JP6923523B2 - 微生物の検出のための化学的に明らかな培地 - Google Patents

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Description

本発明は、原核生物および真核生物を含む広い範囲の微生物の検出のための、少なくともグルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む、化学的に明らかな培養培地に関する。
１９世紀から、複雑なな汎用培地は、細菌、酵母およびカビの増殖および培養のために利用可能である。これらの培地を製造するためのプロセスおよび使用される主要な成分は、この時からその基本的な性質において驚くべきことに、ほとんど変化していない。これらの微生物学的培地の主要な基礎は、それらに含有されるペプトンである。
採用されるペプトンは、極めて広く多様な細菌、酵母およびカビの増殖を可能にする組み合わせおよび濃度で存在するように設計される。したがって、これらのペプトンの混合物は、生化学的に富み、よくバランスの取れた栄養源であり、通常は、塩、緩衝剤、および、速い増殖を最適化するためおよび／または特定の生化学的特性を有する微生物を選択するために必須の他の原料の添加によって補完される。加えて、固形の培地は、一般に、十分に水に可溶性である。溶解後、培地は滅菌可能であり、これが必要であれば、原核生物および／または真核生物細胞の接種後に、コンタミネーションを防止しながらも同時に酸素を入れることを許容する、好適な都合の良い容器に提供され得る。続いて、培地および細胞を含む容器は、細胞増殖の決定（または不在）を可能するのに好適な温度で好適な時間、インキュベートされる。
しかしながら、当該技術分野に精通した高度な経験を積んだ個人による、ペプトンのタイプの注意深い選択のみが、その生化学的組成において十分に広く、十分にバランスのとれた、適切な栄養学的基礎を有する培地をもたらし、極めて幅広い範囲の原核生物および真核生物の培養を可能にする。ペプトンの品質は、ペプトンのタイプ間、同じペプトンの異なる製造者間で変動し、同じ製造者からの異なるグレード間で変動し、単一の製造者からの同じグレードのバッチ間でさえも有意に変動する。しかしながら、この変動する品質の生化学的性質についてはあまり理解されておらず、バッチ間変動のレベルでは殊更にそうである。
しかしながら、生化学的な変動は、確実に、１つには、ペプトンを製造するために用いられる天然原料の変動する品質に起因する。したがって、このような原料における栄養不足または栄養のアンバランスに起因して、ペプトンの全てのバッチが特定の培地レシピにおける使用のために常に好適であるとは限らず、このため、極めて幅広い範囲の原核生物および真核生物の増殖を可能にするために、すなわち、幅広い多様な細菌、酵母およびカビの許容できる増殖を支持するために、特定の培地のための各バッチが注意深く選択されなければならない。
ペプトンの正確な化学的組成は、知られていない。これは、細胞増殖促進をもたらすかかる天然の原料により提供される重要な栄養因子が、ある程度までは理解されているものの十分ではないことを意味する。あまり理解されておらず、同様に制御することが難しいのは、例えば、それが沈殿を引き起す培地内のかかる原料の負の物理化学的相互作用である。沈殿は、それが微生物の増殖を光学的に隠すので、すなわち、理想的には、ほとんどの培地は透明であるべきであるので、培地の望ましくない性質である。問題の複雑さは、あるペプトンが、別のペプトンのタイプとともに、塩、緩衝剤および従来の培地に典型的に存在する他の成分に加えて、混合される場合に増加する。よくバランスの取れた一般的な増殖培地の製造は、試行錯誤および長年の経験の問題である。
添加される個々のペプトンのバッチ間の変動は、試験原核生物（細菌）および真核生物（酵母および真菌）株の所望の細胞増殖の全範囲を与えるのに好適でないバッチを、単独であろうと、または他のペプトンのタイプとの組み合わせであろうと、そのような培地を製造する生産プロセスから排除することができるように、適切に制御されるべきである。
これらの方策の後でさえも、極めて幅広い範囲の細胞株の増殖のためのそのような一般的な培地は、典型的には、環境モニタリング適用のための培地好適性を確認するために用いられる、広範な試験パネルにおいて試験される全ての細菌、酵母および真菌株を増殖させるために、必ずしも生化学的に十分にバランスが取れていないか、栄養価に富んでいない。一方では、ある種の細胞タイプは、培地に提供される生化学物質の正確なバランスに非常に敏感である。他方では、さらに、特に非常に偏好性の細胞は、それらの増殖性能を押し上げるために新鮮な血液または血液抽出物のような追加の補充物を必要とする。
しかしながら、これらの培地でさえも、ある種の非常に偏好性の高い細胞タイプのための十分な栄養価に富む組成を有しておらず、環境サンプル中に典型的に見出される原核生物および真核生物細胞の広い範囲について、それらをそれらの使用に効果的にするための、増殖を支持する、または増殖を加速するための補充物のさらなる添加を必要とする。
近年、化学的に明らかな細胞培養培地が開発されている。しかしながら、今日まで、微生物の培養のための化学的に明らかな培地の生産者らは、しばしば特定の選択の微生物の大部分である、原核生物（例えば、細菌）または真核生物（例えば、酵母または真菌または昆虫または哺乳動物細胞）のいずれかの増殖を支持することに専念している。
WO 2007/135385は、例えば、細菌、とりわけNeisseria種の増殖のための化学的に明らかな培地を開示する。
GB 2464203は、Campylobacterの計数のための化学的に明らかな培地を開示する。
本発明の目的は、したがって、環境サンプル、食品および飲料産業からのサンプル、医薬サンプルまたは臨床サンプルなどの多様なサンプルにおいて典型的に見出される、原核生物および真核生物細胞の増殖の必要性を網羅する、例えば、よく知られているペプトンおよび／または抽出物ベースの培地に匹敵することができる、広い範囲の原核生物および真核生物種を含む極めて広い範囲の微生物を増殖させるための土台を提供する、化学的に明らかな原料に基づく細胞培養培地を提供することである。
従来のペプトンベースの培地と本質的に同じ増殖能力を有する様々なサンプル中に典型的に見出される極めて広い範囲の原核生物および真核生物の増殖を支持することができる一般的な、非特異的な化学的に明らかな増殖培地は、ある種の必須成分が細胞培養培地中に存在し、他の典型的な培地成分と組み合わされている場合に提供することができることを見出した。
培地は、原核生物と真核生物の両方の典型的な単離体の大部分を増殖させるための適切な生化学的バランスを満たすのみならず、原核生物と真核生物の両方の偏好性の細胞の増殖を支持するための要件を同時に満たす。付随して、このような培地は、典型的には、従来のペプトンベースの複合培地よりもはるかに速い酵母およびカビの増殖も可能にする。
結果として、本発明は、細胞培養培地がグルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含むことを特徴とする、化学的に明らかな細胞培養培地中で原核生物および真核生物を培養するために向けられる。
好ましい態様において、細胞培養培地は、１以上のサッカリド(saccharide)成分、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤成分、１以上の補因子および１以上の核酸成分を含む。
好ましい態様において、細胞培養培地は、０．０１〜１０ｇ／Ｌのグルタミン、０．０１〜３ｇ／Ｌのシステインおよび／またはシスチン、０．１〜３００ｍｇ／Ｌのアデニン、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌのグアニン、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアミノ安息香酸および０．０１〜１００ｍｇ／Ｌの鉄（ＩＩＩ）塩を含む。
