JP2022544616A - クロストリジウム属細菌の最適化された培養培地 - Google Patents

クロストリジウム属細菌の最適化された培養培地 Download PDF

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    • C12R2001/45—Staphylococcus epidermidis

Abstract

本発明は、細菌を培養するための培地組成に関する。特に、本発明は、クロストリジウム属細菌の培養及び／又は発酵のための培地に関する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年８月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／８８７，７９３号に対する優先権を主張する。前述の出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、２０２０年７月１６日付で作成された、「ＪＢＩ６１４５ＷＯＰＣＴ１Ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、４３ＫＢのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本明細書に提供される開示は、クロストリジウム属に属する細菌を増殖させるのに有用な細菌培養培地と、前述の培地を製造及び使用する方法とに関する。
最近の研究により、クロストリジウム属の細菌は、哺乳動物の腸における粘膜免疫系で宿主の免疫細胞の分化を制御することが示されている（国際公開第２０１３０８０５６１号、同第２０１１１５１９４１号）。したがって、生物の免疫系を調節するために、クロストリジウム属の特定の細菌を生物に導入することが有益であり得る。
ヒトが使用するのに有益な免疫機能を有する、これらの細菌を含む薬物、栄養補助食品、プロバイオティクス、又は食品を開発するために、それらの細菌が従来の工業的発酵プロセスによって生産され、次に医薬又は食品製剤に組み込まれ得るように、それらを培養する方法を開発する必要がある。クロストリジウム属細菌の生産は高コストなプロセスであり、これらの細菌を高収率で生産するために使用される増殖培地を改善するために継続的な研究が行われている。クロストリジウム属細菌のいくつかの株を組み合わせて使用する場合、更なる困難が生じる。いくつかのクロストリジウム株の各々を異なる培地で増殖させることは、コスト効率が悪く、時間がかかる場合がある。
したがって、クロストリジウム属細菌のいくつかの株を高収率で培養するために最適化された新規培地を開発することが望ましい。
本発明は、細菌細胞を培養するための最適化された培地組成及びプロセスを提供することによって、上記に示した問題を解決する。
一実施形態では、培地は、（ａ）４５～５５ｇ／ｋｇのＨＹ－ペプトン、（ｂ）１５～２５ｇ／ｋｇの酵母エキス、（ｃ）９～１４ｇ／ｋｇのＭ９塩、（ｄ）５～１５ｇ／ｋｇのグルコースを含み、培地は、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものである。
別の実施形態では、培地は、（ａ）５０ｇ／ｋｇのＨＹ－ペプトン、（ｂ）２０ｇ／ｋｇの酵母エキス、（ｃ）１１．４ｇ／ｋｇのＭ９塩、（ｄ）１０ｇ／ｋｇのグルコースを含む。
別の実施形態では、培地は、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものであり、クロストリジウム属に属する細菌株は、クロストリジウムクラスタＩＶ又はＸＩＶａに属する細菌株である。
別の実施形態では、培地は、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものであり、クロストリジウム属に属する細菌株は、表１に列挙された株からなる群から選択される。
別の実施形態では、培地は、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものであり、クロストリジウム属に属する細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択される配列を含む。
別の実施形態では、培地は、嫌気性条件で維持される。
別の実施形態では、培地は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７の群から選択される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの細菌を更に含む。
一実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、ａ）バイオリアクタを提供することと、ｂ）培養される細胞を培地と混合することと、ｃ）得られた混合物をインキュベートすることとを含む。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、クロストリジウム属に属する細菌株が、クロストリジウムクラスタＩＶ又はＸＩＶａに属する細菌株である、プロセスである。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、クロストリジウム属に属する細菌株が、表１に列挙された株からなる群から選択される、プロセスである。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、クロストリジウム属に属する細菌株が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択される配列を含む、プロセスである。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、培地が約５．８～７の初期ｐＨを有する、プロセスである。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、培地が嫌気性条件で維持される、プロセスである。
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）全ての刊行物は、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
開示される内容は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。開示される内容は、本明細書に記載及び／又は表示の内容に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、請求項に記載の内容に限定することを意図しないことを理解されたい。
特別な記述がない限り、動作に関する可能なメカニズム又は形態、あるいは改善の理由についての説明は、説明のみを意図したものである。本開示の内容は、提案されている動作に関するメカニズム又は形態、あるいは改善の理由の是非によって制限されない。
