞培育時間內一次或若干次向該生物反應器中添加細胞培養基 其中所添加之細胞培養基較佳地具有小於pH 8.5之pH且包含至少一種N-乳醯基胺基酸。通常培養基包含在50與150 g/l之間的溶解於溶劑中之固體成分。

在一個實施例中，所添加之培養基為進料培養基且該方法為分批進料方法。在另一種培養基中，所添加之培養基為灌注培養基且該方法為灌注方法。

已發現，藉由使用一或多種N-乳醯基胺基酸，可獲得包含高濃度(總濃度在100與250 g/l之間)之所有必需進料組分之進料培養基。相比於需要將兩種或更多種不同進料培養基進料至生物反應器中之已知方法，本發明提供一種培養基及能夠使用一種包含高濃度之所有組分的進料培養基之方法。另外，根據本發明之進料培養基之pH通常低於8.5。

在一個較佳實施例中，在本發明方法中，在培育期間連續地或一次或若干次地在該時間內添加至生物反應器之進料培養基始終具有相同組成。

然而，藉由以下圖式及實例進一步說明本發明，但不限於此。

上文及下文所引用之所有申請案、專利及公開案以及申請於2019年11月14日之相應歐洲專利申請案EP 19209150.2的全部揭示內容特此以引用之方式併入本文中。

實例 以下實例表示本發明之實際應用。

實例 1 L- 乳醯基 -L- 苯丙胺酸之合成 以游離苯丙胺酸為起始物質合成L-乳醯基-L-苯丙胺酸(Sforza，S.,等人，Accumulation of non-proteolytic aminoacyl derivatives in Parmigiano-Reggiano cheese during ripening. International Dairy Journal，2009.19 (10)：582-587頁)。首先合成L-苯丙胺酸甲酯鹽酸鹽：將2.00 g L-苯丙胺酸(12.05 mmol)溶解於100 mL甲醇中且在連續攪拌下保持於冰浴中；緩慢添加SOCl₂ 直至最終濃度為1 M。藉由TLC (溶離劑：正丁醇:乙酸:H₂ O，4:1:1，以體積計；UV及茚三酮檢測，Rf為0.6)監測反應且持續隔夜。真空乾燥反應混合物，添加甲醇，且在減壓下再次蒸發(4次)以完全消除HCl；粗產率為98%。接著將(S)-2-乙醯氧基丙酸 (0.41 g，3.12 mmol)與1.12 g (2.96 mmol)的HBTU一起溶解於4 mL CH₂ Cl₂ 中且在連續攪拌下將混合物保持在室溫下30分鐘，以活化羧酸官能基。將先前合成之L-苯丙胺酸-甲酯鹽酸鹽(0.68 g，3.12 mmol)與DIPEA (1.54 mL，9.36 mmol)一起溶解於4 mL CH₂ Cl₂ 中且隨後將其添加至經活化之乙醯氧基丙酸中。在磁性攪拌下將反應物保持在室溫下4小時。藉由TLC (溶離劑：乙酸乙酯；UV吸光度檢測器，R_f 為0.8)監測反應。接著用KHSO₄ (三次)及NaHCO₃ (三次)之飽和溶液洗滌有機溶劑，經MgSO₄ 乾燥且過濾且真空乾燥產物；粗產率為46%。接著藉由在0℃下，使產物在0.34 g(1.296 mmol)的Ba(OH)₂ .5H₂ O於20 mL之四氫呋喃(tetrahydrofurane；THF)/H₂ O(1:1，v/v)中之混合物中反應20分鐘來移除甲基及乙醯基保護基。隨後在真空下消除THF，且用HCl酸化水性溶液至pH為3.0。藉由LC/ESI-MS分析所得溶液。