別の好ましい態様において、細胞培養培地は、ゲル化剤を含む。
別の好ましい態様において、細胞培養培地は、少なくとも１つの発色性または蛍光性基質を、さらに含む。
好ましい態様において、原核生物は、１以上の以下の株：Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis、Escherichia coli、Streptococcus pyogenes、Pseudomonas aeruginosaを含む。
好ましい態様において、真核生物は、１以上の以下の株：Candida albicans、Aspergillus brasiliensisおよびSaccharomyces cerevisiaeを含む。
好ましい態様において、原核生物および真核生物は、少なくとも１つの偏好性株を含む。
本発明はさらに、
ａ）グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む、化学的に明らかな細胞培養培地中でサンプルをインキュベートすること、
ｂ）原核生物および真核生物の存在を検出すること
により、１つのアッセイにおいて、同時に、サンプルから原核生物および真核生物を検出するための方法に向けられる。
好ましい態様において、ステップａ）におけるインキュベーションは、３０時間未満で行われる。
さらに好ましい態様において、原核生物および真核生物の存在は、光学的に、それらの増殖、例えば、これに限定されないが、濁りの存在および／またはコロニー形成を介して、および／または色の変化、例えば、これに限定されないが、原核生物および／または真核生物の存在に起因するｐＨ変化により誘導される色を介して検出される。
加えて、血清学的試験および／または生化学的試験は、染色または色素（発色体および／または蛍光体など）を用いることにより、および／または酵素的試験を用いることにより、および／またはＰＣＲまたは関連する遺伝子技術、例えば、これらに限定されないが、ブロッティング技術、および／または顕微鏡検査、および／またはＡＴＰの検出、および／または生物発光試験におけるその誘導体、および／または大規模並列配列決定、および／またはフローサイトメトリーを用いて微生物の存在を同定することにより、微生物の存在を確認するために採用されてもよい。
多くの他の技術が微生物学者には知られている。微生物の存在／不存在のより容易かつ／またはより迅速な同定を可能にし、および／または同定を助けるために、例えば、これらに限定されないが、遠心分離および／または濾過などの前濃縮ステップを加えてもよいことに留意されたい。
本発明はさらに、グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む、化学的に明らかな培養培地に向けられる。
好ましい態様において、培地は、０．０１〜１０ｇ／Ｌのグルタミン、０．０１〜３ｇ／Ｌのシステインおよび／またはシスチン、０．１〜３００ｍｇ／Ｌのアデニン、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌのグアニン、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアミノ安息香酸および０．０１〜１００ｍｇ／Ｌの鉄（ＩＩＩ）塩を含む。
好ましい態様において、培地は、ゲル化剤を含む。
本発明はさらに、原核生物および真核生物を同時に培養するための、グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む、化学的に明らかな細胞培養培地の使用に向けられる。
好ましくは、化学的に明らかな細胞培養培地は、バイオバーデン、無菌、環境または培地充填の試験のために使用される。
グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む、化学的に明らかな細胞培養培地は、混合または純粋培養として多様な原核および真核微生物の迅速な増殖を促進する、普遍的な、化学的に明らかな、かつ完全に合成の培養培地を生み出すことを可能にすることを見出した。
細胞培養は、その中で細胞が培養される、任意の構成(setup)である。
細胞培養は、細胞の培養に好適な任意の容器、例えば、ペトリティッシュ、接触プレート(contact plate)、ボトル、チューブ、ウェル、ベッセル、バッグ、フラスコおよび／またはタンクの中で行うことができる。典型的には、容器は、使用の前に滅菌される。培養は、典型的には、好適な温度、浸透圧、通気、撹拌などの好適な条件下で水性培養培地中での細胞のインキュベーションにより行われ、それは環境からの外来微生物によるコンタミネーションを限定する。当業者は、細胞の増殖／培養を支持または維持するための好適なインキュベーション条件を知っている。
本発明による細胞培養培地（同義に使用：培養培地）は、細胞のインビトロ増殖を維持および／もしくは支持し、および／または特定の生理学的状態を支持する、成分の任意の混合物である。これは、前増菌(pre-enrichment)培養のみならず、維持培地としての使用のためにもまた好適である。
それは、化学的に明らかな培地である。細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持するのに必要な全ての成分を含むことができる、あるいは別々に添加されるさらなる成分（培地補充物）と組み合わされる、または組み合わされない、選択された成分の添加のために使用することができる。好ましくは、細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持するのに必要な全ての成分を含む。
本発明による細胞培養培地は、細菌細胞のような原核生物細胞、ならびに酵母、真菌、藻類、植物、昆虫および／または哺乳動物細胞のような真核生物細胞、および任意に古細菌を増殖させること、またはその増殖を維持／支持することに、好適であるように設計される。原核生物および真核生物ならびに任意である古細菌は、以下において、微生物または細胞とも呼ばれる。
偏好性微生物は、いくつかの特別な栄養素がその細胞培養培地中に存在する場合にのみ増殖する微生物である。偏好性微生物の例は、Legionella種、Brucella種、Francisella tularensis、Leptospira種、Borrelia burgdorferi、Bartonella種およびBordetella種である。
増殖が本発明の方法および培地によって維持または支持される微生物は、典型的には以下に見出される：
− 医薬関連の環境モニタリングにおける環境サンプル
− 医薬関連の原料、中間品および／または完成品から得られるサンプル
− 病院検査における臨床サンプル
− 獣医学サンプル
− 飲料水および／または廃棄水および／またはスイミングプールの水の検査のための水サンプル
− 微生物コンタミネーションの検査のための食品サンプル
− 化粧品サンプル。
増殖が本発明による培地および方法により維持／支持／検出される細胞の例は以下のとおりである。
− 細菌：
Achromobacter種 野生型
Acinetobacter lwoffii（ATCC（登録商標）17925（商標））
Bacillus clausii（ATCC（登録商標）700160）
Bacillus halodurans野生型
Bacillus okuhidensis野生型
Bacillus pumilus野生型
Bacillus subtilis（ATCC（登録商標）6633（商標））
Bacillus subtilis野生型
Burkholderia種野生型
Clostridium sporogenes（ATCC（登録商標）11437（商標））
Clostridium sporogenes（ATCC（登録商標）19404（商標））