値の範囲が表されている場合、別の実施形態においては、ある特定の値から、及び／又は他の特定の値までが含まれる。更に、範囲で記述される値に関する言及は、その範囲内のあらゆる値を含む。範囲はいずれも包括的であり、組み合わせであってもよい。値が、先行詞「約」を用いて近似値として表現される場合、その特定の値は、別の実施形態を形成することが理解される。特定の数値に関する言及は、文脈上その他に明記されない限り、少なくともその特定の値を含むものとする。
本明細書において、明確性のために、別々の実施形態の文脈において記載される、開示された内容の複数の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔のために単一の実施形態として記載された開示される内容の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の下位の組み合わせで提供されてもよい。
定義
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数を含むものとする。
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する種々の用語が使用される。特に指示がない限り、このような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
数値範囲、カットオフ、又は特定の値に言及するときに用いる場合、「約」という用語は、引用した値が、記載値から最大１０％変動し得ることを示すために用いる。したがって、用語「約」とは、規定値からの±１０％以下の変動、±５％以下の変動、±１％以下の変動、±０．５％以下の変動、又は±０．１％以下の変動を包含するために使用される。
「細菌増殖」は、二分裂と呼ばれるプロセス中で細菌細胞が２つの同一の娘細胞に分裂することと定義される。細菌集団の複製は、各細胞分裂において生じ、指数関数的に増殖する。培養物中の指数関数的細菌増殖は、とりわけ、細菌細胞の直接計数（すなわち、顕微鏡法、フローサイトメトリ）、バイオマス定量（ミリグラム、グラム、キロ、又はトン）、コロニー計数、光学密度（分光光度計で測定、約６００ｎｍの波長）、栄養消費などの周知の方法によってモニタすることができる。細菌増殖は、「遅滞期」、「指数増殖又は対数期」、「静止期」、及び「衰退又は死滅期」の４つの異なる期を特徴とすることができる。
「遅滞期」の間、細菌は増殖条件に順応中であり、まだ細胞分裂を行うことができないことが一般的に知られている。細胞が成熟状態に入る期間である。「指数増殖又は対数期」は、細菌集団の複製を特徴とする期間である。増殖が制限されない場合、細胞の複製は一定の割合で継続し、その結果、細胞数及び増殖率が共に各世代で複製される。増殖培地は栄養に限りがあり、かつ細胞分裂中に細菌細胞によって産生された代謝産物は多くの場合に毒性であるため、指数増殖期は無期限に持続しない。したがって、増殖率は減少する傾向があり、細菌増殖は「静止期」に入る。この期は、培養培地中の資源枯渇を特徴とする。「衰退又は死滅期」では、細菌は培養培地中の残りの栄養物を完全に枯渇させ、死滅する。
「前培養物」又は「前接種物」は、「培養物」又は「接種物」の製造に使用されるであろう保存培養物から得られる微生物の懸濁液として定義される。
「培養物」、「細胞培養物」、又は「接種物」という用語は、互換的に使用され、初期スケールよりも大規模（より大きな培養培地量）での増殖及び／又は発酵に使用される特定の濃度を有する微生物の懸濁液を定義する。
細胞培養は、ペトリ皿、コンタクトプレート、ボトル、チューブ、ウェル、ベッセル、バッグ、フラスコ、又はタンクなどの細胞の培養に好適な任意の容器で行うことができる。典型的には、容器は、使用前に滅菌される。インキュベーションは、典型的には、好適な温度、浸透圧、通気、撹拌などの好適な条件下で行われる。当業者は、細胞の増殖／培養を支持又は維持するための好適なインキュベーション条件を認識している。
本発明による「細胞培養培地」（同義的に使用される「培養培地」）は、細胞のインビトロ増殖を維持及び／若しくは支持する、並びに／又は特定の生理学的状態を支持する、成分の任意の混合物である。それは合成培地である。細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持及び／若しくは支持するために必要な全成分を含むか、又は別個に添加される更なる成分と組み合わせて選択成分を添加するために使用され得る。好ましくは、細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持及び／又は支持するために必要な全成分を含む。
「嫌気性条件」及び「嫌気生活」は、実質的に無酸素の培養条件を維持することとして定義される。
「新鮮な培養培地」は、培養培地がその成分の全てを完全に含有するとき、以前に使用されていない微生物増殖又は発酵のための任意の培養培地を指す。
「保存又は貯蔵培養物」は、所定の期間貯蔵された凍結培地中の微生物の画分を指す。
「操作的分類単位（ＯＴＵ、複数形ＯＴＵｓ）」は、系統樹における末端葉を指し、特定の遺伝子配列及びこの配列と種のレベルで配列同一性を共有する全ての配列によって定義される。細菌の１つの「種類」又は複数の「種類」は、１つのＯＴＵ又は複数の異なるＯＴＵを含み、細菌の株、種、属、科、又は目も包含する。特定の遺伝子配列は、１６Ｓ配列若しくは１６Ｓ配列の一部であってもよく、又は真正細菌界にわたって広く見られる機能的に保存されたハウスキーピング遺伝子であってもよい。ＯＴＵは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有する。ＯＴＵは、しばしば生物間の配列を比較することによって定義される。９５％未満の配列同一性を有する配列は、同じＯＴＵの部分を形成するとは見なされない。
微生物学において、「１６Ｓ配列決定」又は「１６Ｓ ｒＲＮＡ」又は「１６Ｓ－ｒＲＮＡ」又は「１６Ｓ」は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（複数可）を含むヌクレオチドを特徴付けることによって誘導される配列を指す。細菌１６Ｓ ｒＤＮＡは、約１５００ヌクレオチド長であり、系統学的アプローチを使用してある細菌分離株の進化的関係及び配列類似性を他に対して再生する際に使用される。１６Ｓ配列は、一般に高度に保存されているため、系統学的再生に使用されるが、ほとんどの細菌並びに真菌の属及び種を区別するのに十分なヌクレオチド多様性を有する特異的な超可変領域を含有する。
