CN113677787A - 包含酮酸的细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含α酮酸的细胞培养基。一些氨基酸(如异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)的不良溶解度可以通过用相应的α酮酸替代它们来克服。
Description
本发明涉及包含α酮酸的细胞培养基。一些氨基酸(如异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)的不良溶解度可以通过用相应的α酮酸替代它们来克服。
细胞培养基支持和维持细胞在人工环境中的生长。
根据其生长将得到支持的生物体的类型，细胞培养基包含组分(有时多于100种不同的组分)的复杂混合物。
哺乳动物、昆虫或植物细胞繁殖所需的细胞培养基通常比支持细菌和酵母生长的培养基复杂得多。
开发的第一种细胞培养基由未定义的组分组成，例如血浆、血清、胚胎提取物或其它未定义的生物提取物或蛋白胨。因此，随着化学限定的培养基的发展取得了重大进展。化学限定的培养基通常包含但不排他地限于氨基酸、维生素、金属盐、抗氧化剂、螯合剂、生长因子、缓冲液、激素和本领域技术人员已知的许多更多的物质。
一些细胞培养基以无菌水性液体提供。液体细胞培养基的缺点是它们的保存期限缩短，并且运输和储存困难。因此，目前许多细胞培养基以细磨的干粉末混合物形式提供。它们被制造用于溶解在水和/或水性溶液中的目的，并且在溶解状态下通常与其它补充剂一起被设计用于为细胞供应用于从所述细胞生长和/或生产生物药物的大量营养基。
许多生物药物生产平台基于补料分批细胞培养方案。目地通常是开发高滴度细胞培养方法以满足日益增长的市场需求并降低制造成本。除了使用高效重组细胞系之外，需要改进细胞培养基和方法参数以实现最大生产潜力。
在补料分批方法中，基础培养基支持初始生长和生产，并且补料培养基防止营养物的耗尽并维持生产期。选择培养基以适应不同生产阶段期间的不同代谢需求。方法参数设置(包括补料策略和控制参数)定义了适于细胞生长和蛋白质生产的化学和物理环境。
补料培养基的优化是补料分批方法优化中的主要方面。
大部分补料培养基是高度浓缩的，以避免生物反应器中重组蛋白的稀释。营养物的受控加入直接影响培养物的生长速率、存活力以及滴度。
而且在其它细胞培养方法(如分批方法或灌注方法)中，需要精确组成的且通常高度浓缩的培养基制剂。特别是在灌注方法中，生物反应器中培养基的持续交换需要操作者准备和处理大量液体培养基。为了减少储存这些体积所必需的占地面积，需要浓缩培养基。
由干粉末制备细胞培养基的限制因素是一些组分(特别是一些氨基酸)的不良溶解度或稳定性。
因此，找到提供充分溶解以产生高度浓缩的液体培养基组合物的干粉末培养基组合物的方法将是有利的。
已经发现，可以使用相应的α酮酸替代氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，而没有任何负面作用，并且有时甚至对细胞生长具有正面作用，并具有改进的溶解度。
进一步发现那些酮酸甚至对液体细胞培养基制剂具有稳定作用。
在1959年，在涉及氨基酸代谢的论文中，指出一些氨基酸可以被它们的酮酸替代(Eagle H: Amino acid metabolism in mammalian cell cultures. Science 1959, 130(3373):432-437.)。但是从未注意到，某些酮酸可以用作高效细胞培养中的氨基酸替代物，并且它们适于克服一些氨基酸的溶解度和稳定性问题。
因此，本发明涉及干粉末或干的颗粒状细胞培养基，其包含选自4-甲基-2-氧代戊酸(酮基Leu)、3-甲基-2-氧代戊酸(酮基Ile)、α-酮基异戊酸(酮基Val)、苯丙酮酸(酮基Phe)和α-酮基γ-甲硫基丁酸(酮基Met)和/或其衍生物的至少一种α酮酸，其量使得在溶解所述干粉末或干的颗粒状细胞培养基后获得的液体培养基中每种酮酸和/或其衍生物的浓度高于10 mM，优选在20-600 mM之间，最优选在30-300 mM之间。通常每种酮酸以不同的浓度存在，由此通常4-甲基-2-氧代戊酸(酮基Leu)、3-甲基-2-氧代戊酸(酮基Ile)、α-酮基异戊酸(酮基Val)和苯丙酮酸(酮基Phe)和/或其衍生物以高于50 mM的较高浓度存在，由此α-酮基γ-甲硫基丁酸(酮基Met)通常以较低浓度存在，通常在10-30 mM之间。
在优选的实施方案中，如果所述干粉末或干的颗粒状细胞培养基是补料培养基，则与酮酸和/或衍生物相比，其包含少于30 摩尔%的相应的氨基酸。这意味着两种化合物的摩尔比小于3:10。
在另一个实施方案中，干粉末或干的颗粒状细胞培养物补料培养基不包含相应的氨基酸。
对于其它培养基(如灌注培养基或(补料)分批基础培养基)，在培养基制剂中具有氨基酸和相应的酮酸和/或其衍生物两者可能是有利的。
在另一个实施方案中，干粉末或干的颗粒状细胞培养基包含两种或更多种α酮酸和/或其衍生物。
在优选的实施方案中，干粉末或干的颗粒状细胞培养基包含一种或多种以上所列的α酮酸的钠盐。
在优选的实施方案中，干粉末或干的颗粒状细胞培养基包含一种或多种选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸和/或其盐(优选其钠盐)的α酮酸。
本发明进一步涉及用于稳定液体细胞培养基的方法，其包含在培养基中包括至少20 mM(优选在30-600 mM之间)的一种或多种α酮酸，所述α酮酸选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸和/或其衍生物，优选4-甲基-2-氧代戊酸和/或3-甲基-2-氧代戊酸和/或α-酮基异戊酸和/或其衍生物，并且由此与其它方面相同组成但缺乏酮酸和/或其衍生物或其中酮酸和/或其衍生物已被相应的氨基酸和/或其衍生物替代的培养基相比，所得培养基在4℃或室温下储存90天后显示较少的颜色变化和/或较少的沉淀。
本发明进一步涉及改进限定组成的干粉末或干的颗粒状细胞培养基的溶解度的方法，通过用选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的相应的酮酸完全或部分替代氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种。
在优选的实施方案中，至少50%(更优选70%，最优选至少90%) (摩尔比)的相应的氨基酸被相应的α酮酸和/或其衍生物替代。
在这种情况下，替代是指向培养基中加入至少80摩尔%(通常约100摩尔%)的相应的酮酸和/或其衍生物代替给定量的氨基酸。优选将100-150 摩尔%之间的相应的酮酸和/或其衍生物加入到培养基中。
在优选的实施方案中，所述方法包括提供干粉末或干的颗粒状细胞培养基，其中如以上解释的，氨基酸已被替代，并且溶解所述培养基，由此与其中氨基酸未被替代的其它方面相同组成的培养基相比，溶解发生得更快和/或发生在更少的液体中。
在另一个优选的实施方案中，将干粉末或干的颗粒状培养基溶解，以得到pH为8.5或更低的液体培养基。
在优选的实施方案中，将其溶解以得到pH在6.5-8.5之间，最优选在6.7-7.8之间的液体培养基。
在一个实施方案中，其溶解度改进的干粉末或干的颗粒状细胞培养基包含至少一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲液组分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分。