實例 2 ： 與其各別胺基酸相比 ， Lac-Ile 及 Lac-Leu 具有增加的於水中之溶解度 在25℃下經由製備飽和溶液來比較Ile及Leu之最大溶解度與其各別乳醯基衍生物或其鹽於水中之溶解度。在沈降之後，使用紅外線(120℃，120分鐘)乾燥溶液且殘餘質量以g/kg測定。 如表1中所示，當與各別胺基酸於水中之溶解度相比時，乳醯基-AA及其鹽之溶解度顯著較高。對於Leu，在使用Lac-Leu (N-乳醯基白胺酸)時溶解度提高約30倍，而當與Ile相比時，Lac-Ile (N-乳醯基異白胺酸)提高20倍。為排除溶解度增加係由於乳醯基-AA之鈉鹽形式，進行獨立實驗以比較Leu、Leu鈉鹽及lac-Leu鈉鹽之溶解度。於水中獲得之最大溶解度分別為22.1、86.0及689.2 g/kg，其表明如所預期的，鈉鹽之形成已增加了Leu之溶解度，但用乳醯基衍生物獲得之溶解度增加明顯更重要且因此不能僅歸因於鹽形式。相同行為被視為對於其他lac-AA係有效的。總而言之，此等結果表明lac-AA及其鹽為藉由置換其各別胺基酸來提高細胞培養基及進料調配物之溶解度的適合候選物。表 1 ： 胺基酸及其各別 lac-AA 或其鹽在 25 ℃ 下於水中之溶解度。使用飽和溶液進行溶解度實驗且在紅外線乾燥之後測定殘餘質量。

胺基酸	化學式	25℃之溶解度，以g/kg為單位	相應 Lac-AA	可用性	化學式	25℃之溶解度，以g/kg為單位
白胺酸		22.1	Lac-Leu鈉鹽	自身 合成		689.2
異白胺酸		32.4	Lac-lle鈉鹽	自身 合成		639.3
纈胺酸		57.8	Lac-Val鈉鹽	自身 合成		91.5
苯丙胺酸		26.0	Lac-Phe鈉鹽	自身 合成		483.1
酪胺酸		0.5	Lac-Tyr鈉鹽	自身 合成		101.9
甲硫胺酸		52.9	Lac-Met鈉鹽	自身 合成		279.3

實例 3 ： 當與其各別胺基酸相比時 ， Lac-AA 於耗乏 Ile 及 Leu 的 Cellvento® 4Feed 中之 最大溶解度 將增加量之Lac-Leu及Lac-Ile及其鹽添加至耗乏Ile及Leu之細胞培養進料調配物(Cellvento® 4Feed)中。類似地，將增加量之Ile及Leu添加至與對照物相同的進料調配物中。此進料調配物之總濃度為113 g/L且pH為7.0 +/- 0.2。在小規模實驗中，在每次添加胺基酸或Lac-AA之後，攪動進料10分鐘且量測濁度。在室溫(25℃)下進行實驗。

發現Ile於耗乏Ile/Leu之Cellvento® 4Feed中之最大溶解度為大約105 mM，而對於lac-Ile，951 mM之最大測試濃度仍為可溶的，濁度值低於5 NTU (圖2)。此表明Lac-Ile於耗乏Ile/Leu之Cellvento® 4Feed中比Ile更加可溶至少9倍。

圖2展示Ile或Lac-Ile於耗乏Ile及Leu之Cellvento® 4Feed調配物中之最大溶解度的測定(113 g/L，pH 7.0/-0.2)。濁度低於5 NTU之溶液視為可溶的。

發現Leu於耗乏Ile及Leu之Cellvento® 4Feed中之最大溶解度為大約90 mM，而對於Lac-Leu，最大可溶濃度(濁度值低於5 NTU)為大約600 mM(圖3)。此表明Lac-Leu於耗乏Ile/Leu之Cellvento® 4Feed中比Leu更加可溶6.6倍。

圖3展示Leu或Lac-Leu於耗乏Ile及Leu之Cellvento® 4Feed調配物中之最大溶解度的測定(113 g/L，pH 7.0/-0.2)。濁度低於5 NTU之溶液視為可溶的。

實例 4 ：使用 Lac-AA 使得能夠在中性 pH 下濃縮細胞培養基調配物。 藉由將增加量之進料乾粉培養基溶解於水中直至肉眼檢測到沈澱來測定Cellvento® 4Feed(正常濃度為130 g/L)之最大溶解度。對於各條件，攪拌進料約30分鐘，pH調節至7.0 +/- 0.2且將溶液再攪拌10分鐘以便平衡。量測滲透重量莫耳濃度及濁度，且獲取圖像(圖4)。資料表明，此調配物(160 g/L)之已經為1.2倍濃縮物為不可溶的，因為可以在懸浮液中檢測到粒子且濁度基本上高於5 NTU之限值。

