TW202104587A - 包含酮酸之細胞培養基 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含α酮酸之細胞培養基。一些如異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之胺基酸的不良溶解度可藉由用各別α酮酸取代其來克服。

Description

包含酮酸之細胞培養基
本發明係關於包含α酮酸之細胞培養基。一些如異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之胺基酸的不良溶解度可藉由用各別α酮酸取代其來克服。
細胞培養基支持且維持細胞在人工環境中之生長。
視將要支持其生長之生物類型而定，細胞培養基包含組分之複雜混合物，有時超過一百種不同組分。
哺乳動物、昆蟲或植物細胞之繁殖所需的細胞培養基通常比支持細菌及酵母之生長的培養基要複雜得多。
研發之第一細胞培養基由不確定組分，諸如血漿、血清、胚胎提取物或其他非限定生物提取物或蛋白腖組成。因此化學成分確定之培養基之開發取得重大進展。化學成分確定之培養基通常包含但不限於胺基酸、維生素、金屬鹽、抗氧化劑、螯合劑、生長因子、緩衝劑、激素及許多彼等熟習此項技術者已知之物質。
一些細胞培養基係以無菌水性液體形式提供。液體細胞培養基之缺點為其儲存期限縮短以及運送及儲存困難。因此，當前許多細胞培養基以精細研磨之乾粉混合物形式提供。其係出於溶解於水及/或水溶液之目的製造且在溶解狀態下常常與其他補充劑一起設計用於向細胞供應大量養分基質以用於生長及/或由該等細胞生產生物醫藥。
許多生物醫藥生產平台係基於進料批式細胞培養方案。目標通常為研發高效價細胞培養方法以滿足增加的市場需求且降低製造成本。除使用高效能重組細胞株以外，需要改良細胞培養基及製程參數以實現最大生產潛力。
在進料批式製程中，基本培養基支持初始生長及生產，且進料培養基防止養分耗乏且維持生產階段。選擇培養基以適應不同生產階段期間之不同代謝需求。包括進料策略及控制參數之方法參數設定界定適用於細胞生長及蛋白質生產之化學及物理環境。
進料培養基之最佳化為進料批式製程之最佳化中之主要態樣。
通常高度濃縮進料培養基以避免生物反應器中重組蛋白稀釋。養分的受控添加直接影響培養物的生長速率、存活率以及效價。
但在如批式法或灌注法之其他細胞培養方法中，亦需要精確組成及通常高度濃縮之培養基調配物。詳言之，在灌注法中，生物反應器中培養基之恆定交換需要操作員製備及處置巨大體積之液體培養基。為了減小儲存此等體積所需之佔據面積，需要濃縮培養基。
用於由乾粉製備細胞培養基之限制因素為一些組分，尤其一些胺基酸之不良溶解度或穩定性。
因此，尋找提供足夠可溶以產生高度濃縮液體培養基組合物之乾粉培養基組合物的方式將為有利的。
已發現，可使用各別α酮酸代替異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸，而對細胞生長及改良之溶解度無任何負面作用且有時甚至具有正面作用。
另外已發現，彼等酮酸甚至對液體細胞培養基調配物具有穩定作用。
在1959年，處理胺基酸代謝之論文中陳述一些胺基酸可經其酮酸取代 (Eagle H: Amino acid metabolism in mammalian cell cultures.Science 1959, 130(3373):432-437.)。但自那以後再未注意到某些酮酸可用作高效細胞培養中之胺基酸取代物且其適合於解決一些胺基酸之溶解度及穩定性問題。
因此，本發明係關於乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，其包含來自4-甲基-2-側氧基戊酸(酮Leu)、3-甲基-2-側氧基戊酸(酮Ile)、α-酮異戊酸(酮Val)、苯丙酮酸(酮Phe)及α酮γ甲基硫代丁酸(酮Met)及/或其衍生物之群中的至少一種α酮酸， 其量使得在溶解乾粉或乾燥粒化之細胞培養基之後獲得的液體培養基中之各酮酸及/或其衍生物之濃度大於10 mM、較佳在20與600 mM之間、最佳在30與300 mM之間。通常各酮酸以不同濃度存在，其中通常4-甲基-2-側氧基戊酸(酮Leu)、3-甲基-2-側氧基戊酸(酮Ile)、α-酮異戊酸(酮Val)及苯丙酮酸(酮Phe)及/或其衍生物以大於50 mM之較高濃度存在，其中α酮γ甲基硫代丁酸(酮Met)通常以較低濃度存在，通常在10與30 mM之間。
在一較佳實施例中，若乾粉或乾燥粒化之細胞培養基為進料培養基，則與酮酸及/或衍生物相比，其包含小於30 mol%之相應胺基酸。彼意謂兩種化合物之莫耳比小於3:10。
在另一實施例中，乾粉或乾燥粒化之細胞培養進料培養基不包含相應胺基酸。
對於其他如灌注培養基或(進料)批式基本培養基之培養基，在培養基調配物中具有胺基酸與相應酮酸及/或其衍生物兩者可為有利的。
在另一實施例中，乾粉或乾燥粒化之細胞培養基包含α酮酸及/或其衍生物中之兩者或更多者。
在一較佳實施例中，乾粉或乾燥粒化之細胞培養基包含上文所列之α酮酸中之一或多者之鈉鹽。
在一較佳實施例中，乾粉或乾燥粒化之細胞培養基包含選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸中之α酮酸中之一或多者及/或其鹽，較佳為其鈉鹽。
本發明進一步關於一種穩定液體細胞培養基之方法，其包含在培養基中包括至少20 mM，較佳在30與600 mM之間的選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸及/或其衍生物中之α酮酸中之一或多者，較佳4-甲基-2-側氧基戊酸及/或3-甲基-2-側氧基戊酸及/或α-酮異戊酸及/或其衍生物，且藉此與缺乏該等酮酸及/或其衍生物或其中該等酮酸及/或其衍生物已經相應胺基酸及/或其衍生物取代之其他方面組成相同之培養基相比，在4℃或室溫下儲存超過90天後，所得培養基顯示較少顏色變化及/或較少沈澱。
本發明進一步關於一種藉由用選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群的相應酮酸完全或部分取代異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸中之一或多者來改良限定組成的乾粉或乾燥粒化之細胞培養基之溶解度的方法。
在一較佳實施例中，至少50%、更佳70%、最佳至少90%(莫耳比)之相應胺基酸經相應α酮酸及/或其衍生物取代。
取代在此情況下意謂代替給定量之胺基酸，將至少80 mol%，通常約100 mol%之相應酮酸及/或其衍生物添加至培養基中。較佳地，將介於100與150 mol%之間的相應酮酸及/或其衍生物添加至培養基中。
在一較佳實施例中，該方法涉及提供其中胺基酸已如上文所闡述經取代之乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，且溶解該培養基，藉此與其中胺基酸未經取代之其他方面組成相同之培養基相比，溶解發生較快及/或在較少液體中發生。
在另一較佳實施例中，將乾粉或乾燥粒化之培養基溶解以得到pH為8.5或更小之液體培養基。
在一較佳實施例中，將其溶解以得到pH在6.5與8.5之間，最佳在6.7與7.8之間的液體培養基。
在一個實施例中，可溶性經改良之乾粉或乾燥粒化之細胞培養基包含至少一或多種醣組分、一或多種胺基酸、一或多種維生素或維生素前驅體、一或多種鹽、一或多種緩衝劑組分、一或多種輔因子及一或多種核酸組分。
在另一實施例中，將溶解度經改良之乾粉或乾燥粒化之細胞培養基溶解以產生包含溶解於溶劑中之50與400 g/l之間，較佳100與300 g/l之間的固體成分的液體培養基及/或各酮酸及/或其鹽之濃度大於10 mM，較佳30與600 mM之間。