Corynebacterium tuberculostearicum野生型
Escherichia coli（ATCC（登録商標）25922（商標））
Escherichia coli（ATCC（登録商標）8739（商標））
Kocuria rhizophila（ATCC（登録商標）9341（商標））
Leifsonia種野生型
Methylobacterium extorquens（ATCC（登録商標）43645（商標））
Methylobacterium extorquens（NBRC 15911）
Methylobacterium fujisawaense野生型
Methylobacterium mesophilicum（ATCC（登録商標）29983（商標））
Methylobacterium亜種野生型
Micrococcus luteus（ATCC（登録商標）10240（商標））
Micrococcus lylae野生型
Paenibacillus lautus野生型
Pantoea種野生型
Propionibacterium acnes（ATCC（登録商標）6919（商標））
Pseudomonas aeruginosa（ATCC（登録商標）9027（商標））
Ralstonia pickettii（ATCC（登録商標）27511（商標））
Ralstonia pickettii野生型
Salmonella typhimurium（ATCC（登録商標）14028（商標））
Serratia marcescens野生型
Sphingomonas parapaucimobilis野生型
Sphingomonas paucimobilis（ATCC（登録商標）29837（商標））
Sphingomonas paucimobilis野生型
Staphylococcus aureus（ATCC（登録商標）25923（商標））
Staphylococcus aureus（ATCC（登録商標）6538（商標））
Staphylococcus epidermidis（ATCC（登録商標）12228（商標））
Staphylococcus epidermidis野生型
Staphylococcus hominis（ATCC（登録商標）27844（商標））
Stenotrophomonas maltophilia（ATCC（登録商標）13637（商標））
Streptococcus pyogenes（ATCC（登録商標）12344（商標））
Streptococcus pyogenes（ATCC（登録商標）21059（商標））
− 酵母：
Candida albicans（ATCC（登録商標）10231（商標））
Debaryomyces hansenii（DSM 3428）
Exophiala種野生型
− カビ：
Aspergillus brasiliensis（ATCC（登録商標）16404（商標））
Aspergillus brasiliensis野生型
Aspergillus sydowii（DSM 63373）
Penicillium commune（ATCC（登録商標）10428（商標））。
例えば、本発明による化学的に明らかな培養培地は、グラム陽性微生物およびグラム陰性微生物のような真核生物および原核生物、例えば、ヒト皮膚コンタミナント、水コンタミナント、酵母およびカビ、例えば、Bacillus subtilis、Bacteroides vulgatus、Clostridium sporogenes、Propionibacterium acnes、Staphylococcus aureus、Apergillus brasiliensis、Candida albicans、Escherichia coli、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium fujisawaense、Methylobacterium mesophilicum、Pseudomonas aeruginosa、Paenibacillus lautus、Ralstonia pickettii、Staphylococcus epidermidisの増殖を支持してもよい。
化学的に明らかな細胞培養培地は、化学的によく特徴付けられた「明らかな」原料からなる細胞培養培地である。これは、培地に用いられている全ての化学物質の化学的な組成が知られていることを意味する。化学的に明らかな培地は、化学的にはっきりしない酵母、動物または植物組織のような化学的にはっきりしない物質からならない；それらはペプトン、フィーダー細胞、血清、はっきりしない抽出物もしくは消化物、または、化学的に不明瞭なタンパク質および／またはペプチドおよび／または加水分解物を培地に提供し得る他の成分を含まない。
化学的に不明確であるか、はっきりしないか、または不明瞭な化学成分は、その化学的組成および構造がよく知られていないものであり、不明瞭な変動する組成で存在し、または莫大な科学的実験的努力によることにしか定義できなかったものである。いくつかの場合において、化学的に明らかな培地は、化学的に明らかなタンパク質またはペプチド（１つの例は、インスリンである（以下を参照））を含んでもよい。
粉末状細胞培養培地または乾燥粉末培地または脱水培養培地は、典型的には、粉砕プロセスまたは凍結乾燥プロセスにより生ずる細胞培養培地である。これは、粉末状細胞培養培地が、典型的には、細かい顆粒の粒子状培地であり、液体培地ではないことを意味する。
用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と互換的に用いられてもよい；しかしながら、本明細書で用いられる「乾燥粉末」は、単に、造粒された材料の肉眼的外観を指し、別段の指示がない限り、材料が複合体化または凝集した溶媒を完全に含まないことを意味することを意図しない。粉末状細胞培養培地はまた、例えば、ローラー圧縮によって乾式造粒されるか、または流動床噴霧造粒によって湿式造粒され得る、造粒された細胞培養培地であり得る。このような培地は、噴霧乾燥によっても調製され得る。
原核生物および真核生物の一般的な増殖を支持するための本発明の培地は、この目的のために用いられる標準的な培地に匹敵する（視覚的な）増殖特性を示す。したがって、これらは、典型的には、
ａ．検出されやすい大部分の細胞の細胞増殖を促進するための生化学物質のバランスを含有する
ｉ）極めて幅広い範囲の原核生物および真核生物のニーズを供給するのに十分な特定の生化学物質を含有するが、しかし同時に
ｉｉ）ある種の感受性細胞株の増殖を有意に阻害するほど高い、特定の生化学物質の濃度を含有しない
ｂ．多くの原核生物および真核生物種に存在する栄養要求性のギャップを橋渡しするのに好適な豊富な栄養ベースを含有する
ｃ．増殖が広範囲のデノボ酵素合成によって不必要に遅れないように、細胞に供給することができるある種の複雑な生化学物質を含有する。
このような望ましくない、広範囲のデノボ酵素合成は、
ｉ）有意に延長された遅滞期、または
ｉｉ）それらが重大な細胞損傷に打ち勝つのにおよび／または過度の細胞同化活性を相殺するのに十分な代謝活性を回復することができないことにより、細胞死を導き得る。
細胞のインビトロの増殖を維持および／または支持するために必要な全ての成分を含む細胞培養培地は、典型的には、少なくとも１以上のサッカリド成分、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤成分、１以上の補因子および１以上の核酸成分（窒素含有塩基）またはそれらの誘導体を含む。これはまた、組換えタンパク質、例えば、ｒインスリン、ｒＢＳＡ、ｒトランスフェリン、ｒサイトカインなどの化学的に明らかな生化学物質を含んでもよい（上記を参照）。
