JP2022527582A - ケト酸を含む細胞培養培地 - Google Patents
ケト酸を含む細胞培養培地 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022527582A JP2022527582A JP2021559723A JP2021559723A JP2022527582A JP 2022527582 A JP2022527582 A JP 2022527582A JP 2021559723 A JP2021559723 A JP 2021559723A JP 2021559723 A JP2021559723 A JP 2021559723A JP 2022527582 A JP2022527582 A JP 2022527582A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- keto
- cell culture
- medium
- methyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 94
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 title claims description 75
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 97
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 87
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 87
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract description 80
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 20
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 83
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 58
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 42
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 35
- 239000001142 4-methyl-2-oxopentanoic acid Substances 0.000 claims description 32
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 claims description 32
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 31
- RILPIWOPNGRASR-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-2-Hydroxy-3-methylpentanoic acid Natural products CCC(C)C(O)C(O)=O RILPIWOPNGRASR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000001668 3-methyl-2-oxopentanoic acid Substances 0.000 claims description 30
- JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxovaleric acid Chemical compound CCC(C)C(=O)C(O)=O JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 26
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 239000001903 2-oxo-3-phenylpropanoic acid Substances 0.000 claims description 18
- DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxycinnamic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=CC=C1 DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 17
- IFSCKRWNXKWTLR-UHFFFAOYSA-M sodium;4-methylsulfanyl-2-oxobutanoate Chemical compound [Na+].CSCCC(=O)C([O-])=O IFSCKRWNXKWTLR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 15
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 14
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 13
- 238000010923 batch production Methods 0.000 claims description 13
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 13
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 3
- OFHCOWSQAMBJIW-AVJTYSNKSA-N alfacalcidol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C OFHCOWSQAMBJIW-AVJTYSNKSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 79
- -1 keto Leu Chemical compound 0.000 description 75
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 64
- 239000000306 component Substances 0.000 description 45
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 24
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 24
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 21
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 21
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 18
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 15
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 14
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 13
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 13
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 13
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 12
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 12
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 9
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 8
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 8
- 229930003231 vitamin Chemical class 0.000 description 8
- 239000011782 vitamin Chemical class 0.000 description 8
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 8
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 3
- 230000037354 amino acid metabolism Effects 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 3
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDVFRMMRZOCFLS-UHFFFAOYSA-N 2-oxopentanoic acid Chemical compound CCCC(=O)C(O)=O KDVFRMMRZOCFLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 2
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 2
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 2
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 2
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000007686 potassium Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CN)=C1O NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 2
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 2
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001851 vibrational circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 2
- RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L (5-hydroxy-4,6-dimethylpyridin-3-yl)methyl phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP([O-])([O-])=O)C(C)=C1O RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- GJJVAFUKOBZPCB-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-(4,8,12-trimethyltrideca-3,7,11-trienyl)-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound OC1=CC=C2OC(CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)(C)CCC2=C1 GJJVAFUKOBZPCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 2-methyl-3-[(2e,6e,10e,14e)-3,7,11,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaenyl]naphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000007992 BES buffer Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- SSAYTADWPRNBQW-UHFFFAOYSA-K C(CC(O)(C(=O)[O-])CC(=O)[O-])(=O)[O-].[NH4+].[Fe+3].O.P(=O)(O)(O)[O-].[Na] Chemical compound C(CC(O)(C(=O)[O-])CC(=O)[O-])(=O)[O-].[NH4+].[Fe+3].O.P(=O)(O)(O)[O-].[Na] SSAYTADWPRNBQW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 229930195709 D-tyrosine Natural products 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-Asparagine Natural products OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-Histidine Natural products OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-Serine Natural products OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Natural products C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N Menaquinone 1 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound NC(=O)CNCCS(O)(=O)=O DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- TXRRBMSBROGTJG-UHFFFAOYSA-N NC1=CC(=C2C=CC=3C(=CC(=C4C=CC1=C2C34)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O.[Na].[Na].[Na] Chemical compound NC1=CC(=C2C=CC=3C(=CC(=C4C=CC1=C2C34)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O.[Na].[Na].[Na] TXRRBMSBROGTJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWSKCQZVXZVBHQ-DJYHDCNISA-N N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O.N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O.O.N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)O Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O.N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O.O.N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)O QWSKCQZVXZVBHQ-DJYHDCNISA-N 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N Vitamin D2 Natural products C1CCC2(C)C(C(C)C=CC(C)C(C)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003190 adenosine monophosphate Drugs 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940053200 antiepileptics fatty acid derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007860 aryl ester derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- PLKYGPRDCKGEJH-UHFFFAOYSA-N azane;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;iron Chemical compound N.[Fe].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O PLKYGPRDCKGEJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- JVYLIMILBNDJRH-UHFFFAOYSA-L dichloronickel;tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.Cl[Ni]Cl JVYLIMILBNDJRH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000007908 dry granulation Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002061 ergocalciferol Drugs 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000007603 infrared drying Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000004723 keto acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000013627 low molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001055 magnesium Nutrition 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940073640 magnesium sulfate anhydrous Drugs 0.000 description 1