本發明進一步關於一種用於產生根據本發明之乾粉細胞培養基之方法，其係藉由以下步驟產生： a)  將來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群的至少一種α酮酸與細胞培養基之其他組分混合 b)  對步驟a)之混合物進行研磨。
在一較佳實施例中，步驟b)在針磨機(pin mill)、菲茨磨機(fitz mill)或噴射磨機中進行。
在另一較佳實施例中，將來自步驟a)之混合物冷卻至低於0℃之溫度，隨後研磨。
本發明進一步關於用於培養細胞之方法，其係藉由以下步驟培養： a)  提供生物反應器 b)  將待培養之細胞與液體細胞培養基混合，在該液體細胞培養基中異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸中之一或多者經選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群的相應酮酸部分或完全取代 c)  培育步驟b)之混合物。
在一較佳實施例中，液體細胞培養基包含以大於10 mM之濃度存在之各酮酸及/或其衍生物。
本發明亦關於一種用於在生物反應器中培養細胞之進料批式方法，其係藉由以下步驟培養： -  向生物反應器中裝填細胞及水性細胞培養基 -  在該生物反應器中培育該等細胞 -  在該生物反應器中培育細胞之整個時間內持續或在該培育時間內一次或若干次將細胞培養基添加至該生物反應器中，該細胞培養基在此情況下為進料培養基 其中該進料培養基之pH值小於pH 8.5且包含來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群中的至少一種α酮酸。
較佳地，進料培養基至少包含各濃度在20與600 mmol/l之間，較佳在20與400 mmol/l之間的4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸及/或其鹽。
本發明進一步關於一種用液體細胞培養基之灌注方法，其中異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸中之一或多者經選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群的相應酮酸部分或完全取代。
根據本發明之細胞培養基為維持及/或支持細胞之活體外生長之組分的任何混合物。其可為複合培養基或化學成分確定之培養基。細胞培養基可包含維持及/或支持細胞之活體外生長所需之所有組分或僅包含一些組分，從而分開添加其他組分。根據本發明之細胞培養基之實例為完整培養基，其包含維持及/或支持細胞之活體外生長所需之所有組分以及培養基補充劑或進料。在一較佳實施例中，細胞培養基為完整培養基、灌注培養基或進料培養基。亦稱為基本培養基之完整培養基之pH通常在6.7與7.8之間。進料培養基之pH較佳低於8.5。
通常，根據本發明之細胞培養基用於維持及/或支持細胞在生物反應器中之生長。
進料或進料培養基並不為支持細胞培養物中之初始生長及生產之基本培養基，而是在後期添加用以防止養分耗乏且維持生產階段的細胞培養基。與基本培養基相比，進料培養基可具有較高濃度之一些組分。例如，一些組分，諸如包括胺基酸或碳水化合物之養分，可以基本培養基中之濃度之約5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至約1000倍存在於進料培養基中。
哺乳動物細胞培養基為維持及/或支持哺乳動物細胞之活體外生長的組分之混合物。哺乳動物細胞之實例為人類或動物細胞，較佳CHO細胞、COS細胞、I型VERO細胞、BHK細胞、AK-1細胞、SP2/0細胞、L5.1細胞、融合瘤細胞或人類細胞。
化學成分確定之細胞培養基為不包含任何化學不確定物質之細胞培養基。此意謂用於該培養基中之所有化學物質之化學組成為已知的。化學成分確定之培養基不包含任何酵母、動物或植物組織；其不包含飼養細胞、血清、水解產物、萃取物或消化物或其他化學成分不明確之組分。化學成分不確定或不明確之化學組分為彼等化學組成及結構未知、以不同組成存在或僅可經巨大實驗努力確定之化學組分，與評估蛋白質(如胰島素、白蛋白或酪蛋白)之化學組成及結構相當。
粉末狀細胞培養基或乾粉培養基為通常由研磨製程或凍乾製程產生之細胞培養基。彼意謂粉末狀細胞培養基為顆粒、微粒培養基，而非液體培養基。術語「乾粉」可與術語「粉末」互換使用；然而，除非另外指明，否則如本文所用之「乾粉」僅係指粒化材料之總體外觀且不意欲意謂材料完全不含複合或聚結溶劑。
乾燥粒化之培養基為由濕式或乾式粒化製程產生之乾燥培養基。較佳地，其為由乾粉培養基之滾筒壓實產生之培養基。除非另外指明，否則如本文所用之術語乾燥僅指粒化材料之總體外觀且不意欲意謂材料完全不含複合或聚結溶劑。
待與根據本發明之培養基一起培養之細胞可為原核細胞，如細菌細胞或真核細胞，如植物或動物細胞。細胞可為正常細胞、永生化細胞、患病細胞、轉化細胞、突變細胞、體細胞、生殖細胞、幹細胞、前驅細胞或胚胎細胞，其中任一者可建立或轉化細胞株或獲自天然來源。
粒子之尺寸意謂粒子之平均直徑。粒子直徑藉由雷射光散射(粒徑分析儀3000, Malvern)測定。
液體細胞培養基之顏色變化較佳在視覺上或以光譜方式測定。
沈澱可視覺上或藉由濁度法測定。
惰性氛圍藉由用惰性氣體裝填各別容器或裝置產生。適合之惰性氣體為惰性氣體，如氬氣，或較佳為氮氣。此等惰性氣體為非反應性的且防止發生不合需要之化學反應。在根據本發明之方法中，產生惰性氛圍意謂例如藉由引入液氮或氮氣將氧氣濃度降至低於10% (v/v)絕對值。
不同類型之磨機已為熟習此項技術者所知。
亦稱為離心衝擊磨機的針磨機會粉碎固體，其中高速旋轉圓盤上之突出針提供裂斷能。針磨機例如由Munson Machinery (USA)、Premium Pulman (India)或Sturtevant (USA)出售。
噴射磨機使用壓縮氣體來加速粒子，從而使其在處理腔室中彼此相抵地衝擊。噴射磨機例如由Sturtevant (USA)或PMT (Austria)出售。
由Fitzpatrick (USA)商品化之菲茨磨機使用具有葉片之轉子用於研磨。
連續運行之製程為不分批運行之製程。若持續運行研磨製程，則意謂培養基成分在一定時間內持久性地且穩定地進給至磨機中。
根據本發明之細胞培養基，尤其完整培養基通常包含至少一或多種醣組分、一或多種胺基酸、一或多種維生素或維生素前驅體、一或多種鹽、一或多種緩衝劑組分、一或多種輔因子及一或多種核酸組分。
培養基亦可包含丙酮酸鈉、胰島素、植物蛋白、脂肪酸及/或脂肪酸衍生物及/或普洛尼克酸(pluronic acid)及/或表面活性組分，如以化學方式製備之非離子型界面活性劑。適合之非離子界面活性劑之一個實例為以一級羥基封端之雙官能嵌段共聚物界面活性劑，亦稱為泊洛沙姆(poloxamer)，例如可自德國BASF以商標名pluronic®獲得。
醣組分全部為單醣或二醣，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(單醣之實例)或蔗糖、乳糖或麥芽糖(二醣之實例)。
根據本發明之胺基酸之實例為酪胺酸、蛋白型胺基酸，尤其必需胺基酸、白胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、精胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸，以及非蛋白型胺基酸，如D-胺基酸，其中L-胺基酸為較佳的。
術語胺基酸進一步包括胺基酸之鹽，如鈉鹽，或各別水合物或鹽酸鹽。
例如，酪胺酸意謂L-酪胺酸或D-酪胺酸，較佳L-酪胺酸，以及其鹽或水合物或鹽酸鹽。
維生素之實例為維生素A(視黃醇、視黃醛、各種類視黃素及四種類胡蘿蔔素)、維生素B1 (硫胺)、維生素B2 (核黃素)、維生素B3 (菸酸、菸鹼醯胺)、維生素B5 (泛酸)、維生素B6 (吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、維生素B7 (生物素)、維生素B9 (葉酸、醛葉酸)、維生素B12 (氰鈷胺素、羥鈷維生素、甲基鈷胺素(methylcobalamin))、維生素C(抗壞血酸)、維生素D(麥角鈣化醇、膽鈣化醇)、維生素E(生育酚、參雙鍵生殖酚)及維生素K(葉綠醌、甲萘醌)。亦包括維生素前驅體。