培地は、ピルビン酸ナトリウム、高度に精製された、したがって化学的に十分に明らかな抽出物、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック生成物成分（エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに基づくブロックコポリマー）、特にPluronic F 68もしくはKolliphor P 188もしくはLutrol F 68と時折呼ばれるPoloxamer 188および／または化学的に調製された非イオン性界面活性剤などの表面活性成分を含んでもよい。
好適な非イオン性界面活性剤の１つの例は、ポロキサマーとも呼ばれる第一級ヒドロキシル基で終端をなす二官能性ブロックコポリマー界面活性剤であり、例えば、BASF, Germanyから商標名pluronic（登録商標）で入手可能である。そのようなプルロニック製品の成分は、以下において単にプルロニックと呼ばれる。キレート剤、ホルモンおよび／または増殖因子もまた、添加してもよい。
それが含んでもよい他の成分は、乳酸、チオグリコール酸、チオスルファート、テトラチオナート、ジアミノブタン、ミオイノシトール、ホスファチジルコリン（レシチン）、スフィンゴミエリン、鉄含有化合物（鉄硫黄クラスターを有する化合物を含む）、尿酸、カルバモイルホスファート、コハク酸、チオレドキシン、オロチン酸、ホスファチジン酸、ポリアミン（例えば、プトレシン、スペルミジン、スペルミンおよび／またはカダベリンなど）、トリグリセリド、ステロイド（コレステロールを含むがこれに限定されない）、メタロチオニン、酸素、グリセロール、尿素、アルファ−ケトグルタラート、アンモニア、グリセロホスファート、デンプン、グリコーゲン、グリオキサラート、イソプレノイド、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、脂質（ミセルのそれらを含むがこれらに限定されない）、トリブチリン、ブチリン、コール酸、デスオキシコール酸、ポリホスファート、アセタート、タルトラート、マラートおよび／またはオキサラートの純粋な化合物、塩、コンジュゲートおよび／または誘導体である。
サッカリド成分は、グルコース、ガラクトースもしくはフルクトース（モノサッカリドの例）またはスクロース、ラクトースもしくはマルトース（ジサッカリドの例）のような全てのモノ−もしくはジ−サッカリド、または糖アルコールのようなそれらの誘導体である。糖成分は、オリゴ−またはポリサッカリドであってもよい。
本発明によるアミノ酸の例は、特に、タンパク質新生アミノ酸、とりわけ、必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびに非タンパク質新生アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸などである。
チロシンは、Ｌ−またはＤ−チロシン、好ましくはＬ−チロシンを意味する。
システインは、Ｌ−またはＤ−システイン、好ましくはＬ−システインを意味する。
アミノ酸前駆体および類似体も含まれる。
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、様々なレチノイド、おおび４つのカロテノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）（アスコルビン酸のリン酸塩を含む）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体および類似体も含まれる。
塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸塩、カリウムおよびナトリウムなどの無機イオンまたはＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、ＶおよびＺｎなどの微量元素を含む成分である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、一塩基性リン酸ナトリウム無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム無水物（ＭｇＳＯ４）、二塩基性リン酸ナトリウム無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）である。
緩衝剤の例は、重炭酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。
補因子の例は、チアミン、ビオチン、ビタミンＣ、カルシフェロール、コリン、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ（還元型および／または酸化型）、コバラミン、ビタミンＢ１２、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、フラビンアデニンジヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン（還元型および／または酸化型および／または二量体として）、ヘム、ヘミン、ヘモグロビン、フェリチン、ヌクレオチドリン酸および／または誘導体（例えば、アデノシンリン酸）、補酵素Ｆ４２０、ｓ−アデノシルメチオニン、補酵素Ｂ、補酵素Ｍ、補酵素Ｑ、アセチルＣｏ−Ａ、モリブドプテリン、ピロロキノリンキノン、テトラヒドロビオプテリンの化合物、塩、複合体および／または誘導体である。
本発明による核酸成分は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、キサンチンおよび／またはヒポキサンチンのようなヌクレオ塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、キサントシン、イノシン、グアノシンおよびチミジンのようなヌクレオシド、およびアデノシン一リン酸、またはアデノシン二リン酸、またはアデノシン三リン酸のようなヌクレオチドであり、これらに限定されないが、それらのデオキシ−および／またはリン酸誘導体および／または二量体、三量体および／またはＲＮＡおよび／またはＤＮＡのような多量体を含む。
これらに限定されないが、用いられる濃度において細胞増殖特性に有意に負の影響を与えることなく、培地および／または１以上のその成分の透明度および／または溶解性を増加させるような、培地の物理化学的特性を改善する化合物を添加してもよい。そのような化合物は、これらに限定されないが、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤、デタージェント(detergents)、界面活性剤、乳化剤（ポリソルベート８０など）、中和剤、（ポリソルベート８０など）、ミセル形成剤、ミセル阻害剤、および／またはポリプロピレングリコール、ポリエチレンアルコールおよび／またはカルボキシメチルセルロールを含む。
培地は、典型的には、糖および／または糖混合物および／または糖二量体および／または糖多量体および／またはそれらの誘導体などの炭水化物を含有する。典型的には、グルコースおよび／またはラクトースおよび／またはガラクトースは、主な炭水化物糖成分であり得る。グルコースは、通常、水性培地溶液中０．００１ｍＭ〜２５０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭ、さらにより好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で培地中に含まれる。
典型的には、培地は、１リットル当たり１０ｍｇ〜３ｇの範囲で、好ましくは１リットル当たり４０ｍｇ〜１ｇの範囲で各アミノ酸を含む。
培地は、典型的には、ビタミンを含む。培地中のビタミンの典型的な量は、１リットル当たり５μｇ〜１０ｍｇの範囲、好ましくは１リットル当たり５０μｇ〜６ｍｇの範囲である。