１６Ｓ ｒＲＮＡの「Ｖ１～Ｖ９領域」は、細菌試料の遺伝子型決定に使用される１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の第１～第９の超可変領域を指す。これらの細菌の領域は、大腸菌系の命名法に基づく番号付けを使用して、それぞれヌクレオチド６９～９９、１３７～２４２、４３３～４９７、５７６～６８２、８２２～８７９、９８６～１０４３、１１１７～１１７３、１２４３～１２９４、及び１４３５～１４６５によって定義される。Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＰＮＡＳ ７５（１０）：４８０１－４８０５（１９７８）。いくつかの実施形態では、ＯＴＵを特徴付けるために、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、及びＶ９領域のうちの少なくとも１つを使用する。一実施形態では、ＯＴＵを特徴付けるために、Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３領域を使用する。別の実施形態では、ＯＴＵを特徴付けるために、Ｖ３、Ｖ４、及びＶ５領域を使用する。別の実施形態では、ＯＴＵを特徴付けるために、Ｖ４領域を使用する。当業者は、当該候補配列を参照の配列と比較して、参照の超可変領域との類似性に基づいて超可変領域を特定することにより、（配列番号１～１，４において）候補１６Ｓ ｒＲＮＡの特異的な超可変領域を特定することができる。
発明の説明
本発明による細胞培養培地は、クロストリジウム属に属する１つ以上の細菌株を増殖するか又はその増殖を維持／支持するのに好適であるように設計される。本発明による培地によって増殖が維持／支持されるクロストリジウム株の例は、表１及び表１０に列挙された１つ以上の株である。
例えば、以下のように、「クロストリジウム属に属する細菌」のクラスタを特定し得ることに留意されたい。具体的には、クロストリジウム属に属する細菌は、配列番号１８及び１９からなるプライマセット（クラスタＸＩＶａに属するクロストリジウム種用）又は配列番号２０及び２１からなるプライマセット（クラスタＩＶに属するクロストリジウム種用）を使用してＰＣＲによって分類される。更に、クロストリジウム属に属する細菌は、配列番号２２及び２３からなるプライマセットを使用して増幅された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定によって分類される。
配列番号１８－ＡＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＡＡ
配列番号１９－ＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＧＡＡ
配列番号２０－ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴ
配列番号２１－ＣＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＴＴＧＴＣＡＡ
配列番号２２－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ
配列番号２３－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ
本発明による細胞培養培地、特に完全培地は、典型的には、少なくとも１つ以上の糖成分、任意選択で１つ以上のアミノ酸、任意選択で１つ以上のビタミン又はビタミン前駆体、１つ以上の塩、任意選択で１つ以上の緩衝成分、任意選択で１つ以上の補助因子、及び任意選択で１つ以上の核酸成分を含む。
培地はまた、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物性タンパク質、脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体、及び／又はプルロニック酸、及び／又は化学的に調製された非イオン性界面活性剤のような界面活性成分を含み得る。
糖成分は、グルコース、ガラクトース、リボース、若しくはフルクトース（単糖類の例）、又はスクロース、ラクトース、若しくはマルトース（二糖類の例）のような全ての単糖類又は二糖類である。
本発明によるアミノ酸の例は、チロシン、タンパク質原性アミノ酸、特に必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、及びバリン、並びにＤ－アミノ酸のような非タンパク質原性アミノ酸である。
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、様々なレチノイド、及び４つのカロチノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）、及びビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体も含まれる。
塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸塩、カリウム、及びナトリウムなどの無機イオン、又はＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、Ｖ、及びＺｎなどの微量元素を含む成分である。例としては、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、塩基性リン酸ナトリウム無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム無水物（ＭｇＳＯ４）、二塩基性リン酸ナトリウム無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物である。
緩衝剤の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸塩）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、及びＴＲＩＳである。
補助因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチド及び誘導体、グルタチオン、リン酸ヘムヌクレオチド及び誘導体である。
細胞は、例えば、灌流バイオリアクタ、細胞バッグ、培養プレート、フラスコ、及び当業者に周知の他の容器を含む様々な容器で培養され得る。温度及び空気組成などの細胞培養に適した周囲条件もまた、当業者に周知である。細胞を培養するための方法もまた、当業者に周知である。
一態様では、本発明は、以下の量で以下の成分を含む組成を提供する：
６．５～４０ｇ／ｋｇのプロテオースペプトン（植物性）、
１～５０ｇ／ｋｇの酵母エキス、
５～１５ｇ／ｋｇの二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、
１～５０ｇ／ｋｇの糖、並びに任意選択で
チオグリコール酸ナトリウム、Ｌ－システイン、及びアスコルビン酸からなる群から選択される、０．３～１０ｇ／ｋｇの還元剤。