鹽之實例為包含無機離子之組分，諸如碳酸氫鹽、鈣、氯化物、鎂、磷酸鹽、鉀及鈉或微量元素，諸如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V及Zn。實例為五水合硫酸銅(II)(CuSO4 . 5H2 O)、氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2 . 2H2 O)、氯化鉀(KCl)、硫酸鐵(II)、檸檬酸鐵銨(FAC)、無水磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 )、無水硫酸鎂(MgSO4 )、無水磷酸氫鈉(Na2 HPO4 )、六水合氯化鎂(MgCl2 . 6H2 O)、七水合硫酸鋅。
緩衝劑之實例為CO2 /HCO3 (碳酸鹽)、磷酸鹽、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS及TRIS。
輔因子之實例為硫胺衍生物、生物素、維生素C、NAD/NADP、鈷胺素、黃素單核苷酸及衍生物、麩胱甘肽、血紅素核苷酸磷酸鹽及衍生物。
根據本發明之核酸組分係核鹼基，如胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶；核苷，如胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷及胸苷；及核苷酸，如單磷酸腺苷或二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。
進料培養基與完整培養基相比可具有不同組成。其通常包含胺基酸、微量元素及維生素。其亦可包含醣組分，但有時出於生產原因，醣組分在分別進料中添加。
適合之進料培養基可例如包含以下化合物中之一或多者：
單水合L-天冬醯胺
L-異白胺酸
L-苯丙胺酸
單水合L-麩胺酸鈉
L-白胺酸
L-蘇胺酸
單鹽酸化L-離胺酸
L-脯胺酸
L-絲胺酸
單鹽酸化L-精胺酸
單水合單鹽酸化L-組胺酸
L-甲硫胺酸
L-纈胺酸
單水合單-L-天冬胺酸鈉
L-色胺酸
氯化膽鹼
肌醇
菸鹼醯胺
泛酸鈣-D(+)
鹽酸化吡哆醇
鹽酸化氯化硫胺
微粉化維生素B12(氰鈷胺素)
生物素
葉酸
核黃素
無水硫酸鎂
五水合硫酸銅(II)
七水合硫酸鋅
1,4-丁二胺二鹽酸鹽
四水合七鉬酸銨
水合硫酸鎘
四水合氯化錳(II)
六水合氯化鎳(II)
偏矽酸鈉
偏釩酸鈉
二水合氯化錫(II)
亞硒酸鈉(約45%SE)
單水合磷酸二氫鈉
檸檬酸銨鐵(III)(約18%FE)
根據本發明之冷凍意謂冷卻至低於0℃之溫度。
在灌注方法中，經由泵連續添加細胞培養基且將其自生物反應器移除，同時經由細胞滯留器件將細胞保留於生物反應器中。灌注之優點為可能達到極高細胞密度(由於恆定培養基交換)及可能產生極脆弱之重組蛋白，因為產物可每天自生物反應器移除，因此降低重組蛋白至高溫之暴露時間、氧化還原電位或所釋放之細胞蛋白酶。
灌注細胞培養物之方法通常包含在生物反應器系統中培養細胞，該生物反應器系統包含具有培養基入口及收集出口之生物反應器，其中 i.   在細胞培養製程期間，持續或一次或若干次，較佳持續將新細胞培養基經由培養基入口插入至生物反應器中 ii.  在細胞培養製程期間持續或一次或若干次，較佳持續經由收集出口自生物反應器移除收集物。收集物通常包含由細胞、細胞及液體細胞培養基產生之目標產物。
胺基酸為細胞培養基之必需組分，因為其為支持細胞生長之關鍵。另外，胺基酸為使用哺乳動物細胞培養技術產生之重組蛋白的關鍵建構嵌段。胺基酸之溶解度為阻礙細胞培養基及進料調配物之濃度之限制因素。此類濃縮對於產生下一代製造平台而言將為必不可少的。詳言之，需要高度濃縮之調配物用於使用內嵌稀釋之生物製程，以減小必須儲存於槽中之細胞培養基之體積(=減小製造佔據面積)或一般而言，減小整個進料批式製程中所添加之進料的體積且因此潛在地提高體積效價。
已發現若干胺基酸可在細胞培養基中經其酮酸或其鹽替換。除其作為胺基酸源之用途以外，尤其此等酮基之鈉鹽與其相應胺基酸相比呈現較高溶解度且因此可用於高度濃縮之調配物中。次於溶解度優點，已發現使用酮酸亦允許減少細胞培養物中之氨，其為已知毒性及抑制性代謝物。此外，證明使用某些酮酸可產生更穩定調配物，當儲存於室溫下時顏色變化減少、沈澱缺乏或延遲且副產物形成較少或經延遲。
胺基酸之酮酸及其鹽可因此用於細胞培養基調配物中以用於以下應用 •    應用1：增加總體培養基/進料溶解度 •    應用2：替換相應胺基酸且減少細胞培養物中之銨離子/氨調配物 •    應用3：提高培養基穩定性、減少顏色變化及沈澱(由於在4℃或室溫下儲存調配物)且減少在進料儲存期間氨之形成。
表1展示白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸以及其相應酮酸或相應酮酸之鈉鹽。如自表1可見，相應酮酸之溶解度高於胺基酸之溶解度.
胺基酸 化學式 25℃下之溶解度(g/kg) 相應酮酸 可用性 化學式 25℃下之溶解度(g/kg)
白胺酸
Figure 02_image001
 22.1 4-甲基-2-側氧基戊酸鈉鹽 CAS 4502-00-5 Sigma W387101 (97%)/K0629(98%)
Figure 02_image003
 313.7
異白胺酸
Figure 02_image005
 32.4 3-甲基-2-側氧基戊酸鈉鹽 CAS 3715-31-9 Sigma 198978(98%)
Figure 02_image007
 480
纈胺酸
Figure 02_image009
 58.5 α-酮異戊酸鈉鹽 CAS 223-062-2 Sigma 198994(95%)
Figure 02_image011
 362
苯丙胺酸
Figure 02_image013
 26.8 苯丙酮酸鈉鹽 CAS 114-76-1 Sigma P8001(95%)
Figure 02_image015
 72
甲硫胺酸
Figure 02_image017
 52.9 α酮γ甲基硫代丁酸鈉鹽 CAS 518282-97-8 Sigma K6000(97%)
Figure 02_image019
 ＞500
表1在25℃下在水中胺基酸及其各別酮酸或其鹽之溶解度。使用飽和溶液及在紅外乾燥之後之殘餘質量測定來進行溶解度實驗。
已發現藉由用相應酮酸及/或其衍生物部分或完全取代白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及/或甲硫胺酸胺基酸，與在其他方面相同之細胞培養基相比，可改良乾粉或乾燥粒化之細胞培養基之溶解度而對細胞培養物之效能無負面作用。在一較佳實施例中，使用酮酸之鈉鹽，因為其通常展示最高溶解度。
適合之衍生物為金屬鹽衍生物、肽衍生物、酯衍生物以及其他衍生物。衍生物為酮酸衍生物且與相應胺基酸相比具有較高水溶性，且其在維持及/或支持細胞活體外生長之作用中在胞內協調回至相應胺基酸或可以其他方式取代相應胺基酸。
金屬鹽衍生物為最佳衍生物。此等為酮酸之金屬鹽，如鈉、鉀、鈣或鎂鹽，較佳為鈉鹽。
肽衍生物為其中一或多個，通常一個、兩個或三個胺基酸經由肽鍵連接於酮酸之衍生物。肽衍生物在此情況下係酮白胺酸之示意化學式展示於以下示意圖1中：
Figure 02_image021
示意圖1 其中R1 為胺基酸側鏈且R2 為經由肽鍵連接之另一胺基酸。
酯衍生物為其中酮酸形成之羧酸及烷基或芳基酯之衍生物。最佳為C1 至C4 烷基酯。酮-白胺酸酯衍生物之實例展示於示意圖2中：
Figure 02_image023
