ITRM20120379A1 - Terreno di trasporto per l'isolamento e l'identificazione di helicobacter pylori. - Google Patents

Terreno di trasporto per l'isolamento e l'identificazione di helicobacter pylori. Download PDF

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ITRM20120379A1
ITRM20120379A1 IT000379A ITRM20120379A ITRM20120379A1 IT RM20120379 A1 ITRM20120379 A1 IT RM20120379A1 IT 000379 A IT000379 A IT 000379A IT RM20120379 A ITRM20120379 A IT RM20120379A IT RM20120379 A1 ITRM20120379 A1 IT RM20120379A1
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Bartolomeo Soraya Di
Campli Emanuela Di
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Uni Degli Studi G D Annun Zio Chieti Pe
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description

Terreno di trasporto per l'isolamento e
l'identificazione di Helicobacter pylori
La presente invenzione riguarda un terreno di trasporto per l'isolamento e l'identificazione di Helicobacter pylori.
Più dettagliatamente l'invenzione riguarda un terreno di trasporto del tipo detto, in particolare destinato al trasporto di biopsie gastriche per la coltura ed il recupero di H. pylori, che fornisce condizioni ottimali per il mantenimento della vitalità del microrganismo.
Com'à ̈ ben noto, i terreni di trasporto vengono utilizzati per la conservazione temporanea di campioni durante il loro trasporto al laboratorio di analisi per l'esame colturale e hanno il compito di conservare la vitalità di tutti i microrganismi presenti, mantenendone costante la concentrazione. In genere, i terreni di trasporto per microrganismi sono costituiti da soluzioni saline tamponate, e più in particolare, al loro interno non devono essere presenti carbonio, azoto e agenti di crescita, per evitare la replicazione batterica .
Per quanto riguarda H pylori, non à ̈ stato fino ad oggi possibile sviluppare un terreno di trasporto costituito solo da tamponi e sale. Trattandosi di un microrganismo facilmente "stressabile", H. pylori,in presenza di terreno costituito solo da tamponi e sale, risponde all'ambiente sfavorevole acquisendo lo stato Vitale non Coltivabile (VBNC) che non consente il successivo isolamento sui terreni di coltura. Attualmente, i terreni di trasporto utilizzati per l'isolamento e l'identificazione di Helicobacter pylori presentano nella loro composizione una certa quantità di antibiotici, che hanno la funzione di evitare la contaminazione microbica del terreno.
È altresì noto che H. pylori à ̈ un microrganismo di difficile isolamento, che presenta tre diversi aspetti morfologici: i) spiraliforme in vivo quando il germe colonizza la mucosa gastrica; ii) bastoncellare in vitro quando il germe cresce sui terreni di coltura; iii) coccoide in condizioni di crescita sub-ottimali (mancanza di nutrienti, presenza di concentrazioni subinibenti di antibiotico).
La presenza nel terreno di trasporto di chemioantibiotici , anche inefficaci nei confronti di H. pylori, à ̈ quindi non desiderabile, in quanto può risultare "stressante" e quindi inducente nella popolazione microbica il morfotipo coccoide che, per una parte, perde la capacità di crescere su terreni di coltura solidificabili (stato VBNC).
Ulteriori limiti dei terreni di trasporto secondo la tecnica nota sono: la scarsa capacità di questi terreni di conservare il campione nel tempo (anche garantendo il rispetto della temperatura ottimale di conservazione, pari a 4°C) e la difficoltà di isolamento di H. pylori dal terreno.
Scopo della presente invenzione à ̈ quindi quello di realizzare un terreno di trasporto per l'isolamento e l'identificazione di H. pylori che permetta di superare i limiti delle soluzioni secondo la tecnologia nota e di ottenere i risultati tecnici precedentemente descritti .
Ulteriore scopo dell'invenzione à ̈ che detto terreno di trasporto possa essere realizzato con costi sostanzialmente contenuti, sia per quanto riguarda i costi di produzione che per quanto concerne i costi di conservazione .
Non ultimo scopo dell'invenzione à ̈ quello di realizzare un terreno di trasporto per l'isolamento e l'identificazione di H. pylori che sia sostanzialmente semplice da realizzare, sicuro ed affidabile.