- 229940091250 magnesium supplement Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052756 noble gas Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007833 oxidative deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005220 pharmaceutical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000003711 photoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 235000019175 phylloquinone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 1
- MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229960001898 phytomenadione Drugs 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 description 1
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 description 1
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 description 1
- 235000008151 pyridoxamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011699 pyridoxamine Substances 0.000 description 1
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 1
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019795 sodium metasilicate Nutrition 0.000 description 1
- CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N sodium metavanadate Chemical compound [Na+].[O-][V](=O)=O CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- WZWGGYFEOBVNLA-UHFFFAOYSA-N sodium;dihydrate Chemical compound O.O.[Na] WZWGGYFEOBVNLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLURHQRAUSIQBH-UHFFFAOYSA-N sodium;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na] WLURHQRAUSIQBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003544 thiamines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J tin(iv) chloride Chemical compound Cl[Sn](Cl)(Cl)Cl HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 229930003802 tocotrienol Natural products 0.000 description 1
- 239000011731 tocotrienol Substances 0.000 description 1
- 235000019148 tocotrienols Nutrition 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000001892 vitamin D2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011653 vitamin D2 Substances 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 1
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 238000005550 wet granulation Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、アルファケト酸を含む細胞培養培地に関する。イソロイシン、ロイシンおよびバリンのようないくつかのアミノ酸の乏しい可溶性は、それらを夫々のアルファケト酸で置換することにより克服することができる。
Description
本発明は、アルファケト酸を含む細胞培養培地に関する。イソロイシン、ロイシンおよびバリンのようないくつかのアミノ酸の乏しい可溶性は、それらを夫々のアルファケト酸で置換することにより克服することができる。
細胞培養培地は、人工的な環境における細胞の成長を支援し、維持する。
成長が支援される生物のタイプに応じて、細胞培養培地は、構成要素の複雑な混合物、ときには１００超の種々の構成要素を含む。
哺乳類の動物、昆虫または植物の細胞の増殖に要求される細胞培養培地は、典型的には、細菌および酵母の成長を支援するための培地よりもはるかに複雑である。
成長が支援される生物のタイプに応じて、細胞培養培地は、構成要素の複雑な混合物、ときには１００超の種々の構成要素を含む。
哺乳類の動物、昆虫または植物の細胞の増殖に要求される細胞培養培地は、典型的には、細菌および酵母の成長を支援するための培地よりもはるかに複雑である。
開発された最初の細胞培養培地は、血漿、血清、胚抽出物、または非定義の生物学的抽出物またはペプトンなどの未定義の構成要素からなっていた。よって、大きな進歩は、化学的に定義された培地の開発によりなされた。化学的に定義された培地は、これらに限定されるものではないが、しばしば、アミノ酸、ビタミン、金属塩、酸化防止剤、キレート剤、成長因子、緩衝剤、ホルモン、および当業者に知られている多くの物質を含む。
いくつかの細胞培養培地は、滅菌された水性液体として提案される。液体細胞培養培地の不利な点は、それらの短い貯蔵寿命と輸送および保管の困難性である。結果として、多くの細胞培養培地は、現下、細かく粉砕された乾燥粉末混合物として提案されている。これらは、水および／または水性溶液に溶解する目的のために製造され、溶解した状態では、しばしば、他の補充物と一緒に、前記細胞からのバイオ医薬の成長および／または産生のための実質的な栄養素ベースで細胞を補充するために設計されている。
多くのバイオ医薬産生プラットフォームは、フェドバッチ細胞培養プロトコルに基づく。本目的は、典型的には、増大する市場の要求に応え、製造コストを低下させる、高力価の細胞培養プロセスを開発することである。最大限の産生能力を実現するためには、高性能の組換え細胞株の使用に加えて、細胞培養培地やプロセスパラメータの改善が要求される。
フェドバッチプロセスにおいて、基本培地は初期の成長および産生を支援し、フィード培地は、栄養素の欠乏を防止し、生産フェーズを持続させる。培地は、種々の産生フェーズの間の別個の代謝要件に適応するように選択される。プロセスパラメータ―供給ストラテジーおよび制御パラメータを含む―の設定は、細胞成長およびタンパク質産生に好適な化学的および物理的環境を定義する。
フィード培地の最適化は、フェドバッチプロセスの最適化において主要な側面である。
ほとんどの場合、バイオリアクターにおける組換えタンパク質の希釈を避けるために、フィード培地は高度に濃縮されている。栄養素の制御された添加は、培養物の成長速度、バイアビリティおよび力価に直接影響する。
ほとんどの場合、バイオリアクターにおける組換えタンパク質の希釈を避けるために、フィード培地は高度に濃縮されている。栄養素の制御された添加は、培養物の成長速度、バイアビリティおよび力価に直接影響する。
しかしながら、バッチプロセスや灌流プロセスのような他の細胞培養プロセスにおいても、正確に構成され、かつしばしば高度に濃縮された培地製剤が必要である。とりわけ灌流プロセスにおいて、バイオリアクターにおける培地の定期的な交換は、オペレーターに大容量の液体培地を調製して扱うことを要求する。これらの容量を保管するために必要なフットプリントを削減するためには、培地の濃縮が要求される。
乾燥粉末からの細胞培養培地の調製のための制限因子は、いくつかの構成要素、とくにいくつかのアミノ酸の乏しい可溶性または安定性である。
その結果として、高度に濃縮された液体培地組成物を生成するのに充分に可溶性である、乾燥粉末培地組成物を提供する方法を見出すことが好ましい。
アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンの代わりに、夫々のアルファケト酸を、いずれの負の効果もなく、場合によっては、細胞成長や改善された可溶性に正の効果を伴ってさえ、使用できることを見出した。
さらに、それらのケト酸は、液体細胞培養培地製剤を安定化する効果さえ有することも見出された。
その結果として、高度に濃縮された液体培地組成物を生成するのに充分に可溶性である、乾燥粉末培地組成物を提供する方法を見出すことが好ましい。
アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンの代わりに、夫々のアルファケト酸を、いずれの負の効果もなく、場合によっては、細胞成長や改善された可溶性に正の効果を伴ってさえ、使用できることを見出した。
さらに、それらのケト酸は、液体細胞培養培地製剤を安定化する効果さえ有することも見出された。
１９５９年にアミノ酸の代謝を扱った論文の中で、いくつかのアミノ酸をそのケト酸で置換することができることが述べられている（Eagle H: Amino acid metabolism in mammalian cell cultures. Science 1959, 130(3373):432-437）。しかしながら、それ以来、ある種のケト酸が高性能の細胞培養においてアミノ酸代替物として使用できること、およびそれらが、いくつかのアミノ酸の可溶性および安定性の問題を克服するのに適していることは、全く注目されていなかった。
本発明は、したがって、４－メチル－２－オキソペンタン酸（ケトＬｅｕ）、３－メチル－２－オキソペンタン酸（ケトＩｌｅ）、アルファ－ケトイソ吉草酸（ケトＶａｌ）、フェニルピルビン酸（ケトＰｈｅ）およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸（ケトＭｅｔ）、および／またはそれらの誘導体の群のうちの少なくとも１のアルファケト酸を、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地の溶解後に得られる液体培地中で、各ケト酸および／またはそれらの誘導体の濃度が、１０ｍＭ超、好ましくは２０～６００ｍＭ、最も好ましくは３０～３００ｍＭとなる量で含む、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地に向けられる。典型的には、各ケト酸は種々の濃度で存在し、ここで、典型的には、４－メチル－２－オキソペンタン酸（ケトＬｅｕ）、３－メチル－２－オキソペンタン酸（ケトＩｌｅ）、アルファ－ケトイソ吉草酸（ケトＶａｌ）、フェニルピルビン酸（ケトＰｈｅ）および／またはそれらの誘導体は、５０ｍＭ超のより高い濃度で存在し、ここでアルファケトガンマメチルチオ酪酸（ケトＭｅｔ）は、典型的には、より低い濃度、典型的には１０～３０ｍＭで存在する。
好ましい態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地がフィード培地である場合、それは、ケト酸および／または誘導体と比較して、３０ｍｏｌ％未満の対応するアミノ酸を含む。それは、２つの化合物のモル比が３：１０未満であることを意味する。
別の態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養フィード培地は、対応するアミノ酸を含まない。
灌流培地または（フェド）バッチ基本培地のような他の培地では、アミノ酸および対応するケト酸および／またはそれらの誘導体の両方を培地製剤中に有することが好ましい場合がある。
別の態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養フィード培地は、対応するアミノ酸を含まない。
灌流培地または（フェド）バッチ基本培地のような他の培地では、アミノ酸および対応するケト酸および／またはそれらの誘導体の両方を培地製剤中に有することが好ましい場合がある。
別の態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、２以上のアルファケト酸および／またはそれらの誘導体を含む。
好ましい態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、１以上の上記に列挙したアルファケト酸のナトリウム塩を含む。
好ましい態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸および／またはそれらの塩、好ましくはそれらのナトリウム塩から選択される１以上のアルファケト酸を含む。
好ましい態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、１以上の上記に列挙したアルファケト酸のナトリウム塩を含む。
好ましい態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸および／またはそれらの塩、好ましくはそれらのナトリウム塩から選択される１以上のアルファケト酸を含む。
本発明は、少なくとも２０ｍＭ、好ましくは３０～６００ｍＭの、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸および／またはそれらの誘導体から選択される、１以上のアルファケト酸、好ましくは４－メチル－２－オキソペンタン酸および／または３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはアルファ－ケトイソ吉草酸および／またはそれらの誘導体を含む、液体細胞培養培地を安定化するための方法であって、ここでその結果得られる培地は、ケト酸および／またはそれらの誘導体を欠いている、あるいはケト酸および／またはそれらの誘導体が対応するアミノ酸および／またはそれらの誘導体により置換されている、他の点では同じ組成の培地と比較して、４℃にてまたは室温にて９０日にわたって保管した場合、少ない色変化および／または少ない沈殿を示す、前記方法に向けられている。