示意圖2 其中R2 為烷基或芳基，其中烷基可進一步經-OH或OR2 取代或例如形成醚或酯。
適合R2 之實例為甲基、乙基、異丙基、正丙基、正丁基、第三丁基、苯甲基以及
Figure 02_image025
其他衍生物展示於示意圖3中：
Figure 02_image027
示意圖3
展示用於酮白胺酸之以上實例可理所當然同等實現於來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸之群中的其他酮酸。
因此，本發明係關於乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，其包含來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物，較佳金屬鹽衍生物，最佳鈉鹽之群中的至少一種α酮酸。在一較佳實施例中，乾粉或乾燥粒化之細胞培養基包含4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸及/或α-酮異戊酸之鈉鹽，最佳所有三種酮酸之鈉鹽。
乾粉或乾燥粒化之細胞培養基中之酮酸之量使得在乾粉或乾燥粒化之細胞培養基溶解之後獲得的液體培養基中之各磺酸及/或其衍生物之濃度大於10mM、較佳在20mM與600mM之間、最佳在30mM與300mM之間。
在一個實施例中，包含如上文所定義之酮酸的乾粉或乾燥粒化之細胞培養基不包含相應胺基酸。在另一實施例中，包含如上文所定義之酮酸的乾粉或乾燥粒化之細胞培養基包含至多50%(mol%)之相應胺基酸。
為了使用乾粉或乾燥粒化之培養基，將溶劑，較佳水(最特定言之，蒸餾及/或去離子水或純化水或注射用水)或水性緩衝劑添加至培養基中且混合該等組分直至培養基完全溶解於溶劑中。
溶劑亦可包含提供適合pH範圍(通常pH在1.0與10.0之間，較佳在6.5與8.5之間的範圍內)之生理食鹽水、可溶性酸或鹼離子、穩定劑、界面活性劑、防腐劑及醇或其他極性有機溶劑。
亦可將其他物質，如用於調節pH之緩衝物質、胎牛血清、糖等添加至細胞培養基與溶劑之混合物中。隨後使所得液體細胞培養基與待生長或維持之細胞接觸。
儘管包含較高濃度之白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸之乾粉或乾燥粒化之培養基組合物當與溶劑混合時由於胺基酸之有限溶解度將展示渾濁，而使用相同濃度之相應酮酸及/或其衍生物之根據本發明之細胞培養基得到澄清溶液。此尤其適用於進料培養基。
包含酮酸及/或其衍生物之所得液體培養基在細胞培養物中展示至少相同效能。已發現胺基酸可經相應酮酸及/或衍生物，較佳其鹽完全取代。儘管如此，亦有可能僅部分取代胺基酸。在此情況下，較佳50%(mol%)或更多之胺基酸經相應酮酸及/或其衍生物取代。
在一些情況下，與經取代之胺基酸之量相比，可有利的係修改及尤其擴大酮酸之量。雖然對於異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之取代，1:1取代通常足夠，但已發現對於苯丙胺酸及甲硫胺酸通常較佳添加與胺基酸之量相比更多的酮酸。通常，1:1.1至1:3(按莫耳計)取代為適合的。
藉由較佳用相應酮酸及/或其衍生物(尤其藉由酮酸之鈉鹽)完全取代白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸，可擴大培養基之最大溶解度。如實例3中可見，乾粉培養基之溶解度可例如倍增。
除藉由取代如上所述之胺基酸改良乾粉或乾燥粒化之培養基之溶解度以外，亦已進一步意外地發現，當使用其中白胺酸及/或異白胺酸已經相應酮酸及/或其鹽替換之培養基時，細胞培養物之比產率擴大。
可進一步展示，使用其中白胺酸及/或異白胺酸已經相應酮酸及/或其鹽替換之培養基產生的IgG1之三個關鍵品質屬性在使用胺基酸之對照條件與經取代之條件之間未展示差異。三個關鍵品質屬性為糖基化模式、抗體聚集及片段化以及電荷變異體。
已進一步發現，酮酸及/或其衍生物，尤其白胺酸、異白胺酸及纈胺酸之酮酸及/或鹽，較佳4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸及/或其鹽適用於穩定液體細胞培養基調配物。包含該等組分之液體培養基當在室溫或4℃下在有或無曝光之情況下經三個月儲存時與不包含4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸及/或其鹽但具有相同量之相應胺基酸的培養基相比展示減少之顏色變化。其亦展示減少之沈澱。
當用相應酮酸及/或其衍生物取代相應胺基酸(例如異白胺酸及/或白胺酸)時，可達到此作用。其亦可在將相應酮酸，例如4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸及/或其衍生物添加至包含白胺酸及/或異白胺酸之細胞培養基調配物時達到。彼意謂酮酸及/或其衍生物可用作培養基穩定劑而與培養基組成無關。液體調配物中之適合濃度為至少20mM，較佳在30與600mM之間。
本發明之粉末狀細胞培養基較佳藉由混合所有組分且對其加以研磨來產生。組分之混合為熟習此項技術者已知藉由研磨產生乾粉細胞培養基。較佳地，充分混合所有組分以使得混合物之所有部分具有幾乎相同之組成。組合物之均一性愈高，所得培養基在均質細胞生長方面之品質愈佳。
研磨可藉由適合於產生粉末狀細胞培養基之任何類型之磨機進行。典型實例為球磨機、針磨機、菲茨磨機或噴射磨機。較佳為針磨機、菲茨磨機或噴射磨機，極佳為針磨機。
熟習此項技術者知曉如何運行此類磨機。
具有約40cm之圓盤直徑之大規模設備磨機例如在針磨機之情況下通常以每分鐘1-6500轉，較佳為每分鐘1至3000轉運行。
研磨可在標準研磨條件下進行，產生粒徑在10與300µm之間，最佳在25與120µm之間的粉末。
粒子之尺寸意謂粒子之直徑。粒子直徑藉由雷射光散射測定。使用此技術，粒徑報導為體積等效球體直徑。
粒徑範圍提供75%或更多，較佳90%或更多之粒子具有之粒徑範圍。此意謂若粒徑介於25與120µm之間，則至少75%之粒子具有25與120µm之間的粒徑。
較佳地，經受研磨之混合物之所有組分均為乾燥的。此意謂，若其包含水，則其僅包含結晶水但不超過10重量%、較佳不超過5重量%、最佳不超過2重量%之未結合或未配位水分子。
在一較佳實施例中，研磨在惰性氛圍中進行。較佳惰性保護氣體為氮氣。
在另一較佳實施例中，混合物之所有組分在研磨之前冷凍。可藉由確保將成分冷卻至低於0℃且最佳低於-20℃之溫度的任何手段來進行研磨之前的成分之冷凍。在一較佳實施例中，用液氮進行冷凍。此意謂該等成分例如藉由將液氮倒入在引入至磨機中之前儲存該等成分之容器中經液氮處理。在一較佳實施例中，容器為進料器。若容器為進料器，則液氮較佳在引入成分處之進料器之側面或接近於進料器之側面引入。
通常歷經2至20秒用液氮處理該等成分。
較佳地，成分之冷卻以使進入磨機中之所有成分處於低於0℃、最佳低於-20℃之溫度下的方式進行。
在一較佳實施例中，將所有成分置於容器中，混合物自該容器轉移於進料器中，最佳於計量螺旋進料器(metering screw feeder)中。在進料器中，成分有時視進料器之類型而進一步混合，且另外經冷卻。隨後將經冷凍之混合物自進料器轉移至磨機以使得在磨機中研磨之混合物較佳地仍具有低於0℃，更佳地低於-20℃之溫度。
通常摻合時間意謂成分之混合物在進料器中之滯留時間超過一分鐘，較佳在15與60分鐘之間。
計量螺旋進料器(亦稱為劑量螺)通常以每分鐘10至200轉，較佳地以每分鐘40至60轉之速度運作。
通常，將磨機之溫度保持在-50℃與+30℃之間。在一較佳實施例中，溫度保持約10℃。
研磨期間之氧含量較佳低於10%(v/v)。
該製程可例如分批地或持續地運行。在一較佳實施例中，根據本發明之製程藉由歷經一定時間將成分之混合物持久性裝填至進料器中用於冷卻且將來自進料器之經冷卻混合物持久性裝填至磨機中來持續進行。