典型的には、培地は塩を含む。１種類の塩の量は、典型的には、１リットル当たり２μｇ〜５ｍｇの範囲、好ましくは１リットル当たり１０μｇ〜１．５ｍｇの範囲である。特定の塩はまた、はるかに高い量で存在してもよい；ＮａＣｌの濃度は、例えば、１リットルあたり５ｇまでであり得る。
培地に含まれる核酸の典型的な量は、１リットル当たり０．５〜１０ｍｇの範囲、好ましくは１リットル当たり１〜５ｍｇの範囲である。
培地は、典型的には、全てのタンパク質新生アミノ酸（および／またはそれらの誘導体および／またはそれらのコンジュゲートおよび／またはそれらの二量体（純粋および／または混合））を含有する。固体培地中の成分の濃度は、溶解後に実際に測定される濃度と著しく異なる可能性があることに留意すべきである。これは、例えば、ある種のアミノ酸が水性培地中で他の成分と反応して、溶液中の純粋なアミノ酸がそれによって枯渇するアミノ酸をしたがって間接的に含有する生成物を形成し得るからである。
このプロセスは、他の容易に反応する構成要素、例えば、これに限定されないがビタミンＣに生じてもよく、および／または、実際にはアミノ酸が互いにまたはそれ自身と反応してもよい。このプロセスは、酸素濃度や、微量元素および／または超微量元素、特に成分として直接的に添加される、および／またはコンタミナントとして存在する、銅および／または鉄のような遷移金属イオンの存在に依存する酸化プロセスであり得る。
他の明らかな成分は、指示薬のように、微生物の検出または同定を助けるために添加されてもよい。
本発明による化学的に明らかな培養培地は、少なくとも１つの発色性または蛍光性基質をさらに含むことができる。蛍光性基質は、微生物により合成される酵素と接触すると切断され、蛍光性となる複合分子である。
放出された蛍光は、ＵＶまたは可視スペクトルの放射線を用いて増殖培地を照射することによって、視覚的におよび／または分光光度計のような分析機器で検出可能である。蛍光性基質の例は、フルオレセイン誘導体（ＣＦＡ、ＣＦＤＡ）、メチルウンベリフェロン誘導体またはAldols（商標）（Biosynth社により開発された）である。
発色性基質は、例えば、微生物の特異的酵素により、それらが修飾されたときに、その色を変える基質である。発色性基質の例は、ＯＮＰＧ（オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）またはＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド）である。この場合において、培地の色は、目的のある種の微生物の増殖後に色が変化し、そのような微生物の指標となる。
典型的には、好適な液体細胞培養培地は、２〜５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜３０ｇ／Ｌの典型的な組成を有する。ゲル化剤を含む培地は、典型的には、１〜５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２〜３０ｇ／Ｌのゲル化剤に起因して追加の重量を有する。
培地の浸透圧は、典型的には５０ｍＯｓｍ〜１０００ｍＯｓｍ、より好ましくは１５０ｍＯｓｍ〜５００ｍＯｓｍである。
好適な細胞培養培地は、動物および植物由来のペプトンがないので、それらは、例えば医薬適用または環境試験において、それらの使用時に外来性汚染生物(adventitious agent)コンタミネーションの供給源となる可能性を極めて低減させる。
それらの存在下で極めて有意に低減されるであろう、かかる感染性コンタミナントには、これらに限定されないが、以下が含まれる：
− ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のようなタンパク質性コンタミナント
− マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）のようなウイルス性コンタミナント、
− 耐熱性胞子形成原核生物、
− 真核生物のコンタミナント、
− Burkholderia cepaciaのようなマイコプラズマなどのある種の条件下でそれらの非常に小さいサイズに起因して、滅菌濾過において可能であること、または膜孔を透過することが知られている細胞。
本発明による化学的に明らかな細胞培養培地は、典型的な化学的に明らかな細胞培養培地に加えて、例えば、ＣＨＯ細胞の培養のために、以下の成分および／またはそれらの塩および／またはそれらの誘導体および／またはコンジュゲートおよび／または二量体（純粋または混合）を含む。
Figure 0006923523
好適な鉄塩の例は、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物または硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物である。鉄のキレートも、タンパク質またはペプチドを含有する鉄として使用してもよい。
システインおよび／またはシスチンは、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチル−システインとして添加されてもよい。
グルタミンは、例えば、純粋な化合物として、および／またはＬ−アラリル−Ｌ−グルタミン、または塩酸塩として、添加されてもよい。
アデニンおよびグアニンは、例えば、純粋な化合物として、または塩酸塩として添加することができる。
アミノ安息香酸は、純粋な化合物として、または塩、例えばナトリウム塩として添加することができる。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、酸化型または還元型として、および／またはリン酸誘導体として、および／または当業者に知られている他の誘導体として添加することができる。
細胞培養培地は、乾燥粉末培地、液体培地または半固体培地であり得る。半固体培地の場合において、培地は、化学的に明らかな成分に加えてゲル化剤を含む。好適なゲル化剤の例は、寒天および／またはアガロースである。
粉末状細胞培養培地は、好ましくは、全ての成分を混合し、それらを粉砕することによって生産される。成分の混合は、粉砕によって乾燥粉末状細胞培養培地を生産する当業者に知られている。好ましくは、混合物のすべての部分がほぼ同じ組成を有するように、全ての成分を完全に混合する。組成物の均一性が高いほど、均質性に関して、得られる培地の品質は優れる。
粉砕は、粉末状細胞培養培地を生産するのに好適な任意のタイプのミルで行うことができる。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミル(fitz mill)またはジェットミルである。ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルが好ましく、ピンミルが非常に好ましい。粉砕チャンバーを窒素で冷却するピンミルがさらにより好ましい。
好ましくは、粉砕に供される混合物の全ての成分は乾燥している。これは、それらが水を含む場合、それらは結晶化水のみを含むが、１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、最も好ましくは２重量％以下の未結合または非配位水分子を含むことを意味する。それらはまた、粉末特性が著しく影響を受けないように、培地内に結合した液体を含有していてもよい。
乾燥粉末細胞培養培地は、取扱いを容易にするための圧縮物としても使用することができる。典型的には、圧縮された培地は、良好な溶解特性を有し、粉塵形成の減少により取り扱いがより容易である。
粉末培地は、好ましくはロールプレスで圧縮される。
乾燥粉末状培地の使用のために、溶媒、好ましくは水（最も特別には蒸留水および／または脱イオン水または精製水または注射用水）または水性緩衝剤を培地に添加し、成分は、培地が溶媒に完全に溶解するまで混合される。