圖4展示在pH為7.0下Cellvento® 4Feed之溶解度極限。使用濁度計量測濁度。

因為Ile及Leu已鑑別為Cellvento® 4Feed調配物濃度之第一限制性胺基酸，所以產生耗乏Ile及Leu之新主鏈進料(Cellvento® 4Feed - Ile/Leu)。藉由將增加量之饋料乾粉培養基+乳醯基衍生物溶解於水中直至肉眼檢測到沈澱來測定補充有Lac-Leu及Lac-Ile之此饋料的最大濃度。對於各條件，攪拌饋料約30分鐘，pH調節至7.0 +/- 0.2. 且將溶液再攪拌10分鐘以便平衡。量測濁度且認為5 NTU之限值為可溶的。

結果表明，獲得在189 g/L與212 g/L之間的耗乏Ile/Leu且補充有Lac-Leu及Lac Ile之Cellvento® 4Feed之最大溶解度(圖5)。考慮到Cellvento® 4Feed(含有Ile及Leu)之濃度為130 g/L，此表示當用Lac-Ile及Lac-Leu置換Ile及Leu時，濃度增加大約50%。

圖5展示含有增加量之耗乏Ile/Leu之4Feed且補充有Lac-Leu及Leu-Ile衍生物之溶液的濁度(與游離AA相比等莫耳濃度)。

實例 5 ： 當在 4 ℃ 或 RT 避光下儲存於 Cellvento 4Feed-Ile/Leu 中 3 個月時 ， Lac-Leu 及 Lac-Ile 為穩定的 為監測Lac-AA於複合進料混合物中之穩定性，研發了靶向定量LC-MS方法。在pH為7.0下，將Cellvento® 4Feed - Ile / Leu中之Lac-Leu及Lac-Ile從100 mM連續稀釋至100 µM以測定本方法之線性。在LC-MS分析之前進行水中之200倍稀釋。在與ESI-Q-ToF質譜儀(Impact II，Bruker Daltonics)耦合之UHPLC(Vanquish，Thermo Fisher)上研發此方法。

簡言之，將於99.9%緩衝液A(20 mM甲酸銨/0.1% FA)中之1 µL樣品裝到在40℃恆溫下，流動速率為300 µL/分鐘的XSelect HSS T3管柱(2.1×150 mm，3.5 µm，Waters)上，且用表2中所呈現之多步梯度之緩衝液B(100%甲醇)溶離。表 2 ：使用 XSelect HSS T3 管柱之層析法的梯度

時間 (分鐘)	0	2	4	6	8	8.5	9.5	9.6	12
緩衝液(%)	A1	99.9	99.9	80	70	20	0	0	99.9	99.9
B2	0.1	0.1	20	30	80	100	100	0.1	0.1

¹ ：20 mM甲酸銨/0.1% FA；² ：100%甲醇

LC-MS分析使用配備有ESI源之Impact II質譜儀(Bruker Daltonics)進行LC-MS分析。在陰性模式下分別使用設定為500及3500 V之端板偏移及毛細管電壓進行MS獲取。將噴霧器及乾燥氣體(250℃)分別設定在1.4巴及9.0 L/分鐘。以5 Hz之掃描速率在20至1000之m/z範圍內獲取MS光譜。使用在分析開始時注射之甲酸鈉溶液進行校準。

Lac-Leu及Lac Ile之所獲得之標準曲線呈現於圖6中。獲得了管柱上之10 pmol與400 pmol之間的注射(進料中為500 µM至20 mM)的極佳線性，而未獲得管柱上之2 pmol至2 nmol範圍之線性(進料中為100 µM至100 mM，未圖示)。因此，應藉由在管柱上注射10至400 pmol進行Lac-AA定量。