本發明進一步關於用於培養細胞之方法，其係藉由以下步驟培養： a)  提供生物反應器 b)  提供液體細胞培養基，其包含來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群中的至少一種α酮酸，較佳濃度大於10mM c)  將待培養之細胞與該液體細胞培養基混合 d)  培育步驟b)之混合物。
在一較佳實施例中，細胞為CHO細胞。
在一個實施例中，步驟b)中所提供之液體細胞培養基為液體細胞培養基，其中異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸中之一或多者經選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸之群的相應酮酸及/或其衍生物部分或較佳完全取代。
在一較佳實施例中，藉由將根據本發明之乾粉或乾燥粒化之培養基溶解於如上文所描述之溶劑中來提供步驟b)之液體細胞培養基。
生物反應器為其中可培養細胞之任何容器或槽。培育通常在適合之條件(如適合之溫度等)下進行。熟習此項技術者知道用於支持或維持細胞生長/培養之適合的培育條件。
已發現，本發明亦極適合於製備進料培養基。由於特定胺基酸之可用性的限制，尤其在進料培養基所需之濃度中，進料培養基之濃度由於溶解度問題而受到限制。
因此，存在對在一種進料中且在高濃度下包含所有所需組分之進料培養基的需要。另外，進料之pH不應不利地影響細胞培養物，亦即液體進料之pH應低於8.5，較佳在6.5與7.8之間。
已發現藉由用相應酮酸及/或衍生物(較佳地其鹽)部分或較佳完全取代異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸，所得乾粉培養基之溶解度得以改良。此提供產生具有較高濃度之成分之液體培養基的可能性，以使得可以較小量之液體但仍在較佳低於8.5之適合pH下將相同量之成分添加至細胞培養物。可使用包含酮酸之較高濃縮之進料培養基，而對細胞生長及/或產率以及對液體培養基之穩定性無任何負面作用且有時甚至正面作用。
因此，本發明亦關於一種呈粉末狀培養基形式或在溶解之後呈液體培養基形式的進料培養基。
所得液體培養基包含選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸之群的至少一種酮酸及/或其衍生物，其濃度大於10mM、較佳在20與600mM之間且較佳具有8.5或更小之pH。
在一較佳實施例中，pH在6.7與8.4之間。
本發明亦關於一種用於在生物反應器中培養細胞之進料批式方法，其係藉由以下步驟培養： -    向生物反應器中裝填細胞及水性細胞培養基 -    在該生物反應器中培育該等細胞 -    在該生物反應器中培育細胞之整個時間內持續或在該培育時間內一次或若干次將細胞培養基添加至該生物反應器中，該細胞培養基在此情況下為進料培養基 其中該進料培養基較佳具有小於pH8.5之pH且包含選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸之群的至少一種酮酸及/或其衍生物。
較佳地，進料培養基包含濃度大於10mM，較佳在20與600mM之間的一或多種酮酸及/或其衍生物。較佳地，進料培養基包含4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸及/或α-酮異戊酸及/或其鹽，最佳為鈉鹽。通常，進料培養基包含50與400g/l之間的溶解於溶劑中之固體成分。
在一較佳實施例中，在本發明之方法中，在培育期間持續或在該時間內一次或若干次添加至生物反應器之進料培養基始終具有相同組成。在一較佳實施例中，細胞為CHO細胞。
然而，藉由以下圖式及實例進一步說明本發明，但不限於此。
上文及下文所引用之所有申請案、專利及公開案之全部揭示內容特此以引用之方式併入。
實例 以下實例表示本發明之實際應用。
實例 1 ： 在水中酮酸與其各別胺基酸相比具有提高之溶解度 經由製備飽和溶液，在25℃下在水中比較五個例示性胺基酸之最大溶解度與其各別酮酸或其鹽之溶解度。在沈積之後，使用紅外乾燥溶液(120℃，120分鐘)且以g/kg為單位測定殘餘質量。
如圖1中所示，在水中酮酸及其鹽之溶解度當與各別胺基酸之溶解度相比時顯著較高。為了排除溶解度提高係歸因於酮酸之鈉鹽形式，進行獨立實驗以比較Leu、Leu鈉鹽及酮Leu鈉鹽之溶解度。在水中所獲得之最大溶解度分別為22.1、86.0及313.7g/kg，表明如所預期，鈉鹽之形成已提高Leu之溶解度，但由酮酸獲得之溶解度提高顯著更重要，且因此並不可能僅由於鹽形式。
實例 2 ： 在 Ile 及 Leu 耗乏 之 4Feed 中與其各別胺基酸相比時酮酸之最大溶解度 將增加量之酮酸及其鹽添加至Ile及Leu耗乏之細胞培養進料調配物(Cellvento® 4Feed, MilliporeSigma)中。類似地，將增加量之Ile及Leu添加至相同進料調配物中作為對照組。此進料調配物之總濃度為125g/L且pH為7.0+/-0.2。在小規模實驗中，在每次添加胺基酸或酮酸之後，攪拌進料10分鐘且量測濁度。在室溫(25℃)下進行實驗。
發現在Ile/Leu耗乏之Cellvento® 4Feed中Ile之最大溶解度為大約105mM，而對於酮Ile，635mM之最大測試濃度仍可溶，其中濁度值低於5NTU(參見圖1)。此表明在Ile/Leu耗乏之4Feed中酮Ile之溶解度至少為Ile之6倍。
發現在Ile及Leu耗乏之Cellvento® 4Feed中Leu之最大溶解度為大約90mM，而對於酮Leu，最大可溶濃度(其中濁度值低於5NTU)為240mM(參見圖2)。此表明在Ile/Leu耗乏之4Feed中酮Leu之溶解度為Leu之2.6倍。
實例 3 ： 酮酸之使用使得細胞培養基調配物能夠在中性 pH 下濃縮。 藉由將增加量之進料乾粉培養基溶解於水中直至視覺上偵測到沈澱來測定Cellvento® 4Feed之最大溶解度。對於各條件，攪拌進料約30分鐘，將pH調節至7.0+/-0.2。且再攪拌溶液10分鐘用於平衡。量測重量莫耳滲透濃度及濁度(參見圖3)。資料表明此調配物之1.2倍濃縮物已不可溶，因為懸浮液中可偵測到粒子且濁度大大高於5NTU之限值。
由於已鑑別Ile及Leu為濃縮Cellvento® 4Feed調配物之第一限制性胺基酸，因此產生Ile及Leu耗乏之新主乾進料(4Feed-Ile/Leu)。在有或無補充有酮Leu及酮Ile之情況下此進料之最大濃度藉由將增加量之進料乾粉培養基溶解於水中直至視覺上偵測到沈澱來測定。對於各條件，攪拌進料約30分鐘，將pH調節至7.0+/-0.2。且再攪拌溶液10分鐘用於平衡。量測濁度且5NTU之限值視為可溶的。
結果表明Ile/Leu耗乏之Cellvento® 4Feed之最大溶解度為大約228g/L。在添加酮Leu及酮Ile後，獲得在216g/L與228g/L之間的耗乏之乾粉培養基之最大溶解度，該缺乏乾粉培養基補充有36g/L至38g/L之組合量的酮Leu及酮Ile(莫耳等效於該濃縮物中之理論量的Ile及Leu)，對於含有酮Leu及酮Ile之調配物得到總濃度為252g/L-266g/L。考慮到Cellvento® 4Feed之濃度為130g/L，此表示當Ile及Leu經酮Ile及酮Leu替換時，濃度增加100%。
資料表明有可能濃縮調配物直至至少2倍(265g/L)，因為懸浮液中未偵測到粒子且濁度低於5NTU(參見圖4)。
實例 4 ： Leu 及 Ile 之酮酸可使細胞培養基調配物穩定 比較含有Ile及Leu之進料(Cellvento® 4Feed)之穩定性與Ile/Leu耗乏且其中補充酮Leu或酮Ile之相同進料之穩定性。根據標準方案製備進料。最終pH為7.0+/-0.2且將進料儲存在4℃或室溫下避光或曝光。藉由量測介於300nm與600nm範圍內之吸光度(5nm之間隔)在90天期間監測調配物之顏色變化。藉由計算吸光度掃描(300nm-600nm)之基線校正之曲線下面積的隨時間推移(在D0與D90之間)之曲線下面積(AUC)來比較條件。