本発明は、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンの１以上を４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群から選択される対応するケト酸により完全にまたは部分的に置換することにより、定義された組成の乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地の可溶性を改善するための方法にさらに向けられている。
好ましい態様において、少なくとも５０％、より好ましくは７０％、最も好ましくは少なくとも９０％（モル比）の夫々のアミノ酸は、対応するアルファケト酸および／またはそれらの誘導体により置換されている。
この場合において、置換することとは、所与の量のアミノ酸の代わりに、少なくとも８０ｍｏｌ％、典型的にはほぼ１００ｍｏｌ％の対応するケト酸および／またはそれらの誘導体が培地に添加されることを意味する。好ましくは、１００～１５０ｍｏｌ％の対応するケト酸および／またはそれらの誘導体が培地に添加される。
この場合において、置換することとは、所与の量のアミノ酸の代わりに、少なくとも８０ｍｏｌ％、典型的にはほぼ１００ｍｏｌ％の対応するケト酸および／またはそれらの誘導体が培地に添加されることを意味する。好ましくは、１００～１５０ｍｏｌ％の対応するケト酸および／またはそれらの誘導体が培地に添加される。
好ましい態様において、方法は、上で説明したようにアミノ酸が置換されている乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地を提供すること、および前記培地を溶解することを含み、アミノ酸が置換されていない他の点において同一の組成の培地と比較して、溶解がより速く、および／またはより少ない液体で生じる。
別の好ましい態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒培地は、溶解して、８．５以下のｐＨを有する液体培地を与える。
好ましい態様において、それは溶解して、６．５～８．５、最も好ましくは６．７～７．８のｐＨを有する液体培地を与える。
別の好ましい態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒培地は、溶解して、８．５以下のｐＨを有する液体培地を与える。
好ましい態様において、それは溶解して、６．５～８．５、最も好ましくは６．７～７．８のｐＨを有する液体培地を与える。
一態様において、可溶性が改善された乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、少なくとも１以上の糖類構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤構成要素、１以上の補因子および１以上の核酸構成要素を含む。
別の態様において、可溶性が改善された乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、溶解して、５０～４００ｇ／ｌ、好ましくは１００～３００ｇ／の溶媒に溶解する固体成分を含む液体培地をもたらし、および／または、各ケト酸および／またはその塩の濃度が１０ｍＭ超、好ましくは３０～６００ｍＭである。
本発明は、さらに、
ａ）４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群のうちの少なくとも１のアルファケト酸を細胞培養培地の他の構成要素と混合すること
ｂ）ステップａ）の混合物を粉砕に供すること
による、本発明による乾燥粉末細胞培養培地を生産するための方法に向けられる。
ａ）４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群のうちの少なくとも１のアルファケト酸を細胞培養培地の他の構成要素と混合すること
ｂ）ステップａ）の混合物を粉砕に供すること
による、本発明による乾燥粉末細胞培養培地を生産するための方法に向けられる。
好ましい態様において、ステップｂ）は、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルで行われる。
別の好ましい態様において、ステップａ）からの混合物は、粉砕に先立ち、０℃未満の温度に冷却される。
別の好ましい態様において、ステップａ）からの混合物は、粉砕に先立ち、０℃未満の温度に冷却される。
本発明は、
ａ）バイオリアクターを提供すること、
ｂ）培養される細胞を、１以上の、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンが、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸、および／またはそれらの誘導体の群から選択される対応するケト酸により部分的または全体的に置換されている液体細胞培養培地と混合すること
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすること
による、細胞を培養するためのプロセスにさらに向けられる。
ａ）バイオリアクターを提供すること、
ｂ）培養される細胞を、１以上の、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンが、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸、および／またはそれらの誘導体の群から選択される対応するケト酸により部分的または全体的に置換されている液体細胞培養培地と混合すること
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすること
による、細胞を培養するためのプロセスにさらに向けられる。
好ましい態様において、液体細胞培養培地は、１０ｍＭ超の濃度で存在する各ケト酸および／またはその誘導体を含む。
本発明はまた、
－細胞および水性細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること
－バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること
－バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたって連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、この場合においてフィード培地である細胞培養培地をバイオリアクターに添加すること
ここで、フィード培地は、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群からの少なくとも１のアルファケト酸を含む、
による、バイオリアクター中で細胞を培養するためのフェドバッチプロセスにも向けられる。
本発明はまた、
－細胞および水性細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること
－バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること
－バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたって連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、この場合においてフィード培地である細胞培養培地をバイオリアクターに添加すること
ここで、フィード培地は、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群からの少なくとも１のアルファケト酸を含む、
による、バイオリアクター中で細胞を培養するためのフェドバッチプロセスにも向けられる。
好ましくは、フィード培地は、少なくとも４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸および／またはそれらの塩を、各２０～６００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２０～４００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含む。
本発明は、１以上の、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンが、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸、および／またはそれらの誘導体の群から選択される対応するケト酸により部分的または全体的に置換されている、液体細胞培養培地を用いた灌流プロセスにさらに向けられる。
本発明は、１以上の、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンが、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸、および／またはそれらの誘導体の群から選択される対応するケト酸により部分的または全体的に置換されている、液体細胞培養培地を用いた灌流プロセスにさらに向けられる。
本発明による細胞培養培地は、細胞のin vitroでの成長を維持および／または支援する構成要素のあらゆる混合物である。それは、複合培地または化学的に定義された培地であり得る。細胞培養培地は、細胞のin vitroでの成長を維持および／または支援するために必要なすべての構成要素を含むことができ、あるいは、さらなる構成要素が個別に添加されるようにいくつかの構成要素のみを含むことができる。本発明による細胞培養培地の例は、細胞のin vitro成長を維持および／または支援するために必要なすべての成分を含む完全な培地、ならびに培地補充物またはフィードである。好ましい態様において、細胞培養培地は、完全培地、灌流培地またはフィード培地である。完全培地はまた、基本培地とも呼ばれ、典型的には６．７～７．８のｐＨを有する。フィード培地は、好ましくは８．５未満のｐＨを有する。
典型的には、本発明による細胞培養培地は、バイオリアクター中の細胞の成長を維持および／または支援するために使用される。
フィードまたはフィード培地は、細胞培養における初期成長および産生を支援する基本培地ではなく、栄養素の欠乏を防止し、産生フェーズを維持するために後のステージで添加される細胞培養培地ではなく、産生フェーズを持続させるために後期段階に添加される培地である。フィード培地は、基本培養培地と比較して、より高濃度のいくつかの構成要素を有し得る。例えば、アミノ酸または炭水化物を含む栄養素などの、例えばいくつかの構成要素は、基本培地の濃度の約５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１２Ｘ、１４Ｘ、１６Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、５０Ｘ、１００Ｘ、２００Ｘ、４００Ｘ、６００Ｘ、８００Ｘ、または約１０００Ｘでフィード培地中に存在してもよい。
フィードまたはフィード培地は、細胞培養における初期成長および産生を支援する基本培地ではなく、栄養素の欠乏を防止し、産生フェーズを維持するために後のステージで添加される細胞培養培地ではなく、産生フェーズを持続させるために後期段階に添加される培地である。フィード培地は、基本培養培地と比較して、より高濃度のいくつかの構成要素を有し得る。例えば、アミノ酸または炭水化物を含む栄養素などの、例えばいくつかの構成要素は、基本培地の濃度の約５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１２Ｘ、１４Ｘ、１６Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、５０Ｘ、１００Ｘ、２００Ｘ、４００Ｘ、６００Ｘ、８００Ｘ、または約１０００Ｘでフィード培地中に存在してもよい。
哺乳類細胞培養培地は、哺乳類細胞のin vitroでの成長を維持および／またはサポートする構成要素の混合物である。哺乳類細胞の例は、ヒトまたは動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＩＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＫ－１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ハイブリドーマ細胞またはヒト細胞である。
化学的に定義される細胞培養培地は、化学的に定義されないいかなる物質も含まない細胞培養培地である。これは、培地において使用されるすべての化学物質の化学的組成が、知られていることを意味する。化学的に定義される培地は、いかなる酵母、動物、または植物組織をも含まない；それらは、フィーダー細胞、血清、加水分解物、抽出物、または消化物、または、他の不完全に定義される構成要素を、含まない。化学的に定義されない、または、不完全に定義される化学物質構成要素は、化学的組成および構造が知られていないものであり、変化する組成で存在し、または、インスリン、アルブミンまたはカゼインのようなタンパク質の化学的組成および構造の評価に匹敵する、膨大な実験的な努力によりのみ定義され得る。
粉末状の細胞培養培地または乾燥粉末培地は、典型的に、粉砕プロセスまたは凍結乾燥プロセスから生じる細胞培養培地である。それは、粉末状の細胞培養培地が、顆粒状の、粒子状の培地であり―液体培地でないことを意味する。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と交換可能に使用してもよい；本明細書に使用されるとき、「乾燥粉末」は、単に、顆粒状の材料の全体的な外観を指しており、別段の指示がない限り、材料が複合体化したまたは凝集した溶媒を完全に含まないことを意味することを意図しない。
乾燥顆粒培地は、湿式または乾式の造粒プロセスから生じる乾燥培地である。好ましくは、それは乾燥粉末培地のローラー圧縮から生じる培地である。本明細書で使用されるとき、乾燥なる用語は、単に、顆粒状の材料の全体的な外観を指しており、別段の指示がない限り、材料が複合体化したまたは凝集した溶媒を完全に含まないことを意味することを意図しない。
本発明による培地を用いて培養される細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞、または植物または動物細胞のような真核生物細胞でもよい。細胞は、正常細胞、不死化細胞、異常細胞、形質転換細胞、突然変異細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆細胞、または胚細胞であることができ、それらのいずれも、確立されまたは形質転換された細胞株であり得、または天然の供給源から得られ得る。
粒子のサイズは、粒子の平均直径を意味する。粒子直径は、レーザー光散乱法（Mastersizer 3000, Malvern）によって決定される。
液体細胞培養培地の色の変化は、好ましくは視覚的にまたは分光学的に決定される。
沈殿は、視覚的にまたは比濁法により決定することができる。
液体細胞培養培地の色の変化は、好ましくは視覚的にまたは分光学的に決定される。
沈殿は、視覚的にまたは比濁法により決定することができる。
不活性雰囲気は、それぞれのコンテナまたは器具を不活性気体で満たすことによって生成される。適切な不活性気体は、アルゴンまたは好ましくは窒素のような希ガスである。これらの不活性気体は、非反応性であり、望ましくない化学反応が起こることを防ぐ。本発明によるプロセスにおいて、不活性雰囲気の生成は、例えば液体窒素または窒素気体を導入することにより、酸素の濃度が絶対的に１０％（ｖ／ｖ）未満に減少されることを意味する。
さまざまなタイプのミルは、当業者に公知である。
遠心衝撃ミルとも呼ばれるピンミルは、高速回転ディスク上の突出したピンが、破断エネルギーを提供するそれによって固体を微粉砕する。
例えばピンミルは、Munson Machinery（USA）、Premium Pulman（India）、またはSturtevant（USA）により販売されている。
ジェットミルは圧縮気体を利用して粒子を加速し、それらをプロセスチャンバー中で互いに衝突させる。ジェットミルは、例えばSturtevant（USA）、またはPMT（Austria）で販売されている。
Fitzpatrick（USA）によって市販されているフィッツミルは、粉砕するための刃をもつローターを使用する。
遠心衝撃ミルとも呼ばれるピンミルは、高速回転ディスク上の突出したピンが、破断エネルギーを提供するそれによって固体を微粉砕する。
例えばピンミルは、Munson Machinery（USA）、Premium Pulman（India）、またはSturtevant（USA）により販売されている。
ジェットミルは圧縮気体を利用して粒子を加速し、それらをプロセスチャンバー中で互いに衝突させる。ジェットミルは、例えばSturtevant（USA）、またはPMT（Austria）で販売されている。
Fitzpatrick（USA）によって市販されているフィッツミルは、粉砕するための刃をもつローターを使用する。
連続的に実行されるプロセスは、バッチ式では実行されないプロセスである。粉砕するプロセスが連続的に実行される場合、それは、培地成分が永久にかつ着実に、ある時間にわたってミルへ供給されることを意味する。