特定の実施形態では、糖は、単糖類であり得る。特定の実施形態では、単糖類は、グルコース又はフルクトースであり得る。特定の実施形態では、糖は、二糖類であり得る。特定の実施形態では、二糖類は、スクロースであり得る。特定の実施形態では、糖は、三糖類であり得る。特定の実施形態では、三糖類は、ラフィノースであり得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約６．５～約８、約７．５～約９、約８～約１０、約９～約１１、約１０～約１２、約１１～約１３、約１２～約１４、約１３～約１５、約１４～約１６、約１５～約１７、約１６～約１８、約１７～約１９、約１８～約２０、約１９～約２１、約２０～約２２、約２１～約２３、約２２～約２４、約２３～約２５、約２４～約２６、約２５～約２７、約２６～約２８、約２７～約２９、約２８～約３０、約２９～約３１、約３０～約３２、約３１～約３３、約３２～約３４、約３３～約３５、約３４～約３６、約３５～約３７、約３６～約３８、約３７～約３９、約３８～約４０、約３９～約４１、約４０～約４２ｇ／ｋｇのプロテオースペプトン（植物性）を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約０．３～約１、約０．５～約１．５、約１～約２、約１．５～約２．５、約２～約３、約２．５～約３．５、約３～約４、約３．５～約４．５、約４～約５、約４．５～約５．５、約５～約６、約５．５～約６．５、約６～約７、約０．５～約２、約０．８～約１．３ｇ／ｋｇの還元剤を含み得る。特定の実施形態では、還元剤は、チオグリコール酸ナトリウムである。特定の実施形態では、還元剤は、Ｌ－システインである。特定の実施形態では、還元剤は、アスコルビン酸である。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約４、約２～約５、約３～約６、約４～約７、約５～約８、約６～約９、約７～約１０、約８～約１１、約８～約１２、約８～約１３、約８～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０ｇ／ｋｇの酵母エキスを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約５～約１０、約６～約１１、約７～約１２、約８～約１３、約９～約１４、約１０～約１５ｇ／ｋｇの二塩基性リン酸ナトリウムを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５ｇ／ｋｇのグルコースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５ｇ／ｋｇのスクロースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５ｇ／ｋｇのラフィノースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５ｇ／ｋｇのフルクトースを含み得る。
一態様では、本発明は、以下の量で以下の成分を含む組成を提供する：
５～１５ｇ／ｋｇのプロテオースペプトン、
５～１５ｇ／ｋｇのフィトンペプトン、
１５～２５ｇ／ｋｇの酵母エキス、
９～１４ｇ／ｋｇのＭ９塩、
５～１５ｇ／ｋｇの糖、
任意選択で２～６ｇ／ｋｇの脂肪酸、及び
任意選択で２～６ｇ／ｋｇのポリソルベート２０。
特定の実施形態では、糖は、単糖類であり得る。特定の実施形態では、単糖類は、グルコース又はフルクトースであり得る。特定の実施形態では、糖は、二糖類であり得る。特定の実施形態では、二糖類は、スクロースであり得る。特定の実施形態では、糖は、三糖類であり得る。特定の実施形態では、三糖類は、ラフィノースであり得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約５～約１０、約６～約１０、約８～約１０、約９～約１１、約１０～約１２、約１０～約１３、約１０～約１４、約１０～約１５、約１０～約１６、約１０～約１７、約１０～約１８、約１０～約１９、約１０～約２０、約８～約１２、約８～約１３、約７～約１２ｇ／ｋｇのプロテオースペプトンを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約５～約１０、約６～約１０、約８～約１０、約９～約１１、約１０～約１２、約１０～約１３、約１０～約１４、約１０～約１５、約１０～約１６、約１０～約１７、約１０～約１８、約１０～約１９、約１０～約２０、約８～約１２、約８～約１３、約７～約１２ｇ／ｋｇのフィトンペプトンを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１５～約２０、約１６～約２０、約１７～約２０、約１８～約２０、約１８～約２１、約１８～約２２、約１８～約２３、約１８～約２４、約１８～約２５、約１９～約２０、約１９～約２１、約１９～約２２、約１９～約２３、約１９～約２４、約１９～約２５、約２０～約２５、約２０～約２６、約２０～約２７、約２０～約２８、約２０～約２９、約２０～約３０ｇ／ｋｇの酵母エキスを含み得る。
Ｍ９塩は、細菌増殖培地で使用される、当該技術分野において周知の塩の組成である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。本発明のＭ９塩は、以下を含有する：
３３．９ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４
１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４
５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ
２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約９～約１１．５、約９．５～約１１．５、約１０～約１１．５、約１０．５～約１１．５、約１１～約１１．５、約１１～約１２、約１１～約１２．５、約１１～約１３、約１１～約１３．５、約１１～約１２、約１１～約１２．５、約１１～約１３、約１１～約１３．５、約１１～約１４ｇ／ｋｇのＭ９塩を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５、約９～約１１、約９～約１２、約９～約１３ｇ／ｋｇのグルコースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５、約９～約１１、約９～約１２、約９～約１３ｇ／ｋｇのフルクトースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５、約９～約１１、約９～約１２、約９～約１３ｇ／ｋｇのラフィノースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５、約９～約１１、約９～約１２、約９～約１３ｇ／ｋｇのスクロースを含み得る。
本明細書で使用する場合、「脂肪酸」という用語は、当該技術分野で認識されており、長鎖炭化水素系カルボン酸を含む。脂肪酸は、グリセリドを含む多くの脂質の成分である。最も一般的な天然に存在する脂肪酸は、偶数の炭素原子（１６又は１８個）を有するモノカルボン酸であり、これは飽和又は不飽和であり得る。「不飽和」脂肪酸は、炭素原子間にシス二重結合を含む。「多価不飽和」脂肪酸は、２つ以上の二重結合を含み、二重結合は、メチレン中断系に配置されている（－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－）。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約２～約４、約２．５～約４、約３～約４、約２～約５、約２．５～約５、約３～約５、約３．５～約５、約３～約６、約３．５～約６、約４～約６、約４～約５ｇ／ｋｇの脂肪酸を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約２～約４、約２．５～約４、約３～約４、約２～約５、約２．５～約５、約３～約５、約３．５～約５、約３～約６、約３．５～約６、約４～約６、約４～約５ｇ／ｋｇのポリソルベート２０を含み得る。