如圖5A中所展示，在對照條件中含有Ile及Leu之進料隨著溫度或曝光之升高變得更暗(AUC自350增加至7000)。在4℃下，當Leu經酮Leu替換時，AUC在避光及曝光條件中分別降低27%及8%。在室溫下，降低甚至更明顯，其中AUC在酮Leu條件中分別降低31%(避光)及37%(曝光)。此表明Leu經酮Leu替換可顯著減少隨時間推移之進料中觀測到之顏色變化。
針對酮Ile獲得之結果呈現於圖5B中。關於酮Leu，當Ile經酮Ile替換時觀測到AUC降低。在4℃下，AUC在避光及曝光條件中分別降低33%及68%。在室溫下，在避光條件中未發現降低，但在曝光條件下觀測到38%之降低，表明Ile經酮Ile替換可顯著減少隨時間推移之進料中觀測到之顏色變化。
總體而言，結果表明胺基酸經其酮酸或其鹽替換可引起穩定，使在曝光或不曝光之情況下在4℃或室溫下儲存3個月時顏色變化減少。
另外，當在進料中使用酮Leu而非Leu時，進料之沈澱受到延遲。為觀測沈澱，使50mL法爾康管返回以查看管底部上之可能沈積，且採集圖片。在4℃下，該等條件中無一者沈澱，但在室溫避光下，控制條件沈澱於D49與D70之間，而在含有酮Leu之條件中未觀測到沈澱。在室溫曝光下未觀測到沈澱之完全抑制，但在酮Leu條件中沈澱經延遲。儘管對於對照條件自D49處觀測到沈澱，但對於酮Leu條件初始沈澱出現在D70處。在接下來數天期間，在含有酮Leu之條件中，沈澱物之量以及沈澱物之色彩強度減少，表明在室溫曝光下酮Leu調配物之穩定性亦略微提高。
最後，與含有正常胺基酸之進料相比，在4℃或室溫下儲存含有酮酸之進料期間形成之銨離子之量減少。為了能夠評估在穩定性研究之整個時段內NH3 之形成，在3個月之時間範圍內計算NH3 濃度之AUC以比較條件。
酮Leu之結果呈現於圖6A中且當與對照條件相比時表明氨形成減少。當在4℃下將進料分別於避光及曝光下儲存時，與對照組相比，在酮Leu條件中產生10及19%較少氨。在室溫下，將進料分別於避光及曝光下儲存3個月時觀測到氨含量減少15及5%之相同趨勢。
對於酮Ile獲得類似結果(圖6B)且當與對照條件相比時表明氨形成減少。當在4℃下將進料分別於避光及曝光下儲存時，與對照組相比，在酮Ile條件中產生21及24%較少氨。在室溫下，將進料分別於避光及曝光下儲存3個月時觀測到氨含量減少28%及25%之相同趨勢。
實例 5 ： 酮 Ile 及酮 Leu 可替換進料中其各別胺基酸且提高比產率。產生 IgG1 之 CHOK1GS 純系之細胞培養結果。 對於細胞培養實驗，使用表現人類IgG1之CHOK1GS懸浮細胞株。使用50mL自旋管在起始培養物體積為30mL且接種密度為2×105 個細胞/mL的情況下，將細胞一式四份培養於Cellvento 4CHO培養基(Merck Darmstadt, Germany)中。在37℃、5%CO2 、80%濕度及320rpm之攪拌下進行培育。將酮酸添加於進料(Ile及leu耗乏之4Feed)中，而非其各別胺基酸。所有進料之pH為中性(pH7.0+/-0.2)。陽性對照含有正常胺基酸，而陰性對照含有各別胺基酸耗乏且不添加酮酸之進料。在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天按以下v/v比率(3、3、6、3及3%)進行進料。每日定量葡萄糖且使用400g/L葡萄糖溶液將其調節至6g/L。重複實驗至少3次。
用Vi-CELLXR(Beckman Coulter, Fullerton, CA)評估活細胞密度(VCD)及存活率。基於分光光度法及濁度法，使用Cedex Bio HT(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)監測代謝物濃度。在用AccQ•TagUltra®試劑套組衍生化後，胺基酸定量經由UPLC進行。根據供應商建議(Waters，Milford, MA)進行衍生化、層析及資料分析。
藉由將效價除以經校正積分VCD來計算每天每細胞的產率，以考慮由進料產生之稀釋度。總體比產率藉由計算效價與經校正積分VCD之間的線性回歸之斜率來測定。
當觀察活細胞密度時(圖7A)，兩種酮衍生物與對照組相比均引起最大VCD略微降低，但在第11天之後獲得之效價(圖7B)略微高於對照條件，表明整體較高之比產率(圖8)。進料耗乏Leu及Ile之陰性對照展示在第7天後VCD快速降低且最重要地，呈非常有限之IgG效價，表明Leu及Ile對支持藉由CHO細胞之IgG產生為關鍵的。
NH3 為在進料批式方法之製程中產生之非所需代謝物。與含有Leu及Ile的對照組相比，在酮Leu及酮Ile條件中在17天進料批式製程期間產生之NH3 的量顯著降低(圖9A)，表明相當大一部分氨由Leu及Ile之氧化去胺生成，或生物反應器培養基中酮酸之存在促進游離NH3 用作建構嵌段以經由胺化來生成胺基酸。
在消耗培養基中測定胺基酸之濃度。在Leu已用酮Leu替換之條件中，消耗培養基中Leu之濃度(圖9B)略微低於陽性對照(含有Leu及Ile)中Leu之濃度，但隨時間之演變展示進料日與後續日之間的濃度增加，表明Leu可極迅速地自酮Leu產生。在Ile經酮Ile替換之條件中(圖10A)，隨時間推移所偵測之Ile濃度顯著低於陽性對照中之Ile濃度，表明酮Ile至Ile之轉化緩慢或另一產物由培養物中之酮Ile形成。酮Ile條件與其中進料已耗乏Ile及Leu之陰性對照的比較表明，儘管如此在彼進料批式中Ile可自酮Ile產生。另外，對層析圖進行謹慎分析允許鑑別對應於別Ile的新峰(圖10B)，其隨時間增加。
將對照進料批式製程(含有Ile及Leu之進料)中所產生之抗體的品質與在Leu及Ile耗乏且補充有酮Leu或酮Ile之進料所產生之抗體的品質進行比較。
使用蛋白APhyTips®(PhyNexus Inc, San Jose, CA)自細胞培養上清液純化抗體。在衍生作用之後根據製造商說明書使用GlykoPrep®-plus Rapid N-Glycan樣品製備套組(Sample Preparation kit)與8-胺基芘-1,3,6-三磺酸三鈉(APTS)(Prozyme, Hayward, CA)藉由毛細管凝膠電泳與經雷射誘導之螢光(CGE-LIF)分析糖基化模式。簡言之，使純化抗體變性且固定，且藉由用N-Glycanase®消化，接著在50℃下用APTS標記60分鐘自抗體釋放聚糖。在移除剩餘APTS之清潔步驟之後，使用醫藥分析系統CESI8000 Plus(Pharmaceutical Analysis System CESI8000 Plus)(Sciex, Washington, USA)與LIF偵測器(Ex：488nm，Em：520nm)測定聚糖之相對量。在經聚乙烯醇塗佈之毛細管(總長度：50.2cm，內徑：50μm)中進行分離，且裝填有來自碳水化合物標記套組(Beckman Coulter, Brea, USA)之碳水化合物分離緩衝劑。首先在30psi下用分離緩衝劑沖洗毛細管表面3分鐘。每20個週期更換一次入口及出口緩衝劑小瓶。藉由在0.5psi下壓力注射12秒引入樣品隨後進行0.2分鐘之浸漬步驟以清潔毛細管頂端。最終在20kV下進行分離20min，其中0.17min勻變施加反向極性。峰係根據其個別遷移時間鑑別且根據以下參數整合：峰寬0.05、臨限值10,000及肩峰靈敏度(shoulder sensitivity)9,999。
使用尺寸排阻層析法在使用TSKgel SuperSW3000管柱(Tosoh Bioscience)之Water Acquity UPLC系統上量測抗體聚集及片段化。流動相為0.05M磷酸鈉、0.4M過氯酸鈉，pH為6.3，且流率為0.35mL/min。在IgG純化之後使用儲存緩衝劑將樣品濃度調節至1.0mg/mL且使用在214nm下之吸光度進行偵測。