Forma pertanto un primo oggetto specifico della presente invenzione un terreno di trasporto per l'isolamento e l'identificazione di Helicobacter pylori, che comprende, per un litro di terreno: da 6,5 a 7,2 g di agar granulato, da 9,5 a 10,5 g di digerito enzimatico di caseina, da 9 a 10 g di digerito enzimatico di tessuto animale, da 1,8 a 2,2 g di estratto di lievito, da 0,8 a 1,2 g di glucosio, da 5,3 a 5,7 g di sodio cloruro, nonché da 9 a 10,2 mL di arricchimento, il resto essendo costituito da acqua distillata, dovendo essere garantito un pH compreso tra 6,8 e 7,2.
Preferibilmente, secondo l'invenzione, detto arricchimento contiene {tutti i componenti essendo espressi in g/L): Vitamina B12 0,01, L-Glutamina da 9,5 a 10,5 , Adenina da 0,9 a 1,1, Guanine Idroclorido 0,03, Acido p-Aminobenzoico 0,013, Nicotinamide Adenina Dinucleotide da 0,23 a 0,27, Tiamina Pirofosfato 0,1, Nitrato Ferrico 0,02, Tiamina Idroclorido 0,003, L-Cisteina Idroclorido da 24,9 a 26,9, L-Cistina da 1 a 1,2, Destrosio da 90 a 100.
Ancora più preferibilmente, secondo l'invenzione, detto terreno di trasporto comprende, per un litro di terreno; 7 g di agar granulato, 10 g di digerito enzimato di caseina, 9,5 g di digerito enzimato di tessuto animale, 2 g di estratto di lievito, 1 g di glucosio, 5,5 g di sodio cloruro, nonché 10 mL di arricchimento, il resto (961,2 mL) essendo costituito da acqua distillata, dovendo essere garantito un pH pari a 7,0±0,2.
Forma inoltre un secondo oggetto specifico della presente invenzione, un procedimento di realizzazione di un terreno di trasporto come precedentemente definito, comprendente le seguenti fasi:
- miscelare tutti i componenti, fatta eccezione per l'arricchimento, nelle proporzioni definite;
portare la miscela ad ebollizione in agitazione;
- sterilizzare in autoclave ad una temperatura di 121°C per 15 minuti oppure 119°C per 20 minuti;
- raffreddare la miscela fino ad una temperatura compresa tra 45°C e 50°C;
- aggiungere l'arricchimento.
In particolare, secondo l'invenzione, il terreno ottenuto à ̈ conservato ad una temperatura compresa tra 4<0>C e 8<0>C.
Preferibilmente, secondo la presente invenzione, detta fase di sterilizzazione à ̈ condotta in autoclave ad una temperatura pari a 121°C per un tempo pari a 15 minuti, detta fase di raffreddamento che precede l'aggiunta dell'arricchimento comporta una riduzione della temperatura fino a 50 °C e detta fase di conservazione à ̈ effettuata ad una temperatura pari a 4°C .
L'invenzione verrà descritta nel seguito a titolo illustrativo, ma non limitativo, con particolare riferimento ad alcuni esempi illustrativi.
In particolare, l'invenzione si riferisce ad un nuovo terreno di trasporto di biopsie gastriche per il recupero di H. pylori , un microrganismo di difficile isolamento. Si tratta di un terreno sterile, semisolido, inodore, di facile preparazione i cui ingredienti, adeguatamente combinati, permettono di recuperare nel tempo il microrganismo. Il terreno di trasporto che si propone à ̈ privo della miscela di antibiotici presente nelle formulazioni dei terreni di trasporto di H. pylori secondo la tecnica nota e in particolare dell'unico prodotto presente sul mercato italiano (Portagerm pylori<®>, della BioMérieux Italia) .
Come sarà meglio chiarito in seguito, queste osservazioni suggeriscono l'uso di questa preparazione anche per un minor costo rispetto al prodotto in commercio .
Il nuovo terreno di trasporto secondo la presente invenzione, à ̈ un terreno semisolido, idoneo per il trasporto di batteri difficili come H. pylori dal centro di gastroenterologia al laboratorio. Il campione bioptico va introdotto in profondità nell'agar immediatamente dopo il prelievo. I flaconi, tenuti al riparo dalla luce, vanno trasportati in laboratorio.
La biopsia, recuperata in laboratorio, viene opportunamente seminata su adeguati terreni selettivi e non, per il recupero di H. pylori.
L'efficienza di questo preparato risiede nella possibilità di isolamento del microrganismo anche dopo un periodo di conservazione di 10 giorni con ottimo recupero del batterio con assenza di contaminanti.