在另一个实施方案中，将其溶解度改进的干粉末或干的颗粒状细胞培养基溶解，以得到液体培养基，其包含50-400 g/L之间(优选100-300 g/L之间)的固体成分，将所述固体成分溶解于溶剂中，和/或每种酮酸和/或其盐的浓度高于10 mM，优选在30-600 mM之间。
本发明进一步涉及用于生产根据本发明的干粉末细胞培养基的方法，通过
a)将选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物中的至少一种α酮酸与细胞培养基的其它组分混合
b)使步骤a)的混合物经历研磨。
在优选的实施方案中，步骤b)在针磨机、菲茨磨机或喷射磨机中进行。
在另一个优选的实施方案中，在研磨之前将来自步骤a)的混合物冷却至低于0℃的温度。
本发明进一步涉及用于培养细胞的方法，通过
a)提供生物反应器
b)将待培养的细胞与液体细胞培养基混合，其中氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种被选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的相应的酮酸部分或完全替代
c)孵育步骤b)的混合物。
在优选的实施方案中，液体细胞培养基包含以大于10 mM的浓度存在的每种酮酸和/或其衍生物。
本发明还涉及用于在生物反应器中培养细胞的补料分批方法，通过
-将细胞和水性细胞培养基填充到生物反应器中
-在生物反应器中孵育细胞
-在生物反应器中细胞的整个孵育时间内连续地或在所述孵育时间内一次或数次地向生物反应器中加入细胞培养基(在这种情况下是补料培养基)
由此所述补料培养基的pH小于pH 8.5，并且包含至少一种选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的α酮酸。
优选地，补料培养基包含至少4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸和/或其盐，其各自的浓度在20-600 mmol/l之间，优选在20-400 mmol/l之间。
本发明进一步涉及用液体细胞培养基的灌注方法，其中氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种被选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的相应的酮酸部分或完全替代。
图1显示在耗尽Ile和Leu的Cellvento® 4Feed制剂(125 g/L，pH 7.0 +/- 0.2)中Ile或酮基Ile的最大溶解度的确定。浊度低于5 NTU的溶液被认为是可溶的。
图2显示在耗尽Ile和Leu的Cellvento® 4Feed制剂(125 g/L，pH 7.0 +/- 0.2)中Leu或酮基Leu的最大溶解度的确定。浊度低于5 NTU的溶液被认为是可溶的。关于图1和图2的进一步信息可以在实施例2中找到。
图3显示在pH 7.0下Cellvento® 4Feed的溶解度极限。用浊度计测量浊度。进一步的细节可以在实施例3中找到。
图4显示在pH 7.0下，其中Ile和Leu已被酮基Ile和酮基Leu替代的修饰的4Feed制剂的溶解度极限。用浊度计测量浊度。进一步的细节可以在实施例3中找到。
图5A显示对于含有Leu的对照补料和Leu耗尽且用等摩尔浓度的酮基Leu替代的测试补料，在300-600 nm之间的吸光度的基线校正的曲线下面积随时间(D0至D90)的AUC。
图5B显示对于含有异亮氨酸的对照补料和ile耗尽且用等摩尔浓度的酮基Ile替代的测试补料，在300-600 nm之间的吸光度的基线校正的曲线下面积随时间(D0至D90)的AUC。细节可以在实施例4中找到。
图6A显示与对照相比，在含有酮基Leu的补料中测量的NH3浓度的曲线下面积(D0至D90)。将补料在4℃和室温下储存，并且保护或暴露于光3个月。
图6B显示与对照相比，在含有酮体Ile的补料中测量的NH3浓度的曲线下面积(D0至D90)。将补料在4℃和室温下储存，并且保护或暴露于光3个月。细节可以在实施例4中找到。
图7A：在17天补料分批方法中，用酮基Leu或酮基Ile分别替代补料中的Leu和Ile的VCD。耗尽的4Feed是负对照并且不含任何Leu或Ile。
图7B：在17天补料分批方法中，用酮基Leu或酮基Ile分别替代补料中的Leu和Ile产生的IgG。细节可以在实施例5中找到。
图8：17天补料分批方法的平均比生产率，用酮基Leu或酮基Ile分别替代补料中的Leu和Ile。
图9A：在17天补料分批方法期间，用酮基Leu或酮基Ile分别替代补料中的Leu和Ile的NH3生产。
图9B：在17天补料分批方法期间，用酮基Leu或酮基Ile分别替代补料中的Leu和Ile，用过的培养基中的Leu定量。
图10A：在17天补料分批方法期间，用酮基Leu或酮基Ile分别替代补料中的Leu和Ile，用过的培养基中的Ile定量。
图10B：在17天补料分批方法期间，用酮基Ile替代补料中的Ile，用过的培养基中的allo-Ile定量。进一步的细节可以在实施例5中找到。
图11：在对照方法中或在其中使用耗尽Ile/Leu并补充有酮基Leu或酮基Ile的补料的方法中产生的IgG1的糖基化。使用APTS标记和CGE-LIF检测来确定糖形分布。
图12A：在对照方法中或在其中使用耗尽Ile/Leu并补充有酮基Leu或酮基Ile的补料的方法中产生的IgG1的聚集和片段化。使用尺寸排阻色谱法确定高分子量(HMW)和低分子量物类(LMW)。
图12B：在对照方法中或在其中使用耗尽Ile/Leu并补充有酮基Leu或酮基Ile的补料的方法中产生的IgG1的进料变化。使用cIEF在毛细管电泳CESI 8000上确定进料变化分布。进一步的细节可以在实施例5中找到。
图13：对于表达IgG1的CHODG44细胞系，与对照相比，含有酮基Leu的方法的性能。
图14：对于表达IgG1的CHOK1非GS细胞系，与对照相比，含有酮基Leu的方法的性能。进一步的细节可以在实施例6中找到。
图15A：用CHOK1GS细胞系进行分批实验，所述细胞系在含有Leu和Ile的培养基(对照)中或其中Ile或Leu已被其等摩尔浓度的酮基Ile或酮基Leu替代的培养基中培养。接种密度为0.2×106个细胞/mL，使用Vi-CELL XR测量VCD。
图15B：在分批实验期间测量的IgG浓度。使用浊度测定在Cedex Bio HT (Roche)上测量IgG。进一步的细节可以在实施例7中找到。
图16：使用较高的接种密度和不同的Leu/酮基Leu比的分批实验。测量VCD和滴度以及在用过的培养基中释放的亮氨酸。进一步的细节可以在实施例7中找到。
图17：在补料中用酮基Val替代Val。测量VCD和滴度以及在用过的培养基中释放的Val和NH3浓度。进一步的细节可以在实施例8中找到。
图18：在补料中用苯丙酮酸盐替代Phe，具有相同的摩尔浓度(1x)或与Phe相比为两倍浓度(2x)。测量VCD和滴度以及在用过的培养基中释放的Phe浓度。进一步的细节可以在实施例8中找到。
根据本发明的细胞培养基是维持和/或支持细胞体外生长的组分的任何混合物。它可以是复杂的培养基或化学限定的培养基。细胞培养基可以包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分或仅一些组分，使得单独地加入另外的组分。根据本发明的细胞培养基的实例是完全培养基，其包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分以及培养基补充剂或补料。在优选的实施方案中，细胞培养基是完全培养基、灌注培养基或补料培养基。完全培养基也称为基础培养基，其pH通常在6.7-7.8之间。优选补料培养基的pH低于8.5。
通常，根据本发明的细胞培养基用于维持和/或支持生物反应器中细胞的生长。