本発明よる細胞培養培地、とくに完全培地は、典型的には、少なくとも１以上の糖構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝液構成要素、１以上の補因子、および１以上の核酸構成要素を含む。
本発明よる細胞培養培地、とくに完全培地は、典型的には、少なくとも１以上の糖構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝液構成要素、１以上の補因子、および１以上の核酸構成要素を含む。
培地はまた、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物性タンパク質、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック酸および／または化学的に調製される非イオン性界面活性剤等の界面活性構成要素をも含んでもよい。適切な非イオン性界面活性剤の１つの例は、ポロクサマーとも呼ぶ、一級水酸基で終結する二官能基ブロックコポリマー界面活性剤である（例えば商標名pluronic（登録商標）の下でBASF、Germanyから入手できる）。
糖構成要素は、グルコース、ガラクトース、リボース、またはフルクトース（単糖の例）、またはスクロース、ラクトース、またはマルトース（二糖の例）等の、すべて単糖または二糖である。
本発明に従うアミノ酸の例は、チロシン、タンパク質有機アミノ酸、特に必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリン、ならびにＤ－アミノ酸等の非タンパク質有機アミノ酸であり、Ｌ－アミノ酸が好ましい。
アミノ酸の用語は、ナトリウム塩などのアミノ酸の塩、または夫々の水和物または塩酸塩をさらに含む。
例えば、チロシンは、Ｌ－またはＤ－チロシン、好ましくはＬ－チロシン、ならびにその塩または水和物または塩酸塩を意味する。
本発明に従うアミノ酸の例は、チロシン、タンパク質有機アミノ酸、特に必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリン、ならびにＤ－アミノ酸等の非タンパク質有機アミノ酸であり、Ｌ－アミノ酸が好ましい。
アミノ酸の用語は、ナトリウム塩などのアミノ酸の塩、または夫々の水和物または塩酸塩をさらに含む。
例えば、チロシンは、Ｌ－またはＤ－チロシン、好ましくはＬ－チロシン、ならびにその塩または水和物または塩酸塩を意味する。
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、各種のレチノイドおよび４つのカロチノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）、およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体も包含される。
塩の例は、無機イオン、例えば重炭酸塩、カルシウム、クロライド、マグネシウム、リン酸塩、カリウム、およびナトリウム、または微量元素、例えばＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、Ｖ、およびＺｎを含む構成要素である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）、無水リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、無水リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物である。
緩衝液の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸塩）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、およびＴＲＩＳである。
緩衝液の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸塩）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、およびＴＲＩＳである。
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン、へムヌクレオチドリン酸および誘導体である。
本発明に従って、核酸構成要素は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、またはウラシルのような核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、およびチミジンのようなヌクレオシド、およびアデノシン一リン酸またはアデノシン二リン酸またはアデノシン三リン酸のようなヌクレオチドである。
本発明に従って、核酸構成要素は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、またはウラシルのような核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、およびチミジンのようなヌクレオシド、およびアデノシン一リン酸またはアデノシン二リン酸またはアデノシン三リン酸のようなヌクレオチドである。
フィード培地は、完全培地と比較して、異なる組成を有していてもよい。それらは、典型的には、アミノ酸、微量元素、およびビタミンを含む。それらはまた、糖類構成要素を含んでいてもよいが、ときには生産の理由から糖類構成要素は別々のフィードにおいて添加される。
好適なフィード培地は、例えば、１以上の以下の化合物を含んでいてもよい：
Ｌ－アスパラギン一水和物
Ｌ－イソロイシン
Ｌ－フェニルアラニン
Ｌ－グルタミン酸ナトリウム一水和物
Ｌ－ロイシン
Ｌ－トレオニン
Ｌ－リシン一塩酸塩
Ｌ－プロリン
Ｌ－セリン
Ｌ－アルギニン一塩酸塩
Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物
Ｌ－メチオニン
Ｌ－バリン
Ｌ－アスパラギン酸一ナトリウム一水和物
Ｌ－トリプトファン
塩化コリン
ＭＹＯ－イノシトール
ニコチンアミド
パントテン酸カルシウム－Ｄ（＋）
ピリドキシン塩酸塩
チアミン塩化物塩酸塩
微粉化ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）
ビオチン
葉酸
リボフラビン
Ｌ－アスパラギン一水和物
Ｌ－イソロイシン
Ｌ－フェニルアラニン
Ｌ－グルタミン酸ナトリウム一水和物
Ｌ－ロイシン
Ｌ－トレオニン
Ｌ－リシン一塩酸塩
Ｌ－プロリン
Ｌ－セリン
Ｌ－アルギニン一塩酸塩
Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物
Ｌ－メチオニン
Ｌ－バリン
Ｌ－アスパラギン酸一ナトリウム一水和物
Ｌ－トリプトファン
塩化コリン
ＭＹＯ－イノシトール
ニコチンアミド
パントテン酸カルシウム－Ｄ（＋）
ピリドキシン塩酸塩
チアミン塩化物塩酸塩
微粉化ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）
ビオチン
葉酸
リボフラビン
硫酸マグネシウム無水
硫酸銅（ＩＩ）五水和物
硫酸亜鉛七水和物
１，４－ジアミノブタン二塩酸塩
へプタモリブデン酸アンモニウム四水和物
硫酸カドミウム水和物
塩化マンガン（ＩＩ）四水和物
塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物
メタケイ酸ナトリウム
メタバナジン酸ナトリウム
塩化スズ（ＩＩ）二水和物
亜セレン酸ナトリウム（約４５％ＳＥ）
リン酸二水素ナトリウム一水和物
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム（約１８％ＦＥ）。
硫酸銅（ＩＩ）五水和物
硫酸亜鉛七水和物
１，４－ジアミノブタン二塩酸塩
へプタモリブデン酸アンモニウム四水和物
硫酸カドミウム水和物
塩化マンガン（ＩＩ）四水和物
塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物
メタケイ酸ナトリウム
メタバナジン酸ナトリウム
塩化スズ（ＩＩ）二水和物
亜セレン酸ナトリウム（約４５％ＳＥ）
リン酸二水素ナトリウム一水和物
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム（約１８％ＦＥ）。
本発明に従って、凍結することは、０℃未満の温度に冷却することを意味する。
灌流プロセスにおいて、細胞培養培地をバイオリアクターに連続的に添加され、ポンプを通して取り出され、一方で細胞は細胞保持デバイスによりバイオリアクター中に保持される。灌流の利点は、（定期的な培地交換に起因して）極めて高い細胞密度に到達する可能性、および生成物をバイオリアクターから毎日取り出すことができ、よって高温、酸化還元電位、または放出された細胞プロテアーゼへの暴露時間が低減するので、極めて壊れやすい組換えタンパク質を生産できる可能性があることである。
灌流プロセスにおいて、細胞培養培地をバイオリアクターに連続的に添加され、ポンプを通して取り出され、一方で細胞は細胞保持デバイスによりバイオリアクター中に保持される。灌流の利点は、（定期的な培地交換に起因して）極めて高い細胞密度に到達する可能性、および生成物をバイオリアクターから毎日取り出すことができ、よって高温、酸化還元電位、または放出された細胞プロテアーゼへの暴露時間が低減するので、極めて壊れやすい組換えタンパク質を生産できる可能性があることである。
灌流細胞培養のためのプロセスは、典型的には、培地入口および収穫物出口を備えたバイオリアクターを含むバイオリアクターシステムで細胞を培養することを含み、ここで
ｉ．細胞培養プロセスの間、連続的にまたは１回もしくは数回、好ましくは連続的に、新しい細胞培養培地が、培地入口を介してバイオリアクターに挿入される
ｉｉ．細胞培養プロセスの間、連続的にまたは１回または数回、好ましくは連続的に、収穫物が収穫物出口を介してバイオリアクターから取り出される。収穫物は、典型的には、細胞によって産生された目的生成物、細胞、および液体細胞培養培地を含む。
ｉ．細胞培養プロセスの間、連続的にまたは１回もしくは数回、好ましくは連続的に、新しい細胞培養培地が、培地入口を介してバイオリアクターに挿入される
ｉｉ．細胞培養プロセスの間、連続的にまたは１回または数回、好ましくは連続的に、収穫物が収穫物出口を介してバイオリアクターから取り出される。収穫物は、典型的には、細胞によって産生された目的生成物、細胞、および液体細胞培養培地を含む。
アミノ酸は、細胞の成長を支援するのに重要であるので、細胞培養培地の必須の構成要素である。加えて、アミノ酸は、哺乳類の細胞培養技術を使用して生産される組換えタンパク質の重要な構成ブロックである。アミノ酸の可溶性は、細胞培養培地およびフィード製剤の濃縮を妨げる制限因子である。そのような濃縮は、次世代の製造プラットフォームを開発するために必須である。とりわけ、インライン希釈を使用するバイオ製造プロセスは、タンクに保管しなければならない細胞培養培地の体積を削減し（＝製造フットプリントを削減し）、または一般的にはフェッドバッチプロセスを通して添加するフィードの体積を削減し、よって体積力価（volumetric titer）を高める可能性があるため、高度に濃縮された製剤が要求される。
細胞培養培地中のいくつかのアミノ酸は、それらのケト酸またはそれらの塩で置き換えることができることが見出されている。アミノ酸供給源としてのそれらの使用に加えて、とくにこれらのケト酸のナトリウム塩は、それらの対応するアミノ酸と比較して高い可溶性を示し、したがって高度に濃縮された製剤に使用することができる。可溶性の利点を別にして、ケト酸の使用はまた、既知の毒性および阻害性代謝体である細胞培養中のアンモニアの低減を可能にすることが見出されている。さらにまた、ある種のケト酸の使用は、ＲＴにて保管した場合に、色の変化が少なく、沈殿がない、または遅延する、および副生成物の形成が少ない、または遅延する、より安定した製剤が得られることが証明された。
よって、アミノ酸のケト酸およびそれらの塩は、以下の適用のために細胞培養培地製剤に使用することができる。
・適用１：全体の培地／フィード可溶性を増大させること
・適用２：対応するアミノ酸を置き換え、細胞培養中のアンモニウムイオン／アンモニア製剤を低減させること
・適用３：培地安定性を増大させ、４℃または室温での製剤の保管に起因する色の変化および沈殿を低減させ、フィード保管の間のアンモニアの形成を低減させること
・適用１：全体の培地／フィード可溶性を増大させること
・適用２：対応するアミノ酸を置き換え、細胞培養中のアンモニウムイオン／アンモニア製剤を低減させること
・適用３：培地安定性を増大させ、４℃または室温での製剤の保管に起因する色の変化および沈殿を低減させ、フィード保管の間のアンモニアの形成を低減させること
表１は、アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンならびにそれらの対応するケト酸または対応するケト酸のナトリウム塩を示す。表１から見ることができるように、対応するケト酸の可溶性は、アミノ酸の可溶性よりも高い。
表１ アミノ酸およびそれらの夫々のケト酸またはそれらの塩の２５℃における水への可溶性。可溶性実験は、赤外線乾燥後、飽和溶液および残存質量決定を使用して行った。
アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよび／またはメチオニンを部分的にまたは全体的に、対応するケト酸および／またはそれらの誘導体で置換することにより、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地の可溶性を、他の点では同一の細胞培養培地と比較して、細胞培養の性能に負の効果を有することなく改善できることが見出されている。好ましい態様において、ケト酸のナトリウム塩は、それらが典型的に最も高い可溶性を示すために使用される。
好適な誘導体は、金属塩誘導体、ペプチド誘導体、エステル誘導体、およびその他の誘導体である。誘導体はケト酸誘導体であり、対応するアミノ酸と比較して水への高い可溶性を有し、それらは、対応するアミノ酸に細胞内で協働して戻るか、さもなければ細胞のin vitroでの成長を維持および／または支援するその役割において対応するアミノ酸を置換することができる。
金属塩誘導体は、最も好ましい誘導体である。これらは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはマグネシウム塩のようなケト酸の金属塩であり、好ましくはナトリウム塩である。
金属塩誘導体は、最も好ましい誘導体である。これらは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはマグネシウム塩のようなケト酸の金属塩であり、好ましくはナトリウム塩である。
ペプチド誘導体は、１つ以上、典型的には１つ、２つまたは３つのアミノ酸が、ペプチド結合を介してケト酸へ連結されている誘導体である。ケトロイシンのこの場合において、ペプチド誘導体の構造式を以下のスキーム１に示す：
Ｒ１はアミノ酸側鎖であり、Ｒ２はペプチド結合を介して連結した別のアミノ酸である。
エステル誘導体は、ケト酸のカルボン酸がアルキルまたはアリールエステルを形成する誘導体である。最も好ましくは、Ｃ１～Ｃ４アルキルエステルである。ケト－ロイシンエステル誘導体の例をスキーム２に示す：
Ｒ２はアルキルまたはアリールであり、アルキル基は－ＯＨまたはＯＲ２
でさらに置換されていてもよく、または例えば、エーテルまたはエステルを形成してもよい。
でさらに置換されていてもよく、または例えば、エーテルまたはエステルを形成してもよい。
好適なＲ２の例は、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ベンジルおよび
である。
他の誘導体は、スキーム３に示される：
ケトロイシンについて示した上の例は、もちろん、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸の群のうちの他のケト酸についても等しくに実現することができる。
本発明は、したがって、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群のうちの少なくとも１のアルファケト酸、好ましくは金属塩誘導体、最も好ましくはナトリウム塩を含む、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地に向けられる。好ましい態様において、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはアルファ－ケトイソ吉草酸のナトリウム塩、最も好ましくは３つのケト酸すべてのナトリウム塩を含む。
乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地中のケト酸の量は、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地の溶解後に得られる液体培地中の各ケト酸および／またはその誘導体の濃度が１０ｍＭ超、好ましくは２０～６００ｍＭ、最も好ましくは３０～３００ｍＭとなるようにする。