Un altro aspetto interessante à ̈ quello dell'assenza di antibiotici nella composizione del prodotto che non favorisce la conversione morfologica di H. pylori da bastoncino a cocco, con un recupero più veloce rispetto al prodotto attualmente in commercio. Questa performance permette di effettuare 1'antibiogramma più rapidamente, anticipando la risposta microbiologica al paziente.
Il terreno à ̈ di facile preparazione e gli ingredienti sono facilmente reperibili.
Esempio 1. Composizione del terreno di trasporto secondo la presente invenzione
Le prove sperimentali descritte nel seguito della descrizione sono state effettuate facendo uso di un terreno di trasporto per l'isolamento e l'identificazione di Helicobacter pylori che aveva la composizione specificata nella Tabella 1.
Tabella 1
Ingredienti x IL
Arricchimento (mL)* (Becton-Dickinson 10 211875, Le Point de Claix, Francia)
Agar granulato (g)(agar n°l Batteriologico 7
LP0011B, OXOID SpA, Garbagnate Milanese-Mi, Italia)
Digerito enzimatico di Caseina (g) 10
(Tryptone T9410, Sigma-Aldrich, Milano)
Digerito enzimatico di tessuto animale(g) 9,5
(Peptone from animai tissue, Type I, for
microbiology, P7750, Sigma-Aldrich,
Milano, Italia)
Estratto di lievito (g) (Yest Extract 2
Power LP021B, OXOID SpA, garbagnate
Milanese-Mi, Italia)
Glucosio (g) (Glucose 4125012, Biolife 1
Italiana, Milano, Italia)
Sodio Cloruro (g) (Sodium chloride S7653- 5,5
lKg, Sigma Aldrich, Milano, Italia)
H20 distillata (mL) 961,2
pH 7,0±0,2
*Supplemento IsoVitaleX (tutti i componenti vengono espressi in g/L): Vitamina B120,01, L-Glutamina 10,0, Adenina 1,0, Guanine Idroclorido, 0,03, Acido p-Aminobenzoico 0,013, Nicotinamide Adenina Dinucleotide 0,25, Tiamina Pirofosfato 0,1, Nitrato Ferrico 0,02, Tiamina Idroclorido 0,003, L-Cisteina Idroclorido 25,9, L-Cistina 1,1, Destrosio 100,0
Esempio 2. Modalità di preparazione del terreno di trasporto secondo la presente invenzione
Dopo aver pesato gli ingredienti che compongono il terreno, gli stessi, ffatta eccezione per l'arricchimento , sono stati miscelati e portati ad ebollizione in agitazione e quindi sterilizzati in autoclave a 121°C per 15 minuti. Dopo la sterilizzazione, il terreno à ̈ stato raffreddato fino a 50°C, e quindi à ̈ stato aggiunto l'arricchimento. Il terreno à ̈ stato quindi suddiviso in flaconi sterili da 1 mL, di facile apertura e chiusura con assenza di estremità taglienti. Il terreno raffreddato à ̈ stato quindi conservato alla temperatura di 4°C prima dell'uso. Il terreno così ottenuto si presenta di colore chiaro, con consistenza omogenea, trasparente in controluce, in modo da facilitare il rilievo della biopsia infissa.
Esempio 3 . Conservazione del terreno di trasporto secondo la presente invenzione
La conservazione del terreno di trasporto secondo la presente invenzione à ̈ stata effettuata ad una temperatura pari a 4-6°C, al riparo della luce, in luogo asciutto. In queste condizioni, il prodotto à ̈ stato successivamente utilizzato dopo un anno e mezzo dalla preparazione, dimostrandosi ancora valido. L'eventuale presenza di modifiche del colore, indurimento o altri segni evidenti di deterioramento dell'agar sono un indicatore del fatto che la conservazione non à ̈ stata effettuata correttamente e che il terreno non à ̈ utilizzabile.
Esempio 4. Valutazione dell'efficacia del terreno di trasporto secondo la presente invenzione
L'efficacia del terreno di trasporto à ̈ stata valutata sia in vitro che ex vivo.
In vitro sono stati inoculati nel terreno di trasporto della presente invenzione, a diverse concentrazioni, un ceppo di riferimento internazionale H. pylori ATCC 43629 ed un ceppo clinico, valutando il recupero di H. pylori nel tempo. La Tabella 2 mostra i risultati ottenuti, in particolare il numero di UFC (Unità Formanti Colonie) di H. pylori (ceppo di riferimento H. pylori ATCC 43629-Hpl e ceppo clinico H. pylori 13-Hp2) recuperate dopo conservazione a 4 °C nel terreno di trasporto dell'invenzione nel tempo (T=0, 1, 2, 3, 4, 5 e 7 giorni).