补料或补料培养基是细胞培养基，其不是支持细胞培养物中的初始生长和生产的基础培养基，而是在后期阶段加入的培养基，以防止营养物的耗尽并维持生产阶段。与基础培养基相比，补料培养基可以具有更高浓度的一些组分。例如，一些组分(例如包括氨基酸或碳水化合物的营养物)可以以基础培养基中约5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100x、200X、400X、600X、800X或甚至约1000X的浓度存在于补料培养基中。
哺乳动物细胞培养基是维持和/或支持哺乳动物细胞体外生长的组分的混合物。哺乳动物细胞的实例是人或动物细胞，优选CHO细胞、COS细胞、I VERO细胞、BHK细胞、AK-1细胞、SP2/0细胞、L5.1细胞、杂交瘤细胞或人细胞。
化学限定的细胞培养基是不包含任何化学未限定的物质的细胞培养基。这意味着培养基中使用的所有化学品的化学组成是已知的。化学限定的培养基不包含任何酵母、动物或植物组织；它们不包含补料器细胞、血清、水解产物、提取物或消化物或其它不良限定的组分。化学上未限定的或不良限定的化学组分是其化学组成和结构未知的那些，以不同的组成存在或仅可以用巨大的实验努力来限定，与蛋白质(如胰岛素、白蛋白或酪蛋白)的化学组成和结构的评价相当。
粉末化的细胞培养基或干粉末培养基是通常由研磨方法或冷冻干燥方法产生的细胞培养基。这意味着粉末化的细胞培养基是颗粒状的、微粒状的培养基，而不是液体培养基。术语“干粉末”可以与术语“粉末”互换使用；然而，本文所用的“干粉末”仅指颗粒状材料的总体外观，而不旨在是指该材料完全不含复合的或附聚的溶剂，除非另有说明。
干的颗粒状培养基是由湿法或干法制粒方法得到的干的培养基。优选地，它是由干粉末培养基的碾压产生的培养基。本文所用的术语“干的”简单地指颗粒状材料的总体外观，并且不旨在是指该材料完全不含复合的或附聚的溶剂，除非另有说明。
待用根据本发明的培养基培养的细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)或真核细胞(如植物或动物细胞)。细胞可以是正常细胞、永生化细胞、患病细胞、转化细胞、突变细胞、体细胞、生殖细胞、干细胞、前体细胞或胚胎细胞，其中任何一种都可以是建立的或转化的细胞系或从天然来源获得。
颗粒的尺寸是指颗粒的平均直径。粒径通过激光散射(Mastersizer 3000，Malvern)确定。
优选通过目视或分光确定液体细胞培养基的颜色变化。
通过目视或浊度方法可以确定沉淀。
通过用惰性气体填充相应的容器或设备产生惰性气氛。合适的惰性气体是稀有气体，如氩气或优选氮气。这些惰性气体是非反应性的，并且防止发生不期望的化学反应。在根据本发明的方法中，产生惰性气氛意味着例如通过引入液氮或氮气将氧浓度降低低于10% (v/v)绝对值。
不同类型的磨机对于本领域技术人员是已知的。
针磨机(也称为离心冲击式磨机)粉碎固体，由此高速旋转圆盘上的突出的针提供断裂能。例如，针磨机例如由Munson Machinery (USA)、Premium Pulman (印度)或Sturtevant (USA)出售。
喷射磨机使用压缩气体来加速颗粒，引起它们在处理室中彼此撞击。喷射磨机例如由Sturtevant (USA)或PMT (奥地利)出售。
由Fitzpatrick (USA)商业化的菲茨磨机使用带有叶片的转子进行研磨。
连续进行的方法是不分批进行的方法。如果研磨方法连续进行，则意味着培养基成分在一定时间内永久且稳定地补料到磨机中。
根据本发明的细胞培养基(尤其是完全培养基)通常包含至少一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲液组分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分。
培养基也可以包含丙酮酸钠、胰岛素、植物蛋白、脂肪酸和/或脂肪酸衍生物和/或普朗尼克酸和/或表面活性组分(如化学制备的非离子表面活性剂)。合适的非离子表面活性剂的一个实例是封端于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，也称为泊洛沙姆，例如可以商品名pluronic®从BASF, Germany获得。
糖组分都是单糖或二糖，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(单糖的实例)或蔗糖、乳糖或麦芽糖(二糖的实例)。
根据本发明的氨基酸的实例是酪氨酸、蛋白氨基酸，尤其是必需氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸，以及非蛋白氨基酸如D-氨基酸，由此优选L-氨基酸。
术语氨基酸进一步包括氨基酸的盐，如钠盐，或相应的水合物或盐酸盐。
例如，酪氨酸是指L-或D-酪氨酸，优选L-酪氨酸，以及其盐或水合物或盐酸盐。
维生素的实例是维生素A (视黄醇、视黄醛、各种类视色素和四种类胡萝卜素)、维生素B1 (硫胺素)、维生素B2 (核黄素)、维生素B3 (烟酸、烟酰胺)、维生素B5 (泛酸)、维生素B6 (吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B7 (生物素)、维生素B9 (叶酸、亚叶酸)、维生素B12(氰钴胺素、羟钴胺素、甲钴胺)、维生素C (抗坏血酸)、维生素D (麦角钙化醇、胆钙化醇)、维生素E (生育酚、生育三烯酚)和维生素K (叶绿醌、甲基萘醌)。还包括维生素前体。
盐的实例是包含无机离子(例如碳酸氢盐、钙、氯化物、镁、磷酸盐、钾和钠)或微量元素(例如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V和Zn)的组分。实例是五水合硫酸铜(II)(CuSO4·5H2O)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2·2H2O)、氯化钾(KCl)、硫酸铁(II)、柠檬酸铁铵(FAC)、无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)、七水合硫酸锌。
缓冲液的实例是CO2/HCO3 (碳酸盐)、磷酸盐、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。
辅因子的实例是硫胺素衍生物、生物素、维生素C、NAD/NADP、钴胺素、黄素单核苷酸和衍生物、谷胱甘肽、血红素核苷酸磷酸盐和衍生物。
根据本发明的核酸组分是核碱基(如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)、核苷(如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和胸苷)以及核苷酸(如单磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷)。
补料培养基可以具有与完全培养基不同的组成。它们通常包含氨基酸、微量元素和维生素。它们也可能包含糖组分，但有时由于生产原因，糖组分在单独的补料中加入。
合适的补料培养基可以例如包含一种或多种下列化合物：
根据本发明的冷冻是指冷却至低于0℃的温度。
在灌注方法中，通过泵连续地加入细胞培养基并从生物反应器中去除细胞培养基，同时通过细胞保留装置将细胞保留在生物反应器中。灌注的优点是可能达到非常高的细胞密度(由于恒定的培养基交换)和可能产生非常脆弱的重组蛋白，因为每天可以从生物反应器中去除产物，因此减少重组蛋白暴露于高温、氧化还原电位或释放的细胞蛋白酶的时间。