一態様では、本発明は、以下の量で以下の成分を含む組成を提供する：
４５～５５ｇ／ｋｇのＨＹ－ペプトン、
１５～２５ｇ／ｋｇの酵母エキス、
９～１４ｇ／ｋｇのＭ９塩、
５～１５ｇ／ｋｇの糖、及び
任意選択で２～６ｇ／ｋｇの脂肪酸。
特定の実施形態では、糖は、単糖類であり得る。特定の実施形態では、単糖類は、グルコース又はフルクトースであり得る。特定の実施形態では、糖は、二糖類であり得る。特定の実施形態では、二糖類は、スクロースであり得る。特定の実施形態では、糖は、三糖類であり得る。特定の実施形態では、三糖類は、ラフィノースであり得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約４５～約５０、約４６～約５０、約４７～約５０、約４７～約５１、約４７～約５２、約４７～約５３、約４７～約５４、約４７～約５５、約４８～約５５、約４９～約５５、約５０～約５５ｇ／ｋｇのＨＹ－ペプトンを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１５～約２０、約１６～約２０、約１７～約２０、約１８～約２０、約１８～約２１、約１８～約２２、約１８～約２３、約１８～約２４、約１８～約２５、約１９～約２０、約１９～約２１、約１９～約２２、約１９～約２３、約１９～約２４、約１９～約２５、約２０～約２５、約２０～約２６、約２０～約２７、約２０～約２８、約２０～約２９、約２０～約３０ｇ／ｋｇの酵母エキスを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約９～約１１．５、約９．５～約１１．５、約１０～約１１．５、約１０．５～約１１．５、約１１～約１１．５、約１１～約１２、約１１～約１２．５、約１１～約１３、約１１～約１３．５、約１１～約１２、約１１～約１２．５、約１１～約１３、約１１～約１３．５、約１１～約１４ｇ／ｋｇのＭ９塩を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５、約９～約１１、約９～約１２、約９～約１３ｇ／ｋｇのグルコースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５、約９～約１１、約９～約１２、約９～約１３ｇ／ｋｇのフルクトースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５、約９～約１１、約９～約１２、約９～約１３ｇ／ｋｇのラフィノースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約１～約８、約２～約９、約３～約１０、約４～約１１、約５～約１２、約６～約１３、約７～約１４、約８～約１５、約８～約１６、約８～約１７、約８～約１８、約８～約１９、約８～約２０、約８～約２１、約８～約２２、約８～約２３、約８～約２４、約８～約２５、約８～約３０、約８～約３５、約８～約４０、約８～約４５、約８～約５０、約８～約５５、約９～約１１、約９～約１２、約９～約１３ｇ／ｋｇのスクロースを含み得る。
本明細書で使用する場合、「脂肪酸」という用語は、当該技術分野で認識されており、長鎖炭化水素系カルボン酸を含む。脂肪酸は、グリセリドを含む多くの脂質の成分である。最も一般的な天然に存在する脂肪酸は、偶数の炭素原子（１６又は１８個）を有するモノカルボン酸であり、これは飽和又は不飽和であり得る。「不飽和」脂肪酸は、炭素原子間にシス二重結合を含む。「多価不飽和」脂肪酸は、２つ以上の二重結合を含み、二重結合は、メチレン中断系に配置されている（－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－）。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約２～約４、約２．５～約４、約３～約４、約２～約５、約２．５～約５、約３～約５、約３．５～約５、約３～約６、約３．５～約６、約４～約６、約４～約５ｇ／ｋｇの１つ以上の脂肪酸を含み得る。
以下の例は、本発明を例示する。これらの例は本発明の範囲を制限するとして解釈されてはならない。例は図示の目的のために含まれ、本発明は請求項によってのみ限定される。
実施例１．クロストリジウム株の初期増殖条件。
この研究は、少なくとも１．０×１０９細胞／ｍＬの最終濃度に達することを目標として、クロストリジウム属の細菌を増殖させるための増殖培地の最適化を検討した。
以下のクロストリジウム株を試験に使用した（表１）。
Figure 2022544616000001
培養培地（培地Ａ）は、Ｄｕｎｃａｎ Ｓｔｒｏｎｇ（ＤＳ）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄｕｎｃａｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１６，１９６８）の部分変更に基づいて、以下の成分を使用して調製した。
培地Ａ：
プロテオースペプトン（植物性）（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号２９１８５）－７．５ｇ／ｋｇ
植物抽出物（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９８６９－５００Ｇ－Ｆ）－７．５ｇ／ｋｇ
酵母エキス（ＢＤ、カタログ番号２１２７５０）－４ｇ／ｋｇ
チオグリコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０６３２）－１ｇ／ｋｇ
二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ５１３６－５００）－１０ｇ／ｋｇ
Ｄ－（＋）－ラフィノース五水和物（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８３４００－１００ｇ）－４ｇ／ｋｇ
ジャガイモ由来デンプン、可溶性（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ９７６５）－０．５ｇ／ｋｇ
水（ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）システムを使用して精製）－１Ｌ
培地は、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）又は０．２２μｍフィルタを使用した滅菌濾過によって滅菌した。培地を使用前に嫌気キャビネットに約１６時間配置した。