In particolare, nella Tabella 2, il numero delle UFC per piastra rappresenta la media di esperimenti in triplicato .
(segue Tabella 2)
Tabella 2
Concentrazione Recupero di H. pylori (UFC)dopo conservazione a 4°C nel iniziale di H. 0 1 2 y 3 1 4 pylori nel Hpl Hp2 Hpl Hp2 Hpl HP2 Hpl Hp2 Hpl H terreno di
trasporto
(UFC)
IO<5>>10<3>—* >10<3>_* >10<3>_* >10<3>>10<3>>10 IO<4>>10<3>>10<3>>10<3>705 >10<3>208 >10<3>155 321 98 IO<3>490 106 450 52 471 44 420 6 88 1 IO<2>170 12 165 8 158 3 33 0 7 0 IO<1>9 2 32 2 1 0 3 1 0
<0>
<♦>nessuna crescita
I risultati esposti nella Tabella 2 sottolineano l'efficacia del recupero, nel tempo, del microrganismo, anche a concentrazioni di inoculo particolarmente basse (10 UFC) ottenendone il recupero fino a 4 giorni.
Ex vivo sono state studiate 22 biopsie provenienti dall'antro ed 22 biopsie provenienti dal fondo gastrico (Tabella 3) di pazienti UBT (Urea Breath Test) positivi. Le biopsie, opportunamente frammentate, sono state poste in altrettanti flaconi del terreno di trasporto dell'esempio 1, ad una temperatura pari a 4°C, e processate fino a 10 giorni dal prelievo. In tutte le prove effettuate à ̈ stato recuperato H. pylori. In un solo caso si à ̈ registrato inquinamento (campione 17A/F per pinza bioptica contaminata).
II terreno di trasporto della presente invenzione ha mostrato, rispetto al Portagerm -pylori, la possibilità di consentire il recupero e l'isolamento del batterio fino a 10 giorni di conservazione del campione bioptico a 4°C.
Inoltre, il terreno di trasporto dell'invenzione, conservato alla temperatura di 4°C per un periodo di 18 mesi, ha conservato le stesse caratteristiche, consentendo un buon recupero del microrganismo. Rispetto alla scadenza indicata nel Portagerm-pylori (6 mesi), il terreno di trasporto della presente invenzione, conservato 18 mesi a 4°C consente un'eccellente capacità di recupero di H. pylori con caratteristiche sovrapponibili alle indicazioni in Tabella 3.
In particolare, con riferimento alla Tabella 3, sono riportate le caratteristiche di isolamento di Helicobacter pylori da biopsie gastriche (A-antro, F-fondo) conservato nel terreno di trasporto dell'esempio 1 fino a 10 giorni alla temperatura di 4°C (ogni campione bioptìco à ̈ stato settato in 4 frammenti, processati random).
Tabella 3
Campione Positività di H. pylori bioptico nel tempo (giorni)
Antro 1* 2 3 4 5 6 7 8 9 10
7 A 2011
8 A 2011
9 A 2011
10 A 2011
11 A 2011
12 A 2011
13 A 2011
14 A 2011
15 A 2011
16 A 2011
17 A 2011 -
18 A 2011
19 A 2011
20 A 2011
21 A 2011
22 A 2011
23 A 2011
24 A 2011
25 A 2011
1 A 2012
2 A 2012
3 A 2012
4 A 2012
5 A 2012 Campione Positività di H. pylori bioptico nel tempo (giorni)
Fondo 1* 2 3 4 5 6 7 j8 j9 10 F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011 -
—
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011
F 2011 F 2012
2 F 2012
_
3 F 2012
4 F 2012
5 F 2012
*1° giorno dal prelievo
In conclusione, il terreno di trasporto per l'isolamento e l'identificazione di H. pylori secondo la presente invenzione fornisce condizioni ottimali per il mantenimento della vitalità del microrganismo.
La semplice composizione del terreno di trasporto, con l'aggiunta di un supplemento di arricchimento, favorisce:
1) un elevato recupero delle Unità Formanti Colonia (UFC);
2) elevate percentuali di isolamento da biopsia {> 95%);
3) rapida esecuzione dell'antibiogramma direttamente dal primo isolamento;
4) tempi di risposta più brevi {almeno 4 giorni in meno) per i pazienti rispetto alle risposte ottenute con i terreno di trasporto secondo la tecnica nota;
5) bassa contaminazione {associata alla composizione del terreno e non alla presenza di antibiotici);
6) basso costo.