灌注细胞培养的方法通常包括在生物反应器系统中培养细胞，所述生物反应器系统包含具有培养基入口和收获物出口的生物反应器，由此
i. 在细胞培养方法期间，经由培养基入口将新的细胞培养基连续地或一次或数次(优选连续地)插入生物反应器中
ii.在细胞培养方法期间，经由收获物出口从生物反应器中连续地或一次或数次(优选连续地)去除收获物。收获物通常包含由细胞产生的目标产物、细胞和液体细胞培养基。
氨基酸是细胞培养基的必需组分，因为它们是支持细胞生长的关键。此外，氨基酸是使用哺乳动物细胞培养技术生产的重组蛋白的关键结构单元。氨基酸的溶解度是阻碍细胞培养基和补料制剂浓度的限制因素。这样的浓度对于开发下一代制造平台是必要的。特别地，使用在线稀释的生物制造方法需要高度浓缩的制剂，以减少必须储存在罐中的细胞培养基的体积(=减少制造占地面积)或通常减少在整个补料分批方法中加入的补料的体积，并因此潜在地增加体积滴度。
已经发现，在细胞培养基中，几种氨基酸可以被它们的酮酸或其盐替代。除了用作氨基酸源外，尤其是这些酮酸的钠盐与其相应的氨基酸相比具有更高的溶解度，并因此可以用于高度浓缩的制剂中。接着溶解度优势，还发现使用酮酸还允许减少细胞培养物中的氨，氨是已知的毒性和抑制性代谢物。此外，某些酮酸的使用被证明当在室温下储存时产生更稳定的制剂，其颜色变化减少、缺乏或延迟沉淀以及较少或延迟形成副产物。
氨基酸的酮酸及其盐因此可以用于细胞培养基制剂中以用于以下应用
●应用1：增加总培养基/补料溶解度
●应用2：在细胞培养物中替代相应的氨基酸并减少铵离子/氨制剂
●应用3：以增加培养基稳定性，减少由于制剂在4℃或室温下储存而引起的颜色变化和沉淀，并减少在补料储存期间氨的形成。
表1显示氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸以及它们相应的酮酸或相应的酮酸的钠盐。从表1可以看出，相应的酮酸的溶解度高于氨基酸的溶解度。
表1 氨基酸和它们相应的酮酸或其盐在25℃水中的溶解度。使用饱和溶液进行溶解度实验，并在红外干燥后确定残余质量。
已经发现，通过用相应的酮酸和/或其衍生物部分或完全替代氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和/或甲硫氨酸，与其它方面相同的细胞培养基相比，干粉末或干的颗粒状细胞培养基的溶解度可以得到改进，而对细胞培养的性能没有负面作用。在优选的实施方案中，使用酮酸的钠盐，因为它们通常显示最高的溶解度。
合适的衍生物是金属盐衍生物、肽衍生物、酯衍生物以及其它衍生物。所述衍生物是酮酸衍生物，并且与相应的氨基酸相比在水中具有更高的溶解度，并且它们在细胞内协调回相应的氨基酸，或者可以以其它方式替代相应的氨基酸，其作用是维持和/或支持细胞的体外生长。
金属盐衍生物是最优选的衍生物。这些是酮酸的金属盐，如钠、钾、钙或镁盐，优选钠盐。
肽衍生物是其中一个或多个(通常一个、两个或三个)氨基酸经由肽键与酮酸连接的衍生物。肽衍生物(在这种情况下，酮基亮氨酸)的示意性分子式如下面的方案1所示：
其中R1为氨基酸侧链，并且R2为经由肽键连接的另一个氨基酸。
酯衍生物是其中酮酸形式的羧酸的衍生物并且是烷基酯或芳基酯。最优选C1-C4烷基酯。酮基-亮氨酸酯衍生物的实例示于方案2中：
其中R2为烷基或芳基，由此烷基可以被-OH或OR2进一步取代，或例如以形成醚或酯。
合适的R2的实例是甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、叔丁基、苄基以及
其它衍生物示于方案3中：
对于酮基亮氨酸所示的上述实例当然可以同样地用于选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸的其它酮酸。
因此，本发明涉及干粉末或干的颗粒状细胞培养基，其包含选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物(优选金属盐衍生物，最优选钠盐)的至少一种α酮酸。在优选的实施方案中，干粉末或干的颗粒状细胞培养基包含4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸和/或α-酮基异戊酸的钠盐，最优选所有三种酮酸的钠盐。
干粉末或干的颗粒状细胞培养基中的酮酸量使得在干粉末或干的颗粒状细胞培养基溶解后获得的液体培养基中每种酮酸和/或其衍生物的浓度高于10 mM，优选在20-600mM之间，最优选在30-300 mM之间。
在一个实施方案中，包含如上定义的酮酸的干粉末或干的颗粒状细胞培养基不包含相应的氨基酸。在另一个实施方案中，包含如上定义的酮酸的干粉末或干的颗粒状细胞培养基包含至多50% (摩尔%)的相应的氨基酸。
为了使用干粉末或干的颗粒状培养基，将溶剂(优选水(最特别是蒸馏水和/或去离子水或纯净水或注射用水)或水性缓冲液)加入到培养基中，并且将组分混合直到培养基完全溶解在溶剂中。
溶剂也可以包含盐水、提供合适的pH范围(通常在pH 1.0至pH 10.0之间的范围内，优选在6.5-8.5之间的范围内)的可溶性酸或碱离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和醇或其它极性有机溶剂。
也可以向细胞培养基和溶剂的混合物中加入其它物质，如用于调节pH的缓冲物质、胎牛血清、糖等。然后将所得液体细胞培养基与待生长或维持的细胞接触。
虽然包含较高浓度的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的干粉末或干的颗粒状培养基组合物在与溶剂混合时由于氨基酸的有限溶解度将显示混浊，使用相同浓度的相应的酮酸和/或其衍生物的根据本发明的细胞培养基产生澄清溶液。这特别适合于补料培养基。
包含酮酸和/或其衍生物的所得液体培养基在细胞培养中显示至少相同的性能。已经发现氨基酸可以被相应的酮酸和/或衍生物(优选其盐)完全替代。然而，也可以仅部分替代氨基酸。在这种情况下，优选50% (摩尔%)或更多的氨基酸被相应的酮酸和/或其衍生物替代。
在一些情况下，与被替代的氨基酸的量相比，修改并且尤其是扩大酮酸的量可能是有利的。虽然对于异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的替代，1:1的替代通常是足够的，已经发现对于苯丙氨酸和甲硫氨酸，通常优选加入与氨基酸的量相比更多的酮酸。通常1:1.1至1:3(基于摩尔)替代是合适的。
通过优选用相应的酮酸和/或其衍生物(特别是用酮酸的钠盐)完全替代氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，可以扩大培养基的最大溶解度。如在实施例3中可以看出，干粉末培养基的溶解度可以例如加倍。
除了通过如上所述替代氨基酸来改进干粉末或干的颗粒状培养基的溶解度之外，进一步出乎意料地发现，当使用其中亮氨酸和/或异亮氨酸已被相应的酮酸和/或其盐替代的培养基时，细胞培养物的比生产率扩大。
可以进一步显示，使用其中亮氨酸和/或异亮氨酸已被相应的酮酸和/或其盐替代的培养基产生的IgG1的三个关键的质量属性在使用氨基酸的对照条件和替代条件之间显示没有差异。三个关键的质量属性是糖基化模式、抗体聚集和片段化以及进料变化。
进一步发现酮酸和/或其衍生物(尤其亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的酮酸和/或盐，优选4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸和/或其盐)适于稳定液体细胞培养基制剂。与不包含4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸和/或其盐但包含相同量的相应的氨基酸的培养基相比，包含所述组分的液体培养基在暴露于光或不暴露于光的情况下在室温或4℃下储存三个月后显示更低的颜色变化。它们还显示沉淀减少。