クロストリジウム株（表１）の凍結保存培養物を嫌気チャンバ内で解凍した。４００μＬの各株を、２５ｍＬの培地Ａを有する別個のフラスコに接種し、嫌気性条件下で３７℃で１５時間インキュベートした。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）をモニタし、Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ寒天プレートを使用して、最大ＯＤ６００ｎｍにおいてコロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントした（表２）。
Figure 2022544616000002
増殖収率を増加させる目的で、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）、ｍ２ｐｌａｂｓ）を使用して、増殖培地の最適化に関する試験を行った。ＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）では、規定の波長の光をマルチウェルプレートの各ウェルに送ることによって細菌増殖を連続的にモニタし、その一方で後方散乱光（バイオマスのインジケータ）を検出及び分析する。
実施例２．クロストリジウム株の増殖における炭素源の影響。
培地Ａの本来の配合は、主炭素源としてラフィノースを含む。最良の増殖条件を見出すために、培地Ａ中のラフィノースを同じ濃度のスクロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８４１００）又はグルコース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ５７６７）のいずれかと置き換え、したがって以下の組成のうちの１つを使用した。
プロテオースペプトン（植物性）－７．５ｇ／ｋｇ
植物抽出物－７．５ｇ／ｋｇ
酵母エキス－４ｇ／ｋｇ
チオグリコール酸ナトリウム－１ｇ／ｋｇ
二塩基性リン酸ナトリウム－１０ｇ／ｋｇ
Ｄ－（＋）－ラフィノース五水和物、又はＤ－（＋）－グルコース、又はＤ－スクロース－４ｇ／ｋｇ
デンプン－０．５ｇ／ｋｇ
水（ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）システムを使用して精製）－１Ｌ
最初に、各クロストリジウム株の凍結保存培養物（３００μＬ）を解凍し、次いで、４ｇ／Ｌのラフィノース、スクロース、グルコース、又はフルクトースのいずれかを含有する３ｍＬの培地Ａに接種し、嫌気チャンバ内で３７℃で２０時間インキュベートした（前培養物と称される）。次に、分光光度計を使用して前培養物のＯＤ６００ｎｍを測定し、培養物に接種される前培養物の体積（Ｘ）を以下の式に従って計算した。
前培養物の体積Ｘ＝目標ＯＤ６００ｎｍ（０．０５）＊目標体積（１．４ｍＬ）／前培養物のＯＤ６００ｎｍ
次に、計算された体積の前培養物を、４ｇ／Ｌのラフィノース、スクロース、グルコース、又はフルクトースのいずれかを含有する合計１．４ｍＬの培地Ａに再び接種し（培養物と称される）、ＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用して嫌気性条件下で６００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で４８時間維持した。
嫌気性条件は、以下の体積による気体の混合物を使用することによって達成した：１０％のＨ２、１０％のＣＯ２、及び８０％のＮ２。あるいは、以下の混合物を使用することができる：５％のＨ２、１０％のＣＯ２、及び８５％のＮ２。
結果は、各炭素源の選好が株依存性であることを示した（表３）。
表３．使用した炭素源に応じてより速い増殖を示すクロストリジウム株。２０時間培養後のＢｉｏｌｅｃｔｏｒの散乱光読み取り値（ゲイン４０）によって、異なる株の増殖をスコア化した。＋＋－散乱光読み取り値＞１００、＋－２０時間の散乱光読み取り値＞５０、ｏ－散乱光読み取り値＜５０、ｎｄ－検出不可能。
Figure 2022544616000003
実施例３．クロストリジウム株の増殖における植物抽出物、ペプトン、酵母エキス、及び炭素源の様々な濃度の影響。
次に、植物抽出物、ペプトン、酵母エキス、及び／又は炭素源の濃度を増加させることによって、培地Ａを更に最適化した（表４参照）。
Figure 2022544616000004
表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例２に記載したようにＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用して分析した。結果は、培地Ａ１、Ａ２、又はＡ３を使用した場合に細菌増殖が向上することを示唆した。培地Ａ４を使用した場合、有益性は観察されなかった。
実施例４．クロストリジウム株の増殖におけるデンプン及び植物抽出物の影響。
次に、実施例１の配合表からデンプンを除去することによって培地Ａを更に最適化し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン（植物性）－７．５ｇ／ｋｇ
植物抽出物＃２－７．５ｇ／ｋｇ
酵母エキス－４ｇ／ｋｇ
チオグリコール酸ナトリウム－１ｇ／ｋｇ
二塩基性リン酸ナトリウム－１０ｇ／ｋｇ
炭素源（株依存性、表３参照）－４ｇ／ｋｇ
水（ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）システムを使用して精製）－１Ｌ
表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例２に記載したようにＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用して分析した。結果は、デンプンの除去が増殖曲線に有意な影響を及ぼさないことを示唆した。
次に、実施例１の配合表から植物抽出物を除去することによって培地Ａを更に最適化し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン（植物性）－７．５ｇ／ｋｇ
酵母エキス－４ｇ／ｋｇ
チオグリコール酸ナトリウム－１ｇ／ｋｇ
二塩基性リン酸ナトリウム－１０ｇ／ｋｇ
炭素源（株依存性、表３参照）－４ｇ／ｋｇ
デンプン－０．５ｇ／ｋｇ
水（ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）システムを使用して精製）－１Ｌ
表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例２に記載したようにＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用して分析した。植物抽出物の除去は、増殖曲線に有意な影響を及ぼさなかった。
実施例５．クロストリジウム株の増殖におけるチオグリコール酸ナトリウムの影響。
次に、実施例１の配合表からチオグリコール酸ナトリウムを除去することによって培地Ａを更に最適化し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン（植物性）－７．５ｇ／ｋｇ
植物抽出物－７．５ｇ／ｋｇ
酵母エキス－４ｇ／ｋｇ
二塩基性リン酸ナトリウム－１０ｇ／ｋｇ
炭素源（株依存性、表３参照）－４ｇ／ｋｇ
デンプン－０．５ｇ／ｋｇ