圖6展示在水中200x稀釋之後，使用LC-MS方法獲得的在Cellvento®4Feed - Ile/Leu中之Lac-Leu及Lac-Ile之線性。獲得了管柱上之10-400 pmol範圍內之極好線性。

使用先前研發之方法，在儲存在4℃及室溫避光下3個月的樣品中監測Lac-Ile及Lac-Leu於Cellvento 4Feed-Ile/Leu中之穩定性。如圖6中所示，乳醯基AA兩者之穩定性在4℃及室溫下極佳，其表明若進料調配物在4℃或室溫下避光儲存高達3個月，則Lac-Ile及Lac-Leu為穩定的。

圖7展示如藉由LC-MS所測定，Cellvento®4Feed -Ile/Leu中之Lac-Ile及Lac-Leu之穩定性。

實例 6 ： Lac-Ile 及 Lac-Leu 可置換其在進料中之各別胺基酸。 細胞培養藉由產生 IgG1 之 CHOK1GS 純系產生。 對於細胞培養實驗，使用表現人類IgG1之CHOK1GS懸浮細胞株。使用具有30 mL之起始培養體積及2×10⁵ 個細胞/毫升之接種密度的50 mL旋轉管將細胞一式四份培養於Cellvento^® 4CHO培養基(Merck Darmstadt，Germany)中。在37℃、5% CO2、80%濕度及320 rpm之攪拌下進行培育。將Lac-AA而非其各別胺基酸添加到進料(耗乏Ile及leu之Cellvento® 4Feed)中。所有進料之pH均為中性(pH 7.0 +/- 0.2)。陽性對照含有正常胺基酸，而陰性對照含有耗乏各別胺基酸且未添加Lac-AA的進料。在第3天、第5天、第7天、第10天、第12天及第14天時，以以下v/v比率(3、3、6、3、3及3%)進行進料。每天對葡萄糖進行定量且使用400 g/L葡萄糖溶液將其調節至6 g/L。重複實驗至少3次。

用Vi-CELL XR(Beckman Coulter，Fullerton，CA)評估活細胞密度(viable cell density；VCD)及存活率。基於分光光度法及濁度法，使用Cedex Bio HT(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)監測代謝物濃度。在用AccQ•TagUltra®試劑套組衍生化之後，經由UPLC進行胺基酸定量。遵循供應商建議(Waters，Milford，MA)進行衍生化、層析及資料分析。

當考慮活細胞密度時(圖8)，對於耗乏Leu及Ile之進料之陰性對照在第7天之後顯示VCD快速降低，指示細胞需要兩種胺基酸以進行有效生長。與陽性對照相比，用Lac-Ile置換Ile對峰值VCD或總體VCD曲線無作用，而用Lac-Leu置換Leu對平穩階段之持續時間具有積極作用，因為自第10天至第14天，細胞保持在大約1500萬個細胞/毫升。

圖8展示歷經17天的分批進料方法之VCD，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。耗乏之Cellvento® 4Feed係陰性對照且不含有任何Leu或Ile。

對於所有條件，第14天獲得之IgG濃度均為約3 g/L(圖9)，其中在Lac-Leu及Lac-Ile分別置換之Leu及Ile的條件下具有輕微但不顯著的較高效價。

圖9展示在歷經17天的分批進料方法中產生之IgG，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。

因為由Lac-AA形成游離AA釋放乳酸鹽，所以在FB方法之持續時間內在上清液中監測此代謝物(圖10)。在其中用Lac-Leu及Lac-Ile分別置換Leu及Ile之條件下，在第5天之後觀測到較高乳酸濃度，其最可能由衍生物之裂解產生。當計算乳酸濃度之曲線下面積時，對乳酸鹽之整體增加進行定量。用Lac-Leu置換Leu使得游離乳酸增加20%，而用Lac-Ile置換Ile使得增加37%，其與陰性對照中觀測到之乳酸增加非常類似(36.5%)。