当用相应的酮酸和/或其衍生物替代相应的氨基酸(例如异亮氨酸和/或亮氨酸)时，可以达到这种作用。当将相应的酮酸(例如4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸和/或其衍生物)加入到包含亮氨酸和/或异亮氨酸的细胞培养基制剂时，也可以达到该作用。这意味着酮酸和/或其衍生物可以用作培养基稳定剂，而与培养基组成无关。液体制剂中的合适浓度为至少20 mM，优选在30-600 mM之间。
本发明的粉末化的细胞培养基优选通过混合所有组分并研磨它们来生产。混合各组分是通过研磨生产干粉末化的细胞培养基领域技术人员已知的。优选地，将所有组分充分混合，使得混合物的所有部分具有几乎相同的组成。组合物的均匀性越高，所得培养基在均匀细胞生长方面的质量越好。
研磨可以用任何类型的适于生产粉末化的细胞培养基的磨机进行。典型的实例是球磨机、针磨机、菲茨磨机或喷射磨机。优选针磨机、菲茨磨机或喷射磨机，非常优选针磨机。
本领域技术人员知道如何运转这样的磨机。
在针磨机的情况下，盘直径为约40 cm的大型设备磨机例如通常以1-6500转/分钟运行，优选1-3000转/分钟。
研磨可以在标准研磨条件下进行，得到粒度在10-300 μm之间，最优选在25-120 μm之间的粉末。
颗粒的尺寸是指颗粒的直径。粒径通过激光散射确定。使用该技术，粒度以体积当量球体直径报道。
粒度范围给出其中75%或更多(优选90%或更多)的颗粒具有的粒度的范围。这意味着如果粒度在25-120 μm之间，则至少75%的颗粒的粒度在25-120 μm之间。
优选地，经历研磨的混合物的所有组分是干的。这意味着，如果它们包含水，它们确实仅包含结晶水，但不超过10重量%，优选不超过5重量%，最优选不超过2重量%的未结合或未配位的水分子。
在优选的实施方案中，研磨在惰性气氛中进行。优选的惰性保护气体是氮气。
在另一个优选的实施方案中，在研磨之前将混合物的所有组分冷冻。在研磨之前冷冻成分可以通过确保将成分冷却至低于0℃(并且最优选低于-20℃)的温度的任何方式进行。在优选的实施方案中，冷冻用液氮进行。这意味着用液氮处理成分，例如通过将液氮倒入其中储存成分的容器中，然后引入磨机中。在优选的实施方案中，容器是补料器。如果容器是补料器，则优选在补料器的引入成分的一侧或靠近补料器的引入成分的一侧引入液氮。
通常，用液氮处理成分超过2-20秒。
优选地，以进入磨机的所有成分的温度低于0℃，最优选低于-20℃的方式进行成分的冷却。
在优选的实施方案中，将所有成分放入容器中，将混合物从该容器转移到补料器中，最优选转移到计量螺旋补料器中。在补料器中，成分有时被进一步混合(这取决于补料器的类型)并且另外被冷却。然后将冷冻的混合物从补料器转移至磨机，使得在磨机中研磨的混合物优选仍具有低于0℃，更优选低于-20℃的温度。
通常，共混时间(即成分的混合物在补料器中的停留时间)超过一分钟，优选在15-60分钟之间。
计量螺旋补料器(也称为计量蜗形轮)通常以10-200转/分钟的速度运行，优选其以40-60转/分钟运行。
通常，磨机的温度保持在-50℃至+30℃之间。在优选的实施方案中，温度保持在约10℃。
在研磨期间的氧水平优选低于10% (v/v)。
所述方法可以例如分批或连续运行。在优选的实施方案中，根据本发明的方法通过在一定时间内将成分的混合物永久性地填充到用于冷却的补料器中并将冷却的混合物从补料器永久性地填充到磨机中而连续进行。
本发明进一步涉及用于培养细胞的方法，通过
a)提供生物反应器
b)提供液体细胞培养基，其包含选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的至少一种α酮酸，优选浓度高于10 mM。
c)将待培养的细胞与液体细胞培养基混合
d)孵育步骤b)的混合物。
在优选的实施方案中，细胞是CHO细胞。
在一个实施方案中，在步骤b)中提供的液体细胞培养基是这样的液体细胞培养基，其中氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种被选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的相应的酮酸部分替代或优选完全替代。
在优选的实施方案中，步骤b)的液体细胞培养基通过将根据本发明的干粉末或干的颗粒状培养基溶解于如上所述的溶剂中来提供。
生物反应器是其中可以培养细胞的任何容器或罐。孵育通常在合适的条件(如合适的温度等)下进行。本领域技术人员知道用于支持或维持细胞生长/培养的合适的孵育条件。
已经发现，本发明也非常适于制备补料培养基。由于某些氨基酸的可用性的限制，尤其是在补料培养基所需的浓度下，补料培养基的浓度由于溶解度问题而受到限制。
因此，需要在一次补料中并且以高浓度包含所有需要的组分的补料培养基。此外，补料的pH不应负面影响细胞培养，即液体补料的pH应低于8.5，优选在6.5-7.8之间。
已经发现，通过用相应的酮酸和/或衍生物(优选其盐)部分或优选完全替代氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，所得干粉末培养基的溶解度得到改进。这提供了生产具有更高浓度的成分的液体培养基的可能性，使得相同量的成分可以以更少量的液体加入到细胞培养物中，但是仍然处于优选低于8.5的合适pH。可以使用包含酮酸的较高浓缩的补料培养基，而对细胞生长和/或生产率以及对液体培养基的稳定性没有任何负面作用，并且有时甚至是正面作用。
因此，本发明还涉及粉末化的培养基形式或溶解后液体培养基形式的补料培养基。
所得液体培养基包含至少一种选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的酮酸，其浓度超过10 mM，优选在20-600 mM之间，并且优选pH为8.5或更低。
在优选的实施方案中，pH在6.7-8.4之间。
本发明还涉及用于在生物反应器中培养细胞的补料分批方法，通过
-将细胞和水性细胞培养基填充到生物反应器中
-在生物反应器中孵育细胞
-在生物反应器中细胞的整个孵育时间内连续地或在所述孵育时间内一次或数次地向生物反应器中加入细胞培养基(在这种情况下是补料培养基)
由此补料培养基优选pH少于pH 8.5，并且包含至少一种选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的酮酸。
优选地，补料培养基包含浓度超过10 mM，优选在20-600 mM之间的一种或多种酮酸和/或其衍生物。优选补料培养基包含4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸和/或α-酮基异戊酸和/或其盐(最优选钠盐)。通常补料培养基包含50-400 g/L之间的溶解于溶剂中的固体成分。
在优选的实施方案中，在本发明的方法中，在孵育期间连续地或在所述时间内一次或数次加入到生物反应器中的补料培养基总是具有相同的组成。在优选的实施方案中，细胞是CHO细胞。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明，然而，本发明不限于此。
上文和下文引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容通过引用并入本文。
实施例
以下实施例代表本发明的实际应用。
实施例1：与它们相应的氨基酸相比，酮酸在水中具有增加的溶解度