溶媒はまた、生理食塩水、好適なｐＨ範囲（典型的には、ｐＨ１とｐＨ１０との間の範囲）を提供する可溶性酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、保存剤、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒、ならびに半固体媒体の生産のためのゲル化剤を含んでもよい。
培地は、好ましくは、処理されることで、生物学的コンタミナントが使用前の最終処理培地中に極めてまれに存在するようなレベルまで、使用前にバイオバーデン負荷を有意に減少させられる。この処理は、好ましくは、濾過および／または熱処理（例えば、１２１℃で１５分間）および／またはＵＶ処理によって、液体状態で行うことができる。
細胞を添加する前の溶解した培地のｐＨは、典型的にはｐＨ２と１２との間、より好ましくはｐＨ４と１０との間、さらにより好ましくはｐＨ６と８との間、最も好ましくはｐＨ６．５〜７．５の間、理想的にはｐＨ７．０〜７．５の間である。
本発明による培養培地は、好気的および嫌気的の増殖条件下で使用することができる。当業者は、好気的または嫌気的増殖のために取られるべきそれぞれの手段に精通している。典型的には、嫌気的培養条件のために、例えば、水性培地中の酸素を減少させるか、または好ましくは排除する添加物によって、および／または真空下での物理的手段によって、および／または酸素ガスを沸騰させることによって、酸素が除去される。
したがって、添加物が使用される場合、好ましくは、添加物は、媒体中に溶解している酸素と反応して化学的に除去され、したがって嫌気的環境を作り出す。いかなる手段によっても、酸素枯渇培地を含有する容器は、新鮮な酸素の培地への侵入を防止すべきである。添加物は、還元剤を含んでいてもよく、または酸素吸収剤、またはパラジウム触媒などのスカベンジャー、または酵素、例えば、モノ−および／またはジ−オキシゲナーゼ、および／またはスクシナートであってもよい。
グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む化学的に明らかな細胞培養培地が、原核生物および真核生物の両方の増殖を支持することを見出した。培地は、それらが前記成分を含む限り、それらの組成物において広く変更することができる。
結果として、広い範囲の原核生物および真核生物の両方を増殖させるという目的のために、グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を、広く多様な化学的に明らかな細胞培養培地に添加し、および／または組み込み、これらの培地の適用性を改善することができる。
それゆえ、本発明はさらに、グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む細胞培養培地補充物に向けられる。好適な、かつ好ましい量は、表１で提供する。
一態様において、細胞培養培地補充物は、０．０１〜１０ｇ／Ｌのグルタミン、０．０１〜３ｇ／Ｌのシステインおよび／またはシスチン、０．１〜３００ｍｇ／Ｌのアデニン、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌのグアニン、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアミノ安息香酸および０．０１〜１００ｍｇ／Ｌの鉄（ＩＩＩ）塩を含有する。
本発明の培地補充物は、典型的には、本発明の細胞培養培地と同じ様式で生産され、使用される。補充物は、乾燥粉末培地に添加され、溶解および使用の前に、この培地と完全に混合されてもよい。それはまた、細胞培養培地自体のような水または水性緩衝剤中に溶解され、生物学的コンタミナントを除去するための処理、例えば濾過による処理の後または前に、溶解された細胞培地と混合されてもよい。
本発明の培地補充物で補充することができる化学的に明らかな培地の例は、哺乳動物および／または昆虫細胞を増殖させる目的で使用されるものである。
本発明の補充物で補充されるのに特に好適な培地は、ＣＨＯ細胞のための細胞培養培地配合物である。これらは文献に十分に記載されており、いくつかは、例えば、Merck KGaA（Darmstadt, Germany）から市販されている。
ＣＨＯ細胞の培養のための典型的に明らかな培地ベース（ペプトンまたは重炭酸ナトリウムを全く添加しない）は、下から見出され得る：
− Ｆ−１２Ｋ培地のための配合物、ATCC（登録商標）30-2004
− 無血清培地ＣＨＯ−Ｔ１−ＳＦの組成物
（Journal of Biotechnology, 2004, 108, p 279‐292, Schroeder et al., “Serum- and protein-free media formulations for the Chinese hamster ovary cell line DUKXB11”から）
− 米国特許出願第US 2006/0148074 A1号、Gorfien et al.、公開日06.07.2006、“Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof”。
したがって、本発明はさらに、哺乳動物および／または昆虫細胞の化学的に明らかな培養培地にグルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む細胞培養培地補充物を添加することによる、原核生物および真核生物の培養／増殖を支持する化学的に明らかな細胞培養培地を調製する方法に向けられる。
本発明の要旨は、化学的に明らかであって、極めて広い範囲の原核生物および真核生物の迅速な培養／増殖を支持する、細胞培養培地を提供することである。培地は厳密な化学的配合組成を有するので、バッチ間の生産は最小限の変動を示し、再現性を保証することができる。培地は、動物および植物由来のペプトンが実質的にないので、それらは、例えば医薬適用または環境試験において、それらの使用時に外来性汚染生物コンタミネーションの供給源となる可能性を極めて低減させる。
本発明はさらに、上で明らかなとおり培養培地中の微生物を培養するための方法、および微生物の培養のための本発明による細胞培養培地の使用に向けられる。好ましい態様において、微生物は、細菌、酵母および真菌からなる群から選択される。
典型的には、培地は好適な容器に入れられ、微生物または前記微生物を潜在的に含むサンプルに接種される。好適な容器は、上で明らかにされている。サンプルは、細胞培養培地に接触することができる任意の液体、気体または固体の実体であり得る。サンプルは、例えば、細胞培養培地を含む接触プレートに接触する表面であってもよい。これは、例えば、細胞培養培地に接触させられるスワブ、または培地中にもしくは培地上に置かれる任意の液体または固体であり得る。
細胞の増殖を可能にする培地のインキュベーションの温度は、典型的には０℃と１００℃との間、より典型的には１５℃と５０℃との間、なおより典型的には２０℃と４５℃との間である。サンプルは、例えば、室温（約２０℃）で、例えば、２２．５℃または３２．５℃で、インキュベートされてもよい。
一般に、接種後、培地は、それらを容易に検出することができるように、微生物のある程度の増殖を可能にするため時間インキュベートされる。従来の方法では、この時間は最低数時間から数週間の範囲で行うことができる。一般に、インキュベーション時間は、約１日と１４日間との間である。この方法で製造される培地は、従来、増殖のために２日間を要する微生物であっても、２４時間未満後にある種の微生物を検出することを可能にする。特に、酵母およびカビは、ペプトンで製造される従来の培地と比較して、並外れて速い増殖速度を示す。
本発明はさらに、
ａ）サンプルを、グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩を含む、化学的に明らかな細胞培養培地に接触させること、
ｂ）ステップａ）の接種された細胞培養培地をインキュベートすること、
ｃ）前記細胞培養培地から原核生物および真核生物の存在を検出すること