水（ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）システムを使用して精製）－１Ｌ
表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例２に記載したようにＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用して分析した。チオグリコール酸ナトリウムの除去は、株１、４、６、７、９、１８、２６、２７、及び２８に有意な増殖抑制の影響を及ぼした。
実施例６．クロストリジウム株の増殖におけるｐＨの影響。
次に、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用してｐＨを５．８、６．３、又は７のいずれかに調整することによって、炭素源としてラフィノースを含有する培地Ａを更に最適化した。
表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例２に記載したようにＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用して分析した。結果は、より低いｐＨが増殖率に悪影響を及ぼすことを示唆した（表５）。
表５．異なるｐＨにおける２０時間後のクロストリジウム株の増殖。
２０時間培養後のＢｉｏｌｅｃｔｏｒの散乱光読み取り値（ゲイン４０）によって、異なる株の増殖をスコア化した。＋＋－散乱光読み取り値＞１００、＋－２０時間の散乱光読み取り値＞５０、ｏ－散乱光読み取り値＜５０。
Figure 2022544616000005
 ＊全ての散乱光読み取り値が閾値を下回ったが、株２６のｐＨ７の散乱光信号は、他のｐＨよりも実質的に高かった。
実施例７．クロストリジウム株の増殖における消泡剤の影響。
細菌増殖の指数増殖期中の泡の形成を防止するために、消泡剤２０４（１００μＬ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）を培地に添加し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン（植物性）－７．５ｇ／ｋｇ
植物抽出物－７．５ｇ／ｋｇ
酵母エキス－４ｇ／ｋｇ
チオグリコール酸ナトリウム－１ｇ／ｋｇ
二塩基性リン酸ナトリウム－１０ｇ／ｋｇ
炭素源（株依存性、表３参照）－４ｇ／ｋｇ
デンプン－０．５ｇ／ｋｇ
水（ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）システムを使用して精製）－１Ｌ
表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例２に記載したようにＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用して分析した。結果は、消泡剤の添加が細菌増殖率に悪影響を及ぼさないことを示唆した。
実施例８．クロストリジウム株の増殖における基本培地の影響。
最終培地は、上記の全ての変更を含み、基本培地（ＢＭ、表６）と名付けられた。培地中の添加糖は株依存性であるため、最終培地は、ラフィノースを含む場合は「ＢＭＲ」、スクロースを含む場合は「ＢＭＳ」、又はグルコースを含む場合は「ＢＭＧ」と称された。
Figure 2022544616000006
クロストリジウム株に対して培地ＡとＢＭとの比較を行った（表７）。
表７．培地Ａ及びＢＭ培地におけるクロストリジウム株の増殖。
２０時間培養後のＢｉｏｌｅｃｔｏｒの散乱光読み取り値（ゲイン４０）によって、異なる株の増殖をスコア化した。＋＋－散乱光読み取り値＞１００、＋－２０時間の散乱光読み取り値＞５０、ｏ－散乱光読み取り値＜５０、ｎｄ－検出不可能。
Figure 2022544616000007
実施例９．クロストリジウム株の増殖における高純度ペプトンの影響。
表５による培地組成中の本来のプロテオースペプトンの代わりに、高純度ペプトン（ＶＥＧＥＴＡＢＬＥ ＰＥＰＴＯＮＥ Ｎｏ１、ＯＸＯＩＤ、ＶＧ０１００）を３０ｇ／ｋｇの濃度で試験した。表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例２に記載したようにＢＩＯＬＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用して分析した。結果は、このペプトンが株番号１、４、６、９、１８、及び２９の細菌の増殖に悪影響を及ぼすことを示唆した。
実施例１０．Ｍ１培地を使用したクロストリジウム株の増殖。
単一の培地を開発して１７種のクロストリジウム株を約１０９細胞／ｍＬのＣＦＵまで増殖させること、並びに株３及び株８の増殖を改善することを目標として、新規の培地組成を試験してきた。
Ｍ１培地：
プロテオースペプトン（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号２９１８５－５００Ｆ）－１０ｇ／ｋｇ
フィトンペプトン（ＢＤ、カタログ番号２１１９０６）－１０ｇ／ｋｇ
酵母エキス（ＢＤ、カタログ番号２１２７３０）－１０ｇ／ｋｇ
Ｍ９塩（３３．９ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、ＢＤ、カタログ番号２４８５１０）－１１．４ｇ／ｋｇ
Ｄ－（＋）－グルコース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ５７６７）－１０ｇ／ｋｇ
微量元素金属混合カクテル粉末（Ｓｉｇｍａ ＳＡＦＣ、８７１４８ＣＰ）－０．１ｇ／ｋｇ
脂肪酸（Ｓｉｇｍａ ＳＡＦＣ、カタログ番号Ｆ７０５０）－４ｇ／ｋｇ
水（ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）システムを使用して精製）－１Ｌ
表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例１に記載したように分析した。結果は、全てのクロストリジウム株がＭ１培地で良好に増殖していることを示唆した（表８）。株３及び株２７を除く全ての株が、１０９細胞／ｍＬの所望のＣＦＵに達することが観察された（表８）。
Figure 2022544616000008
Ｍ１培地を更に最適化するために、追加の試験を行った。上記のＭ１培地の組成から微量元素金属混合物及び脂肪酸を除去し、細菌細胞の増殖を試験した。結果は、細菌の増殖に有意な影響を及ぼさないことを示唆した。
実施例１１．Ｍ８１培地を使用したクロストリジウム株の増殖。
単一の培地を開発して１７種のクロストリジウム株を約１０９細胞／ｍＬのＣＦＵまで増殖させること、並びに株３の増殖を改善することを目標として、Ｍ１培地を下記のように変更し、新しい培地をＭ８１と称した。
Ｍ８１培地：
ＨＹペプトン（Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５Ｘ０１１１１）５０ｇ／ｋｇ
酵母エキス（ＢＤ、カタログ番号２１２７３０）－１０ｇ／ｋｇ
Ｍ９塩（３３．９ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、ＢＤ、カタログ番号２４８５１０）－１１．４ｇ／ｋｇ