通过制备饱和溶液，将五种示例性氨基酸的最大溶解度与它们相应的酮酸或其盐在25℃的水中的溶解度进行比较。沉降后，使用红外线(120℃，120分钟)干燥溶液，并确定残余质量，以g/kg计。
如在图1中所示，当与相应的氨基酸在水中的溶解度相比时，酮酸及其盐的溶解度显著更高。为了排除溶解度的增加是由于酮酸的钠盐形式，进行单独的实验以比较Leu、Leu钠盐和酮基Leu钠盐的溶解度。在水中获得的最大溶解度分别为22.1、86.0和313.7 g/kg，这指示如所预期的，钠盐的形成已经增加了Leu的溶解度，但是用酮酸获得的溶解度的增加显著更重要，并因此不能仅由于盐形式引起。
实施例2：在耗尽Ile和Leu的4Feed中，当与它们相应的氨基酸相比时，酮酸的最大溶解度
将增加量的酮酸及其盐加入到耗尽Ile和Leu的细胞培养补料制剂(Cellvento®4Feed，MilliporeSigma)中。类似地，将增加量的Ile和Leu加入到相同的补料制剂中作为对照。该补料制剂的总浓度为125 g/L，并且pH为7.0 +/- 0.2。在小规模实验中，每次加入氨基酸或酮酸后，将补料搅动10分钟并测量浊度。实验在室温(25℃)下进行。
在耗尽Ile/Leu的Cellvento® 4Feed中，发现Ile的最大溶解度为约105 mM，而对于酮基Ile，635 mM的最大测试浓度仍然是可溶的，浊度值低于5 NTU (参见图1)。这指示在耗尽Ile/Leu的4Feed中，酮基Ile比Ile更加可溶，为至少6倍。
在耗尽Ile和Leu的4Feed中，发现Leu的最大溶解度为约90 mM，而对于酮基Leu，最大可溶性浓度(浊度值低于5 NTU)为240 mM (参见图2)。这指示在耗尽Ile/Leu的4Feed中，酮基Leu比Leu更加可溶，为2.6倍。
实施例3：酮酸的使用使得能够在中性pH下浓缩细胞培养基制剂。
通过将增加量的补料干粉末培养基溶解在水中直到目视检测到沉淀来确定Cellvento® 4Feed的最大溶解度。对于每种条件，将补料搅拌约30分钟，将pH调节至7.0+/- 0.2，并将溶液再搅拌10分钟以平衡。测量同渗质量摩尔浓度和浊度(参见图3)。数据指示，该制剂的1.2x浓缩物已经是不可溶的，因为在悬浮液中可以检测到颗粒，并且浊度大部分高于5 NTU的限值。
由于Ile和Leu已被鉴定为Cellvento® 4Feed制剂浓度的第一个限制性氨基酸，产生耗尽Ile和Leu的新的主干补料(4 Feed-Ile/Leu)。通过将增加量的补料干粉末培养基溶解在水中直到目视检测到沉淀，确定补充有或未补充有酮基Leu和酮基Ile的该补料的最大浓度。对于每种条件，将补料搅拌约30分钟，将pH调节至7.0 +/- 0.2，并将溶液再搅拌10分钟以平衡。测量浊度，并且5 NTU的限值被认为是可溶的。
结果指示，耗尽Ile/Leu的Cellvento® 4Feed的最大溶解度为约228 g/L。在加入酮基Leu和酮基Ile后，补充有36 g/L至38 g/L的组合量的酮基Leu和酮基Ile (摩尔当量等于该浓缩物中Ile和Leu的理论量)的耗尽的干粉末培养基获得在216 g/L-228 g/L之间的最大溶解度，对于含有酮基Leu和酮基Ile两者的制剂，产生252 g/L-266 g/L的总浓度。考虑到Cellvento® 4Feed的浓度为130 g/L，当Ile和Leu被酮基Ile和酮基Leu替代时，这表示浓度增加100%。
数据指示，由于在悬浮液中没有检测到颗粒并且浊度低于5 NTU (参见图4)，可以浓缩该制剂直到至少2×(265 g/L)。
实施例4：Leu和Ile的酮酸可以稳定细胞培养基制剂
将含有Ile和Leu的补料(Cellvento® 4Feed)的稳定性与耗尽Ile/Leu并补充有酮基Leu或酮基Ile的相同补料的稳定性进行比较。根据标准方案制备补料。最终pH为7.0+/- 0.2，并将补料在4℃或室温下储存，被保护或暴露于光。在90天期间通过测量在300nm-600nm范围内的吸光度(间隔5 nm)监测制剂的颜色变化。通过计算在吸光度扫描(300nm-600nm)下基线校正的曲线下面积的随时间(D0-D90之间)的曲线下面积(AUC)来比较条件。
如在图5A中所示，在对照条件下含有Ile和Leu的补料随着温度的升高或光暴露而变得更暗(AUC从350增加到7000)。在4℃下，当用酮基Leu替代Leu时，在光保护和光暴露条件下AUC分别降低27%和8%。在室温下降低甚至更明显，其中在酮基Leu条件下，AUC分别降低31% (光保护)和37% (光暴露)。这指示用酮基Leu替代Leu可以显著降低补料中观察到的随时间的颜色变化。
酮基Ile获得的结果在图5B中呈现。对于酮基Leu，当用酮基Ile替代Ile时，观察到AUC降低。在4℃下，在光保护和光暴露条件下AUC分别降低33%和68%。在室温下，在光保护条件下没有看到降低，但在光暴露条件下观察到38%的降低，这指示用酮基Ile替代Ile可以显著降低补料中观察到的随时间的颜色变化。
我们的结果总体上指示，氨基酸被它们的酮酸或其盐替代可以导致稳定，当在4℃或室温下在有光暴露或没有光暴露的情况下储存3个月时，导致较低的颜色变化。
另外，当在补料中使用酮基Leu代替Leu时，补料的沉淀延迟。为了观察沉淀，将50mL法尔康管转回以观察在管底部可能的沉降并拍照。在4℃下没有条件沉淀，但在室温光保护下，对照条件在D49-D70之间沉淀，而在含有酮基Leu的条件下未观察到沉淀。在室温暴露于光时没有观察到完全抑制沉淀，但在酮基Leu条件下沉淀延迟。而对于对照条件在D49开始观察到沉淀，对于酮基Leu条件在D70出现初始沉淀。在随后的几天期间，在含有酮基Leu的条件下，沉淀的量以及沉淀的颜色强度较低，这指示在室温光暴露下，酮基Leu制剂的稳定性也稍有增强。
最后，当与含有正常氨基酸的补料相比时，在含有酮酸的补料在4℃或室温下贮存期间形成的铵离子的量较低。为了能够评价稳定性研究整个时期NH3的形成，在3个月的时间范围内计算NH3浓度的AUC以比较条件。
酮基Leu的结果在图6A中呈现，并且指示当与对照条件相比时，氨形成较低。当补料分别在4℃光保护和光暴露下储存时，与对照相比，在酮基Leu条件下产生的氨少10%和19%。在室温下，当将补料光保护和光暴露储存3个月时，观察到相同的趋势，其中氨的水平分别降低15%和5%。
对于酮基Ile获得类似的结果(图6B)，并且指示当与对照条件相比时，氨形成较低。当补料分别在4℃光保护和光暴露下储存时，与对照相比，在酮基Ile条件下产生的氨少21%和24%。在室温下，当将补料光保护和光暴露储存3个月时，观察到相同的趋势，其中氨的水平分别降低28%和25%。
实施例5：酮基Ile和酮基Leu可以替代补料中它们相应的氨基酸并增加比生产率。用产生IgG1的CHOK1GS克隆的细胞培养结果。
对于细胞培养实验，使用表达人IgG1的CHOK1GS悬浮细胞系。使用50 mL旋转管，起始培养体积为30 mL，并且接种密度为2×105个细胞/mL，在Cellvento 4CHO培养基(MerckDarmstadt，德国)中一式四份培养细胞。在37℃、5% CO2、80%湿度和320 rpm搅动下进行孵育。在补料中加入酮酸(耗尽Ile和Leu的4Feed)代替它们相应的氨基酸。所有补料的pH为中性(pH 7.0 +/- 0.2)。正对照含有正常氨基酸，而负对照含有耗尽相应的氨基酸且不加入酮酸的补料。在第3、5、7、10和14天，以下列v/v比率(3、6、3和3%)进行补料。每天定量葡萄糖，并使用400 g/L葡萄糖溶液调节至6 g/L。将实验重复至少3次。