Questi vantaggi evidenziano i progressi raggiunti con la messa a punto del terreno di trasporto secondo la presente invenzione rispetto ai terreni di trasporto secondo la tecnica nota. Di rilevante importanza à ̈ il rispetto del paziente, che usufruisce di un tempo minore per la risposta, attuando la terapia dopo solo 7 giorni dal prelievo; ad oggi, con i terreni di trasporto secondo la tecnica nota, la risposta si ha dopo circa 13 giorni dal prelievo bioptico, con maggiore difficoltà dei pazienti, che sono costretti a ritardare la terapia eradicante. In particolare, il problema dell'eradicazione di H. pylori riguarda la resistenza del batterio a molti chemioantibiotici usati in terapia; l'uso dell'antibiogramma à ̈ essenziale per la scelta mirata dei farmaci da utilizzare. Il terreno di trasporto secondo la presente invenzione permette l'isolamento diretto di H. pylori già dopo 3 giorni dalla semina delle biopsie, con piastre senza inquinanti, e permettendo l'esecuzione dell'antibiogramma senza sottoisolare i ceppi, con ulteriore tempi di attesa per il paziente. Il successo del recupero rapido in coltura di H. pylori da biopsie gastriche à ̈ influenzato dalle condizioni di trasporto dalla sala di endoscopia al laboratorio e dalla corretta conservazione alla temperatura di 4°C.
La presente invenzione à ̈ stata descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma à ̈ da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1) Terreno di trasporto di biopsie gastriche per il recupero di Helicobacter pylori, caratterizzato dal fatto che si trova allo stato semisolido e che comprende, per un litro di terreno: da 6,5 a 7,2 g di agar granulato, da 9,5 a 10,5 g di digerito enzimatico di caseina, da 9 a 10 g di digerito enzimatico di tessuto animale, da 1,8 a 2,2 g di estratto di lievito, da 0,8 a 1,2 g di glucosio, da 5,3 a 5,7 g di sodio cloruro, nonché da 9 a 10,2 mL di arricchimento, il resto essendo costituito da acqua distillata, dovendo essere garantito un pH compreso tra 6,8 e 7,2.
  2. 2) Terreno di trasporto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto arricchimento contiene (tutti i componenti essendo espressi in g/L): Vitamina B12 0,01, L-Glutamina da 9,5 a 10,5 , Adenina da 0,9 a 1,1, Guanine Idroclorido 0,03, Acido p-Aminobenzoico 0,013, Nicotinamide Adenina Dinucleotide da 0,23 a 0,27, Tiamina Pirofosfato 0,1, Nitrato Ferrico 0,02, Tiamina Idroclorido 0,003, L-Cisteina Idroclorido da 24,9 a 26,9, L-Cistina da 1 a 1,2, Destrosio da 90 a 100.
  3. 3) Terreno di trasporto secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che comprende, per un litro di terreno: 7 g di agar granulato, 10 g di digerito enzimato di caseina, 9,5 g di digerito enzimato di tessuto animale, 2 g di estratto di lievito, 1 g di glucosio, 5,5 g di sodio cloruro, nonché 10 mL di arricchimento, il resto (961,2 mL) essendo costituito da acqua distillata, dovendo essere garantito un pH pari a 7,0+0,2.
  4. 4) Procedimento di realizzazione di un terreno di trasporto come definito nelle rivendicazioni 1-3, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi : - miscelare tutti i componenti, fatta eccezione per l'arricchimento, nelle proporzioni definite; portare la miscela ad ebollizione in agitazione ; - sterilizzare in autoclave ad una temperatura di 121 °C per 15 minuti oppure 119°C per 20 minuti; - raffreddare la miscela fino ad una temperatura compresa tra 45°C e 50°C; - aggiungere l'arricchimento.
  5. 5) Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto di prevedere ulteriormente che il terreno ottenuto sia conservato ad una temperatura compresa tra 4°C e 8°C.
  6. 6) Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4 e 5, caratterizzato dal fatto che detta fase di sterilizzazione à ̈ condotta in autoclave ad una temperatura pari a 121°C per un tempo pari a 15 minuti .
  7. 7) Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6, caratterizzato dal fatto che detta fase di raffreddamento che precede l'aggiunta dell'arricchimento comporta una riduzione della temperatura fino a 50°C.
  8. 8) Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-7, caratterizzato dal fatto che detta fase di conservazione à ̈ effettuata ad una temperatura pari a 4 °C.
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