一態様において、上に定義されるとおりのケト酸を含む乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、対応するアミノ酸を含まない。別の態様において、上に定義されるとおりのケト酸を含む乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地は、５０％（ｍｏｌ％）までの対応するアミノ酸を含む。
乾燥粉末または乾燥顆粒培地の使用のために、溶媒、好ましくは水（最も具体的には蒸留水および／または脱イオン水、また精製水また注射用水）または水性緩衝剤が培地に添加され、構成要素は、培地が溶媒に完全に溶解するまでを混合される。
乾燥粉末または乾燥顆粒培地の使用のために、溶媒、好ましくは水（最も具体的には蒸留水および／または脱イオン水、また精製水また注射用水）または水性緩衝剤が培地に添加され、構成要素は、培地が溶媒に完全に溶解するまでを混合される。
溶媒はまた、生理食塩水、好適なｐＨ範囲（典型的にはｐＨ１．０～ｐＨ１０．０の間の範囲、好ましくは６．５～８．５の範囲）を提供する可溶性の酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、保存料、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒を含んでいてもよい。
また、細胞培養培地および溶媒の混合物に、ｐＨ調整のための緩衝剤物質、ウシ胎仔血清、糖類などの物質をさらに添加することも可能である。その結果得られる液体細胞培養培地を、次いで成長または維持される細胞と接触させる。
また、細胞培養培地および溶媒の混合物に、ｐＨ調整のための緩衝剤物質、ウシ胎仔血清、糖類などの物質をさらに添加することも可能である。その結果得られる液体細胞培養培地を、次いで成長または維持される細胞と接触させる。
より高濃度のロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンを含む乾燥粉末または乾燥顆粒培地組成物は、アミノ酸の限定された可溶性に起因して、溶媒と混合した場合、濁りを示す一方で、同じ濃度の対応するケト酸および／またはそれらの誘導体を使用する本発明による細胞培養培地は透明な溶液を与える。これはフィード培地にとくに好適である。
その結果得られる、ケト酸および／またはそれらの誘導体を含む液体培地は、細胞培養において少なくとも同じ性能を示す。アミノ酸は、対応するケト酸および／または誘導体、好ましくはそれらの塩で完全に置換できることが見出されている。それにもかかわらず、アミノ酸を部分的にのみ置換することもまた可能である。この場合、好ましくはアミノ酸の５０％（ｍｏｌ％）以上が対応するケト酸および／またはそれらの誘導体によって置換される。
いくつかの場合において、置換されるアミノ酸の量と比較して、ケト酸の量を修正し、とくに大きくすることが有利な場合がある。イソロイシン、ロイシンおよびバリンの置換については、典型的には１：１の置換で充分である一方で、フェニルアラニンおよびメチオニンについては、典型的には、アミノ酸の量と比較してより多くのケト酸を添加することが好ましいことが見出されている。典型的には、１：１．１～１：３（モルベース）の置換が好適である。
好ましくは、アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンを、対応するケト酸および／またはそれらの誘導体で、とくにケト酸のナトリウム塩で完全に置換することにより、培地の最大可溶性を大きくすることができる。例３に見ることができるように、乾燥粉末培地の可溶性を、例として２倍にすることができる。
上記のようにアミノ酸を置換することによる乾燥粉末または乾燥顆粒培地の可溶性の改善に加えて、ロイシンおよび／またはイソロイシンを対応するケト酸および／またはそれらの塩で置き換えられている培地を使用した場合、細胞培養の比生産性が大きくなることがさらに、予想外に見出された。
上記のようにアミノ酸を置換することによる乾燥粉末または乾燥顆粒培地の可溶性の改善に加えて、ロイシンおよび／またはイソロイシンを対応するケト酸および／またはそれらの塩で置き換えられている培地を使用した場合、細胞培養の比生産性が大きくなることがさらに、予想外に見出された。
ロイシンおよび／またはイソロイシンを対応するケト酸および／またはそれらの塩で置き換えられている培地を使用して生産したＩｇＧ１の３つの重大な品質特性は、アミノ酸を使用した対照条件と置換した条件との間に差がないことをさらに示すことができた。３つの重大な品質特性は、グリコシル化パターン、抗体凝集および断片化、ならびに電荷バリアントである。
ケト酸および／またはそれらの誘導体、とくにロイシン、イソロイシンおよびバリンのケト酸および／または塩、好ましくは４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはそれらの塩は、液体細胞培養培地製剤の安定化に好適であることがさらに見出された。
前記構成要素を含む液体培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはそれらの塩を含まないが、同じ量の対応するアミノ酸を含む培地と比較して、光暴露の有無にかかわらず、室温または４℃のいずれかで３か月にわたり保管した場合、少ない色の変化を示す。これらはまた、沈殿の減少も示した。
前記構成要素を含む液体培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはそれらの塩を含まないが、同じ量の対応するアミノ酸を含む培地と比較して、光暴露の有無にかかわらず、室温または４℃のいずれかで３か月にわたり保管した場合、少ない色の変化を示す。これらはまた、沈殿の減少も示した。
この効果は、対応するアミノ酸、例としてイソロイシンおよび／またはロイシンを、対応するケト酸および／またはそれらの誘導体で置換した場合に、到達することができる。これは、ロイシンおよび／またはイソロイシンを含む細胞培養培地製剤に、対応するケト酸、例として４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはそれらの誘導体を添加した場合にも到達することができる。これは、ケト酸および／またはそれらの誘導体が、培地組成に関係なく、培地安定剤として使用できることを意味する。液体製剤中の好適な濃度は、少なくとも２０ｍＭ、好ましくは３０～６００ｍＭである。
本発明の粉末細胞培養培地は、好ましくはすべての構成要素を混合し、それらを粉砕することにより生産される。構成要素を混合することは、粉砕することにより乾燥粉末細胞培養培地を生産する当業者に周知である。好ましくは、混合物のすべての部分がほとんど同じ組成を有するように、すべての構成要素は完全に混合される。均質な細胞成長に関して、組成物の均一性がより高いほど、結果として生じる培地の質は、より良好である。
粉砕は、細胞培養培地の製造のために適切なミルのいかなるタイプによっても、実施することができる。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミル、またはジェットミルである。好ましくは、ピンミル、フィッツミル、またはジェットミル、非常に好ましくは、ピンミルである。
当業者は、かかるミルの実行の仕方を知っている。
粉砕は、細胞培養培地の製造のために適切なミルのいかなるタイプによっても、実施することができる。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミル、またはジェットミルである。好ましくは、ピンミル、フィッツミル、またはジェットミル、非常に好ましくは、ピンミルである。
当業者は、かかるミルの実行の仕方を知っている。
約４０ｃｍのディスク直径をもつ大規模装置ミルは、例えば、ピンミルの場合には典型的には毎分１～６５００回転、好ましくは毎分１～３０００回転で実行される。
粉砕は、標準的な粉砕条件の下で行われることができ、１０と３００μｍとの間、もっとも好ましくは、２５と１２０μｍとの間の粒子サイズをもつ粉末に、結果としてなる。
粉砕は、標準的な粉砕条件の下で行われることができ、１０と３００μｍとの間、もっとも好ましくは、２５と１２０μｍとの間の粒子サイズをもつ粉末に、結果としてなる。
粒子のサイズは、粒子の直径を意味する。粒子直径は、レーザー光散乱によって決定される。この技法を使用すると、粒子サイズは体積相当球直径として報告される。
粒子サイズ範囲は、７５％以上、好ましくは９０％以上の粒子が有する粒子サイズの範囲を与える。これは、粒子サイズが２５～１２０μｍの場合、少なくとも７５％の粒子が２５～１２０μｍの粒子サイズを有することを意味する。
粒子サイズ範囲は、７５％以上、好ましくは９０％以上の粒子が有する粒子サイズの範囲を与える。これは、粒子サイズが２５～１２０μｍの場合、少なくとも７５％の粒子が２５～１２０μｍの粒子サイズを有することを意味する。
好ましくは、粉砕に供される混合物のすべての構成要素は、乾燥している。これは、それらが水を含む場合、それらは、非結合またはまとまっていない水分子の重量として、１０％より多くなく、好ましくは５％より多くなく、最も好ましくは２％より多くない水の結晶を含むだけであることを意味する。
好ましい態様において、粉砕は、不活性雰囲気中で実施される。好ましい不活性保護気体は、窒素である。
好ましい態様において、粉砕は、不活性雰囲気中で実施される。好ましい不活性保護気体は、窒素である。
さらなる好ましい態様において、混合物のすべての構成要素は、粉砕に先だって凍結される。粉砕に先だつ成分の凍結は、０℃を下回る、およびもっとも好ましくは－２０℃を下回る温度まで成分の冷却を確保するいかなる手段によっても、なされることができる。好ましい態様において、凍結は、液体窒素によってなされる。これは、例えばミルへの導入に先立って、成分が貯蔵された容器へ液体窒素を注ぐことによって、成分が、液体窒素で処置されることを意味する。好ましい態様において、容器は、フィーダー(a feeder)である。容器がフィーダーである場合、好ましくは、液体窒素は、成分が導かれるフィーダーのそばに、またはそのそばの近くに導かれる。
典型的には、成分は、２～２０秒にわたって液体窒素によって処置される。
好ましくは、成分の冷却は、ミルに入るすべての成分が、０℃を下回る、もっとも好ましくは－２０℃を下回る温度であるやり方で、なされる。
好ましくは、成分の冷却は、ミルに入るすべての成分が、０℃を下回る、もっとも好ましくは－２０℃を下回る温度であるやり方で、なされる。
好ましい態様において、すべての成分は、混合物がフィーダー、もっとも好ましくはメータリングスクリューフィーダーの中に移された容器の中に置かれる。フィーダーの中で、成分は、時にさらに混合され－フィーダーのタイプに応じ－、および追加で冷却される。凍結された混合物は、ミルの中で粉砕される混合物が、好ましくは０℃を下回る、より好ましくは－２０℃を下回る温度を依然として有するように、フィーダーからミルへ移される。
典型的には、混合時間（フィーダー中の成分の混合物の滞流時間を意味する）が、１分間超、好ましくは１５と６０分との間にある。
メータリングスクリューフィーダー（軽量スネールとも呼ばれる）は、典型的には、１分当たり１０～２００回転、好ましくは４０～６０回転の速度で実行される。
メータリングスクリューフィーダー（軽量スネールとも呼ばれる）は、典型的には、１分当たり１０～２００回転、好ましくは４０～６０回転の速度で実行される。
典型的には、粉砕する温度は、－５０と＋３０℃との間に保たれる。好ましい態様において、温度は、およそ１０℃に保たれる。
粉砕する間の酸素レベルは、好ましくは１０％（ｖ／ｖ）未満である。
プロセスは、例えばバッチ毎にまたは連続的に実行されることができる。好ましい態様において、本発明に従うプロセスは、ある時間にわたって、冷却のために成分の混合物をフィーダーに永続的に満たし、そして、フィーダーからの冷却した混合物をミルに永続的に満たすことによって、連続的になされる。
粉砕する間の酸素レベルは、好ましくは１０％（ｖ／ｖ）未満である。
プロセスは、例えばバッチ毎にまたは連続的に実行されることができる。好ましい態様において、本発明に従うプロセスは、ある時間にわたって、冷却のために成分の混合物をフィーダーに永続的に満たし、そして、フィーダーからの冷却した混合物をミルに永続的に満たすことによって、連続的になされる。
本発明は、
ａ）バイオリアクターを提供すること
ｂ）好ましくは１０ｍＭ超の濃度で、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群のうちの少なくとも１のアルファケト酸を含む液体細胞培養培地を提供すること
ｃ）培養される細胞を液体細胞培養培地と混合すること
ｄ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすること
による、細胞を培養するためのプロセスにさらに向けられる。
ａ）バイオリアクターを提供すること
ｂ）好ましくは１０ｍＭ超の濃度で、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群のうちの少なくとも１のアルファケト酸を含む液体細胞培養培地を提供すること
ｃ）培養される細胞を液体細胞培養培地と混合すること
ｄ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすること
による、細胞を培養するためのプロセスにさらに向けられる。
好ましい態様において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
一態様において、ステップｂ）において提供される液体細胞培養培地は、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンのうちの１以上が、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群から選択される対応するケト酸で部分的にまたは好ましくは完全に置換されている液体細胞培養培地である。
一態様において、ステップｂ）において提供される液体細胞培養培地は、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンのうちの１以上が、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群から選択される対応するケト酸で部分的にまたは好ましくは完全に置換されている液体細胞培養培地である。
好ましい態様において、ステップｂ）の液体細胞培養培地は、本発明による乾燥粉末または乾燥顆粒培地を、上記のような溶媒に溶解することによって提供される。
バイオリアクターは、細胞が培養できるいずれかの槽(vessel)、またはタンクである。培養は、典型的には、適切な温度などの適切な条件の下でなされる。当業者は、細胞の成長／培養を、支援または維持するための適切なインキュベーション条件を、知っている。
バイオリアクターは、細胞が培養できるいずれかの槽(vessel)、またはタンクである。培養は、典型的には、適切な温度などの適切な条件の下でなされる。当業者は、細胞の成長／培養を、支援または維持するための適切なインキュベーション条件を、知っている。
本発明は、フィード培地の調製に極めて好適であることが見出された。とくにフィード培地に必要な濃度のある種のアミノ酸の利用可能性の制限に起因して、フィード培地の濃度は、可溶性の問題に起因して制限される。
その結果として、必要とされるすべての構成要素を１つのフィード中に高濃度で含むフィード培地が必要とされている。加えて、フィードのｐＨは細胞培養に負の影響を及ぼさないようにすべきであり、すなわち、液体フィードのｐＨは８．５未満、好ましくは６．５～７．８であるべきである。
アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンを対応するケト酸および／または誘導体、好ましくはそれらの塩で部分的または好ましくは完全に置換することにより、その結果得られる乾燥粉末培地の可溶性が改善されることが見出された。これは、より高濃度の成分を含む液体培地を生産する可能性を提案し、その結果、同じ量の成分をより少量の液体で細胞培養に添加することができ、それにもかかわらず、好ましくは８．５未満である好適なｐＨである。ケト酸を含む、より高度に濃縮されたフィード培地は、細胞成長および／または生産性ならびに液体培地の安定性にいずれの負の効果もなく、場合によっては、正の効果を伴ってさえ、使用できる。
よって、本発明はまた、粉末培地の形態の、または液体培地の形態において溶解後の、いずれかのフィード培地に向けられる。
その結果得られる液体培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群から選択される少なくとも１のケト酸を、１０ｍＭ超、好ましくは２０～６００ｍＭの濃度で含み、好ましくは８．５以下のｐＨを有する。
好ましい態様において、ｐＨは、６．７～８．４である。
その結果得られる液体培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群から選択される少なくとも１のケト酸を、１０ｍＭ超、好ましくは２０～６００ｍＭの濃度で含み、好ましくは８．５以下のｐＨを有する。
好ましい態様において、ｐＨは、６．７～８．４である。
本発明はまた、
－細胞および水性細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること
－バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること
－バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたり、連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、この場合においてフィード培地である細胞培養培地をバイオリアクターに添加すること
ここで、フィード培地は、好ましくは、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群から選択される少なくとも１のケト酸を含む、
による、バイオリアクター中で細胞を培養するためのフェドバッチプロセスに向けられる。
－細胞および水性細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること
－バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること
－バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたり、連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、この場合においてフィード培地である細胞培養培地をバイオリアクターに添加すること
ここで、フィード培地は、好ましくは、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群から選択される少なくとも１のケト酸を含む、
による、バイオリアクター中で細胞を培養するためのフェドバッチプロセスに向けられる。
好ましくは、フィード培地は、１０ｍＭ超、好ましくは２０～６００ｍＭの濃度で１以上のケト酸および／またはそれらの誘導体を含む。好ましくは、フィード培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはアルファ－ケトイソ吉草酸および／またはそれらの塩、最も好ましくはナトリウム塩を含む。典型的には、フィード培地は、溶媒に溶解された５０～４００ｇ／ｌの固体成分を含む。
好ましい態様において、本発明のプロセスにおいて、インキュベーションの間に連続的に、または前記時間内に１回または数回バイオリアクターに添加されるフィード培地は、常に同じ組成を有する。好ましい態様において、細胞はＣＨＯ細胞である。
本発明は、以下の図および例によってさらに例証されるが、しかしながら、これらに限定されるものではない。
上および下で引用されたすべての出願、特許、および刊行物の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の図および例によってさらに例証されるが、しかしながら、これらに限定されるものではない。
上および下で引用されたすべての出願、特許、および刊行物の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
例
以下の例は、本発明の実際的な適用を表す。
例１：ケト酸は、それらの夫々のアミノ酸と比較して、水中で増大した可溶性を有する
５つ例示のアミノ酸の最大可溶性を、夫々のケト酸またはそれらの塩の２５℃における水への可溶性を、飽和溶液の調製を通じて比較した。沈降後、溶液を、赤外線を使用して乾燥させ（１２０℃、１２０分）、残存質量をｇ／ｋｇで決定した。
図１に示すように、ケト酸およびそれらの塩の可溶性は、夫々のアミノ酸の水への可溶性と比較して有意に高かった。可溶性の増加がケト酸のナトリウム塩の形態に起因するものであることを除外するために、別の実験をＬｅｕ、Ｌｅｕナトリウム塩およびケトＬｅｕナトリウム塩の可溶性を比較するために行った。水において得られた最大可溶性は、夫々２２．１、８６．０、および３１３．７ｇ／ｋｇであり、予想どおり、ナトリウム塩の形成は、Ｌｅｕの可溶性をすでに増加させるが、ケト酸により得られる可溶性の増加は著しく重要であり、よって塩の形態のみに起因するものではないことが示された。
以下の例は、本発明の実際的な適用を表す。
例１：ケト酸は、それらの夫々のアミノ酸と比較して、水中で増大した可溶性を有する
５つ例示のアミノ酸の最大可溶性を、夫々のケト酸またはそれらの塩の２５℃における水への可溶性を、飽和溶液の調製を通じて比較した。沈降後、溶液を、赤外線を使用して乾燥させ（１２０℃、１２０分）、残存質量をｇ／ｋｇで決定した。
図１に示すように、ケト酸およびそれらの塩の可溶性は、夫々のアミノ酸の水への可溶性と比較して有意に高かった。可溶性の増加がケト酸のナトリウム塩の形態に起因するものであることを除外するために、別の実験をＬｅｕ、Ｌｅｕナトリウム塩およびケトＬｅｕナトリウム塩の可溶性を比較するために行った。水において得られた最大可溶性は、夫々２２．１、８６．０、および３１３．７ｇ／ｋｇであり、予想どおり、ナトリウム塩の形成は、Ｌｅｕの可溶性をすでに増加させるが、ケト酸により得られる可溶性の増加は著しく重要であり、よって塩の形態のみに起因するものではないことが示された。
例２：ＩｌｅおよびＬｅｕを欠乏させた4Feedにおける、それらの夫々のアミノ酸と比較した場合の、ケト酸の最大可溶性
増大した量のケト酸およびそれらの塩を、ＩｌｅおよびＬｅｕを欠乏させた細胞培養フィード製剤（Cellvento（登録商標）4Feed, MilliporeSigma）に添加した。同様に、対照として、増大した量のＩｌｅとＬｅｕを同じフィード製剤に添加した。このフィード製剤の総濃度は１２５ｇ／Ｌであり、ｐＨは７．０＋／－０．２であった。小規模実験では、アミノ酸またはケト酸のいずれかの各添加後、フィードを１０分間撹拌し、濁度を測定した。実験は室温（２５℃）にて行った。
増大した量のケト酸およびそれらの塩を、ＩｌｅおよびＬｅｕを欠乏させた細胞培養フィード製剤（Cellvento（登録商標）4Feed, MilliporeSigma）に添加した。同様に、対照として、増大した量のＩｌｅとＬｅｕを同じフィード製剤に添加した。このフィード製剤の総濃度は１２５ｇ／Ｌであり、ｐＨは７．０＋／－０．２であった。小規模実験では、アミノ酸またはケト酸のいずれかの各添加後、フィードを１０分間撹拌し、濁度を測定した。実験は室温（２５℃）にて行った。
Ｉｌｅ／Ｌｅｕを欠乏させたCellvento（登録商標）4FeedにおけるＩｌｅの最大可溶性はおよそ１０５ｍＭであった一方で、ケトＩｌｅについては試験した最大試験濃度の６３５ｍＭでも５ＮＴＵ未満の濁度値で可溶性であったことが見出された（図１を参照のこと）。これは、Ｉｌｅ／Ｌｅｕを欠乏させた4Feedにおいて、ケトＩｌｅは、Ｉｌｅよりも少なくとも６倍超より可溶性であることを示す。
ＩｌｅとＬｅｕを欠乏させたCellvento（登録商標）4FeedにおけるＬｅｕの最大可溶性はおよそ９０ｍＭであった一方で、ケトＬｅｕについては、最大可溶性濃度（５ＮＴＵ未満の濁度値）は２４０ｍＭであったことが見出された（図２を参照のこと）。これは、Ｉｌｅ／Ｌｅｕを欠乏させた4Feedにおいて、ケトＬｅｕはＬｅｕの２．６倍超可溶性であることを示す。
ＩｌｅとＬｅｕを欠乏させたCellvento（登録商標）4FeedにおけるＬｅｕの最大可溶性はおよそ９０ｍＭであった一方で、ケトＬｅｕについては、最大可溶性濃度（５ＮＴＵ未満の濁度値）は２４０ｍＭであったことが見出された（図２を参照のこと）。これは、Ｉｌｅ／Ｌｅｕを欠乏させた4Feedにおいて、ケトＬｅｕはＬｅｕの２．６倍超可溶性であることを示す。
例３：ケト酸の使用は、中性ｐＨにおける細胞培養培地製剤の濃縮を可能にする。
Cellvento（登録商標）4Feedの最大可溶性は、沈殿が視覚的に検出されるまで、増大する量のフィード乾燥粉末培地を水に溶解することにより決定した。各条件において、フィードを約３０分間撹拌し、ｐＨを７．０＋／－０．２に調整し、平衡化のために溶液をさらに１０分間撹拌した。浸透圧および濁度を測定した（図３を参照のこと）。データは、粒子が懸濁液中で検出され、濁度が５ＮＴＵの限界を大きく上回っていることから、この製剤の１．２倍濃縮物はすでに溶解しないことを示す。
Cellvento（登録商標）4Feedの最大可溶性は、沈殿が視覚的に検出されるまで、増大する量のフィード乾燥粉末培地を水に溶解することにより決定した。各条件において、フィードを約３０分間撹拌し、ｐＨを７．０＋／－０．２に調整し、平衡化のために溶液をさらに１０分間撹拌した。浸透圧および濁度を測定した（図３を参照のこと）。データは、粒子が懸濁液中で検出され、濁度が５ＮＴＵの限界を大きく上回っていることから、この製剤の１．２倍濃縮物はすでに溶解しないことを示す。
ＩｌｅおよびＬｅｕがCellvento（登録商標）4Feed製剤の濃縮のための第１制限アミノ酸として同定されたため、ＩｌｅおよびＬｅｕを欠乏させた新しいバックボーンフィードを生産した（4Feed－Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）。ケトＬｅｕおよびケトＩｌｅの補充の有無にかかわらず、このフィードの最大濃度を、沈殿が視覚的に検出されるまで、増大する量のフィード乾燥粉末培地を水に溶解することにより決定した。各条件について、フィードを約３０分間撹拌し、ｐＨを７．０＋／－０．２に調整し、平衡化のために溶液をさらに１０分間撹拌した。濁度を測定し、５ＮＴＵの限界を可溶性であるとみなした。
結果は、Ｉｌｅ／Ｌｅｕ欠乏Cellvento（登録商標）4Feedの最大可溶性がおよそ２２８ｇ／Ｌであったことを示す。ケトＬｅｕおよびケトＩｌｅを添加した場合、最大可溶性は、３６ｇ／Ｌ～３８ｇ／ＬのケトＬｅｕおよびケトＩｌｅの組み合わせた量（その濃縮物中のＩｌｅおよびＬｅｕの理論量に相当するモル比）で補充した欠乏乾燥粉末培地の２１６ｇ／Ｌ～２２８ｇ／Ｌで得られ、ケトＬｅｕおよびケトＩｌｅの両方を含有する製剤の総濃度の２５２ｇ／Ｌ～２６６ｇ／Ｌをもたらした。Cellvento（登録商標）4Feedが１３０ｇ／Ｌの濃度を有することを考慮すると、ＩｌｅおよびＬｅｕをケトＩｌｅおよびケトＬｅｕで置き換えた場合、これは、１００％の濃度の増大を表す。
データは、懸濁液中に粒子を検出することができず、濁度が５ＮＴＵ未満であることから、少なくとも２ｘ（２６５ｇ／Ｌ）までその製剤を濃縮することが可能であることを示す（図４を参照のこと）。
データは、懸濁液中に粒子を検出することができず、濁度が５ＮＴＵ未満であることから、少なくとも２ｘ（２６５ｇ／Ｌ）までその製剤を濃縮することが可能であることを示す（図４を参照のこと）。
例４：ＬｅｕおよびＩｌｅのケト酸は、細胞培養培地製剤を安定化することができる
ＩｌｅおよびＬｅｕを含有するフィード（Cellvento（登録商標）4Feed）の安定性を、Ｉｌｅ／Ｌｅｕを欠乏させ、ケトＬｅｕまたはケトＩｌｅのいずれかを補充した同じフィードの安定性と比較した。フィードは標準プロトコルに従って調製した。最終的なｐＨは７．０＋／－０．２であり、フィードを４℃またはＲＴで光から保護して、または光に暴露して保管した。３００ｎｍ～６００ｎｍの範囲（５ｎｍの間隔）の吸光度を測定することにより、９０日間にわたって製剤の色の変化をモニタリングした。吸光度スキャン（３００ｎｍ～６００ｎｍ）のベースライン補正した曲線下面積（ＡＵＣ）の経時的（Ｄ０～Ｄ９０の間）な曲線下面積を算出することにより、条件を比較した。
ＩｌｅおよびＬｅｕを含有するフィード（Cellvento（登録商標）4Feed）の安定性を、Ｉｌｅ／Ｌｅｕを欠乏させ、ケトＬｅｕまたはケトＩｌｅのいずれかを補充した同じフィードの安定性と比較した。フィードは標準プロトコルに従って調製した。最終的なｐＨは７．０＋／－０．２であり、フィードを４℃またはＲＴで光から保護して、または光に暴露して保管した。３００ｎｍ～６００ｎｍの範囲（５ｎｍの間隔）の吸光度を測定することにより、９０日間にわたって製剤の色の変化をモニタリングした。吸光度スキャン（３００ｎｍ～６００ｎｍ）のベースライン補正した曲線下面積（ＡＵＣ）の経時的（Ｄ０～Ｄ９０の間）な曲線下面積を算出することにより、条件を比較した。
図５Ａに示すように、対照条件のＩｌｅおよびＬｅｕを含有するフィードは、温度の増大または光暴露により、色が濃くなった（ＡＵＣが３５０から７０００まで増加した）。４℃では、ＬｅｕをケトＬｅｕで置き換えた場合、光保護および光暴露条件でＡＵＣは、夫々２７％および８％減少した。ＲＴでは、減少はさらにより顕著であり、ケトＬｅｕ条件において、ＡＵＣは夫々３１％（光保護）、３７％（光暴露）減少した。これは、ＬｅｕのケトＬｅｕによる置き換えが、フィードにおいて経時的に観察される色の変化を有意に減少させることができることを示す。
ケトＩｌｅについて得られた結果を図５Ｂに表す。ケトＬｅｕについてのように、ＩｌｅをケトＩｌｅで置き換えた場合、ＡＵＣの減少が観察された。４℃では、光保護および光暴露条件で、ＡＵＣは、夫々３３％、および６８％減少した。ＲＴでは、光保護条件では減少が見られなかったが、光暴露条件において３８％の減少が観察され、ＩｌｅのケトＩｌｅによる置き換えが、フィードにおいて経時的に観察される色の変化を有意に減少させることができることを示す。
全体的な我々の結果は、アミノ酸のそれらのケト酸またはそれらの塩による置き換えが、光暴露の有無にかかわらず、４℃またはＲＴのいずれかで３か月間保管した場合に、色の変化が少ない、安定化をもたらし得る。
全体的な我々の結果は、アミノ酸のそれらのケト酸またはそれらの塩による置き換えが、光暴露の有無にかかわらず、４℃またはＲＴのいずれかで３か月間保管した場合に、色の変化が少ない、安定化をもたらし得る。
加えて、フィードにおいてＬｅｕの代わりにケトＬｅｕを使用した場合、フィードの沈殿が遅延した。沈殿を観察するために、５０ｍＬのファルコンチューブを裏返して、チューブの底に沈殿している可能性を確認し、写真を撮影した。４℃ではいずれの条件でも沈殿しなかったが、ＲＴ光保護において、対照条件はＤ４９～Ｄ７０で沈殿した一方で、ケトＬｅｕを含有する条件では沈殿は観察されなかった。光に暴露したＲＴにおいて沈殿の完全な阻害は観察されなかったが、ケトＬｅｕ条件において沈殿が遅延した。対照条件ではＤ４９から沈殿が観察された一方で、ケトＬｅｕの条件ではＤ７０に最初の沈殿が現れた。その後数日間、ケトＬｅｕ含有条件において、沈殿物の量および沈殿物の色の濃さが減少し、これは、ＲＴ光暴露においてもケトＬｅｕ製剤の安定性がわずかに増大したことを示す。
最終的に、ケト酸を含有するフィードの４℃またはＲＴでの保管の間に形成されるアンモニウムイオンの量は、通常のアミノ酸を含有するフィードと比較した場合、少なかった。安定性試験の全期間にわたるＮＨ３の形成を評価できるように、ＮＨ３濃度のＡＵＣを３か月のタイムフレームについて算出し、条件を比較した。
ケトＬｅｕの結果を図６Ａに表し、対照条件と比較した場合、アンモニア形成が少ないことを示す。フィードを４℃で、光保護および光暴露で保管した場合、対照と比較して、ケトＬｅｕ条件において、アンモニアは、夫々１０％および１９％少なく生産された。ＲＴにおいて、同じ傾向が観察され、フィードを光保護および光暴露で３か月保管した場合、アンモニアレベルは、夫々１５および５％減少した。
ケトＬｅｕの結果を図６Ａに表し、対照条件と比較した場合、アンモニア形成が少ないことを示す。フィードを４℃で、光保護および光暴露で保管した場合、対照と比較して、ケトＬｅｕ条件において、アンモニアは、夫々１０％および１９％少なく生産された。ＲＴにおいて、同じ傾向が観察され、フィードを光保護および光暴露で３か月保管した場合、アンモニアレベルは、夫々１５および５％減少した。
ケトＩｌｅについても同様の結果が得られ（図６Ｂ）、対照条件と比較した場合、アンモニア形成が少ないことを示す。フィードを４℃で、光保護および光暴露で保管した場合、対照と比較して、ケトＩｌｅ条件において、アンモニアは、夫々２１および２４％低く生産された。ＲＴにおいて、同じ傾向が観察され、フィードを光保護および光暴露で３か月保管した場合、アンモニアレベルは、夫々２８および２５％減少した。
例５：ケトＩｌｅおよびケトＬｅｕは、フィード中のそれらの夫々のアミノ酸を置き換えて、比生産性を増大させることができる。ＩｇＧ１を産生するＣＨＯＫ１ＧＳクローンによる細胞培養結果。
細胞培養実験に、ヒトＩｇＧ１を発現するＣＨＯＫ１ＧＳ懸濁細胞株を使用した。細胞を、３０ｍＬの開始培養体積および２ｘ１０５細胞／ｍＬの播種密度で、５０ｍＬのスピンチューブを使用して、Cellvento 4CHO培地（Merck Darmstadt, Germany）中で４重に培養した。インキュベーションを、３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度、および３２０ｒｐｍの撹拌で行った。ケト酸を、それらの夫々のアミノ酸の代わりに、フィード（Ｉｌｅおよびｌｅｕが欠乏した4Feed）に添加した。すべてのフィードのｐＨは中性（ｐＨ７．０＋／－０．２）であった。陽性対照は通常のアミノ酸を含有する一方で、陰性対照は、ケト酸を添加することなく、夫々のアミノ酸を欠乏させたフィードを含有する。供給は、３、５、７、１０および１４日目に、以下のｖ／ｖ比率（３、３、６、３および３％）で行った。グルコースを毎日定量し、４００ｇ／Ｌのグルコース溶液を使用して６ｇ／Ｌに調整した。実験は少なくとも３回繰り返した。