用Vi-CELL XR (Beckman Coulter，Fullerton，CA)评价活细胞密度(VCD)和存活力。使用Cedex Bio HT (Roche Diagnostics，Mannheim，德国)基于分光光度法和浊度方法监测代谢物浓度。在用AccQ•TagUltra®试剂试剂盒衍生化后，通过UPLC进行氨基酸的定量。采用供应商的建议(Waters，Milford，MA)进行衍生化、色谱法和数据分析。
每天通过用滴度除以校正的积分VCD以考虑由补料产生的稀释来计算每个细胞每天的生产率。通过计算滴度和校正的积分VCD之间的线性回归的斜率来确定总比生产率。
当考虑活细胞密度时(图7A)，与对照相比，两种酮衍生物导致稍微更低的最大VCD，但是在第11天后获得的滴度(图7B)稍微高于对照条件，这指示总体更高的比生产率(图8)。补料耗尽Leu和Ile的负对照显示第7天后VCD迅速降低，并且最重要的是IgG滴度非常有限，这指示Leu和Ile对于支持CHO细胞产生IgG是关键的。
NH3是在补料分批方法过程中产生的不需要的代谢物。在17天补料分批方法期间，与含有Leu和Ile的对照相比，在酮基Leu和酮基Ile条件下产生的NH3的量(图9A)显著降低，这指示显著部分的氨由Leu和Ile的氧化脱氨基化产生，或者生物反应器培养基中酮酸的存在促进游离NH3作为通过氨基化产生氨基酸的结构单元的用途。
确定用过的培养基中的氨基酸浓度。在其中Leu已被酮基Leu替代的条件下，用过的培养基中Leu的浓度(图9B)略低于阳性对照(含有Leu和Ile)，但随时间的变化显示，在补料日和随后的一天之间浓度增加，这指示Leu能很快由酮基Leu产生。在其中Ile已被酮基Ile替代的情况下(图10A)，随时间推移检测到的Ile浓度显著低于阳性对照中的Ile浓度，这指示酮基Ile向Ile的转化缓慢或培养物中由酮基Ile形成另一种产物。酮基Ile条件与负对照(其中补料已经耗尽Ile和Leu)的比较指示，Ile仍然可以在该补料分批中由酮基Ile产生。另外，仔细分析色谱图可以鉴定对应于allo-Ile的新峰(图10B)，其随时间增加。
将在对照补料分批方法(用含有Ile和Leu的补料)中产生的抗体的质量与用耗尽Leu和Ile并且补充有酮基Leu或酮基Ile的补料产生的抗体的质量进行比较。
使用蛋白质A PhyTips® (PhyNexus Inc, San Jose, CA)从细胞培养物上清液中纯化抗体。在使用具有8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠(APTS) (Prozyme, Hayward, CA)的GlykoPrep®-plus Rapid N-聚糖样品制备试剂盒根据制造商的说明书衍生化之后，通过具有激光诱导的荧光的毛细管凝胶电泳(CGE-LIF)分析糖基化模式。简言之，将纯化的抗体变性并固定，并且通过用N-聚糖酶®消化，随后在50℃用APTS标记60分钟，从抗体释放聚糖。在去除剩余的APTS的清洁步骤后，使用具有LIF检测器(Ex：488 nm，Em：520 nm)的Pharmaceutical Analysis System CESI8000 Plus (Sciex, Washington, USA)确定聚糖的相对量。在聚乙烯醇涂布的毛细管(总长度：50.2 cm，内径：50 μm)中进行分离，并用来自碳水化合物标记试剂盒(Beckman Coulter, Brea, USA)的碳水化合物分离缓冲液填充。首先用分离缓冲液在30 psi下冲洗毛细管表面3分钟。每20个循环更换入口和出口缓冲小瓶。通过在0.5 psi下压力注射12秒引入样品，随后浸渍0.2分钟的步骤以清洁毛细管尖端，。最后在20 kV下进行分离20分钟，其中0.17分钟的斜坡施加反向极性。根据峰各自的迁移时间鉴定峰，并根据以下参数积分：峰宽0.05，阈值10,000，并且肩部敏感性9,999。
使用TSKgel SuperSW3000柱(Tosoh Bioscience)在Water Acquity UPLC系统上使用尺寸排阻色谱法测量抗体聚集和片段化。流动相为0.05 M的磷酸钠，0.4 M的高氯酸钠，pH 6.3，并且流速为0.35 mL/min。在使用储存缓冲液纯化IgG后，将样品浓度调节至1.0mg/mL，并用214 nm处的吸光度进行检测。
在毛细管电泳CESI 8000 (Beckman Coulter/ Sciex)上使用cIEF根据制造商的说明书测量进料变化。在使用储存缓冲液纯化IgG后，将样品浓度调节至1.5 mg/mL的浓度。在测量之前，将样品与含有不同pH标记物、阴极/阳极稳定剂、3M Urea cIEF凝胶和Pharmalyte的主混合物混合。
糖基化(图11)、高分子量和低分子量物类(图12A)和进料变化(图12B)获得的结果指示，对照条件与其中Ile和Leu已与酮基Ile和酮基Leu交换的条件之间没有差异，这指示氨基酸交换对本研究中产生的IgG1的3个关键的质量属性没有影响。
实施例6：用产生IgG1的CHODG44和CHOK1克隆证实酮基Leu性能。
本发明的技术对于不同的生物方法的适用性通过用其它类型的CHO细胞进行补料分批实验来证明：CHODG44和CHOK1 (非GS)对酮基Leu的作用作为实例。DG44细胞系的结果(图13)指示，与对照相比，酮基Leu条件下VCD较低并且IgG滴度稍低。然而，对于使用酮基Leu的方法，总比生产率略有增加。用过的培养基数据显示，对于这种细胞系，酮基Leu条件下的Leu浓度与对照中的Leu浓度几乎相似，这证实了在该细胞系中也能从酮基Leu非常快速地产生Leu。
图13：对于表达IgG1的CHODG44细胞系，与对照相比，含有酮基Leu的方法的性能。
图14：对于表达IgG1的CHOK1非GS细胞系，与对照相比，含有酮基Leu的方法的性能。
实施例7：具有不同接种密度和不同Leu/酮基Leu比的分批性能
我们用具有酮基Ile和酮基Leu的3种不同的CHO细胞系获得的补料分批用过的培养基结果指示，由酮酸形成Ile、allo-Ile和Leu相当快。这指示酮酸也可以用于增加分批和灌注培养基的溶解度，因为它们可能从培养开始就容易获得。为了证实这在CHO系统中是适用的，在细胞培养基(Cellvento® 4CHO)中用酮基Leu或酮基Ile分别替代Leu和Ile。生产耗尽Leu/Ile形式的制剂，并使用等摩尔浓度的酮基Leu替代Leu和酮基Ile替代Ile (图15)。在连续传代实验中，在几周内监测CHOK1GS细胞系的细胞生长和存活力，以确保生长不是由于残留量的Leu或Ile。设计接种密度为0.2×106个细胞/mL的分批实验，并随时间测量IgG产量。使用用过的培养基中的氨基酸定量，随时间跟踪氨基酸的产生。
以类似的方式，在含有不同比率的Leu/酮基Leu的培养基中进行具有较高细胞接种密度的分批实验，以理解当以较高细胞密度开始时哪个比率是优选的(图16)。所用的分析与上述相同。
连续传代的结果指示CHOK1GS细胞不能在耗尽Ile和Leu的培养基中生长，因为在培养的第一天期间没有观察到生长，并且存活力非常显著地降低。相反，当用相应的酮酸替代Leu或Ile时观察到连续生长。总之，每次传代所观察到的最大活细胞密度略低于含有Ile和Leu的对照条件，这指示可能需要少量Leu和Ile以获得与对照条件相比相当的性能。这个量可以通过测试含有不同比率的Ile/Leu和酮基Ile/酮基Leu的培养基而非常容易地通过实验确定。
在分批实验中，对照条件与酮基Leu条件之间的性能相当，这指示当用摩尔当量的酮基Leu替代Leu时CHOK1GS细胞可以生长(图15A)。在该条件下，在第7天和第10天检测到相似量的IgG (图15B)。相反，当用酮基Ile替代Ile时，第5天后的生长和IgG浓度轻微受损，这指示在分批条件下，可能需要少量的Ile以获得与对照相比相似的随时间推移的生长和滴度。这个量可以通过测试含有不同比率的Ile和酮基Ile的培养基而非常容易地通过实验确定。或者，可以测试与Ile浓度相比更高摩尔的酮基Ile浓度。