により、サンプルから原核生物および真核生物を、１つのアッセイにおいて、同時に検出するための方法に向けられる。
ステップａ）およびｂ）は、微生物を培養するために、上記のように行われる。ステップｃ）における検出は、任意の知られている方法によって行うことができる。例としては、半固体培地上に形成されたコロニーまたは液体培地中の濁りの視覚的検出、培地中に存在する発色性または蛍光性基質から生ずる色または蛍光の変化の検出である。増殖は、有機酸を生産する微生物の酵素活性によりもたらされる生化学的変換から生ずるｐＨ変化、例えば、または、ｐＨの著しい上昇を引き起すアンモニウム産生により識別することができる。
検出のための他の方法には、ＰＣＲ分析が含まれる。当業者は、目に見える増殖がない場合でも、微生物の存在を直接的または間接的に検出することができる、そのような培地と組み合わせて使用することができる多くの他の方法を同定することができる。
本発明による化学的に明らかな培地は、様々な適用において、例えば、バイオ医薬品または環境分野において、食品および飲料産業において、または診断において、従来の複雑な培養培地と置き換えることができる。例示的な適用を、以下に列挙する：
無菌およびバイオバーデン試験：
本発明による培地は、無菌およびバイオバーデン試験に使用することができる。中間材料および最終製品の無菌試験は、医薬品および医療用デバイスの製造の間に実証されなければならない。飲料または飲料水の定期的な微生物学的制御も非常に重要である。
サンプルのバイオバーデンレベルまたは無菌性を試験するための典型的な方法は、液体サンプルを、サンプルの存在し得るコンタミナントを保持するメンブレンフィルター上で濾過し、フィルターを培養培地中でインキュベートすることである。サンプルが濾過できない場合、サンプルを培養培地中に直接接種することができる。１以上のコンタミナントが存在する場合、透明な媒体は、細胞の発育により濁る。
この点に関して、本発明による化学的に明らかな培養培地の使用は、好ましくは、それが低濁度であっても容易に検出することができる透明な培地であるので、有利である。１つの有利な点は、視覚的検出を助けるように培地の色を容易に調整できることである。
この用途で使用されるフィルターは、サンプル中の任意の微生物を捕捉するのに十分に小さい孔径を有する。そのようなフィルターは、典型的には、約０．１μｍから最大１．２μｍまでの孔径を有する。好ましくは、孔径は、０．４５μｍ以下である。フィルターは、再生セルロース、混合セルロースエステル、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホンおよびポリフェニルスルホンなどの、かかる適用に一般的に使用される任意の好適な材料で形成することができる。
フィルターのためのホルダーは、単にファンネルなどのステンレス製のデバイスであってもよい。あるいは、試験全体（サンプリング、濾過、培地添加およびインキュベーション）を行うことができる閉鎖デバイスである、Steritest（商標）ＥＺデバイス（Merck Millipore）などの使い捨ての、予め滅菌された透明なフィルター含有デバイスを使用することができる。
環境試験：
施設内の微生物の環境レベルを試験するための典型的な方法は、デバイスを通して空気のサンプルを濾過し、微生物をフィルター上に保持することである。フィルターをその後、上述のように本発明による培養培地中でインキュベートすることができる。
別の典型的な方法は、接触プレートにおけるそのような培地の使用である。特に、培地中の高度に精製され化学的に明らかな性質の原料は、前記培地が外来性汚染生物を含有する可能性が著しく低いことを意味する。接触プレートの表面は、半固体の形態で培地を構成する。
培地表面は、装置が微生物でコンタミネートされているか否かを決定するために、例えば装置表面に押し付けられる。当然のことながら、その後、少量の媒体がこの装置の表面に残される。これは、この重要な表面（例えば、製薬環境）上での試験後に残される培地の指紋が、培地でわずかにコンタミネートされていることを意味する。
従来の培地により、表面は、その後、はっきりしないペプトンや他のはっきりしない原料で汚染される。かかる原料は、ＢＳＥ／ＴＳＥ汚染生物およびウイルスなどの外来性汚染生物を携行するはるかに高いリスクを保有する。これに対して、化学的に明らかな合成培地は、そのような外来性汚染生物を保有する可能性がはるかに低い、低リスクの選択肢である。
培地充填試験：
培地充填試験は、無菌生産プロセスが、例えば、医薬品または食品および飲料産業において、腐敗性細菌、酵母またはカビなどの微生物コンタミネーションにより影響を受けないことを検証するために、定期的に行われる。典型的には、培地充填試験では、製品の生産の全プロセスが、それぞれの製品の代わりに滅菌培養培地でシミュレートされる。
培地を、その後、上で明らかなとおり無菌試験に供する別々のユニットに充填する。再度、上記の場合と同様、外来性汚染生物よる偶発的なコンタミネーションの減少したリスクは、プロセスに由来し、かつ動物組織および／または飼育場に基づく起源を有するはっきりしないペプトン／抽出物がない培地を使用するとき、より低くなる。
特異的同定の前の前増菌：
さらなる側面において、本発明による培地は、同定前の微生物の前増菌に使用することができる。この目的のために、サンプルを培地に接種し、微生物を十分な時間増殖させる。所望の濃度に達するとすぐに、サンプルは、特異的な微生物学的同定などのさらなる処理に供される。
本発明のさらなる側面は、それゆえ、生存する微生物でコンタミネートされているか否かを決定しようとするサンプルから微生物を検出する方法であって、上で明らかなとおりの培養培地にサンプルを接種するステップと、微生物の増殖を観察するステップとを含むことを特徴とする、前記方法である。
本発明はさらに、バイオバーデン、無菌、環境または培地充填試験のための、本発明による細胞培養培地の使用に向けられる。
本発明では、化学的に明らかな細胞培養培地もまた、細胞培養培地の典型的な含有物に加えて、前記培地が、添加物（グルタミン、システインおよび／またはシスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩）のある種の組み合わせを含む場合、真核生物および原核生物の同時検出に適していることが示され得る。
１以上の前記添加物を含む細胞培養培地は知られているが、これまで、前記成分を含む化学的に明らかな培地が、幅広い範囲の微生物の増殖を支持するのにとりわけ好適であることまで認識されていなかった。
本発明の培地および方法は、したがって、外来性汚染生物を保有することが知られている化学的にはっきりしないペプトンおよび／または抽出物を含む細胞培養培地を使用することを強制されることなく、そのような微生物を増殖させ、場合により検出する可能性を提供する。本発明の培地および方法は、ペプトンの使用を含む既知の培地および方法と同等の感受性を有し、迅速である。
本発明を、以下の例によってさらに例証するが、しかしながらこれらに限定されるものではない。
上記及び下記に引用される全ての出願、特許及び刊行物、並びに２０１５年１２月３日に提出された対応するEP15197739.4の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
例
全ての株についての試験手順：
− フィルター滅菌した液体培養培地を、即座に調製するか、または使用前に冷蔵庫内の１２５ｍＬガラスボトルに保存する。
− −８０℃でＨＥＰＥＳ／グリセロール中に保存していた株溶液の段階希釈を０．９％塩化ナトリウム溶液で行う。
− 各培養培地ボトルに２０〜５０ＣＦＵ／ｍＬで接種する。
− 接種したボトルを、株に応じて２２．５℃±２．５℃および３２．５℃±２．５℃で最大１４日間インキュベートする。
− 滅菌ボトルを対照として平行してインキュベートする。
− 微生物の発育を各ボトルにおいて視覚的に観察する。