圖10展示在17天的分批進料方法期間的乳酸產量，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。

在消耗培養基中測定胺基酸濃度。在用Lac-Leu置換Leu之條件下，消耗培養基中之Leu濃度(圖11)快速降低直至第7天且隨後再次增加，表明Lac-AA之裂解花費時間，最有可能視特定酶之釋放或活化而定(類似於先前研發之磷酸酪胺酸釋放技術的緩慢釋放技術)。在其中用Lac-Ile置換Ile之條件下，在乳醯基衍生物之有效裂解之前，分批進料期間之總白胺酸濃度適當地降低，指示可使用其他分支鏈胺基酸而非Ile。

當考慮消耗培養基中之Ile時(圖12)，檢測到與Lac-Leu類似的行為。在其中用Lac-Ile置換Ile之條件下，消耗培養基中之Ile濃度快速降低直至第7天且隨後再次增加，表明Lac-AA之裂解花費時間，最有可能視特定酶之釋放或活化而定。在其中用Lac-Leu置換Leu之條件下，Ile濃度在第7天之後降低，指示此處亦可使用其他分支鏈胺基酸而非Leu。

圖11：在17天的分批進料方法期間的消耗培養基中之Leu定量，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。

圖12：在17天的分批進料方法期間的消耗培養基中之Ile定量，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。

將在對照分批進料方法(在含有Ile及Leu之進料的情況下)中產生之抗體的品質與由耗乏Leu及Ile且補充有Lac-Leu或Lac-Ile之進料產生之抗體的品質進行比較。

使用蛋白質A PhyTips®(PhyNexus Inc，San Jose，CA)自細胞培養上清液純化抗體。根據製造商說明書，使用具有8-胺基芘1,3,6-三磺酸三鈉(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium；APTS) (Prozyme，Hayward，CA)之GlykoPrep®-加快速N-聚醣樣品製備套組，在衍生化之後藉由具有雷射誘導之螢光之毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis with laser-induced fluorescence；CGE-LIF)分析醣基化模式。簡言之，使經純化之抗體變性且固定，且用N-Glycanase®藉由浸提使聚醣自抗體釋放，隨後在50℃下用APTS標記60分鐘。在移除剩餘APTS之清潔步驟之後，使用具有LIF檢測器(激發波長：488 nm，發射波長：520 nm)之醫藥分析系統CESI8000 Plus(Sciex，Washington，USA)測聚醣的相對量。在塗覆聚乙烯醇之毛細管(全長：50.2 cm，內徑：50 µm)中進行分離，且用自碳水化合物標記套組之碳水化合物分離緩衝液填充(Beckman Coulter，Brea，USA)。在30 psi下首先用分離緩衝液沖洗毛細管表面3分鐘。每20個循環更換輸入及排放緩衝液小瓶。在0.5 psi下藉由壓力注射引入樣品12秒，接著進行浸漬步驟0.2分鐘以清潔毛細管尖端。最後在20 kV下進行分離20分鐘，其中勻變施加反向極性0.17分鐘。根據其單獨遷移時間識別峰值且根據以下參數整合：峰寬0.05、臨限值10,000及肩部敏感度9,999。

在使用TSKgel SuperSW3000管柱之Water Acquity UPLC系統(Tosoh Bioscience)上使用尺寸排阻層析法量測抗體聚集及片段化。移動相為0.05 M磷酸鈉、0.4 M過氯酸鈉，pH 6.3且流動速率為0.35 mL/分鐘。在IgG純化之後，使用儲存緩衝液將樣品濃度調節至1.0 mg/mL且使用在214 nm下之吸光度進行檢測。

根據製造商說明書，在使用cIEF之毛細管電泳CESI8000(Beckman Coulter/ Sciex)上量測電荷變異體。在IgG純化之後，使用儲存緩衝液將樣品濃度調節至1.5 mg/mL之濃度。在量測之前，將樣品與含有不同pH標誌物、陰極/陽極穩定劑、3M脲cIEF凝膠及Pharmalyte之反應混合物混合。

所獲得之醣基化(圖13)、高及低分子量物質(圖14)及電荷變異體(圖15)結果指示對照條件與其中用Lac-Ile及Lac-Leu置換Ile及Leu的條件之間無差異，指示胺基酸交換對此研究中所產生之IgG1之三種關鍵品質屬性無影響。