根據製造商說明書使用cIEF在毛細電泳法CESI8000(Beckman Coulter/Sciex)上量測電荷變異體。在IgG純化之後使用儲存緩衝劑將樣品濃度調節至1.5mg/mL之濃度。在量測之前，將樣品與含有不同pH標記之主混合物、陰極/陽極穩定劑、3M尿素cIEF凝膠及Pharmalyte混合。
針對糖基化(圖11)、高及低分子量物種(圖12A)及電荷變異體(圖12B)獲得之結果表明在對照條件與Ile及Leu已與酮Ile及酮Leu交換之條件之間無差異，表明胺基酸交換對在此研究中產生之IgG1之3個關鍵品質屬性無影響。
實例 6 ： 用產生 IgG1 之 CHODG44 及 CHOK1 純系確認酮 Leu 效能。 本發明之技術對於不同生物過程之適用性藉由用其他類型之CHO細胞進行進料批式實驗來證明：針對酮Leu之CHODG44及CHOK1(非GS)作為一實例。DG44細胞株之結果(圖13)表明與對照組相比，針對酮Leu條件之較低VCD及略微較低IgG效價。然而，使用酮Leu之方法的整體比產率略微增加。消耗培養基資料展示對於此細胞株而言，酮Leu條件中之Leu濃度亦幾乎類似於對照組中之Leu濃度，證實Leu在彼細胞株中同樣可自酮Leu非常快地產生。
圖13：與表現IgG1之CHODG44細胞株之對照組相比，含有酮Leu之製程之效能。
圖14：與表現IgG1之CHOK1非GS細胞株之對照組相比，含有酮Leu之製程之效能。實例 7 ：在具有不同接種密度及不同 leu / 酮 Leu 比率之批料中之效能 用具有酮Ile及酮Leu之3種不同CHO細胞株獲得之進料批式培養基結果表明自酮酸形成Ile、別Ile及Leu極其快速。此表明亦可使用酮酸提高批料及灌注培養基之溶解度，因為其可能易於自培養開始時獲得。為證實此適用於CHO系統，酮Leu或酮Ile分別用作細胞培養基(Cellvento® 4CHO)中之Leu及Ile的替換。產生Leu/Ile耗乏形式之調配物且使用等莫耳濃度之酮Leu與Leu及酮Ile與Ile(圖15)。在連續繼代實驗中經數週監測CHOK1GS細胞株之細胞生長及存活率，以確保生長並非歸因於殘餘量之Leu或Ile。設計接種密度為20萬個細胞/mL之批式實驗且隨時間推移量測IgG產量。使用消耗培養基中之胺基酸定量，隨時間跟蹤胺基酸之產生。
以類似方式，在含有不同比率之Leu/酮Leu的培養基中進行具有較高細胞接種密度之批式實驗以理解當以較高細胞密度起始時何比率為較佳的(圖16)。所用分析與上文所描述相同。
連續繼代之結果表明CHOK1GS細胞無法在Ile及Leu耗乏之培養基中生長，因為在培養最初幾天期間未觀測到生長且存活率極顯著降低。相比之下，當Leu或Ile經其相應酮酸替換時，觀測到連續生長。總體而言，各繼代所觀測到之最大活細胞密度略低於含有Ile及Leu之對照條件，表明與對照條件相比，可能需要少量Leu及Ile來獲得類似效能。此量可藉由測試含有不同比率之Ile/Leu及酮Ile/酮Leu的培養基以實驗方式極容易測定。
在批式實驗中，對照條件與酮Leu條件之間的效能相當，表明CHOK1GS細胞可在Leu經莫耳等效之酮Leu替換時生長(圖15A)。在彼條件下，在第7天及第10天偵測到類似量之IgG(圖15B)。相比之下，當Ile經酮Ile替換時，第5天後之生長及IgG濃度略微減弱，表明在批式條件中與對照組相比，可能需要少量Ile來獲得類似的生長及效價。此量可藉由測試含有不同比率之Ile與酮Ile的培養基以實驗方式極容易測定。可替代地，可測試與Ile濃度相比較高的莫耳酮類Ile濃度。
可藉由觀察消耗培養基中之Ile、別Ile及Leu之形成來解釋酮Ile與酮Leu之效能之間的差異。在第3天以Leu形式偵測到34%之初始酮Leu濃度，在第3天以Ile形式僅偵測到21%之初始酮Ile濃度。另外，在至多第10天以別Ile形式偵測到35%之初始酮Ile濃度。此表明由於別Ile之伴隨形成可能不用於與Ile經細胞相同之延伸，因此經細胞之酮Leu至Leu之胺化比酮Ile至Ile之胺化更有效。
最後，進行具有較高細胞密度之批式實驗以確定當以高接種密度開始時酮Leu是否易於獲得或最小濃度之自由白胺酸是否必須存在以支持在此等條件下之生長及產率。對於此實驗，在含有0、25、50、75或100%酮Leu之培養基中以0.3、0.6或1.10^6個細胞/mL接種CHOK1GS細胞株，剩餘部分以白胺酸形式添加。
結果表明正如所預期生長及效價隨接種密度增加而增加。在不同比率之酮Leu/Leu之間，在100%酮leu交換的情況下觀測到最大VCD，其中最高接種密度為1.10^6個細胞/mL。當細胞以0.6.10^6個細胞/mL及0.3.10^6個細胞/mL接種時，對於酮Leu:leu比率為1:1(50%之酮Leu及50%之Leu)，觀測到最高VCD。關於效價，對於以0.3及1.10^6個細胞/mL接種，發現無顯著差異，而對於以0.6.10^6個細胞/mL接種，在leu/酮Leu比率較高之情況下，發現隨著IgG濃度增加略有傾向。此差異可能並非顯著的。
實例 8 . 其他酮酸相對於其各別胺基酸在 FB 培養物中之效能 已測試其他酮酸作為其各別胺基酸在FB實驗中之替換。當在進料中Val經酮Val替換時，與Ile及Leu相比，觀測到極類似特性(圖17)。實際上，與陽性對照相比觀測到類似VCD及效價，而Val耗乏之進料導致VCD之急劇降低以及在第7天之後的極低效價。當使用酮酸時NH3 濃度亦較低表明對於Val在進料批式培養期間各別酮酸之使用亦可產生較少NH3 。總體而言，此表明作為分支鏈酮酸之成員的酮Val最可能展現與酮Leu及酮Ile相同的特性且可能在細胞培養物中極快速地胺化。由於與酮Ile及酮Leu具有結構相似性，所以酮Val對總體進料濃度及進料穩定性之作用與其他分支鏈酮酸類似。當與Val相比時，在水中確認6倍高溶解度。
對於苯丙胺酸(Phe)及其各別酮酸苯丙酮酸(圖18)，在細胞培養物中建構Phe之胺化反應似乎比分支鏈酮酸發生之胺化反應更慢。實際上，當用等效莫耳濃度之苯丙酮酸替換Phe時，消耗培養基資料已證實儘管與陰性對照組(Phe耗乏之進料)相比，在上清液中發現更多Phe，但所形成之量不足以支持與對照條件中相同之生長及效價。在第5天之後觀測到顯著較低VCD且觀測到效價最終降低20%。在彼結果之後，使用2倍莫耳等效之Phe的條件作為進料中苯丙酮酸之濃度。結果表明，苯丙酮酸之量的增加可恢復消耗培養基中之VCD、效價以及極類似量之Phe。此等資料證實Phe亦可由其酮酸替換，但可能需要濃度調節以解決胺化反應之較慢步調問題。
圖1展示在Ile及Leu耗乏之Cellvento® 4Feed調配物(125 g/L，pH 7.0+/-0.2)中Ile或酮Ile之最大溶解度的測定。濁度低於5 NTU之溶液視為可溶的。
圖2展示在Ile及Leu耗乏之Cellvento® 4Feed調配物(125 g/L，pH 7.0+/-0.2)中Leu或酮Leu最大溶解度的測定。濁度低於5 NTU之溶液視為可溶的。關於圖1及圖2之其他資訊可見於實例2中。
圖3展示在pH 7.0下Cellvento® 4Feed之溶解限度。使用濁度計量測濁度。其他細節可見於實例3中。
圖4展示在pH 7.0下已用酮Ile及酮Leu替換Ile及Leu之經改質之4Feed調配物之溶解限度。使用濁度計量測濁度。其他細節可見於實例3中。
圖5A展示含有Leu之對照進料及Leu耗乏且用等莫耳濃度之酮Leu替換之測試進料在300與600 nm之間的吸光度之基線校正之曲線下面積隨時間推移(D0至D90)之AUC。
圖5B展示含有異白胺酸之對照進料及ile耗乏且用等莫耳濃度之酮Ile替換之測試進料在300與600 nm之間的吸光度之基線校正之曲線下面積隨時間推移(D0至D90)之AUC。細節可見於實例4中。
圖6A展示與對照組相比，在含有酮Leu之進料中所量測之NH3 濃度的曲線下面積(D0至D90)。將進料儲存在4℃及室溫下且避光或曝光3個月。