酮基Ile和酮基Leu性能之间的差异可以通过观察用过的培养基中Ile、allo-Ile和Leu的形成来解释。然而，在第3天，初始酮基Leu浓度的34%以Leu形式检出，在第3天，初始酮基Ile浓度的仅21%以Ile形式检出。另外，直到第10天，初始酮基Ile浓度的35%以allo-Ile形式检出。这指示由于同时形成allo-Ile，细胞将酮基Leu氨基化为Leu比将酮基Ile氨基化为Ile更有效，allo-Ile的形成可能不如细胞对Ile的程度。
最后，进行具有较高细胞密度的分批实验，以确定当以高接种密度开始时，酮基Leu是否容易获得，或者是否必须存在最低浓度的游离亮氨酸以支持在这些条件下的生长和生产率。对于该实验，将CHOK1GS细胞系以0.3、0.6或1×106个细胞/mL接种于含有0、25、50、75或100%的酮基Leu的培养基中，其余以亮氨酸形式加入。
结果指示生长和滴度随着接种密度的增加而增加，如所预期的。在不同比率的酮基Leu/Leu之间，观察到最大VCD，其中100%酮基Leu交换，最高接种密度为1×106个细胞/mL。当细胞以0.6×106个细胞/mL和0.3×106个细胞/mL接种时，酮基Leu:Leu比率为1:1(50%酮基Leu和50% Leu)时观察到最高VCD。关于滴度，对于以0.3×106个细胞/mL和1×106个细胞/mL的接种没有观察到显著差异，而对于以0.6×106个细胞/mL的接种观察到轻微趋势，其中IgG浓度随较高比率的Leu/酮基Leu而增加。这种差异可能不显著。
实施例8. FB培养物中其它酮酸相对于它们相应的氨基酸的性能
在FB实验中，测试其它酮酸作为它们相应的氨基酸的替代物。当补料中用酮基Val替代Val时，观察到与Ile和Leu相比非常相似的行为(图17)。实际上，与阳性对照相比观察到类似的VCD和滴度，而耗尽Val的补料导致VCD急剧下降，以及在第7天后非常低的滴度。当使用酮酸时NH3浓度也较低，这指示对于Val，在补料分批培养期间使用相应的酮酸也可能导致较少的NH3。总之，这指示作为支链酮酸成员的酮基Val最有可能表现出与酮基Leu和酮基Ile相同的行为，并且可能在细胞培养中被非常迅速地氨基化。由于与酮基Ile和酮基Leu的结构相似性，酮基Val对总补料浓度和补料稳定性的作用与其它支链酮酸相似。在水中证实了当与Val相比时更高，为6倍的溶解度。
对于苯丙氨酸(Phe)及其相应的酮酸苯丙酮酸盐(图18)，在细胞培养物中生成Phe的氨基化反应似乎比支链酮酸发生的氨基化反应慢。实际上，当用等摩尔量浓度的苯丙酮酸盐替代Phe时，用过的培养基数据揭示，尽管与负对照(耗尽Phe的补料)相比，在上清液中发现更多的Phe，但形成的量不足以支持与对照条件相比相同的生长和滴度。在第5天后观察到显著较低的VCD，并且观察到20%的最终滴度降低。遵循该结果，使用其中2x摩尔当量的Phe用作补料中苯丙酮酸盐浓度的条件。结果指示，苯丙酮酸盐量的增加可以恢复VCD、滴度以及在用过的培养基中非常相似量的Phe。这些数据证实Phe也可以被其酮酸替代，但可能需要调节浓度以适应氨基化反应的较慢速度。
Claims (13)
1.干粉末或干的颗粒状细胞培养基，其包含选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的至少一种α酮酸。
2.根据权利要求1所述的干粉末或干的颗粒状细胞培养基，由此选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的一种或多种α酮酸以这样的量存在，使得在溶解所述干粉末或干的颗粒状细胞培养基后获得的所述液体培养基中每种所述α酮酸的浓度高于10 mM。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的干粉末或干的颗粒状细胞培养基，由此所述干粉末或干的颗粒状细胞培养基不包含相应的氨基酸。
4.根据权利要求1-3中一项或多项所述的干粉末或干的颗粒状细胞培养基，由此所述培养基包含选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸中的一种或多种α酮酸的钠盐。
5.根据权利要求1-4中一项或多项所述的干粉末或干的颗粒状细胞培养基，由此所述干粉末或干的颗粒状细胞培养基包含一种或多种选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸和/或α-酮基异戊酸的α酮酸的钠盐。
6.用于生产根据权利要求1-5中一项或多项所述的干粉末细胞培养基的方法，通过
a)将选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物中的至少一种α酮酸与所述细胞培养基的其它组分混合
b)使步骤a)的所述混合物经历研磨。
7.用于培养细胞的方法，通过
a)提供生物反应器
b)将待培养的所述细胞与液体细胞培养基混合，所述液体细胞培养基通过将根据权利要求1-5中一项或多项所述的干粉末或干的颗粒状培养基溶解在溶剂中而制备
c)孵育步骤b)的所述混合物。
8.用于在生物反应器中培养细胞的补料分批方法，通过
-将细胞和水性细胞培养基填充到生物反应器中
-在所述生物反应器中孵育所述细胞
-在所述生物反应器中所述细胞的整个孵育时间内连续地或在所述孵育时间内一次或数次地向所述生物反应器中加入细胞培养基，在这种情况下所述细胞培养基是补料培养基
由此通过将根据权利要求1-5中一项或多项所述的干粉末或干的颗粒状培养基溶解在溶剂中来制备所述补料培养基。
9.根据权利要求8所述的补料分批方法，由此所述补料培养基包含至少4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸和/或其盐，浓度在12-600 mmol/l之间。
10.用于稳定液体细胞培养基的方法，其包含在所述培养基中包括至少20 mM的4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和/或α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物，并且由此与缺乏4-甲基-2-氧代戊酸和/或3-甲基-2-氧代戊酸和/或其衍生物或者其中所述4-甲基-2-氧代戊酸和/或3-甲基-2-氧代戊酸和/或其衍生物已被相应的氨基酸和/或其衍生物替代的其它方面相同组成的培养基相比，所得培养基在4℃或室温下储存超过90天后显示较少的颜色变化和/或较少的沉淀。
11.改进干粉末或干的颗粒状细胞培养基的溶解度的方法，通过用选自4-甲基-2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代戊酸、α-酮基异戊酸、苯丙酮酸和α-酮基γ-甲硫基丁酸和/或其衍生物的相应的酮酸完全或部分替代氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的方法，由此至少50% (摩尔比)的相应的氨基酸被相应的α酮酸和/或其衍生物替代。
13.根据权利要求11或12所述的方法，由此所述方法包括提供所述干粉末或干的颗粒状细胞培养基，其中与原始组成相比，至少50% (摩尔比)的相应的氨基酸被相应的α酮酸和/或其衍生物替代，并将所述培养基溶解于溶剂中，由此与其中氨基酸未被替代的其它方面相同组成的原始组成的培养基相比，溶解发生得更快和/或发生在更少的溶剂中。
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