圖13展示在對照方法中或在使用耗乏Ile/Leu且補充有Lac-Leu或Lac-Ile之進料的方法中所產生之IgG1的醣基化。使用APTS標記及CGE-LIF檢測測定醣型分佈。

圖14展示在對照方法中或在使用耗乏Ile/Leu且補充有Lac-Leu或Lac-Ile之進料的方法中所產生之IgG1的聚集及片段化。使用尺寸排阻層析法測定高分子量(HMW)及低分子量物質(LMW)。

圖15展示在對照方法中或在使用耗乏Ile/Leu且補充有Lac-Leu或Lac-Ile之進料的方法中產生之IgG1的電荷變異體。使用毛細電泳法CESI 8000上之cIEF測定電荷變異體分佈。

實例 7 ： 用產生 IgG1 之 CHODG44 純系確認 Lac-Leu 及 Lac-Ile 之效能 藉由用CHODG44純系進行分批進料實驗來證明本發明對於不同生物方法之適用性。結果(圖16、圖17、圖18)指示與對照陽性對照相比，Lac-Leu及Lac-Ile條件下之類似VCD及IgG效價。相比之下，耗乏之Cellvento® 4Feed條件導致VCD早期降低且在第7天之後效價顯著降低。消耗培養基資料展示對於此細胞株，檢測到無乳酸自Lac衍生物之裂解而增加。當前對CHOK1GS細胞與此DG44細胞株之間行為的此差異之解釋係未知的。消耗培養基中之Leu及Ile濃度(圖19及20)在FB培養的第一天期間降低直至在D7之後最後再次增加。此行為類似於針對CHOK1GS細胞所見之行為且指示游離AA自衍生物之緩慢釋放過程。

圖16、圖17及圖18展示與表現IgG1之CHODG44細胞株的對照相比，Lac-Leu及Lac-Ile方法的效能。病毒細胞密度(圖16)、IgG效價(圖17)、消耗培養基中之乳酸濃度(圖18)。

圖19及圖20展示與使用未經改性之Ile及Leu之正常方法相比，Lac-Leu及Lac-Ile方法(CHODG44細胞)中之消耗培養基中之異白胺酸(圖19)與白胺酸(圖20)的相對濃度。

圖1展示具有其特徵殘基之天然胺基酸的例示性結構。 圖2展示Ile或Lac-Ile於耗乏Ile及Leu之Cellvento® 4Feed調配物中之最大溶解度的測定(113 g/L，pH 7.0/-0.2)。濁度低於5 NTU之溶液視為可溶的。 圖3展示Leu或Lac-Leu於耗乏Ile及Leu之Cellvento® 4Feed調配物中之最大溶解度的測定(113 g/L，pH 7.0/-0.2)。濁度低於5 NTU之溶液視為可溶的。 圖4展示在pH為7.0下Cellvento® 4Feed之溶解度極限。使用濁度計量測濁度。 圖5展示含有增加量之耗乏Ile/Leu之4Feed且補充有Lac-Leu及Leu-Ile衍生物之溶液的濁度(與游離AA相比等莫耳濃度)。 圖6展示在水中200x稀釋之後，使用LC-MS方法獲得的在Cellvento®4Feed - Ile/Leu中之Lac-Leu及Lac-Ile之線性。獲得了管柱上之10-400 pmol範圍內之極好線性。 圖7展示如藉由LC-MS所測定，Cellvento®4Feed -Ile/Leu中之Lac-Ile及Lac-Leu之穩定性。 圖8展示歷經17天的分批進料方法之VCD，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。耗乏之Cellvento® 4Feed係陰性對照且不含有任何Leu或Ile。 圖9展示在歷經17天的分批進料方法中產生之IgG，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。 圖10展示在17天的分批進料方法期間的乳酸產量，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。 圖11：在17天的分批進料方法期間的消耗培養基中之Leu定量，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。 圖12：在17天的分批進料方法期間的消耗培養基中之Ile定量，其中在進料中用Lac-Leu或Lac-Ile分別置換Leu及Ile。 圖13展示在對照方法中或在使用耗乏Ile/Leu且補充有Lac-Leu或Lac-Ile之進料的方法中所產生之IgG1的醣基化。使用APTS標記及CGE-LIF檢測測定醣型分佈。 圖14展示在對照方法中或在使用耗乏Ile/Leu且補充有Lac-Leu或Lac-Ile之進料的方法中所產生之IgG1的聚集及片段化。使用尺寸排阻層析法測定高分子量(HMW)及低分子量物質(LMW)。 圖15展示在對照方法中或在使用耗乏Ile/Leu且補充有Lac-Leu或Lac-Ile之進料的方法中產生之IgG1的電荷變異體。使用毛細電泳法CESI 8000上之cIEF測定電荷變異體分佈。 圖16、圖17及圖18展示與表現IgG1之CHODG44細胞株的對照相比，Lac-Leu及Lac-Ile方法的效能。病毒細胞密度(圖16)、IgG效價(圖17)、消耗培養基中之乳酸濃度(圖18)。 圖19及圖20展示與使用未經改性之Ile及Leu之正常方法相比，Lac-Leu及Lac-Ile方法(CHODG44細胞)中之消耗培養基中之異白胺酸(圖19)與白胺酸(圖20)的相對濃度。