細胞培養実験に、ヒトＩｇＧ１を発現するＣＨＯＫ１ＧＳ懸濁細胞株を使用した。細胞を、３０ｍＬの開始培養体積および２ｘ１０５細胞／ｍＬの播種密度で、５０ｍＬのスピンチューブを使用して、Cellvento 4CHO培地（Merck Darmstadt, Germany）中で４重に培養した。インキュベーションを、３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度、および３２０ｒｐｍの撹拌で行った。ケト酸を、それらの夫々のアミノ酸の代わりに、フィード（Ｉｌｅおよびｌｅｕが欠乏した4Feed）に添加した。すべてのフィードのｐＨは中性（ｐＨ７．０＋／－０．２）であった。陽性対照は通常のアミノ酸を含有する一方で、陰性対照は、ケト酸を添加することなく、夫々のアミノ酸を欠乏させたフィードを含有する。供給は、３、５、７、１０および１４日目に、以下のｖ／ｖ比率（３、３、６、３および３％）で行った。グルコースを毎日定量し、４００ｇ／Ｌのグルコース溶液を使用して６ｇ／Ｌに調整した。実験は少なくとも３回繰り返した。
生存細胞密度（ＶＣＤ）およびバイアビリティを、Vi-CELL XR（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を用いて評価した。代謝体濃度を、分光光度法および濁度法に基づいて、Cedex Bio HT（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を使用してモニタリングした。アミノ酸の定量は、AccQ・TagUltra（登録商標）試薬キットを用いて、誘導体化後にＵＰＬＣによって行った。誘導体化、クロマトグラフィーおよびデータ解析は、供給者（Waters, Milford, MA）の推奨に従って行った。
１日あたり１細胞あたりの生産性を、補正積分ＶＣＤにより力価を除することにより毎日算出し、供給により生ずる希釈を考慮した。全体の比生産性を、力価と補正積分ＶＣＤとの間の線形回帰から傾きを算出することによって決定した。
生存細胞密度（図７Ａ）を見ると、両方のケト誘導体は対照と比較してわずかに低い最大ＶＣＤを導いたが、１１日後に得られた力価（図７Ｂ）は対照条件よりもわずかに高く、全体的に高い比生産性を示した（図８）。フィードがＬｅｕおよびＩｌｅに欠乏している陰性対照は、７日後に急激に減少したＶＣＤ、および最も重要なことに、非常に限られたＩｇＧ力価を示し、ＬｅｕおよびＩｌｅはＣＨＯ細胞によるＩｇＧ産生を支援するために重要であることを示す。
生存細胞密度（図７Ａ）を見ると、両方のケト誘導体は対照と比較してわずかに低い最大ＶＣＤを導いたが、１１日後に得られた力価（図７Ｂ）は対照条件よりもわずかに高く、全体的に高い比生産性を示した（図８）。フィードがＬｅｕおよびＩｌｅに欠乏している陰性対照は、７日後に急激に減少したＶＣＤ、および最も重要なことに、非常に限られたＩｇＧ力価を示し、ＬｅｕおよびＩｌｅはＣＨＯ細胞によるＩｇＧ産生を支援するために重要であることを示す。
ＮＨ３は、フェッドバッチプロセスの過程にわたり産生される望ましくない代謝体である。ケトＬｅｕおよびケトＩｌｅ条件において１７日のフェッドバッチプロセスの間に産生されたＮＨ３の量（図９Ａ）は、ＬｅｕおよびＩｌｅを含有する対照と比較して有意に減少し、アンモニアのかなりの部分がＬｅｕおよびＩｌｅの酸化的脱アミノ化から生成すること、またはバイオリアクター培地中のケト酸の存在が、アミノ化によってアミノ酸を生成するためのビルディングブロックとしての遊離ＮＨ３の利用を促進していることのいずれかを示す。
使用済み培地中のアミノ酸の濃度を決定した。ＬｅｕがケトＬｅｕで置き換えられている条件において、使用済み培地中のＬｅｕの濃度（図９Ｂ）は陽性対照（ＬｅｕおよびＩｌｅを含有する）よりもわずかに低いが、時間に伴う進化は、供給日と翌日との間に濃度の増大を示し、ＬｅｕがケトＬｅｕから極めて急速に産生され得ることを示す。ＩｌｅがケトＩｌｅで置き換えられている条件（図１０Ａ）において、経時的に検出されるＩｌｅの濃度は、陽性対照におけるＩｌｅ濃度よりも有意に低く、ケトＩｌｅからＩｌｅへの変換が遅いか、培養中にケトＩｌｅから別の生成物が形成されていることのいずれかを示す。ケトＩｌｅ条件と、フィードがＩｌｅおよびＬｅｕに欠乏している陰性対照との比較は、それにもかかわらず、そのフェドバッチにおいてケトＩｌｅからＩｌｅが生産され得ることを示す。加えて、クロマトグラムの慎重な分析は、時間とともに増加する、アロ－Ｉｌｅに対応する新しいピークの同定を可能にした（図１０Ｂ）。
対照のフェッドバッチプロセス（ＩｌｅとＬｅｕを含有するフィード）で生産された抗体の品質を、ＬｅｕおよびＩｌｅのいずれかを欠乏させ、かつケトＬｅｕまたはケトＩｌｅのいずれかで補充したフィードで生産された抗体の品質と比較した。
抗体をプロテインＡ PhyTips（登録商標）（PhyNexus Inc, San Jose, CA）を使用して、細胞培養上清から精製した。GlykoPrep（登録商標）-plus Rapid N-Glycan Sample Preparation kit with 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium（ＡＰＴＳ）（Prozyme, Hayward, CA）を製造者の指示に従って使用して誘導体化した後、グリコシル化パターンを、レーザー誘起蛍光を用いたキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ－ＬＩＦ）により分析した。簡単に説明すると、精製した抗体を変性および固定化し、N-Glycanase（登録商標）で消化した後、５０℃で６０分間ＡＰＴＳで標識することにより、抗体からグリカンを放出させた。残存するＡＰＴＳを除去する洗浄ステップの後、ＬＩＦ検出器（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５２０ｎｍ）を備えたPharmaceutical Analysis System CESI8000 Plus（Sciex, Washington, USA）を使用してグリカンの相対量を決定した。
抗体をプロテインＡ PhyTips（登録商標）（PhyNexus Inc, San Jose, CA）を使用して、細胞培養上清から精製した。GlykoPrep（登録商標）-plus Rapid N-Glycan Sample Preparation kit with 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium（ＡＰＴＳ）（Prozyme, Hayward, CA）を製造者の指示に従って使用して誘導体化した後、グリコシル化パターンを、レーザー誘起蛍光を用いたキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ－ＬＩＦ）により分析した。簡単に説明すると、精製した抗体を変性および固定化し、N-Glycanase（登録商標）で消化した後、５０℃で６０分間ＡＰＴＳで標識することにより、抗体からグリカンを放出させた。残存するＡＰＴＳを除去する洗浄ステップの後、ＬＩＦ検出器（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５２０ｎｍ）を備えたPharmaceutical Analysis System CESI8000 Plus（Sciex, Washington, USA）を使用してグリカンの相対量を決定した。
分離は、ポリビニルアルコールコーティングしたキャピラリー（全長：５０．２ｃｍ、内径：５０μｍ）中で行い、炭水化物標識キット（Beckman Coulter, Brea, USA）から炭水化物分離緩衝剤を充填した。キャピラリー表面を、３０ｐｓｉで３分間、分離緩衝剤で最初にリンスした。入口および出口の緩衝剤バイアルを２０サイクル毎に交換した。試料を０．５ｐｓｉで１２秒間の圧力注入により導入し、続いて０．２分間の浸漬ステップを行い、キャピラリーチップを洗浄した。最後に、０．１７分のランプで逆極性を印可して、２０ｋＶで２０分間、分離を行った。ピークをそれらの個別の移動時間に従って同定し、以下のパラメータに従って積分した：ピーク幅０．０５、閾値１０，０００、ショルダー感度（shoulder sensitivity）９，９９９。
抗体凝集および断片化を、TSKgel SuperSW3000カラム（Tosoh Bioscience）を使用してWater AcquityＵＰＬＣシステム上でサイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した。移動相は０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．４Ｍ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３であり、流速は０．３５ｍＬ／分であった。試料濃度は、ＩｇＧ精製後に保管緩衝剤を使用して１．０ｍｇ／ｍＬに調整し、検出は２１４ｎｍの吸光度を使用して行った。
電荷バリアントを、製造者の指示に従ってｃＩＥＦを使用してCapillary Electrophoresis CESI 8000（Beckman Coulter/ Sciex）上で、測定した。試料濃度を、ＩｇＧ精製後に保管緩衝剤を使用して１．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。測定に先立ち、試料を種々のｐＨマーカー、カソード／アノード安定剤、３Ｍ尿素ｃＩＥＦゲル、ファルマライト（Pharmalyte）を含有するマスターミックスと混合した。
グリコシル化（図１１）、高分子量種および低分子量種（図１２Ａ）、および電荷バリアント（図１２Ｂ）について得られた結果は、対照条件と、ＩｌｅおよびＬｅｕをケトＩｌｅおよびケトＬｅｕで交換した条件との間に差がないことを示し、アミノ酸交換がこの研究で生産されたＩｇＧ１の３つの重要な品質特性に影響を与えないことを示す。
グリコシル化（図１１）、高分子量種および低分子量種（図１２Ａ）、および電荷バリアント（図１２Ｂ）について得られた結果は、対照条件と、ＩｌｅおよびＬｅｕをケトＩｌｅおよびケトＬｅｕで交換した条件との間に差がないことを示し、アミノ酸交換がこの研究で生産されたＩｇＧ１の３つの重要な品質特性に影響を与えないことを示す。
例６：ＩｇＧ１を産生するＣＨＯＤＧ４４およびＣＨＯＫ１クローンを用いた、ケトＬｅｕ性能の確認。
種々のバイオプロセスへの本発明の技術の適用性は、他のタイプのＣＨＯ細胞：例としてケトＬｅｕについてＣＨＯＤＧ４４およびＣＨＯＫ１（非ＧＳ）を用いてフェッドバッチ実験を行うことにより実証された。ＤＧ４４細胞株の結果（図１３）は、対照と比較して、ケトＬｅｕ条件ではＶＣＤが低く、ＩｇＧ力価もわずかに低いことを示す。それにもかかわらず、ケトＬｅｕを使用したプロセスでは、全体的な比生産性がわずかに増大した。使用済み培地データは、この細胞株についてもケトＬｅｕの条件でのＬｅｕ濃度は対照のＬｅｕ濃度とほぼ同様であることを示し、この細胞株においてもケトＬｅｕから非常に急速にＬｅｕが産生され得ることを確認した。
図１３：対照と比較した、ＩｇＧ１を発現するＣＨＯＤＧ４４細胞株のケトＬｅｕ含有プロセスの性能。
図１４：対照と比較した、ＩｇＧ１を発現するＣＨＯＫ１非ＧＳ細胞株のケトＬｅｕ含有プロセスの性能。
種々のバイオプロセスへの本発明の技術の適用性は、他のタイプのＣＨＯ細胞：例としてケトＬｅｕについてＣＨＯＤＧ４４およびＣＨＯＫ１（非ＧＳ）を用いてフェッドバッチ実験を行うことにより実証された。ＤＧ４４細胞株の結果（図１３）は、対照と比較して、ケトＬｅｕ条件ではＶＣＤが低く、ＩｇＧ力価もわずかに低いことを示す。それにもかかわらず、ケトＬｅｕを使用したプロセスでは、全体的な比生産性がわずかに増大した。使用済み培地データは、この細胞株についてもケトＬｅｕの条件でのＬｅｕ濃度は対照のＬｅｕ濃度とほぼ同様であることを示し、この細胞株においてもケトＬｅｕから非常に急速にＬｅｕが産生され得ることを確認した。
図１３：対照と比較した、ＩｇＧ１を発現するＣＨＯＤＧ４４細胞株のケトＬｅｕ含有プロセスの性能。
図１４：対照と比較した、ＩｇＧ１を発現するＣＨＯＫ１非ＧＳ細胞株のケトＬｅｕ含有プロセスの性能。
例７：種々の播種密度および種々のｌｅｕ／ケトＬｅｕ比率を用いたバッチにおける性能
ケトＩｌｅおよびとケトＬｅｕを用いた、３つの異なるＣＨＯ細胞株により得られた我々のフェッドバッチ使用済み培地の結果は、ケト酸からのＩｌｅ、アロ－Ｉｌｅ、Ｌｅｕの形成が非常に急速であることを示す。これは、ケト酸が培養の開始時から容易に利用可能であるため、これらはまた、バッチおよび灌流培地の可溶性を増大するために使用されてもよいことを示す。ＣＨＯシステムでこれが適用可能であることを確認するために、細胞培養培地（Cellvento（登録商標）4CHO）において、ケトＬｅｕまたはケトＩｌｅを、ＬｅｕおよびＩｌｅの代替として夫々使用した。該製剤のＬｅｕ／Ｉｌｅ欠乏バージョンを生産し、ケトＬｅｕ対ＬｅｕおよびケトＩｌｅ対Ｉｌｅの等モル濃度を使用した（図１５）。ＣＨＯＫ１ＧＳ細胞株の細胞成長およびバイアビリティを数週間にわたって連続継代実験でモニタリングし、成長がＬｅｕまたはＩｌｅの残存量に起因しないことを確認した。０．２百万細胞／ｍＬの播種密度でのバッチ実験を設計し、ＩｇＧ産生を経時的に測定した。また、使用済み培地中のアミノ酸の定量を使用して、アミノ酸の産生を時間とともに追跡した。
ケトＩｌｅおよびとケトＬｅｕを用いた、３つの異なるＣＨＯ細胞株により得られた我々のフェッドバッチ使用済み培地の結果は、ケト酸からのＩｌｅ、アロ－Ｉｌｅ、Ｌｅｕの形成が非常に急速であることを示す。これは、ケト酸が培養の開始時から容易に利用可能であるため、これらはまた、バッチおよび灌流培地の可溶性を増大するために使用されてもよいことを示す。ＣＨＯシステムでこれが適用可能であることを確認するために、細胞培養培地（Cellvento（登録商標）4CHO）において、ケトＬｅｕまたはケトＩｌｅを、ＬｅｕおよびＩｌｅの代替として夫々使用した。該製剤のＬｅｕ／Ｉｌｅ欠乏バージョンを生産し、ケトＬｅｕ対ＬｅｕおよびケトＩｌｅ対Ｉｌｅの等モル濃度を使用した（図１５）。ＣＨＯＫ１ＧＳ細胞株の細胞成長およびバイアビリティを数週間にわたって連続継代実験でモニタリングし、成長がＬｅｕまたはＩｌｅの残存量に起因しないことを確認した。０．２百万細胞／ｍＬの播種密度でのバッチ実験を設計し、ＩｇＧ産生を経時的に測定した。また、使用済み培地中のアミノ酸の定量を使用して、アミノ酸の産生を時間とともに追跡した。
同様の方法において、より高い細胞播種密度でのバッチ実験を、種々の比率のＬｅｕ／ケトＬｅｕを含有する培地で行い、より高い細胞密度で開始する場合にどの比率が好ましいかを理解した（図１６）。使用した分析法は上記のものと同じである。連続継代の結果は、ＣＨＯＫ１ＧＳ細胞が、培養の最初の数日間は成長が観察されず、バイアビリティが大幅に低下したため、ＩｌｅおよびＬｅｕが欠乏した培地中で成長できないことを示す。対照的に、ＬｅｕまたはＩｌｅをそれらの対応するケト酸により置き換えた場合、継続的な成長が観察された。全体として、各継代で観察された最大生存細胞密度は、ＩｌｅおよびＬｅｕを含有する対照条件よりもわずかに低く、対照条件と同等の性能を得るためには少量のＬｅｕとＩｌｅが必要とされることを示す。この量は、種々の比率のＩｌｅ／ＬｅｕおよびケトＩｌｅ／ケトＬｅｕを含有する培地を試験することにより、極めて容易に実験的に決定することができる。
バッチ実験において、性能は、対照条件とケトＬｅｕの条件との間で同等であり、Ｌｅｕをモル等量のケトＬｅｕで置き換えた場合、ＣＨＯＫ１ＧＳ細胞が成長できることを示した（図１５Ａ）。その条件において、７日目および１０日目に同様の量のＩｇＧが検出された（図１５Ｂ）。対照的に、ＩｌｅをケトＩｌｅで置き換えた場合、５日目後の成長およびＩｇＧ濃度は、わずかに損なわれ、経時的にバッチ条件の対照と同様の成長および力価を得るためには、少量のＩｌｅが必要である可能性を示す。この量は、種々の比率のＩｌｅおよびケトＩｌｅを含有する培地を試験することにより、極めて容易に実験的に決定することができる。代替的に、Ｉｌｅ濃度と比較して、より高いモルのケトＩｌｅ濃度を試験してもよい。
ケトＩｌｅとケトＬｅｕの性能の違いは、使用済み培地中のＩｌｅ、アロ－ＩｌｅおよびＬｅｕの形成を見ることにより説明できるかもしれない。３４％の初期ケトＬｅｕ濃度が３日目にＬｅｕの形態で検出された一方で、２１％の初期ケトＩｌｅ濃度のみが３日目にＩｌｅとして検出された。加えて、３５％の初期ケトＩｌｅ濃度が１０日目までアロ－Ｉｌｅの形態で検出された。これは、細胞によるケトＬｅｕのＬｅｕへのアミノ化が、細胞によるＩｌｅと同じ程度に使用されない可能性のあるアロ－Ｉｌｅの付随する形成のために、ケトＩｌｅのＩｌｅへのアミノ化よりもより効率的であることを示す。
最終的に、より高い細胞密度でのバッチ実験を行い、高い播種密度で開始した場合にケトＬｅｕが容易に利用可能であるかどうか、あるいはこのような条件において成長および生産性を支援するために最低濃度の遊離ロイシンが存在しなければならないかを決定した。この実験では、ＣＨＯＫ１ＧＳ細胞株を、０、２５、５０、７５、または１００％のケトＬｅｕを含有し、残りをロイシンの形態で添加した培地に０．３、０．６または１．１０＾６細胞／ｍＬで播種した。