例１
典型的に、Tryptic Soy Agar（ＴＳＡ）の増殖能力を試験するために用いられる８つの細胞株を、前記ＴＳＡの代わりに寒天で補充された化学的に明らかな合成培地であるＣＨＯ培地（Cellvento（商標）ＣＨＯ−１００、商品番号1.00899、Merck-Millipore, Darmstadt, Germanyから）の好適性をスクリーニングするのために選択した。ＣＨＯ−Ｓの増殖パラメーターを、ＴＳＡ（Merck-Millipore, Darmstadt, Germanyから購入された商品番号1.05458.0500）と比較して測定する。
前培養物(The pre-cultures)を、Tryptic Soy Broth（ＴＳＢ）（Merck-Millipore, Darmstadt, Germanyから購入した商品番号1.05459.0500）で調製し、アガープレートから真菌の胞子を洗い流して懸濁することによって直接調製されるAspergillus種を除いて、３７℃で２４時間好気的に増殖させる。前培養物を塩化ナトリウムペプトンブロスに希釈し、スパイラルプレーターを用いてプレーティングする。
ＣＨＯ−Ｓ培地を、炭酸ナトリウムを使用してｐＨを７．３に調整した二重濃縮ＣＨＯ−１００培地から調製し、水性補充物濃縮物の添加後、溶液を滅菌濾過する。別々に、アガーを２倍の濃度（２６ｇ／Ｌ）で水に懸濁し、１２１℃で２０分間オートクレーブする。アガー溶液をその後、約４６℃に冷却し、同じ温度で二重濃縮ＣＨＯ−Ｓ培地と混合する。
アガープレートを、外来微生物のコンタミネーションを回避しながら、２つの溶液を穏やかに、しかし完全に混合した後に調製する。表面接種後、プレートを好気的に３２℃±２．５℃でインキュベートし、２４時間後に採点する。
結果を、表２に示す。
Figure 0006923523
増殖は、３２．５±２．５℃でのインキュベーションの２４時間後に読み取った、０（増殖なし）〜５（それぞれの細胞株についての豊かな増殖）のスケール上でのコロニーの相対直径で与えられる。
概要
２４時間後のコロニーサイズによって表される増殖の速さ、およびパーセント回収率は、補充物成分であるグルタミン、システイン／シスチン、アデニン、グアニン、アミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに鉄塩のＣＨＯ培地への添加の後にのみ、ＴＳＡと比較して全て優れている。
これは、グラム陽性生物（Streptococcus pyogenes細胞株、Staphylococcus aureusの両方、およびBacillus subtilis）ならびにグラム陰性細胞株のPseudomonas aeruginosaを含む試験したほぼ全ての細菌について当てはまる。実際に、この正の効果は、試験した真核生物細胞についてもまた見ることができる：Aspergillus brasiliensisのパーセント回収率の改善、ならびに、試験したCandida株のコロニーサイズのわずかな増加を含む。
したがって、試験した原核生物および真核生物の両方が、有意な増殖の改善および／またはコロニーサイズを示し、培地はtryptic soy agarに匹敵するものとなる。
例２
以下の４９株の原核生物および真核生物を、それらが環境に関連し得るかまたは実環境サンプルから単離されるものであることから、試験のために選択する。
所与の温度での１４日間のインキュベーションにおいて視覚的に同定された正の増殖の結果を、表３に示す。
接種は、ＴＳＢまたはＣＨＯ−Ｓ培地中に接種した細胞の数を指す。ＣＨＯ−Ｓ培地の調製は、例１に記載されている。
Figure 0006923523
Figure 0006923523
結果は、試験した全ての原核生物および真核生物が、ＴＳＡ中で、および本発明による化学的に明らかな細胞培養培地中で、良好に増殖することを示す。

Claims (10)

  1. ０．０１〜１０ｇ／Ｌのグルタミン、０．０１〜３ｇ／Ｌのシステインおよび／またはシスチン、０．１〜３００ｍｇ／Ｌのアデニン、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌのグアニン、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに０．０１〜１００ｍｇ／Ｌの鉄（ＩＩＩ）塩を含む細胞培養培地中で細胞がインキュベートされることを特徴とする、化学的に明らかな細胞培養培地中における原核生物および真核生物を培養するための方法。
  2. 細胞培養培地が、１以上のサッカリド成分、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤成分、１以上の補因子および１以上の核酸成分を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 細胞培養培地が、ゲル化剤を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 培養される原核生物が、１以上の以下の株：Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis、Escherichia coli、Streptococcus pyogenes、Pseudomonas aeruginosaを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 培養される真核生物が、１以上の以下の株：Candida albicans、Aspergillus brasiliensisおよび／またはSaccharomyces cerevisiaeを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 原核生物および真核生物が、少なくとも１種の偏好性株を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ａ）０．０１〜１０ｇ／Ｌのグルタミン、０．０１〜３ｇ／Ｌのシステインおよび／またはシスチン、０．１〜３００ｍｇ／Ｌのアデニン、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌのグアニン、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに０．０１〜１００ｍｇ／Ｌの鉄（ＩＩＩ）塩を含む、化学的に明らかな細胞培養培地に、サンプルを接触させること、
    ｂ）ステップａ）の細胞培養培地をインキュベートすること、
    ｃ）細胞培養培地から原核生物および真核生物の存在を検出すること
    による、サンプルから原核生物および真核生物を検出するための方法。
  8. 原核生物および真核生物の存在が、それらの増殖を介して、または、原核生物および真核生物によって誘発される色もしくはｐＨの変化を介して、検出されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 培地が、ゲル化剤を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
  10. バイオバーデン、無菌、環境または培地充填の試験のための、０．０１〜１０ｇ／Ｌのグルタミン、０．０１〜３ｇ／Ｌのシステインおよび／またはシスチン、０．１〜３００ｍｇ／Ｌのアデニン、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌのグアニン、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびに０．０１〜１００ｍｇ／Ｌの鉄（ＩＩＩ）塩を含む原核生物および真核生物を培養するための化学的に明らかな細胞培養培地の使用。
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