Ｄ－（＋）－グルコース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ５７６７）－１０ｇ／ｋｇ
微量元素金属混合カクテル粉末（Ｓｉｇｍａ ＳＡＦＣ、８７１４８ＣＰ）－０．１ｇ／ｋｇ
脂肪酸（Ｓｉｇｍａ ＳＡＦＣ、カタログ番号Ｆ７０５０）－４ｇ／ｋｇ
水（ＭＩＬＬＩ－Ｑ（登録商標）システムを使用して精製）－１Ｌ
表１のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例１に記載したように分析した。結果は、少なくともクロストリジウム株番号１、３、８、１８、２７、及び２９がＭ８１培地で良好に増殖していることを示唆した（表７）。少なくとも株番号３及び１８が、１０９細胞／ｍＬの所望のＣＦＵに達することが観察された（表９）。
Figure 2022544616000009
Ｍ８１培地を更に最適化するために、追加の試験を行った。上記のＭ８１培地の組成から微量元素金属混合物及び脂肪酸を除去し、細菌細胞の増殖を試験した。結果は、細菌の増殖に有意な影響を及ぼさないことを示唆した。
Figure 2022544616000010
Figure 2022544616000011
Figure 2022544616000012
Figure 2022544616000013
Figure 2022544616000014
Figure 2022544616000015
Figure 2022544616000016
Figure 2022544616000017
Figure 2022544616000018
Figure 2022544616000019
Figure 2022544616000020
Figure 2022544616000021
Figure 2022544616000022
Figure 2022544616000023
Figure 2022544616000024
Figure 2022544616000025
Figure 2022544616000026
Figure 2022544616000027
Figure 2022544616000028
Figure 2022544616000029
Figure 2022544616000030
Figure 2022544616000031
Figure 2022544616000032

Claims (13)

  1. （ａ）４５～５５ｇ／ｋｇのＨＹ－ペプトンと、
    （ｂ）１５～２５ｇ／ｋｇの酵母エキスと、
    （ｃ）９～１４ｇ／ｋｇのＭ９塩と、
    （ｄ）５～１５ｇ／ｋｇのグルコースと
    を含む、培地であって、
    前記培地が、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものである、
    前記培地。
  2. 前記培地が、
    （ａ）５０ｇ／ｋｇのＨＹ－ペプトンと、
    （ｂ）２０ｇ／ｋｇの酵母エキスと、
    （ｃ）１１．４ｇ／ｋｇのＭ９塩と、
    （ｄ）１０ｇ／ｋｇのグルコースと
    を含む、請求項２に記載の培地。
  3. 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、クロストリジウムクラスタＩＶ又はＸＩＶａに属する細菌株である、請求項１又は２に記載の培地。
  4. 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、表１に列挙された株からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の培地。
  5. 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択される配列を含む、請求項１又は２に記載の培地。
  6. 前記培地が、嫌気性条件で維持される、請求項１又は２に記載の培地。
  7. 前記培地が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７の群から選択される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの細菌を更に含む、請求項１又は２に記載の培地。
  8. 細菌細胞を培養するためのプロセスであって、
    ａ）バイオリアクタを提供することと、
    ｂ）培養される前記細胞を請求項１又は２に記載の培地と混合することと、
    ｃ）得られた混合物をインキュベートすることと
    を含む、前記プロセス。
  9. 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、クロストリジウムクラスタＩＶ又はＸＩＶａに属する細菌株である、請求項８に記載のプロセス。
  10. 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、表１に列挙された株からなる群から選択される、請求項８に記載のプロセス。
  11. 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択される配列を含む、請求項８に記載のプロセス。
  12. 前記培地が、約５．８～７の初期ｐＨを有する、請求項８に記載のプロセス。
  13. 前記培地が、嫌気性条件で維持される、請求項８に記載のプロセス。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2011151941A1 (ja) 2010-06-04 2011-12-08 国立大学法人東京大学 制御性ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物
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BR102012013110A2 (pt) * 2012-05-31 2014-05-27 Cristalia Prod Quimicos Farm Meio de cultura para bactérias do gênero clostridium livre de componentes de origem animal e processo para produção de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica
AU2014232370B2 (en) * 2013-03-15 2018-11-01 Seres Therapeutics, Inc. Network-based microbial compositions and methods
CN108342434B (zh) * 2018-02-06 2021-08-31 中国兽医药品监察所 一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基

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