結果は、予想どおり、播種密度の増大に伴う、成長および力価の増大を示す。種々の比率のケトＬｅｕ／Ｌｅｕの間で、最大のＶＣＤは、１．１０＾６細胞／ｍＬの最も高い播種密度で、１００％のケトＬｅｕ交換で観察された。０．６．１０＾６細胞／ｍｌおよび０．３．１０＾６細胞／ｍＬで細胞を播種した場合、最も高いＶＣＤは、１：１のケトＬｅｕ：Ｌｅｕ比率（ケトＬｅｕ５０％、Ｌｅｕ５０％）で観察された。力価について、０．３および１．１０＾６細胞／ｍＬでの播種では有意な差は見られなかった一方で、０．６．１０＾６細胞／ｍＬでの播種では、Ｌｅｕ／ケトＬｅｕの比率が高いほどＩｇＧ濃度が増大するというわずかな傾向が見られた。この差は有意ではないかもしれない。
例８．ＦＢ培養における他のケト酸対それらの夫々のアミノ酸の性能
ＦＢ実験において、他のケト酸をそれらの夫々のアミノ酸の代替として試験した。フィード中のＶａｌをケトＶａｌで置き換えた場合、ＩｌｅおよびＬｅｕと比較して酷似する挙動が観察された（図１７）。実際、陽性対照と比較して、同様のＶＣＤおよび力価が観察された一方で、Ｖａｌが欠乏したフィードは、７日後に、大幅に減少したＶＣＤ、および非常に低い力価を導いた。ＮＨ３濃度はまた、ケト酸を使用した場合に低くなり、Ｖａｌについても、夫々のケト酸の利用が、フェッドバッチ培養の間の少ないＮＨ３を導き得ることを示す。全体的に、これは、分岐鎖ケト酸のメンバーのようなケトＶａｌは、ケトＬｅｕおよびケトＩｌｅと同じ挙動を示す可能性が高く、細胞培養中に非常に急速にアミノ化される可能性が高いことを示す。ケトＩｌｅおよびケトＬｅｕとの構造的類似性に起因して、全体のフィード濃度およびフィードの安定性に対するケトＶａｌの効果は、他の分岐鎖ケト酸と同様である。Ｖａｌと比較した場合、水への６倍高い可溶性が確認された。
ＦＢ実験において、他のケト酸をそれらの夫々のアミノ酸の代替として試験した。フィード中のＶａｌをケトＶａｌで置き換えた場合、ＩｌｅおよびＬｅｕと比較して酷似する挙動が観察された（図１７）。実際、陽性対照と比較して、同様のＶＣＤおよび力価が観察された一方で、Ｖａｌが欠乏したフィードは、７日後に、大幅に減少したＶＣＤ、および非常に低い力価を導いた。ＮＨ３濃度はまた、ケト酸を使用した場合に低くなり、Ｖａｌについても、夫々のケト酸の利用が、フェッドバッチ培養の間の少ないＮＨ３を導き得ることを示す。全体的に、これは、分岐鎖ケト酸のメンバーのようなケトＶａｌは、ケトＬｅｕおよびケトＩｌｅと同じ挙動を示す可能性が高く、細胞培養中に非常に急速にアミノ化される可能性が高いことを示す。ケトＩｌｅおよびケトＬｅｕとの構造的類似性に起因して、全体のフィード濃度およびフィードの安定性に対するケトＶａｌの効果は、他の分岐鎖ケト酸と同様である。Ｖａｌと比較した場合、水への６倍高い可溶性が確認された。
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびそのケト酸であるフェニルピルビン酸（図１８）について、細胞培養においてＰｈｅを作るアミノ化反応は、分岐鎖ケト酸で生じるアミノ化反応よりも遅いようである。実際、Ｐｈｅを等モル濃度のフェニルピルビン酸で置き換えた場合、使用済み培地データは、陰性対照（Ｐｈｅが欠乏したフィード）と比較して上清中により多くのＰｈｅが見出されたものの、形成された量は対照条件と同じ成長および力価を支援するのに充分ではなかったことが明らかになった。５日後、有意に低下したＶＣＤが観察され、２０％の力価の最終的な低下が観察された。この結果に続いて、２ｘのモル等量のＰｈｅがフィード中のフェニルピルビン酸の濃度として使用された条件。結果は、フェニルピルビン酸の量の増大は、ＶＣＤ、力価、および使用済み培地中の酷似する量のＰｈｅを回復させることができたことを示す。これらのデータは、Ｐｈｅもまたそのケト酸で置き換えることができることを確認するが、アミノ化反応の遅いペースに対応するために、濃度の調整が必要であるかもしれない。
Claims (13)
- ４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群のうちの少なくとも１つのアルファケト酸を含む、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地。
- ４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群のうちの１つ以上のアルファケト酸が、アルファケト酸の各々について、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地の溶解後に得られる液体培地の濃度が１０ｍＭ超となるような量で存在する、請求項１に記載の乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地。
- 乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地が、対応するアミノ酸を含まない、請求項１または２に記載の乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地。
- 培地が、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸の群のうちの１以上のアルファケト酸のナトリウム塩を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地。
- 乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地が、４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはアルファ－ケトイソ吉草酸から選択されるアルファケト酸のナトリウム塩の１以上を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地。
- ａ）４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群のうちの少なくとも１のアルファケト酸を細胞培養培地の他の構成要素と混合すること、
ｂ）ステップａ）の混合物を粉砕に供すること
による、請求項１～５のいずれか一項に記載の乾燥粉末細胞培養培地を生産するための方法。 - ａ）バイオリアクターを提供すること
ｂ）培養される細胞を、請求項１～５のいずれか一項に記載の乾燥粉末または乾燥顆粒培地を溶媒に溶解することにより調製された液体細胞培養培地と混合すること
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすること
による、細胞を培養するためのプロセス。 - －細胞および水性細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること
－バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること
－バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたって連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、この場合においてフィード培地である細胞培養培地をバイオリアクターに添加すること
ここで、フィード培地は、請求項１～５のいずれか一項に記載の乾燥粉末または乾燥顆粒培地を溶媒に溶解することによって調製される、
による、バイオリアクター中で細胞を培養するためのフェドバッチプロセス。 - フィード培地が、少なくとも４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸および／またはそれらの塩を１２～６００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含む、請求項８に記載のフェドバッチプロセス。
- 培地中に少なくとも２０ｍＭの４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸および／またはアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体を含む、液体細胞培養培地を安定化するための方法であって、ここでその結果得られる培地は、４－メチル－２－オキソペンタン酸および／または３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはそれらの誘導体を欠いている、あるいは４－メチル－２－オキソペンタン酸および／または３－メチル－２－オキソペンタン酸および／またはそれらの誘導体が対応するアミノ酸および／またはそれらの誘導体により置換されている、他の点では同じ組成の培地と比較して、４℃にてまたは室温にて９０日にわたって保管した場合、少ない色変化および／または少ない沈殿を示す、前記方法。
- アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンの１以上を４－メチル－２－オキソペンタン酸、３－メチル－２－オキソペンタン酸、アルファ－ケトイソ吉草酸、フェニルピルビン酸およびアルファケトガンマメチルチオ酪酸および／またはそれらの誘導体の群から選択される対応するケト酸により完全にまたは部分的に置換することにより、乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地の可溶性を改善するための方法。
- 夫々のアミノ酸の少なくとも５０％（モル比）を対応するアルファケト酸および／またはそれらの誘導体により置換することによる、請求項１１に記載の方法。
- 元の組成と比較して、夫々のアミノ酸の少なくとも５０％（モル比）が対応するアルファケト酸および／またはそれらの誘導体により置換されている乾燥粉末または乾燥顆粒細胞培養培地を提供すること、および溶媒に前記培地を溶解することを含み、アミノ酸が置換されていない、他の点では同一組成である元の組成の培地と比較して、溶解がより速く、および／またはより少ない溶媒で生じる、請求項１１または１２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP19168683.1 | 2019-04-11 | ||
| EP19168683 | 2019-04-11 | ||
| PCT/EP2020/059950 WO2020208050A1 (en) | 2019-04-11 | 2020-04-08 | Cell culture media comprising keto acids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022527582A true JP2022527582A (ja) | 2022-06-02 |
Family
ID=66105206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021559723A Pending JP2022527582A (ja) | 2019-04-11 | 2020-04-08 | ケト酸を含む細胞培養培地 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220204918A1 (ja) |
| EP (1) | EP3953449A1 (ja) |
| JP (1) | JP2022527582A (ja) |
| KR (1) | KR20210152507A (ja) |
| CN (1) | CN113677787A (ja) |
| AR (1) | AR118617A1 (ja) |
| SG (1) | SG11202111135PA (ja) |
| TW (1) | TW202104587A (ja) |
| WO (1) | WO2020208050A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220411748A1 (en) * | 2019-11-14 | 2022-12-29 | Merck Patent Gmbh | Cell culture media |
| KR102428940B1 (ko) * | 2019-11-25 | 2022-08-03 | 한국해양과학기술원 | 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4296127A (en) * | 1979-04-18 | 1981-10-20 | The Johns Hopkins University | Mixed salts of essential or semi-essential amino acids and nitrogen-free analogs thereof |
| US5106747A (en) * | 1990-10-05 | 1992-04-21 | Life Technologies, Inc. | Method for enzymatic regeneration of cell culture media and media kits therefor |
| CN101333547A (zh) * | 2008-08-05 | 2008-12-31 | 江南大学 | 一种控制pH和补料发酵生产苯乳酸的方法 |
| EP3230436B1 (en) * | 2014-12-11 | 2020-02-26 | Merck Patent GmbH | Cell culture media |
| US20210355435A1 (en) * | 2018-11-12 | 2021-11-18 | Evonik Operations Gmbh | Culture medium comprising keto acids |
-
2020
- 2020-04-08 EP EP20715915.3A patent/EP3953449A1/en active Pending
- 2020-04-08 CN CN202080027876.9A patent/CN113677787A/zh active Pending
- 2020-04-08 JP JP2021559723A patent/JP2022527582A/ja active Pending
- 2020-04-08 SG SG11202111135PA patent/SG11202111135PA/en unknown
- 2020-04-08 KR KR1020217036297A patent/KR20210152507A/ko unknown
- 2020-04-08 US US17/602,458 patent/US20220204918A1/en active Pending
- 2020-04-08 AR ARP200100980A patent/AR118617A1/es unknown
- 2020-04-08 WO PCT/EP2020/059950 patent/WO2020208050A1/en unknown
- 2020-04-10 TW TW109112098A patent/TW202104587A/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020208050A1 (en) | 2020-10-15 |
| EP3953449A1 (en) | 2022-02-16 |
| TW202104587A (zh) | 2021-02-01 |
| AR118617A1 (es) | 2021-10-20 |
| KR20210152507A (ko) | 2021-12-15 |
| SG11202111135PA (en) | 2021-11-29 |
| CN113677787A (zh) | 2021-11-19 |
| US20220204918A1 (en) | 2022-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6650011B2 (ja) | 細胞培養培地 | |
| US10563169B2 (en) | Cell culture media | |
| US20210207079A1 (en) | Process for producing cell culture media | |
| US9988600B2 (en) | Cell culture media | |
| JP6845218B2 (ja) | 細胞におけるグルタチオンレベルを増加させる方法 | |
| JP2022527582A (ja) | ケト酸を含む細胞培養培地 | |
| US10421941B2 (en) | Process for improving the solubility of cell culture media | |
| US20220411748A1 (en) | Cell culture media |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230406 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240322 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240402 |