圖6B展示與對照組相比，在含有酮Ile之進料中所量測之NH3 濃度的曲線下面積(D0至D90)。將進料儲存在4℃及室溫下且避光或曝光3個月。細節可見於實例4中。
圖7A：經17天進料批式製程之VCD，其中酮Leu或酮Ile分別替換進料中之Leu及Ile。耗乏之4Feed為陰性對照組且不含任何Leu或Ile。
圖7B：經17天進料批式製程之IgG，其中酮Leu或酮Ile分別替換進料中之Leu及Ile。細節可見於實例5中。
圖8：17天進料批式製程之平均比產率，其中酮Leu或酮Ile分別替換進料中之Leu及Ile。
圖9A：在17天進料批式製程期間之NH3 產量，其中酮Leu或酮Ile分別替換進料中之Leu及Ile。
圖9B：在17天進料批式製程期間消耗培養基中之Leu定量，其中酮Leu或酮Ile分別替換進料中之Leu及Ile。
圖10A：在17天進料批式製程期間消耗培養基中之Ile定量，其中酮Leu或酮Ile分別替換進料中之Leu及Ile。
圖10B：在17天進料批式製程期間消耗培養基中之別Ile定量，其中酮Ile替換進料中之Ile。其他細節可見於實例5中。
圖11：使用在對照製程中或在其中Ile/Leu耗乏且補充有酮Leu或酮Ile之進料之製程中產生之IgG1的糖基化。使用APTS標記及CGE-LIF偵測測定糖型分佈。
圖12A：使用在對照製程中或在其中Ile/Leu耗乏且補充有酮Leu或酮Ile之進料之製程中產生之IgG1的聚集及片段化。使用尺寸排除層析法測定高分子量(HMW)及低分子量(LMW)物種。
圖12B：使用在對照製程中或在其中Ile/Leu耗乏且補充有酮Leu或酮Ile之進料之製程中產生之IgG1的電荷變異體。在毛細電泳法CESI 8000 (Capillary Electrophoresis CESI 8000)上使用cIEF測定電荷變異體分佈。其他細節可見於實例5中。
圖13：與表現IgG1之CHODG44細胞株之對照組相比，含有酮Leu之製程之效能。
圖14：與表現IgG1之CHOK1非GS細胞株之對照組相比，含有酮Leu之製程之效能。其他細節可見於實例6中。
圖15A：用在含有Leu及Ile之培養基(對照組)或其中Ile或Leu已經其等莫耳濃度之酮Ile或酮Leu替換之培養基中培養之CHOK1GS細胞株的批式實驗。接種密度為20萬個細胞/mL，使用Vi-CELL XR量測VCD。
圖15B：在批式實驗期間量測之IgG濃度。使用Cedex Bio HT(Roche)上之濁度分析量測IgG。其他細節可見於實例7中。
圖16：具有較高接種密度及不同Leu/酮Leu比率之批式實驗。量測VCD及效價以及在消耗培養基中釋放之白胺酸。其他細節可見於實例7中。
圖17：在進料中經酮Val替換Val。量測VCD及效價以及消耗培養基中之釋放之Val及NH3 濃度。其他細節可見於實例8中。
圖18：與Phe相比具有相同莫耳濃度(1×)或兩倍濃度(2×)之進料中之Phe經苯丙酮酸之替換。量測VCD及效價以及消耗培養基中所釋放之Phe濃度。其他細節可見於實例8中。

Claims (13)

  1. 一種乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，其包含來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群中的至少一種α酮酸。
  2. 如請求項1之乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，其中來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群中的該一或多種α酮酸以以下量存在，該量使得在溶解該乾粉或乾燥粒化之細胞培養基之後獲得的液體培養基中之該等α酮酸中之每一者的濃度大於10mM。
  3. 如請求項1之乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，其中該乾粉或乾燥粒化之細胞培養基不包含相應胺基酸。
  4. 如請求項1之乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，其中該培養基包含來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸之群中的該等α酮酸中之一或多者之鈉鹽。
  5. 如請求項1至4中之一或多項之乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，其中該乾粉或乾燥粒化之細胞培養基包含該等α酮酸之鈉鹽中之一或多者，該等α酮酸係選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸及/或α-酮異戊酸。
  6. 一種用於產生如請求項1至5中之一或多項之乾粉細胞培養基之方法，其係藉由以下步驟產生： a)  將來自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群中的至少一種α酮酸與該細胞培養基之其他組分混合 b)  對步驟a)之混合物進行研磨。
  7. 一種用於培養細胞之方法，其係藉由以下步驟培養： a)  提供生物反應器 b)  將待培養之該等細胞與藉由將如請求項1至5中之一或多項之乾粉或乾燥粒化之培養基溶解於溶劑中所製備之液體細胞培養基混合 c)  培育步驟b)之混合物。
  8. 一種用於在生物反應器中培養細胞之進料批式方法，其係藉由以下步驟培養： 向生物反應器中裝填細胞及水性細胞培養基 在該生物反應器中培育該等細胞 在該生物反應器中培育該等細胞之整個時間內持續或在該培育時間內一次或若干次將細胞培養基添加至該生物反應器中，該細胞培養基在此情況下為進料培養基 其中該進料培養基係藉由將如請求項1至5中之一或多項之乾粉或乾燥粒化之培養基溶解於溶劑中來製備。
  9. 如請求項8之進料批式方法，其中該進料培養基至少包含濃度在12與600mmol/l之間的4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸及/或其鹽。
  10. 一種用於穩定液體細胞培養基之方法，其包含在該培養基中包括至少20mM 4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及/或α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物，且藉此與缺乏該4-甲基-2-側氧基戊酸及/或3-甲基-2-側氧基戊酸及/或其衍生物或其中該4-甲基-2-側氧基戊酸及/或3-甲基-2-側氧基戊酸及/或其衍生物已經相應胺基酸及/或其衍生物取代之其他方面組成相同之培養基相比，在4℃下或室溫下儲存超過90天後，所得培養基顯示較少顏色變化及/或較少沈澱。
  11. 一種用於改良乾粉或乾燥粒化之細胞培養基之溶解度的方法，其係藉由用選自4-甲基-2-側氧基戊酸、3-甲基-2-側氧基戊酸、α-酮異戊酸、苯丙酮酸及α酮γ甲基硫代丁酸及/或其衍生物之群的相應酮酸完全或部分地取代異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸胺基酸中之一或多者來改良。
  12. 如請求項11之方法，其中至少50%(莫耳比)之各別胺基酸經相應α酮酸及/或其衍生物取代。
  13. 如請求項11或12之方法，其中該方法涉及提供與原始組合物相比，其中至少50%(莫耳比)之各別胺基酸經相應α酮酸及/或其衍生物取代的該乾粉或乾燥粒化之細胞培養基，且將該培養基溶解於溶劑中，藉此與其中該等胺基酸未經取代之其他方面組成相同之原始組合物之培養基相比，溶解發生較快及/或在較少該溶劑中發生。
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