Claims (15)

1. 一種細胞培養基，其包含至少一種N-乳醯基-胺基酸及/或其鹽。
2. 如請求項1之細胞培養基，其中該N-乳醯基-胺基酸係選自N-乳醯基-白胺酸、N-乳醯基-異白胺酸、N-乳醯基-纈胺酸、N-乳醯基-苯丙胺酸、N-乳醯基-酪胺酸及/或N-乳醯基-甲硫胺酸，最佳地為N-乳醯基-白胺酸及/或N-乳醯基-異白胺酸。
3. 如請求項1或請求項2之細胞培養基，其中該細胞培養基包含式I之組分中之一或多者：

   

   其中R₁ ⁺ 為H⁺ 或Na⁺ 、K⁺ 、Mg²⁺ 、Ca²⁺ 、Li⁺ R₂ 為該胺基酸之特徵殘基。
4. 如請求項1或2之細胞培養基，其中該細胞培養基包含一或多種N-乳醯基胺基酸之鈉鹽。
5. 如請求項1或2之細胞培養基，其中該細胞培養基包含一或多種N-乳醯基胺基酸以及相應的胺基酸及/或其鹽。
6. 如請求項1或2之細胞培養基，其中該培養基包含一或多種N-乳醯基胺基酸及/或其鹽，但不包含相應的胺基酸及/或其鹽。
7. 如請求項1或2之細胞培養基，其中該細胞培養基為乾粉培養基。
8. 如請求項1或2之細胞培養基，其中該細胞培養基為液體培養基，其具有8.5或更小之pH且包含濃度高於10 mmol/l之至少一種N-乳醯基胺基酸及/或其鹽。
9. 如請求項8之細胞培養基，其中該液體培養基之pH在6.0與8.5之間。
10. 一種用於產生如請求項1至9中任一項之細胞培養基的方法，其係藉由： a)  將根據式I之一或多種N-乳醯基-胺基酸與該細胞培養基之其他組分混合 b)  對步驟a)之混合物進行研磨。
11. 一種用於培養細胞之方法，其係藉由： a)  提供生物反應器 b)  將待培養之細胞與如請求項1至9中任一項之細胞培養基混合 c)  培育步驟b)之混合物。
12. 如請求項11之方法，其中該生物反應器為灌注生物反應器。
13. 一種用於在生物反應器中培養細胞之方法，其係藉由： 將細胞及水性細胞培養基填充至生物反應器中 在該生物反應器中培育該等細胞 在整個時間內連續地或在細胞培育時間內一次或若干次向該生物反應器中添加細胞培養基 其中該培養基為如請求項1至9中任一項之細胞培養基。
14. 如請求項13之方法，其中該方法為分批進料方法，且添加之培養基為pH低於pH 8.5且包含濃度高於10 mmol/l之至少一種N-乳醯基胺基酸及/或其鹽的進料培養基。
15. 如請求項13或14之方法，其中該N-乳醯基胺基酸為N-乳醯基白胺酸及/或N-乳醯基異白胺酸及/或其鹽。

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